BR112021004289A2

BR112021004289A2 - receptores de antígeno quiméricos e células t que expressam o receptor de antígeno quimérico para tumores sólidos

Info

Publication number: BR112021004289A2
Application number: BR112021004289-0A
Authority: BR
Inventors: Seogkyoung KONG
Original assignee: Seogkyoung Kong
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2021-08-03
Also published as: EP3848387A4; WO2020050667A1; KR20240046645A; US20220387503A1; US20230056345A1; KR20240046644A; KR102663253B1; CN113272318A; EP3848387A1; JP2021536266A; KR20210049916A; US20230055761A1; US20210252069A1; IL281232A; JP2023134640A; CA3111978A1; AU2019336031A1

Abstract

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS E CÉLULAS T QUE EXPRESSAM O RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO PARA TUMORES SÓLIDOS. Trata-se de um receptor de antígeno quimérico com persistência melhorada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “RECEPTORES DE ANTÍGENO

QUIMÉRICOS E CÉLULAS T QUE EXPRESSAM O RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO PARA TUMORES SÓLIDOS” CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (CAR) inovador para tratar efetivamente câncer sanguíneo ou câncer sólido, e a uma célula T CAR em que um receptor de antígeno quimérico alvejando um antígeno de câncer específico é expresso. Além disso, a presente invenção se refere a um vetor que expressa um CAR inovador para tratar efetivamente câncer sanguíneo ou câncer sólido.

[002] Mais especificamente, a presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico compreendendo um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembranar; um domínio coestimulatório; e um domínio de sinalização citoplásmico, em que qualquer motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (doravante no presente documento descrito como “ITAM”) presente dentro de um domínio CD3ζ, que é um domínio de sinalização citoplásmico, é mutado para persistência excelente in vivo e efeitos de antitumorais de células T CAR, e a uma célula T CAR em que o receptor de antígeno quimérico é expresso.

[003] Ademais, a fim de induzir um sinal de citocina de uma maneira dependente de antígeno durante a estimulação de antígenos de câncer, um domínio citoplásmico clivado de receptor-α de interleucina-7 (IL7Rα) ou receptor-β de interleucina-2 (IL- 2Rβ) além do domínio de sinalização de CD3ζ e um domínio coestimulatório de 4-1BB foi adicionado a um gene CAR, de modo a reduzir a diferenciação e exaustão de células T CAR causadas por sinalização tônica de CAR de células T CAR, tornando a mesma, assim, capaz de exibir efeitos de persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais.

[004] Além disso, na presente invenção, um receptor de comutação quimérico foi introduzido para converter o sinal imunossupressor no microambiente de tumor hostil em um sinal de ativação em células T CAR.

[005] Além disso, na presente invenção, a citocina IL-21 é liberada para fora de células T CAR, de modo a auxiliar na ativação de células imunorrelacionadas natas e aumentar o teor de células T CAR de memória menos diferenciada.

[006] O receptor de antígeno quimérico de acordo com a presente invenção pode mostrar persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR em um microambiente de tumor hostil, e pode simultaneamente reduzir a toxicidade, reduzindo, assim, efeitos colaterais no paciente enquanto aprimora o efeito de tratamento. Além disso, é possível expandir o escopo de uso da presente invenção preparando um tratamento de T CAR (não autoderivado) alogênico fornecido por receptor de antígeno quimérico, de acordo com a presente invenção.

ANTECEDENTES

[007] As células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) se referem a um tipo de célula T com um gene recombinante, em que um gene que codifica um receptor que reconhece antígenos de superfície de célula de câncer especificamente expresso na superfície de células de câncer é introduzido em uma célula T para exterminar células de câncer.

[008] O Dr. Zelig Eshhar, um químico e imunologista israelense no Instituo de Ciências Weizmann, et al. propuseram anteriormente uma hipótese de que, quando células T são feitas artificialmente com um receptor que se liga a um antígeno especificamente expresso em uma célula de câncer, é possível alvejar apenas células de câncer e alvejar uma resposta imune para exterminar células de câncer. Eles foram bem-sucedidos no preparo de células T dotadas de um receptor de antígeno quimérico, e isso foi relatado em PNAS em 1989.

[009] Nas células T CAR preparadas nos dias iniciais (isto é, as células T CAR de primeira geração), apenas CD3ζ foi usado como um domínio de sinalização. Entretanto, estas células T CAR apresentaram desvantagens no sentido de que o efeito de tratamento foi insignificativo e que a persistência também foi curta. Portanto, esforços foram feitos para aprimorar a reatividade de células T CAR e, como resultado, células T CAR de segunda geração foram preparadas, nas quais um domínio coestimulatório (CD28 ou CD137/4-1BB) e CD3ζ foram combinados, e estas células T CAR mostraram um aumento no número de células T CAR restantes no corpo em comparação com as células T CAR de primeira geração.

[010] Nas células T CAR de segunda geração, apenas um tipo de domínio coestimulatório foi usado, e as células T CAR usando dois tipos de domínios coestimulatórios são chamadas de T CAR de terceira geração.

[011] Em relação ao método de tratar câncer usando células T CAR, três pacientes de leucemia linfoide crônica de estágio tardio (CCL) foram injetados com células T citotóxicas que foram modificadas para reconhecer CD19. Como resultado, a leucemia foi completamente curada em dois dos pacientes, e houve relatos de que as condições duraram por cerca de 10 meses (N Engl J Med 2011, 365:725 a 733, 25 de agosto de 2011; Sic Transl Med 10 de agosto de 2011, 3(95):95ra73). Em particular, a T CAR usada correspondeu às células T CAR de segunda geração, em que 4-1BB foi usado como o domínio coestimulatório e CD3ζ foi usado como o domínio de sinalização. O domínio de ligação ao antígeno das células T CAR reconhece CD19 encontrado na superfície de células de câncer de leucemia como um antígeno.

[012] Além disso, houve um relato de que, quando CTL019 foi administrado a pacientes com leucemia aguda, 27 dos 30 pacientes experimentaram remissão completa, 67% dos pacientes experimentaram remissão completa por mais de 2 anos e 78% dos pacientes sobreviveram por anos. Considerando que os pacientes-alvo acima eram pacientes recidivos ou refratários, estes resultados foram muito surpreendentes (N Engl J Med 2014, 371:1.507 a 1.517, 16 de outubro de 2014).

[013] Atualmente, os testes clínicos para vários cânceres sanguíneos (por exemplo, linfoma, mieloma, etc.) estão em andamento em relação aos métodos terapêuticos usando várias células T CAR, e T CAR, como um fármaco farmacêutico que pode ser usado para o tratamento de câncer sanguíneo, entrou no mercado.

[014] Entretanto, há vários obstáculos para o uso de células T CAR para o tratamento de câncer sólido. Por exemplo, quando células T CAR são administradas intravenosamente a um paciente com câncer, é difícil que as células T CAR migrem para o sítio tumoral; e em um microambiente de tumor hostil, as células T CAR são funcionalmente inibidas enquanto exibem simultaneamente persistência e proliferação limitadas.

[015] Portanto, há uma necessidade de desenvolver células T CAR que possam tratar câncer sólido superando estes problemas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[016] Um objetivo da presente invenção é fornecer plataformas de CAR, células T CAR e vetores de expressão de CAR que têm efeitos terapêuticos notavelmente excelentes em câncer sólido em comparação com as células T CAR conhecidas anteriormente.

[017] O agente terapêutico de célula T CAR da presente invenção para tratar câncer sólido compreende: (1) um ITAM mutado introduzido no domínio de sinalização citoplásmico para persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR; e/ou (2) sinalização tônica de CAR controlada pela adição de um domínio citoplásmico clivado de IL7Rα ou IL-2Rβ além de um domínio de sinalização de CD3ζ e um domínio coestimulatório de 4-1BB a um gene CAR, de modo a induzir um sinal de citocina de uma maneira dependente de antígeno; e/ou (3) um receptor de comutação quimérico introduzido de modo a converter o sinal imunossupressor no microambiente de tumor hostil em um sinal de ativação em células T CAR; e/ou (4) citocina IL-21 que pode ser liberada para fora das células T CAR, de modo a auxiliar a ativação de células imunorrelacionadas natas e aumentar o teor de células T CAR de memória menos diferenciada.

[018] Devido à sinalização tônica de CAR, as células T CAR promovem morte de célula T CAR induzida por anergia, diferenciação, exaustão e ativação. A fim de aumentar a eficácia terapêutica de células T CAR para tratar câncer sólido, persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR são essenciais. Portanto, é necessário controlar o sistema de sinalização tônica de CAR em estratégias para tratamento de câncer sólido.

[019] Visto que a sinalização tônica de CAR pode ser controlada por substituição de um domínio de sinalização citosólico de célula T CAR, um sinal de citocina dependente de antígeno foi adicionado à célula T CAR. Adicionalmente, a fim de controlar a sinalização tônica de CAR que pode ocorrer devido à sinalização não controlada baseada em ITAM excessivo dentro do domínio CD3ζ, um ITAM mutado foi introduzido no domínio de sinalização citoplásmico. Controlando a sinalização tônica de CAR, foi feito com que a persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR durassem mais.

[020] Além disso, um receptor de comutação quimérico foi introduzido, o qual converte o sinal inibitório de TGF-β (isto é, uma citocina imunossupressora superexpressa em um microambiente de tumor hostil) em um sinal de ativação em células T CAR. Além disso, foi preparado de modo que tal citocina IL-21 pudesse ser liberada para fora das células T CAR, de modo a auxiliar a ativação de células imunorrelacionadas natas e aumentar o teor de células T CAR de memória menos diferenciada.

[021] O receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser usado para preparar agentes terapêuticos de célula T CAR para vários carcinomas alterando o alvo de antígeno de câncer no domínio de ligação ao antígeno.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[022] Para solucionar os problemas descritos acima, a presente invenção fornece um polipeptídeo compreendendo um receptor de antígeno quimérico, que compreende um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembranar; um domínio coestimulatório e um domínio de sinalização, Em particular, o domínio coestimulatório pode compreender um domínio 4-1BB ou CD28 ou tanto um domínio 4-1BB quanto um domínio CD28, em que o domínio de sinalização compreende um domínio CD3ζ.

[023] Na presente invenção, o polipeptídeo compreende IL-7Rα ou uma parte do mesmo interposta entre o domínio 4-1BB e o domínio CD3ζ. Em particular, uma parte de IL-7Rα pode ser uma sequência de SEQ ID NO: 15, e uma parte de IL-2Rβ pode ser uma sequência de SEQ ID NO: 17. Uma parte do domínio citoplásmico do IL-7Rα (SEQ ID NO: 15) é uma sequência entre a 266a e a 328a posições em toda a sequência de IL-7Rα de SEQ ID NO: 14, e uma parte do domínio citoplásmico de IL-2Rβ (SEQ ID NO: 17) é uma sequência entre a 266a e a 369a posições em toda a sequência de IL-2Rβ de SEQ ID NO: 16.

[024] Por exemplo, persistência in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR foram aumentados controlando a sinalização tônica de CAR ligando um domínio citoplásmico clivado de IL-7Rα (aminoácidos nas posições de 265 a 328; SEQ ID NO: 15) ou domínio citoplásmico clivado de IL2Rβ (aminoácidos nas posições de 266 a 369; SEQ ID NO: 17) entre 4-1BB (SEQ ID NO: 11) como um domínio coestimulatório e CD3ζ mutante (em que as posições de 91 a 113 de SEQ ID NO: 18 são substituídas pela SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32), em um CAR que é específico a IL-13Ra2, baseado nas células T CAR anti-IL13Ra2 conhecidas (YYB-103 da SEQ ID NO: 22: consultar Publicação Internacional de PCT no WO 2017/023138).

[025] Na presente invenção, três motivos de ativação baseados em tirosina imunorreceptores (ITAMs) são incluídos no domínio CD3ζ, e em uma terceira região de ITAM entre eles, é preferencial que um primeiro motivo, YxxL, e um segundo motivo, YxxL, sejam substituídos (em que x e y, cada um, representam qualquer aminoácido) (consultar a Figura 3).

[026] Geralmente, o ITAM dentro do domínio CD3ζ inclui duas formas de YxxL (ou isoleucina (I)) contendo tirosina (Y), que é afastada da leucina (L) ou isoleucina (I) por uma distância de uma sequência de dois aminoácidos. Visto que as formas de YxxL/I geralmente estão presentes sendo afastadas por 6 a 8 aminoácidos, o ITAM pode ser representado pela estrutura de YxxL/Ix(6–8)YxxL/I.

[027] Na presente invenção, três ITAMs (posições 21 a 35; posições 60 a 75; e posições 91 a 105 da SEQ ID NO: 18) são incluídos dentro do domínio CD3ζ, que é representado pela SEQ ID NO: 18, em que, no domínio CD3ζ, é preferencial que, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL (posições 91 a 94 da SEQ ID NO: 18), seja substituído por YxxQ, e uma região de segundo motivo, YxxLHM

(posições 102 a 107 da SEQ ID NO: 18), seja substituída por YxYVTM; ou em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL (posições 91 a 94 de SEQ ID NO: 18), seja substituído por YyyL, e um segundo motivo, YxxL (posições 102 a 105 da SEQ ID NO: 18), seja substituído por YxxQ (em que x e y, cada um, representam qualquer aminoácido).

[028] Por exemplo, na presente invenção, a região incluindo uma terceira região de ITAM do domínio CD3ζ pode ser mutada para uma sequência de SEQ ID NO: 31 ou 32.

[029] Especificamente, um receptor de antígeno quimérico (CAR) pode ser usado, em que, entre os três motivos de ITAM presentes dentro do domínio CD3ζ (consultar SEQ ID NO: 18) (isto é, um domínio de sinalização conhecido de células T CAR anti-IL13Ra2 (YYB-103)), a sequência de um terceiro motivo de ITAM (isto é, posições 91 a 106 da SEQ ID NO: 18) é mutada de “YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR” para “YLPQSTATKDTYDYVTMQALPPR” (SEQ ID NO: 31); ou entre os três motivos de ITAM presentes dentro do domínio CD3ζ (consultar SEQ ID NO: 18) (isto é, um domínio de sinalização conhecido de células T CAR anti-IL13Ra2 (YYB-103)), a sequência de um terceiro motivo de ITAM (isto é, posições 91 a 105 da SEQ ID NO: 18) é mutada de “YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR” para “YLSLSTATKDTYLPQHMQALPPR” (SEQ ID NO: 32) (consultar a Figura 3).

[030] Em particular, na presente invenção, é preferencial que, em uma terceira região de ITAM do domínio CD3ζ, um primeiro motivo, YxxL (posições 91 a 94 da SEQ ID NO: 18), seja substituído por YxxQ, e um segundo motivo, YxxLHM (posições 102 a 106 de SEQ ID NO: 18), seja substituído por YxYVTM; ou, em uma terceira região de ITAM do domínio CD3ζ, um primeiro motivo, YxxL (posições 91 a 94 da SEQ ID NO: 18), seja substituído por YyyL, e um segundo motivo, YxxL (posições 102 a 105 da SEQ ID NO: 18), seja substituído por YxxQ (em que x e y, cada um, representam qualquer aminoácido).

[031] O polipeptídeo da presente invenção pode conter ainda uma citocina. Por exemplo, o polipeptídeo da presente invenção pode conter IL-21 como uma citocina a ser adicionada. Em particular, é preferencial que a citocina seja unida a um receptor de antígeno quimérico por um peptídeo de autoclivagem.

[032] Como o peptídeo de autoclivagem, por exemplo, o peptídeos 2A conhecidos da SEQ ID NOS: 40 a 43 podem ser usados. O peptídeo de autoclivagem é submetido a uma clivagem pós-traducional, em que a ligação de peptídeo entre uma prolina (P) e uma glice (G) na terminação C é digerida pela clivagem. Portanto, as proteínas localizadas a montante e a jusante do peptídeo de autoclivagem forem expressas independentemente uma da outra.

[033] Consequentemente, quando o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é expresso em uma célula T, a citocina pode ser separada de um receptor de antígeno quimérico (CAR), e a citocina separada pode ser liberada para o lado externo à célula T. As células imunorrelacionadas natas podem ser ativadas pela citocina separada (por exemplo, IL-21) e, assim, o conteúdo de células T CAR menos diferenciadas pode ser aumentado (consultar a Figura 5).

[034] Ou seja, a diferenciação in vitro é impedida devido à expressão de IL-21 durante o processo de preparação de célula T CAR, que resulta em um aumento do teor de células T CAR de memória menos diferenciada, possibilitando, assim, fornecer persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais intensificados de células T CAR, e que resultam adicionalmente na ativação das células imunes natas ao redor do câncer sólido, possibilitando, assim, tratar mais eficientemente o câncer sólido.

[035] O polipeptídeo da presente invenção pode incluir adicionalmente um exodomínio de TGF-βR2, um domínio transmembranar de IL18R e um endodomínio de IL18R, além de um receptor de antígeno quimérico. Em particular, é preferencial que um domínio transmembranar de IL18R seja incluído entre o exodomínio de TGF- βR2 e o endodomínio de IL18R (consultar a Figura 4).

[036] Na presente invenção, é preferencial que o exodomínio de TGF-βR2 seja unido a um receptor de antígeno quimérico por um peptídeo de autoclivagem. Portanto, quando o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é expresso em células T, o polipeptídeo compreendendo um exodomínio de TGF-βR2, um domínio transmembranar de IL18R e um endodomínio de IL18R é separado de um receptor de antígeno quimérico (CAR). O exodomínio de TGF-βR2 do polipeptídeo separado é exposto ao lado externo de células T, o domínio transmembranar de IL18R é localizado na membrana celular de células T, e o endodomínio de IL18R é localizado no citoplasma de células T.

[037] Consequentemente, quando TGF-β, que é uma citocina imunossupressora, está presente fora de células T, TGF-β se liga ao exodomínio de TGF-βR2, ativando, assim, o endodomínio de IL18R. Ou seja, o sinal inibitório de TGF-β (isto é, uma citocina imunossupressora em um microambiente de tumor hostil) é convertido em um sinal de ativação da citocina IL-18 em células T CAR. Portanto, um polipeptídeo, que inclui o exodomínio de TGF-βR2, o domínio transmembranar de IL18R e o endodomínio de IL18R, se torna um receptor de comutação quimérico.

[038] IL-18, que é uma citocina, inibe a expressão de materiais imunossupressores em células T e a diferenciação de células T reguladoras, e intensifica respostas imunes contra células de câncer. Quando os efeitos do agente terapêutico de célula T CAR por IL-18 em tumores sólidos avançados foram examinados, foi confirmado que a expressão de FoxO1 em células T CD4+ foi reduzida por IL-18, e adicionalmente que a expressão de T-bet foi aumentada por IL-18 em células T CD8+.

[039] Por fim, IL-18 mostra um efeito anticâncer excelente em câncer sólido avançado através de T CAR de alto T-bet baixo FoxO1, células T CAR persistentes. Em particular, na presente invenção, um receptor de comutação quimérico, que inclui um exodomínio de TGF-βR2 (posições de aminoácido de 23 a 166; SEQ ID NO: 19), que é um receptor para se ligar a TGF-β (isto é, uma citocina imunossupressora em torno de câncer sólido); e um domínio transmembranar e um endodomínio de IL-18R (posições de aminoácido de 323 a 541; SEQ ID NO: 20), que é um receptor de citocina, foi preparado para ser expresso em células T CAR, alterando, assim, o sinal imunossupressor em um sinal de ativação em células T CAR realizando um uso inverso do microambiente de tumor hostil.

[040] Conforme descrito acima, mesmo um polipeptídeo, que inclui adicionalmente um exodomínio de TGF-βR2, um domínio transmembranar de IL18R e um endodomínio de IL18R no receptor de antígeno quimérico, pode incluir ainda a citocina descrita acima (por exemplo, IL-21).

[041] Ou seja, a citocina descrita acima (por exemplo, IL-21) pode ser unida por um peptídeo de autoclivagem ao endodomínio de IL18R do polipeptídeo, que inclui adicionalmente um exodomínio de TGF-βR2, um domínio transmembranar de IL18R e um endodomínio citoplásmico de IL18R no receptor de antígeno quimérico.

[042] Consequentemente, quando o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é expresso em células T, o polipeptídeo que inclui o exodomínio de TGF- βR2, domínio transmembranar de IL18R e endodomínio de IL18R pode ser separado do receptor de antígeno quimérico (CAR), e adicionalmente, a citocina também pode ser independentemente separada. Portanto, a citocina separada pode ser liberada para o lado externo de células T, o exodomínio de TGF-βR2 é exposto ao lado externo das células T, o domínio transmembranar de IL18R é localizado na membrana celular de células T e o endodomínio de IL18R é localizado no citoplasma de células T.

[043] O polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NOS: 23 a 30 e 34 a 37.

[044] Além disso, a presente invenção se refere a uma célula T CAR, em que o polipeptídeo contendo CAR é expresso como descrito acima.

[045] Além disso, a presente invenção se refere a um vetor de expressão de receptor de antígeno quimérico (CAR), que inclui um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembranar; um domínio coestimulatório; e um domínio de sinalização citoplásmico. Em particular, o vetor de expressão de CAR inclui um ácido nucleico que codifica um CAR, em que o ácido nucleico que codifica um CAR compreende um ácido nucleico que codifica um domínio 4-1BB como o domínio coestimulatório e um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ como o domínio de sinalização, e compreende ainda um ácido nucleico que codifica IL-7Rα ou uma parte da mesma ou um ácido nucleico que codifica IL-2Rβ ou uma parte da mesma entre o ácido nucleico que codifica o domínio 4-1BB e o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ. Em particular, uma parte de IL-7Rα pode ser, por exemplo, uma sequência da SEQ ID NO: 15, e uma parte de IL-2Rβ pode ser, por exemplo, uma sequência da SEQ ID NO: 17.

[046] Na presente invenção, o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ pode ser um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ, em que em uma terceira região de ITAM entre as três ITAMs presentes dentro do domínio CD3ζ, um primeiro motivo, YxxL, e um segundo motivo, YxxLHM, são substituídos. Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ pode ser um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, é substituído por YxxQ; e uma região de segundo motivo, YxxLHM, é substituída por YxYVTM; ou um em que um primeiro motivo, YxxL, é substituído por YyyL, e uma região de segundo motivo, YxxL, é substituída por YxxQ (em que x e y, cada um, representam qualquer aminoácido).

[047] Além disso, o vetor de expressão de CAR da presente invenção pode incluir ainda um ácido nucleico que codifica citocina IL-21. Em particular, o ácido nucleico que codifica citocina IL-21 é unido a um ácido nucleico que codifica um CAR através de um ácido nucleico que codifica um peptídeo de autoclivagem.

[048] Além disso, o vetor de expressão de CAR da presente invenção pode incluir ainda um ácido nucleico que codifica um exodomínio de TGF-βR2, um ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar de IL18R, e um ácido nucleico que codifica um endodomínio de IL18R. Em particular, o ácido nucleico que codifica o exodomínio de TGF-βR2 é unido a um ácido nucleico que codifica um CAR através de um ácido nucleico que codifica um peptídeo de autoclivagem.

[049] Conforme descrito acima, o vetor de expressão de CAR, que inclui um ácido nucleico que codifica um exodomínio de TGF-βR2, um ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar de IL18R e um ácido nucleico que codifica um endodomínio de IL18R, pode incluir ainda um ácido nucleico que codifica citocina IL-21. Em particular, o ácido nucleico que codifica citocina IL-21 é unido a um ácido nucleico que codifica um endodomínio de IL18R através de um ácido nucleico que codifica um peptídeo de autoclivagem.

[050] A presente invenção se refere a uma célula T CAR preparada introduzindo o vetor de expressão de CAR descrito acima.

[051] Além disso, a presente invenção se refere a um agente anticâncer contendo a célula T CAR descrita acima. O agente anticâncer da presente invenção contendo a célula T CAR pode conter ainda um aditivo farmaceuticamente aceitável conforme necessário.

[052] Nos polipeptídeos contendo CAR de acordo com a presente invenção, as células T CAR para vários carcinomas podem ser preparadas alterando o alvo de antígeno de câncer do domínio de ligação ao antígeno conforme necessário. Por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno pode ser preparado como aqueles que se ligam a IL13Rα2, um antígeno associado a uma atividade de angiogênese (antiangiogênese), e antígenos como EGFRvIII, EphA2, αVβ3, Mesotelina e glipicano1. Ou seja, se qualquer aglutinante ou anticorpo alvejando IL-13Ra2, antiangiogênese, EGFRvIII, EphA2, aVβ3, glipicano1 e mesotelina (consultar SEQ ID NOS: 1 a 7 e 33) é introduzido, estas células T CAR podem ser usadas como um agente anticâncer para estes alvos. Portanto, é possível preparar células T CAR que têm um efeito anticâncer contra um carcinoma específico.

[053] No caso de EGFRvIII (isto é, um antígeno de tumor principal expresso em glioblastoma, câncer de pulmão, etc), a fim de reduzir efeitos colaterais de células T CAR que aparecem através de uma ligação não específica, uma taxa de expressão e persistência de CAR em células T CAR foram otimizadas, alterando simultaneamente a sequência-alvo, de modo a minimizar a afinidade de ligação com EGFR tipo selvagem enquanto mantém a especificidade para EGFRvIII.

[054] Durante a alteração das posições 52 a 57 da SEQ ID NO: 3 de STGGYN para DPENDE (uma parte de CDR2 de uma cadeia pesada), da posição 101 da SEQ ID NO: 3 de S para G (uma parte de CDR3 de uma cadeia pesada) e da posição 229 da SEQ ID NO: 3 de V para G (uma parte de CDR3 de uma cadeia leve) na sequência- alvo (SEQ ID NO: 33), uma taxa de expressão e persistência de CAR em células T CAR foram melhoradas usando sequência de sinal de CD8 (SEQ ID NOS: 34 e 35).

[055] A fim de aumentar uma taxa de expressão e persistência de CAR em células T CAR alvejando aVβ3, uma sequência de sinal de luciferase Gaussia princeps ou sequência de sinal de CD8 foi usada (SEQ ID NOS: 36 e 37).

EFEITOS VANTAJOSOS

[056] As células T CAR reveladas na presente invenção têm uma excelente taxa de expressão e persistência; portanto, estas células mostram os efeitos de persistência e efeitos antitumorais no corpo humano, tendo, assim, um efeito terapêutico melhorado contra câncer sólido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[057] A Figura 1 mostra um diagrama ilustrando um processo de tratar eficientemente o câncer sólido por um polipeptídeo contendo CAR de acordo com a presente invenção.

[058] A Figura 2 mostra um diagrama e uma tabela ilustrando um domínio de ligação ao antígeno que pode ser usado para uma plataforma de polipeptídeo contendo CAR de acordo com a presente invenção.

[059] A Figura 3 mostra diagramas ilustrando a introdução de um domínio de sinalização de citocina em células T CAR, de modo a controlar a sinalização tônica de CAR no polipeptídeo contendo CAR de acordo com a presente invenção.

[060] A Figura 4 mostra diagramas ilustrando a introdução de um receptor de comutação quimérico, de modo a converter um sinal imunossupressor em um microambiente de tumor hostil em um sinal de ativação em células T CAR.

[061] A Figura 5 mostra diagramas ilustrando a liberação de citocina IL-21 para fora de células T CAR, de modo a auxiliar na ativação de células imunorrelacionadas natas e aumentar o teor de células T CAR de memória menos diferenciada.

[062] A Figura 6 mostra diagramas ilustrando as estruturas de polipeptídeos contendo CAR de acordo com a presente invenção.

[063] A Figura 7 mostra diagramas ilustrando os peptídeos de autoclivagem usados nos polipeptídeos contendo CAR de acordo com a presente invenção.

[064] A Figura 8 mostra um gráfico e tabelas ilustrando a taxa de crescimento e a viabilidade de células T CAR, que são transformadas com o CAR da presente invenção.

[065] A Figura 9 mostra gráficos e uma tabela ilustrando os resultados de análise da taxa de expressão de CAR de células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, por análise de citometria de fluxo.

[066] A Figura 10 mostra um gráfico e uma tabela ilustrando os resultados de análise da taxa de expressão do receptor de comutação quimérico do exodomínio de TGF-βR2 e do domínio transmembranar e um endodomínio de IL18R de células T CAR, que foram transformados com o CAR da presente invenção, por análise de citometria de fluxo.

[067] A Figura 11 mostra os resultados dos fenótipos do Dia 10 de células T CAR, que foram transformados com o CAR da presente invenção, por análise de citometria de fluxo.

[068] A Figura 12 mostra um gráfico que ilustra a citotoxicidade de células T CAR, que foram transformados com o CAR da presente invenção, confirmada através do ensaio de LDH após 24 horas de cocultura com células de U87 (linhagem celular de câncer de cérebro humano) e células-alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais); e uma tabela, que ilustra a pureza e a viabilidade de células T CAR usadas em um teste de citotoxicidade de T CAR.

[069] A Figura 13 mostra gráficos ilustrando os resultados de análise de toxicidade espontânea de células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, após 24 horas ou 96 horas.

[070] As Figuras 14 a 16, cada, mostram gráficos e uma tabela ilustrando os resultados de análise de alterações em uma taxa de expressão de CAR de células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, após 24 horas (Figura 14), 48 horas (Figura 15) e 96 horas (Figura 16) de cocultura das células T

CAR com células de U87 (linhagem celular de câncer de cérebro humano) e células- alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais), por análise de citometria de fluxo.

[071] A Figura 17 mostra gráficos e uma tabela ilustrando os resultados de análise de alterações na taxa de expressão do receptor de comutação quimérico do exodomínio de TGF-βR2 e domínio transmembranar e um endodomínio de IL-18R de células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, após 24 horas de cocultura das células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, com células de U87 (linhagem celular de câncer de cérebro humano) e células-alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais), por análise de citometria de fluxo.

[072] A Figura 18 mostra gráficos ilustrando os resultados de comparação de produção de citocina de IFN-γ após 24 horas e 48 horas de cocultura de células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, com células de U87 (linhagem celular de câncer de cérebro humano) e células-alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais).

[073] A Figura 19 mostra gráficos ilustrando os resultados de comparação de produção de citocina IL-21 após 24 horas e 48 horas de cocultura de células T CAR, que foram transformadas com o CAR da presente invenção, com células de U87 (linhagem celular de câncer de cérebro humano) e células-alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais).

[074] A Figura 20 mostra um gráfico e tabelas ilustrando a taxa de crescimento e viabilidade de células T CAR, que foram transformadas com um receptor de antígeno quimérico (CAR), quando o antígeno de câncer é EGFRvIII, em que a taxa de expressão e persistência de CAR em células T CAR foram otimizadas, enquanto altera simultaneamente a sequência-alvo, de modo a minimizar a afinidade de ligação para EGFR tipo selvagem, em que a especificidade para EGFRvIII é mantida de modo a reduzir os efeitos colaterais de células T CAR que aparecem através de ligação não específica (YYB105, no 13, no 14) (consultar SEQ ID NOS: 39, 34, 35); e um gráfico e tabelas ilustrando a taxa de crescimento e viabilidade de células T CAR, que foram transformadas com um receptor de antígeno quimérico (CAR), quando o antígeno de câncer é aVβ3, em que a taxa de expressão de CAR em células T CAR foi otimizado (YYB107, no 15, no 16) (consultar SEQ ID NOS: 38, 36, 37).

[075] A Figura 21 mostra um gráfico ilustrando a taxa de expressão de CAR em células T CAR, que foram transformadas com um receptor de antígeno quimérico (CAR), quando o antígeno de câncer é EGFRvIII, em que a taxa de expressão de CAR em células T CAR foi otimizada, enquanto altera simultaneamente a sequência-alvo de modo a minimizar a afinidade de ligação para EGFR tipo selvagem, em que a especificidade para EGFRvIII é mantida de modo a reduzir os efeitos colaterais de células T CAR que aparecem através da ligação não específica (YYB105, n o 13, no 14) (consultar SEQ ID NOS: 39, 34, 35); e um gráfico ilustrando a taxa de expressão de CAR em células T CAR, que foram transformadas com um receptor de antígeno quimérico (CAR), quando o antígeno de câncer é aVβ3, em que a taxa de expressão de CAR em células T CAR foi otimizada (YYB107, n o 15, no 16) (consultar SEQ ID NOS: 38, 36, 37). [MELHOR MODO PARA EXECUTAR A INVENÇÃO]

[076] Doravante no presente documento, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. Entretanto, deve ser observado que os seguintes Exemplos são apenas para ilustrar a presente invenção, e o espírito e escopo técnico da presente invenção não são limitados em nenhum sentido. Ademais, deve ser entendido que a presente invenção não é limitada à disposição e meios precisos das modalidades mostrados nos desenhos, que são citados como referência. EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE PLATAFORMA DE RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR) INOVADORA PARA TRATAMENTO EFICIENTE ATRAVÉS DE LIGAÇÃO ESPECIFICAMENTE A IL13RΑ2 SUPEREXPRESSA EM

CÉLULAS DE CÂNCER SÓLIDO

[077] Em relação à IL13 humana (P35225.1), CD3 humano (P20963-1), CD8A humano (P01732), CD28 humano (P10747), CD3ζ humano (P20963), 41BB humano

(Q07011), IL7RA (P16871), IL2RB (P14784), TGFR2 (P37173), IL18R (Q13478), IL21 (Q9HBE4), IL2 (P60568), T2A, P2A e sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), polipeptídeos contendo CAR foram preparados usando um polipeptídeo contendo antígeno quimérico (consultar SEQ ID NOS: 23 a 30 e 34 a 37; e no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 e no 12 da Figura 6) o vetor de expressão consistindo em DNA sintético otimizado por códon, usando literatura científica e bancos de dados disponíveis publicamente (consultar as Figuras 6 e 7).

[078] Especificamente, as células T, em que um polipeptídeo contendo CAR é expresso, podem ser preparadas através da preparação de um vetor que expressa um polipeptídeo contendo CAR por meio de conjugação de DNA sintético a um vetor de expressão de retrovírus de MFG digerido com XhoI/NotI, seguido pela transdução do vetor nas células T.

[079] A estrutura completa do polipeptídeo no 1 da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana (consultar YYB-103 da Publicação Internacional de PCT no WO 2017/023138), três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR (consultar YYB-103 da Publicação Internacional de PCT no WO 2017/023138), uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4-1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de citocina IL-7RA (posições de aminoácido de 265 a 328; SEQ ID NO: 15), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 31), T2A, uma sequência de sinal de CD8A (sequência líder), um receptor de comutação quimérico que compreende exodomínio de TGF-βR2 (posições de aminoácido de 23 a 166; SEQ ID NO: 19) e um domínio transmembranar e um endodomínio de IL-18R (isto é, um receptor de citocina) (posições de aminoácido de 323 a 541; SEQ ID NO: 20), P2A,

uma sequência de sinal de IL2 humana (sequência líder), uma sequência de IL-21 (posições de aminoácido de 23 a 155; SEQ ID NO: 21) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar polipeptídeo contendo CAR no 1 da Figura 6; e Figura 7).

[080] A estrutura completa do polipeptídeo contendo CAR no 2 da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4- 1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de uma citocina IL-7RA (posições de aminoácido de 265 a 328; SEQ ID NO: 15), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 31), T2A, uma sequência de sinal de CD8A (sequência líder), um receptor de comutação quimérico que compreende exodomínio de TGF-βR2 (posições de aminoácido de 23 a 166; SEQ ID NO: 19) e um domínio transmembranar e um endodomínio de IL-18R (isto é, um receptor de citocina) (posições de aminoácido de 323 a 541; SEQ ID NO: 20) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar polipeptídeo contendo CAR no 2 da Figura 6; e Figura 7).

[081] A estrutura completa do polipeptídeo contendo CAR no 5 da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4- 1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de uma citocina IL-7RA (posições de aminoácido de 265 a 328; SEQ ID NO: 15), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 31), T2A, uma sequência de sinal de IL2 humana, uma IL-21 (posições de aminoácido de 23 a 155; SEQ ID NO: 21) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar polipeptídeo contendo CAR no 5 da Figura 6; e Figura 7).

[082] A estrutura completa do polipeptídeo contendo CAR no 6 da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4- 1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico de uma citocina IL-7RA (posições de aminoácido de 265 a 328; SEQ ID NO: 15), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 31) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar polipeptídeo contendo CAR no 6 da Figura 6; e Figura 7).

[083] A estrutura completa de polipeptídeo no 7 contendo de CAR da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4-1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de uma citocina IL2Rβ (posições de aminoácido de 266 a 369; SEQ ID NO: 17), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ

ID NO: 32), T2A, uma sequência de sinal de CD8A, um receptor de comutação quimérico que compreende um exodomínio de TGF-βR2 (posições de aminoácido de 23 a 166; SEQ ID NO: 19) e um domínio transmembranar e um endodomínio de IL- 18R (isto é, um receptor de citocina) (posições de aminoácido de 323 a 541; SEQ ID NO: 20), P2A, uma sequência de sinal de IL2 humana (sequência líder), uma sequência de IL-21 (posições de aminoácido de 23 a 155; SEQ ID NO: 21) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar no 7 da Figura 6; e Figura 7).

[084] A estrutura completa do polipeptídeo no 8 contendo CAR da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4- 1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de uma citocina IL2Rβ (posições de aminoácido de 266 a 369; SEQ ID NO: 19), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 32), T2A, uma sequência de sinal de CD8A, um receptor de comutação quimérico que compreende um exodomínio de TGF-βR2 (posições de aminoácido de 23 a 166; SEQ ID NO: 19) e um domínio transmembranar e um endodomínio de IL-18R (isto é, um receptor de citocina) (posições de aminoácido de 323 a 541; SEQ ID NO: 20) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar polipeptídeo contendo CAR no 8 da Figura 6; e Figura 7).

[085] A estrutura completa do polipeptídeo no 11 contendo CAR da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4- 1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de uma citocina IL2Rβ (posições de aminoácido de 266 a 369; SEQ ID NO: 17), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 32), T2A, uma sequência de sinal de IL2 humana, uma IL-21 (posições de aminoácido de 23 a 155; SEQ ID NO: 21) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar polipeptídeo contendo CAR no 11 da Figura 6; e Figura 7).

[086] A estrutura completa de polipeptídeo no 12 contendo CAR da Figura 6 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP), uma sequência de proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico através do aumento da solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8α humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4- 1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico clivado de uma citocina IL2Rβ (posições de aminoácido de 266 a 369; SEQ ID NO: 17), um CD3ζ mutante (posições 91 a 113 da SEQ ID NO: 18 são mutados a uma sequência da SEQ ID NO: 32) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI (consultar no 12 da Figura 6; e Figura 7).

[087] As sequências inteiras de polipeptídeos contendo CAR n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 e no 12 são mostradas nas SEQ ID NOS: 23 a 30.

[088] Os fragmentos de CAR de gene finalmente preparados foram conjugados ao vetor de expressão de retrovírus de MFG digerido com XhoI/NotI (Emtage PC et al., Clin Cancer Res, 2008, 14:8.112 a 8.122). Neste Exemplo, a fim de comparar a atividade de receptores de antígeno quimérico, YYB103 (SEQ ID NO: 22) foi preparado adicionalmente. EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS

COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES

[089] Os clones de PG13 expressando CAR de alta titulação foram preparados de modo que células Phoenix-Ampho e Phoenix-Eco fossem transfectadas de modo transitório com o vetor de expressão retroviral preparado no Exemplo 1 e, então, estoques de vetor livre de células foram preparados a partir das células Phoenix- Ampho e Phoenix-Eco transfectadas através da transfecção de células de PG13.

[090] Para monoclones de alta titulação, células de PG13/n o 1, PG13/no 2, PG13/no 5, PG13/no 6, PG13/no 7, PG13/no 8, PG13/no 11 ou PG13/no 12 foram manchadas usando um anticorpo monoclonal anti-IL-13 (BD Pharmingen), e estes clones únicos foram isolados usando uma citometria de fluxo. Os clones de PG13/n o 1, PG13/no 2, PG13/no 5, PG13/no 6, PG13/no 7, PG13/no 8, PG13/no 11 ou PG13/no 12 foram preparados pela segunda subclonagem de acordo com o método de diluição limitante. Estes subclones mostraram estavelmente alta expressão de CAR e foram selecionados pela capacidade de transdução eficiente no sangue periférico.

[091] O grau de transdução de células de PG13/no 1, PG13/no 2, PG13/no 5, PG13/no 6, PG13/no 7, PG13/no 8, PG13/no 11 ou PG13/no 12, que foram transduzidas usando um anticorpo monoclonal anti-IL-13 (BD Pharmingen), foi analisado usando uma citometria de fluxo. Os sobrenadantes das células transduzidas de PG13/no 1, PG13/no 2, PG13/no 5, PG13/no 6, PG13/no 7, PG13/no 8, PG13/no 11 ou PG13/no 12 continha retrovírus, e os sobrenadantes foram coletados para modificação genética de células T.

[092] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram separadas usando centrifugação através da adição do sangue total obtido a partir de um doador humano saudável em Ficoll Paque (GE Healthcare). As PBMCs separadas foram cultivadas adicionando um anticorpo monoclonal anti-CD3 (eBioscience) a uma concentração de 100 ng/ml sob a condição de IL-2 humana (Novartis) a uma concentração de 100 IU/ml para ativar a fração de célula T (BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79 a 84). Dois a três dias após o cultivo, a maioria das células eram células T e incluíam células exterminadoras naturais a uma porcentagem de 0% a 2%.

Dois a três dias após a etapa de ativação, as células T foram submetidas à transdução duas vezes ao longo de dois dias usando o sobrenadante retroviral e lavadas e, então, proliferaram por quatro a sete dias em um frasco. As células foram cultivadas em um dispositivo de plataforma de agitação (um sistema biorreator WAVE) por 12 a 28 dias. IL-2 foi mantida a uma concentração de 100 IU/ml. As células T modificadas como tal foram usadas para um experimento de análise. EXEMPLO EXPERIMENTAL 1: VERIFICAÇÃO DE TAXA DE

CRESCIMENTO E VIABILIDADE DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[093] Para as células T preparadas no Exemplo 2, o número de células foi contado para confirmar a taxa de crescimento e a viabilidade de T CAR, e os resultados são mostrados na Figura 8.

[094] O número de células e a taxa de crescimento de todos os grupos (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) mostram ser superiores àqueles do grupo de controle (isto é, YYB103) dependendo do dia da semana, as células mostraram crescer rapidamente a partir do Dia 12 de cultura, e a viabilidade também mostrou ser 90% ou superior (consultar a Figura 8). EXEMPLO EXPERIMENTAL 2: VERIFICAÇÃO DE TAXA DE

EXPRESSÃO DE CAR NA SUPERFÍCIE DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES MÉTODO EXPERIMENTAL (ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO)

[095] Para a citometria de fluxo (> 30.000 eventos), um dispositivo BD LSRII (Becton Dickinson) e software BD FACSDiva (Becton Dickinson) foram usados. Especificamente, as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de albumina do soro bovino antes da adição de um anticorpo monoclonal de IL-13 anti- humano conjugado com PE (BD Pharmingen) ao mesmo. Após a lavagem, as células foram reagidas com cada anticorpo a 4 ºC por 30 minutos em um estado em que a luz foi bloqueada, e lavadas uma vez, e em seguida, a taxa de expressão de CAR na superfície de células T transduzidas foi verificada.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[096] A fim de confirmar se os 8 tipos de polipeptídeos contendo CAR específicos para IL13Rα2 preparados no Exemplo 2 (no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) foram expressos na superfície de célula T, a cultura de célula T foi realizada por 28 dias de acordo com o Exemplo 2 e, então, a análise citométrica de fluxo foi realizada de acordo com o método experimental.

[097] Como resultado da análise, conforme mostrado na Figura 9, a taxa de expressão dos receptores de antígeno quimérico expressos na superfície de célula de células T vivas mostrou estar na faixa de 24,5% a 84,2%, e a expressão de receptores de antígeno quimérico específicos para IL13Rα2 foi mantida estavelmente por 4 semanas, sem ativação ou transdução adicional de células T (consultar a Figura 9). EXEMPLO EXPERIMENTAL 3: VERIFICAÇÃO DE TAXAS DE

EXPRESSÃO DE RECEPTOR DE COMUTAÇÃO QUIMÉRICO DE EXODOMÍNIO DE TGF-ΒR2 E DOMÍNIO TRANSMEMBRANAR E UM ENDODOMÍNIO DE IL-18R

NA SUPERFÍCIE DE CÉLULA DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES MÉTODOS EXPERIMENTAIS (ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO)

[098] Para a citometria de fluxo (> 30.000 eventos), um dispositivo BD LSRII (Becton Dickinson) e software BD FACSDiva (Becton Dickinson) foram usados. Especificamente, as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de albumina do soro bovino antes da adição de um anticorpo conjugado com fluoresceína de TGF-βR2 humano (FAB2411F) (BD Pharmingen) ao mesmo. Após a lavagem, as células foram reagidas com cada anticorpo a 4 °C por 30 minutos em um estado em que a luz foi bloqueada e lavadas uma vez, e em seguida, as taxas de expressão de receptor de comutação quimérico do exodomínio de TGF-βR2 e domínio transmembranar e um endodomínio de IL-18R na superfície de célula das células T transduzidas foram verificadas.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[099] Para confirmar se os receptores de comutação quiméricos de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R foram expressos na superfície de célula de células T CAR preparadas no Exemplo 2 (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12), a cultivação de célula T foi realizada por 14 dias de acordo com o Exemplo 2 e, então, a análise citométrica de fluxo foi realizada de acordo com o método experimental. Como resultado da análise, as taxas de expressão dos receptores de comutação quiméricos do exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R na superfície de célula de células T vivas mostraram ser cerca de 85% (consultar a Figura 10). EXEMPLO EXPERIMENTAL 4: VERIFICAÇÃO DE FENÓTIPOS NA

SUPERFÍCIE DE CÉLULA DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES MÉTODOS EXPERIMENTAIS (ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO)

[0100] Para a citometria de fluxo (> 30.000 eventos), um dispositivo BD LSRII (Becton Dickinson) e um software a BD FACSDiva (Becton Dickinson) foram usados. Especificamente, as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de albumina do soro bovino antes da adição de um CD45RA Ab conjugado com FITC (HI100) (Biolegend), um CCR7Ab conjugado com PE (G043H7) (Biolegend) e um CD62L Ab conjugado com PE-Cy7 (DREG-56) (Biolegend) ao mesmo. Após a lavagem, as células foram reagidas com cada anticorpo a 4 °C por 30 minutos em um estado em que a luz foi bloqueada e lavadas uma vez, e em seguida, o teor de células T CAR de memória menos diferenciada e fenótipos CCR7 +CD45RA+CD62L+ na superfície de células T transduzidas foram verificados.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0101] Para confirmar o teor das células T CAR de memória menos diferenciada na superfície de célula de células T CAR preparadas no Exemplo 2 (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12), a cultivação de célula T foi realizada por 10 dias de acordo com o Exemplo 2 e, então, a análise citométrica de fluxo foi realizada de acordo com o método experimental. Como resultado da análise, o teor de células T CAR de memória menos diferenciada mostrando fenótipos CCR7 +CD45RA+CD62L+, que foram expressos nas células T vivas, em comparação com uma amostra não transduzida (isto é, um grupo de controle) por 5% ou mais, e em comparação com YYB103 (isto é, a amostra transduzida, grupo de controle de T CAR) por 10% ou mais, na superfície de todos os grupos de células T CAR preparadas no Exemplo 2 (no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12), foi confirmado (consultar a Figura 11). EXEMPLO EXPERIMENTAL 5: VERIFICAÇÃO DE CITOTOXICIDADE

DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO

QUIMÉRICO INOVADORES CONTRA LINHAGEM CELULAR DE GLIOMA EM QUE IL13RΑ2 É SUPEREXPRESSA

MÉTODOS EXPERIMENTAIS

[0102] A fim de medir a citotoxicidade de células T CAR específicas para IL13Rα2 preparadas no Exemplo 2 (no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12), o ensaio de citotoxicidade foi realizado usando um kit de LDH (Promega). Especificamente, as células T CAR (células efetoras) foram usadas 10 dias após a ativação das células com um Ab anti-CD3, e as células T CAR (tendo uma taxa de expressão de CAR de 20% a 40%) foram adicionadas a uma placa de 6 poços a uma razão de 1:2, em que efetora:alvo foi de 1×106 células: 2×106 células e reagidas a 37 °C por 24 horas. Como as células-alvo usadas, as células de U87 (linhagem celular de câncer de cérebro humano expressando IL13Rα2) e células de 293FT (o grupo de controle para células normais) foram usadas.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0103] Uma análise foi realizada para examinar se as células T CAR específicas para IL13Rα2 preparadas na presente invenção podem exterminar eficientemente as células-alvo de câncer (U87 expressando IL13Rα2). O método usado foi de modo em que células-alvo de câncer (U87 expressando IL13Rα2) e células normais (293FT) descritas acima foram cultivadas juntamente com cada uma das células T CAR ativadas e a citotoxicidade foi comparada e analisada. Conforme mostrado na Figura 12, todas as células T CAR preparadas de acordo com a presente invenção mostraram um efeito superior por 50% a 70% de indução da morte da célula-alvo de câncer (U87) em comparação com células T ativadas não transduzidas. Em particular, T CAR n o 5, no 6 e no 11 da presente invenção mostraram alta citotoxicidade. Além disso, as células T CAR (no 1, no 2, no 5 e no 6) contendo IL-7Rα exibiram citotoxicidade geral superior em comparação com células T CAR (no 7, no 8, no 11 e no 12) contendo IL-2Rβ.

[0104] A partir do resultado experimental em que células de 293FT, que não expressam IL13Rα2, foram usadas como o grupo de controle para células normais, como um objetivo a ser comparado com as células-alvo, foi confirmado que as células T CAR específicas para IL13Rα2 mostraram citotoxicidade muito fraca (2% a 4%). Este resultado mostra que os receptores de antígeno quimérico usados neste experimento se ligam especificamente a IL13Rα2.

[0105] Através deste Exemplo Experimental, constatou-se que células T de receptor de antígeno quimérico específicas para IL13Rα2 não mostram citotoxicidade a uma célula normal (293FT) e exterminam significativamente células-alvo de câncer (U87), que expressam IL13Rα2.

[0106] A Figura 13 mostra os resultados em que a citotoxicidade das células T CAR, que foram transformadas com o receptor de antígeno quimérico (CAR) da presente invenção, foi confirmada através de ensaio de LDH após 24 horas ou 96 horas sem cocultura com células-alvo. Visto que a toxicidade espontânea de YYB103 é superior àquela dos outros grupos, espera-se que os 8 grupos mostrem citotoxicidade superior em comparação com YYB103 na cocultura com células de U87, e é esperado que as células T CAR (no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12), que foram transformadas com o receptor de antígeno quimérico (CAR) da presente invenção, tenham uma vantagem comparativa em termos de segurança e estabilidade. EXEMPLO EXPERIMENTAL 6: VERIFICAÇÃO DE ALTERAÇÕES NA TAXA DE EXPRESSÃO DE CAR QUANDO CÉLULAS T CAR, QUE FORAM

TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES, SÃO COCULTIVADAS COM LINHAGEM CELULAR DE GLIOMA

HUMANO EM QUE IL13RΑ2 É SUPEREXPRESSA

MÉTODOS EXPERIMENTAIS

[0107] A fim de verificar as alterações na taxa de expressão de CAR quando as células T CAR preparadas no Exemplo 2 (no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) são cocultivadas com a linhagem celular de glioma humano em que IL13Rα2 é superexpressa, as células T CAR (células efetoras) que têm uma taxa de expressão de CAR de 20% a 40% foram usadas 10 dias após a ativação das células com um Ab anti-CD3. As células T CAR foram adicionadas a uma placa de 6 poços a uma razão de 1:2, em que efetora:alvo foi de 1×106 células: 2×106 células e reagidas a 37 °C por 24, 48 e 96 horas. À amostra, que foi reagida por 96 horas, foram adicionadas 2×10 6 células das células-alvo após 48 horas, e um dispositivo BD LSRII (Becton Dickinson) e um software BD FACSDiva (Becton Dickinson) foram usados para citometria de fluxo (> 30.000 eventos). Especificamente, as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de albumina do soro bovino antes da adição de um anticorpo monoclonal de IL-13 anti-humano conjugado com PE (BD Pharmingen) ao mesmo. Após a lavagem, as células foram reagidas com cada anticorpo a 4 °C por 30 minutos, em um estado em que a luz foi bloqueada, e lavadas uma vez, e em seguida, as alterações na taxa de expressão de CAR foram verificadas.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0108] A fim de confirmar as alterações na taxa de expressão de CAR quando os 8 tipos de células T CAR específicas para IL13Rα2 preparadas no Exemplo 2 (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) são cocultivadas com linhagem celular de glioma humano em que IL13Rα2 é superexpressa, as células T foram cultivadas por 10 dias e, então, a análise citométrica de fluxo foi realizada de acordo com o método experimental de acordo com o Exemplo 2. Como resultado da análise, conforme mostrado na Figura 14, as células T CAR que foram cocultivadas com células de U87 (linhagem celular de glioma humano) por 24 horas mostraram uma alteração menor na expressão de CAR em todos os 8 grupos em comparação com a de YYB103 (Figura 14).

[0109] Em cocultura com células de U87 (linhagem celular de glioma humano) por 48 horas, a alteração na expressão de CAR mostrou ser menor do que a de YYB103 em todos os 8 grupos (Figura 15).

[0110] Em cocultura com células de U87 (linhagem celular de glioma humano) por 96 horas, a alteração na expressão de CAR mostrou ser menor do que a de YYB103 em 5 grupos (isto é, no 1, no 2, no 5, no 6 e no 7) (Figura 16). A expressão de CAR de YYB103 após a cocultura com células de U87 (linhagem celular de glioma humano) por 96 horas mostrou ser insignificativa (Figura 16).

[0111] As alterações na expressão de CAR durante a cocultura com a linhagem celular de glioma humano, em que IL13Rα2 é superexpressa, as alterações na taxa de expressão de CAR sem cocultura com células-alvo ou durante a cocultura com células de 293FT (que foram usadas como o grupo de controle para células normais) podem confirmar que se espera que o receptor de antígeno quimérico (CAR) de acordo com a presente invenção mostre persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR em um microambiente de tumor hostil, ao passo que reduz simultaneamente a toxicidade. EXEMPLO EXPERIMENTAL 7: VERIFICAÇÃO DE ALTERAÇÕES NA TAXA DE

EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE COMUTAÇÃO QUIMÉRICO DE EXODOMÍNIO E DOMÍNIO TRANSMEMBRANAR DE TGFΒR2 E UM ENDODOMÍNIO DE IL-18R

QUANDO CÉLULAS T CAR QUE FORAM TRANSFORMADAS COM

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES SÃO COCULTIVADAS COM A LINHAGEM CELULAR DE GLIOMA HUMANO, EM QUE IL13RΑ2 É

SUPEREXPRESSA MÉTODOS EXPERIMENTAIS

[0112] A fim de verificar as alterações na taxa de expressão do receptor de comutação quimérico de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R quando células T CAR preparadas no Exemplo 2 (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) são cocultivadas com a linhagem celular de glioma, em que IL13Rα2 é superexpressa, as células T CAR (células efetoras) que têm uma taxa de expressão de CAR de 20% a 40% foram usadas 10 dias após a ativação das células com um Ab anti-CD3. As células T CAR foram adicionadas a uma placa de 6 poços a uma razão de 1:2, em que efetora:alvo foi de 1×10 6 células: 2×106 células e reagidas a 37 °C por 24, 48 e 96 horas. À amostra, que foi reagida por 96 horas, foram adicionadas 2×106 células das células-alvo após 48 horas, e um dispositivo BD LSRII (Becton Dickinson) e um software BD FACSDiva (Becton Dickinson) foram usados para citometria de fluxo (> 30.000 eventos). Especificamente, as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de albumina do soro bovino antes da adição de um anticorpo conjugado com fluoresceína de TGF-βR2 anti- humano (FAB2411F) (BD Pharmingen) ao mesmo. Após a lavagem, as células foram reagidas com cada anticorpo a 4 °C por 30 minutos, em um estado em que a luz foi bloqueada, e lavadas uma vez, e em seguida, as alterações na taxa de expressão do receptor de comutação quimérico de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R foram verificadas.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0113] A fim de confirmar as alterações na taxa de expressão do receptor de comutação quimérico de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R quando os 8 tipos de CAR específicos para IL13Rα2 preparados no Exemplo 2 (no 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) são cocultivadas com linhagem celular de glioma humano em que IL13Rα2 é superexpressa, as células T foram cultivadas por 10 dias, de acordo com o Exemplo 2 e, então, a análise citométrica de fluxo foi realizada de acordo com o método experimental.

[0114] Como resultado da análise, conforme mostrado na Figura 17, a expressão dos receptores de comutação quiméricos de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R nos 4 grupos (no 1, no 2, no 7 e no 8) após 24 horas de cocultura mostrou uma tendência de uma redução nos grupos cocultivados com linhagem celular de glioma humano, células de U87 em comparação com aqueles cultivados apenas com células T CAR, porém, a taxa de expressão média foi de 30% (Figura 17). A expressão dos receptores de comutação quiméricos de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R nos 4 grupos (no 1, no 2, no 7 e no 8) após 48 horas de cocultura mostrou uma tendência de uma redução nos grupos cocultivados com células de U87 em comparação com aqueles cultivados apenas com células T CAR, porém, a taxa de expressão média foi de 25%. A expressão dos receptores de comutação quiméricos de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R nos 4 grupos (no 1, no 2, no 7 e no 8) após 72 horas de cocultura mostrou uma tendência de uma redução nos grupos cocultivados com linhagem celular de glioma humano, células de U87 em comparação com aqueles cultivados apenas com células T CAR, porém, a taxa de expressão média foi de 15%. Embora as alterações na taxa de expressão tenham sido maiores em comparação com uma sem cocultura com células-alvo ou a cocultura com células de 293FT (que foram usadas como o grupo de controle para células normais), pela confirmação dos resultados da taxa de expressão do receptor de comutação quimérico de exodomínio e domínio transmembranar de TGFβR2 e um endodomínio de IL-18R contra linhagem celular de glioma humano, U87 em que IL13Rα2 é superexpressa, espera-se que o receptor de antígeno quimérico (CAR) de acordo com a presente invenção mostre persistência excelente in vivo e efeitos antitumorais de células T CAR em um microambiente de tumor hostil. EXEMPLO EXPERIMENTAL 8: VERIFICAÇÃO DE PRODUÇÃO DE CITOCINA (IFN-Γ) POR CÉLULAS T, QUE FORAM TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES, CONTRA CÉLULAS-

ALVO MÉTODOS EXPERIMENTAIS

[0115] A fim de confirmar a produção de citocina (IFN-γ) após 24 horas e 48 horas de cocultura entre as células T CAR preparadas no Exemplo 2 (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) e linhagem celular de glioma humano (células de U87) e células-alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais), as células T CAR (células efetoras) em que a taxa de expressão de CAR estava na faixa de 20% a 40% foram usadas 10 dias após a ativação das células com um Ab anti-CD3. As células T CAR foram adicionadas a uma placa de 6 poços a uma razão, em que efetora:alvo foi de 1×106 células: 2×106 células, 6 ml de um meio de cultura foram adicionados por poço, e as células reagidas a 37 °C por 24 horas. 100 μl do sobrenadante foram coletados e transferidos para um tubo de 1,5 ml, as células foram cultivadas adicionalmente até 48 horas, e 100 μl do sobrenadante foram coletados a partir da cultura da mesma maneira.

[0116] O experimento de análise de IFN-γ foi realizado da seguinte forma, de acordo com as instruções do fabricante do analisador ELISA (R&D systems). 3 ml do diluente calibrador RD6-21 foram adicionados a um recipiente padrão de IFN-γ e misturados em um agitador por 15 minutos, dispensados em uma quantidade de 1 ml por tubo de 1,5 ml para preparar dois “padrão 1”. 500 μl foram tomados de 1 ml do “padrão 1” dispensados e foram submetidos à diluição serial para preparar até “padrão 7”. A fim de preparar brancos, 500 μl do meio de cultura e 500 μl do diluente calibrador RD6-21 foram misturados.

[0117] A fim de diluir as amostras por 1/20, 190 μl do diluente calibrador RD6-21 foram adicionados em cada um de novos tubos de 1,5 ml, tantos quanto o número de amostras. As amostras de ensaio foram, cada uma, preparadas a um volume total de 200 μl coletando 10 μl do sobrenadante de cada amostra. Para preparar um tampão de lavagem, 500 ml de água destilada e 20 ml de concentrado de tampão de lavagem foram bem misturados em um recipiente de armazenamento de 500 ml.

[0118] O diluente de ensaio RD1-51 (corante azul) em uma quantidade de 100 μl, cada, foi adicionado à microplaca de IFN-γ para cada poço de “padrão 1” a “padrão 7”, branco e amostras. Após a adição de 100 μl, cada, de branco, padrões e amostras preparados acima, um vedante de placa foi fixado à mesma e reagidos à temperatura ambiente por 2 horas. Após a reação, a solução de reação foi descartada, e 400 μl do tampão de lavagem preparado foram adicionados à mesma, e os poços foram lavados 4 vezes. 200 μl de conjugado de IFN-γ foram adicionados a cada poço, um vedante de placa foi fixado à mesma, e a reação foi realizada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi descartada, e os poços foram lavados 4 vezes usando 400 μl do tampão de lavagem. Após a mistura do reagente de cor A: B em uma razão de 1:1, a mistura foi adicionada em uma quantidade de 200 μl por poço, um vedante de placa foi fixado à mesma, a luz foi bloqueada com folha metálica, e a reação foi realizada à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a reação, 50 μl da solução de parada foram adicionados a cada poço e medidos a 450 nm em 30 minutos.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0119] YYB103 mostrou secretar uma quantidade relativamente alta de IFN-γ em comparação com outras amostras. Quando as células T CAR foram cultivadas na presença de células de U87 de glioma humano, T CAR (no 1, no 2, no 5 e no 6) contendo um domínio de sinalização de IL-7Rα mostraram conter mais IFN-γ em comparação com T CAR (no 7, no 8, no 11 e no 12) contendo um domínio de sinalização de IL-2Rβ. Os resultados entre as amostras após 24 horas e 48 horas de incubação mostraram padrões similares (Figura 18).

[0120] Conforme mostrado na Figura 12, quando a citotoxicidade foi confirmada através do ensaio de LDH após 24 horas de cocultura entre as T CAR (que foram transformadas com o receptor de antígeno quimérico (CAR) da presente invenção), células de U87 (linhagem celular de glioma humano), e células-alvo de 293FT (que são usadas como um grupo de controle para células normais), os 8 grupos mostraram capacidades similares de exterminar células-alvo. Entretanto, considerando que a produção de IFN-γ foi pequena e, portanto, as células-alvo poderiam ser exterminadas sem efeitos adversos causados por citocinas (síndrome de liberação de citocina, CRS), em termos de segurança, espera-se que o efeito do agente terapêutico de célula T CAR tenha menos efeitos colaterais enquanto apresenta efeitos terapêuticos excelentes. EXEMPLO EXPERIMENTAL 9: VERIFICAÇÃO DE PRODUÇÃO DE CITOCINA (IL-21) POR CÉLULAS T CAR, QUE FORAM TRANSFORMADAS COM

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO INOVADORES MÉTODOS EXPERIMENTAIS

[0121] A fim de confirmar a produção de citocina (IL-21) após 24 horas e 48 horas de cocultura entre as células T CAR preparadas no Exemplo 2 (n o 1, no 2, no 5, no 6, no 7, no 8, no 11 ou no 12) e células de U87 de glioma humano e células-alvo de 293FT (que foram usadas como um grupo de controle para células normais), as células T CAR (células efetoras) em que a taxa de expressão de CAR estava na faixa de 20% a 40% foram usadas 10 dias após a ativação das células com um Ab anti-CD3. As células T CAR foram adicionadas a uma placa de 6 poços a uma razão, em que efetora:alvo foi de 1×106 células: 2×106 células, 6 ml de um meio de cultura foram adicionados por poço, e as células foram reagidas a 37 °C por 24 horas. Então, 100 μl do sobrenadante foram coletados e transferidos para um tubo de 1,5 ml, as células foram cultivadas adicionalmente até 48 horas, e 100 μl do sobrenadante foram coletados a partir da cultura da mesma maneira.

[0122] O experimento de análise de IL-21 foi realizado da seguinte forma, de acordo com as instruções do fabricante do analisador ELISA (Invitrogen). 100 μl de um anticorpo de captura foram adicionados a cada poço de uma placa de ELISA de 96 poços e reagidos a 4 °C de um dia para o outro. Após a reação, os poços foram lavados 3 vezes usando 250 μl de tampão de lavagem. O diluente de ELISA/ELISASPOT foi adicionado a uma quantidade de 200 μl por poço e reagido à temperatura ambiente por uma hora.

[0123] Após a reação, 100 μl, cada, do branco preparado, padrão de citocina IL- 21 e amostras foram adicionados ao mesmo, e o diluente de ELISA/ELISASPOT foi adicionado em uma quantidade de 100 μl por poço, e um vedante de placa foi fixado à mesma e a reação foi realizada à temperatura ambiente por duas horas. Após a reação, os poços foram lavados 3 vezes usando 250 μl de tampão de lavagem. 100 μl de um anticorpo de detecção foram adicionados a cada poço, e um vedante de placa foi fixado à mesma e a reação foi realizada à temperatura ambiente por uma hora. Após a reação, os poços foram lavados 3 vezes usando 250 μl de tampão de lavagem. 100 μl de Avidin-HRP foram adicionados a cada poço, um vedante de placa foi fixado à mesma, e a reação foi realizada à temperatura ambiente por 30 minutos.

Após a reação, os poços foram lavados 5 vezes usando 250 μl de tampão de lavagem. 100 μl de solução de 1× TMB foram adicionados a cada poço, um vedante de placa foi fixado à mesma, e a reação foi realizada à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a reação, 50 μl da solução de parada foram adicionados a cada poço e medidos a 450 nm em 30 minutos.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0124] Foi confirmado que a IL-21 foi secretada em células T CAR contendo gene de IL-21 (no 1, no 5, no 7 e no 11). Quando as células T CAR foram cocultivadas com células de U87 de glioma humano, uma quantidade maior de IL-21 foi secretada, e considerando que os resultados experimentais gerais em 24 horas e 48 horas foram similares, nenhuma diferença significativa de acordo com o tempo de incubação foi observada. Como resultado do experimento em 48 horas mostrou uma concentração de IL-21 superior àquele de 24 horas, a secreção de IL-21 pareceu proceder estavelmente (Figura 19).

[0125] Especula-se que a secreção de IL-21 em um ambiente de células de câncer aumente a capacidade de exterminar células de câncer auxiliando na ativação de células imunorrelacionadas natas. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO DE CÂNCER EGFRVIII ALVEJANDO VETOR DE CAR E AVΒ3 ALVEJANDO VETOR DE CAR

[0126] No caso de EGFRvIII, que é um antígeno principal para tumores como glioblastoma e câncer de pulmão, a fim de reduzir os efeitos colaterais de células T CAR através da ligação não específica enquanto minimiza a afinidade de ligação para EGFR tipo selvagem onde a especificidade para EGFRvIII é mantida, em SEQ ID NO: 33, as posições 52 a 57 da SEQ ID NO: 3 foram primeiro alteradas de STGGYN para DPENDE (uma parte de CDR2 de uma cadeia pesada), a posição 101 da SEQ ID NO: 3 foi alterada de S para G (uma parte de CDR3 de uma cadeia pesada) e a posição 229 da SEQ ID NO: 3 foi alterada de V para G (uma parte de CDR3 de uma cadeia leve).

[0127] O CD3 humano (P20963-1), CD8A humano (P01732), 4-1BB humano

(Q07011), CD3Z humano (P20963), uma luciferase Gaussia princeps e a sequência de sinal de cadeia leve kappa humana (HuVHCAMP) foram otimizados usando literatura científica e bancos de dados disponíveis publicamente e, assim, os polipeptídeos contendo receptor de antígeno quimérico consistindo em DNA sintético otimizado por códon (no 13, no 14, no 15 e no 16 da SEQ ID NOS: 34 a 37) foram preparados.

[0128] A estrutura completa de polipeptídeo contendo CAR n o 13 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de CD8A, um domínio de ligação ao antígeno que se liga a EGFRvlll da SEQ ID NO: 3, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico aumentando a solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8A humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4-1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico de CD3ζ (SEQ ID NO: 18) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI.

[0129] O fragmento de CAR de gene finalmente preparado foi conjugado ao vetor de expressão de retrovírus de MFG digerido com XhoI/NotI (Emtage PC et al., Clin Cancer Res, 2008, 14:8.112 a 8.122). Neste Exemplo, a fim de comparar a atividade de receptores de antígeno quimérico, YYB105 (SEQ ID NO: 39: consultar Publicação Internacional de PCT no WO 2017/023138) foi adicionalmente preparado.

[0130] A estrutura completa de polipeptídeo contendo CAR n o 14 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de CD8A, um domínio de ligação ao antígeno que se liga a EGFRvlll da SEQ ID NO: 33, três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico aumentando a solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8A humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4-1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico de CD3ζ (SEQ ID NO: 18) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI. O fragmento de CAR de gene finalmente preparado foi conjugado ao vetor de expressão de retrovírus de MFG digerido com XhoI/NotI (Emtage PC et al., Clin Cancer Res, 2008, 14:8.112 a 8.122).

[0131] No caso de antiangiogênico aVβ3, a taxa de expressão e persistência de CAR em células T CAR alvejando os mesmos foram otimizadas. No caso de aVβ3, a taxa de expressão e persistência de CAR em células T CAR alvejando os mesmos foram otimizadas usando sequência de sinal de luciferase Gaussia princeps ou sequência de sinal de CD8 (SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37).

[0132] A estrutura completa de polipeptídeo contendo CAR n o 15 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de luciferase Gaussia princeps, SEQ ID NO: 5 (um domínio de ligação ao antígeno que se liga a aVβ3), três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico aumentando a solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8A humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4-1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico de CD3ζ (SEQ ID NO: 18) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI. O fragmento de CAR de gene finalmente preparado foi conjugado ao vetor de expressão de retrovírus de MFG digerido com XhoI/NotI (Emtage PC et al., Clin Cancer Res, 2008, 14:8.112 a 8.122). Neste Exemplo, a fim de comparar a atividade de receptores de antígeno quimérico, YYB107 (SEQ ID NO: 38: consultar Publicação Internacional de PCT no WO 2017/023138) foi adicionalmente preparado.

[0133] A estrutura completa de polipeptídeo contendo CAR n o 16 inclui uma sequência de ligação ao ribossomo de consenso de Kozak, uma sequência de sinal de luciferase Gaussia princeps, SEQ ID NO: 5 (um domínio de ligação ao antígeno que se liga a aVβ3), três glicinas (GGG) que são introduzidas entre um domínio de ligação ao antígeno e uma região de dobradiça, de modo a aumentar a expressão de um receptor de antígeno quimérico aumentando a solubilidade de uma proteína de CAR, uma região de dobradiça de CD8A humano, um domínio transmembranar de CD8 humano, um domínio de sinal coestimulatório de 4-1BB citoplásmico, um domínio citoplásmico de CD3ζ (SEQ ID NO: 18) e um sítio de clivagem de XhoI/NotI. O fragmento de CAR de gene finalmente preparado foi conjugado ao vetor de expressão de retrovírus de MFG digerido com XhoI/NotI (Emtage PC et al., Clin Cancer Res, 2008, 14:8.112 a 8.122). EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS

COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO

[0134] Os clones de PG13 expressando CAR de alta titulação foram preparados de modo que células Phoenix-Ampho e Phoenix-Eco fossem transfectadas de modo transitório com o vetor de expressão retroviral preparado no Exemplo 1 e, então, estoques de vetor livre de células foram preparados a partir das células Phoenix- Ampho e Phoenix-Eco transfectadas através da transfecção de células de PG13. Para monoclones de alta titulação, células de PG13/no 13, PG13/no 14, PG13/no 15 e PG13/no 16 foram manchadas usando um Ab anti-myc (BD Pharmingen), e estes monoclones foram isolados usando uma citometria de fluxo. O grau de transdução de células de PG13/no 13, PG13/no 14, PG13/no 15 e PG13/no 16, que foram transduzidas usando um Ab anti-myc, foi analisado usando uma citometria de fluxo. Os sobrenadantes das células transduzidas de PG13/n o 13, PG13/no 14, PG13/no 15 e PG13/no 16 continha retrovírus, e os sobrenadantes foram coletados para modificação genética de células T. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram separadas usando centrifugação através da adição do sangue total obtido a partir de um doador humano saudável em Ficoll Paque (GE Healthcare). As PBMCs separadas foram cultivadas adicionando um anticorpo monoclonal anti-CD3 (eBioscience) a uma concentração de 100 ng/ml sob a condição de IL-2 humana (Novartis) a uma concentração de 100 IU/ml para ativar a fração de célula T (BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79 a 84). Dois a três dias após o cultivo, a maioria das células eram células T e incluíam células exterminadoras naturais a uma porcentagem de 0% a 2%. Dois a três dias após a etapa de ativação, as células T foram submetidas à transdução duas vezes ao longo de dois dias usando o sobrenadante retroviral e lavadas e, então, proliferaram por 14 dias em um frasco. IL-2 foi mantida a uma concentração de 100

IU/ml. As células T modificadas como tal foram usadas para um experimento de análise. EXEMPLO EXPERIMENTAL 1: VERIFICAÇÃO DE TAXA DE CRESCIMENTO E

VIABILIDADE DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0135] Para as células T preparadas no Exemplo 4 acima, o número de células foi contado para confirmar a taxa de crescimento e a taxa de viabilidade de T CAR, e os resultados são mostrados na Figura 20. O número de células e a taxa de crescimento de todos os grupos (no 13, no 14, no 15 e no 16) mostram ser similares àqueles do grupo de controle (isto é, YYB105) dependendo do dia da semana, as células mostraram crescer rapidamente a partir do Dia 12 de cultura, e a viabilidade também mostrou ser 90% ou superior (consultar a Figura 20). EXEMPLO EXPERIMENTAL 2: VERIFICAÇÃO DE TAXA DE

EXPRESSÃO DE CAR NA SUPERFÍCIE CELULAR DE CÉLULAS T CAR TRANSFORMADAS COM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO MÉTODOS EXPERIMENTAIS (ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO)

[0136] Para a citometria de fluxo (> 30.000 eventos), um dispositivo BD LSRII (Becton Dickinson) e software BD FACSDiva (Becton Dickinson) foram usados. Especificamente, as células foram lavadas uma vez com PBS contendo 2% de albumina do soro bovino antes da adição de um anticorpo anti-myc conjugado com PE (BD Pharmingen) ao mesmo. Após a lavagem, as células foram reagidas com cada anticorpo a 4 ºC por 30 minutos em um estado em que a luz foi bloqueada, e lavadas uma vez, e em seguida, a taxa de expressão de CAR na superfície de células T transduzidas foi verificada.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[0137] Para confirmar se os 4 tipos de CAR preparados no Exemplo 2 (n o 13, no 14, no 15 e no 16) foram expressos na superfície de célula T, a cultivação de célula T foi realizada por 14 dias, de acordo com o Exemplo 4 e, então, a análise citométrica de fluxo foi realizada de acordo com o método experimental.

[0138] Como resultado da análise, conforme mostrado na Figura 21, a taxa de expressão dos receptores de antígeno quimérico expressa na superfície de células T vivas mostrou aumentar em no 13 (43,0%) e no 14 (50,8%) em comparação com YYB105 (37,4%) (isto é, um grupo de controle) (Figura 21); e mostrou aumentar em no 15 (45,9%) e no 16 (40,0%) em comparação com YYB107 (24,6%) (isto é, um grupo de controle) (Figura 21).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0139] A presente invenção se refere a desenvolver rapidamente uma célula T CAR no campo de tratamento de câncer. A célula T CAR de acordo com a presente invenção tem uma taxa de expressão e persistência notavelmente excelentes e, portanto, tem um efeito terapêutico melhorado para câncer sólido, etc., e pode ser efetivamente usada no campo de tratamento de câncer personalizado.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID NO: 1 {domínio de IL13 tipo selvagem de ligação ao antígeno se ligando a IL13Ra2} Comprimento: 112 Tipo: proteína aglutinante Organismo: humano Sequência:

GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLI NVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLL

HLKKLFREGQFN SEQ ID NO: 2 {domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação a um antígeno associado a uma atividade angiogênica} Comprimento: 92 Tipo: proteína aglutinante Organismo: humano Sequência:

EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTAT

ISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNTPPISINYRTHHHHHH SEQ ID NO: 3 {domínio de ligação ao antígeno se ligando a EGFRvIII} Comprimento: 252 Tipo: proteína de scFv Organismo: humano Sequência:

QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEW VASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC ARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPG VPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNVPLTFGGGTKVEIKE

QKLISEEDL SEQ ID NO: 4 {domínio de ligação ao antígeno se ligando a EphA2} Comprimento: 141 Tipo: proteína aglutinante Organismo: humano Sequência:

DRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYI LYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCNRPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFAL

AKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDL SEQ ID NO: 5 {domínio de ligação ao antígeno se ligando a αVβ3} Comprimento: 104 Tipo: proteína aglutinante Organismo: humano Sequência:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISE EDL

SEQ ID NO: 6 {domínio de ligação ao antígeno se ligando a glipicano1} Comprimento: 418 Tipo: proteína aglutinante Organismo: humano Sequência:

TSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYL QIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTG SHPASAIYSVETINDGNFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLN FDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKV PMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQR TNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAI KCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQG YAACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVD

EVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 7 {domínio de ligação ao antígeno se ligando a mesotelina} Comprimento: 262 Tipo: proteína de scFv Organismo: humano Sequência:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLE WIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA REGKNGAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSQVQLQQSGPGL VTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKW YNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYY

YGMDVWGQGTTVTVSSGILGS SEQ ID NO: 8 {sequência de região de dobradiça -1} Comprimento: 47 Tipo: proteína Organismo: humano

Sequência:

KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SEQ ID NO: 9 {sequência de região de dobradiça -2} Comprimento: 45 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFA SEQ ID NO: 10 {sequência de domínio transmembranar-1} Comprimento: 21 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT SEQ ID NO: 11 {sequência de domínio transmembranar-2} Comprimento: 23 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

LAYLLDGILFIYGVILTALFLRV SEQ ID NO: 12 {4-1BB} Comprimento: 42 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO: 13 {CD28 tipo selvagem} Comprimento: 41 Tipo: proteína

Organismo: humano Sequência:

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS SEQ ID NO: 14 {IL-7Rα} Comprimento: 459 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVN GSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLL IGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNT SHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAM YEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFS VALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESF LDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPS EDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHV YQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVT

MSSFYQNQ SEQ ID NO: 15 {parte de IL-7Rα} Comprimento: 64 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQ

ARDEVEGFLQDTF SEQ ID NO: 16 {IL-2Rβ} Comprimento: 551 Tipo: proteína Organismo: humano

Sequência:

MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWS QDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQ KLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETH RCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLE TLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLG HLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEH GGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPE PASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEG VAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTA PGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPEL VLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTD

AYLSLQELQGQDPTHLV SEQ ID NO: 17 {parte de IL-2Rβ} Comprimento: 104 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSF SPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQG

YFFFHL SEQ ID NO: 18 {CD3ζ} Comprimento: 113 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL STATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO: 19 {exodomínio de TGF-βR2} Comprimento: 137 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSN CSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKC

IMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 20 {domínio transmembranar e endodomínio de IL-18R} Comprimento: 219 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

PGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKT YDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGA VVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTP VTDFTFL PQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEV

LPV LSES SEQ ID NO: 21 {IL-21} Comprimento: 133 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSC FQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSY

EKKPPK EFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS SEQ ID NO: 22 {YYB 103} Comprimento: 359

Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRV KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP QRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST

ATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 23 {no 1} Comprimento: 998 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKK RIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQA RDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGP MALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLC KFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETV CHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFS EEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTR RDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCI FERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALV ERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLL YLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSESRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEEN PGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDL VPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRK PPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSR

THGSEDS SEQ ID NO: 24 {no 2} Comprimento: 818 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKK RIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQA RDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGP MALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLC KFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETV CHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFS EEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTR RDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCI FERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALV ERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLL

YLMPAKT VKPGRDEPEVLPVLSES SEQ ID NO: 25 {no 5} Comprimento: 594 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKK RIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQA RDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGP MYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPE FLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPS TNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQH

LSSRTHGSEDS SEQ ID NO: 26 {no 6} Comprimento: 423 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKK RIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQA RDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR

GKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPR SEQ ID NO: 27 {no 7} Comprimento: 1.038 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNC RNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSP GGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYF FFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY LSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALL LPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFST CDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYH DFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD PGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKT YDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGA VVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTP VTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKP GRDEPEVLPVLSESRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMYRMQLL SCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPED VETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRR

QKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS SEQ ID NO: 28 {no 8} Comprimento: 858 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNC RNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSP GGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYF FFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY LSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALL LPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFST CDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYH DFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD PGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKT YDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGA VVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTP VTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKP

GRDEPEVLPVLSES SEQ ID NO: 29 {no 11} Comprimento: 634 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNC RNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSP GGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYF FFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY LSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMYRMQLLS CIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDV ETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQ

KHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS SEQ ID NO: 30 {no 12} Comprimento: 463 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGS MVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNC RNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSP GGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYF FFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI

GMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPR SEQ ID NO: 31 {3o ITAM-1 mutado}

Comprimento: 23 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

YLPQSTATKDTYDYVTMQALPPR SEQ ID NO: 32 {3o ITAM-2 mutado} Comprimento: 23 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

YLSLSTATKDTYLPQHMQALPPR SEQ ID NO: 33 {domínio de ligação ao antígeno se ligando a EGFRvIII} Comprimento: 252 Tipo: proteína de scFv Organismo: humano Sequência:

QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEW VASIDPENDETFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC ARGYGSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPG VPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNGPLTFGGGTKVEIKE

QKLISEEDL SEQ ID NO: 34 {no 13} Comprimento: 499 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAK NTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGST SGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWY QQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYY CLQSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLR VKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD

ALHMQALPPR SEQ ID NO: 35 {no 14} Comprimento: 499 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASIDPENDETFYSDNVKGRFTISRDNAK NTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYGSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGST SGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWY QQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYY CLQSFNGPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLR VKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD

ALHMQALPPR SEQ ID NO: 36 {no 15} Comprimento: 349 Tipo: proteína Organismo: humano

Sequência:

MGVKVLFALICIAVAEAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNE GSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKL LYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ

ALPPR SEQ ID NO: 37 {no 16} Comprimento: 353 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MALPVTALLLPLALLLHAARPVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGD WNEGSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL

HMQALPPR SEQ ID NO: 38 {YYB 107} Comprimento: 351 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRY YRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDW NEGSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM

QALPPR SEQ ID NO: 39 {YYB 105} Comprimento: 497 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS KFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNT LYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSG SGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQ KPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCL QSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLRV KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD

ALHMQALPPR SEQ ID NO: 40 {peptídeo de T2A} Comprimento: 21 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 41 {peptídeo de P2A}

Comprimento: 22 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 42 {peptídeo de E2A} Comprimento: 23 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 43 {peptídeo de F2A} Comprimento: 25 Tipo: proteína Organismo: humano Sequência:

GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo caracterizado por compreender um receptor de antígeno quimérico, que compreende um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembranar; um domínio coestimulatório e um domínio de sinalização, em que o domínio de sinalização compreende um domínio CD3ζ.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender IL-7Rα ou uma parte da mesma interposta entre o domínio coestimulatório e o domínio CD3ζ.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender IL-2Rβ ou uma parte da mesma interposta entre o domínio coestimulatório e o domínio CD3ζ.

4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por uma parte de IL-7Rα ser uma sequência de SEQ ID NO: 15.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por uma parte de IL-2Rβ ser uma sequência de SEQ ID NO: 17.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender três motivos de ativação baseado em tirosina imunorreceptores (ITAMs) dentro do domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, é substituído por YxxQ; e uma segunda região de motivo, YxxLHM, é substituída por YxYVTM.

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender três motivos de ativação baseado em tirosina imunorreceptores (ITAMs) interpostos dentro do domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, é substituído por YyyL; e um segundo motivo, YxxL, é substituído por YxxQ.

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender três motivos de ativação baseado em tirosina imunorreceptores (ITAMs)

dentro do domínio CD3ζ, em que uma terceira região de ITAM é mutada para uma sequência de SEQ ID NO: 31.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender três motivos de ativação baseado em tirosina imunorreceptores (ITAMs) dentro do domínio CD3ζ, em que uma terceira região de ITAM é mutada para uma sequência de SEQ ID NO: 32.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por o domínio CD3ζ ser uma sequência representada pela SEQ ID NO: 18.

11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por uma terceira região de ITAM ser uma sequência entre a 91ª e a 113ª posições em uma sequência representada pela SEQ ID NO: 18.

12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, ser substituído por YxxQ; e um segundo motivo, YxxLHM, ser substituído por YxYVTM, em que x é qualquer aminoácido.

13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, ser substituído por YyyL; e um segundo motivo, YxxL, ser substituído por YxxQ, em que x e y são, cada um, qualquer aminoácido.

14. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado por compreender, ainda, uma citocina.

15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a citocina ser IL-21.

16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a citocina ser unida a um receptor de antígeno quimérico através de um peptídeo de autoclivagem.

17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a citocina expressa em uma célula T ser separada do receptor de antígeno quimérico e, em seguida, ser liberada para o exterior da célula T.

18. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado por compreender, ainda, um exodomínio TGF-βR2 e um endodomínio IL18R, em que um domínio transmembranar IL18R está compreendido entre o exodomínio TGF-βR2 e o endodomínio IL18R.

19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o exodomínio TGF-βR2 ser unido a um receptor de antígeno quimérico através de um peptídeo de autoclivagem.

20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o exodomínio TGF-βR2, o domínio transmembranar IL18R e o endodomínio IL18R, que são expressos em uma célula T, serem separados do receptor de antígeno quimérico, e dentre os mesmos, o exodomínio TGF-βR2 é exposto ao exterior da célula T, em que o endodomínio IL18R é ativado através da união do TGF-β presente no exterior da célula T ao exodomínio TGF-βR2.

21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender, ainda, uma citocina.

22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a citocina ser IL-21.

23. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a citocina ser unida a um endodomínio IL18R através de um peptídeo de autoclivagem.

24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a citocina expressa em uma célula T ser separada do endodomínio IL18R e, em seguida, ser liberada para o exterior da célula T.

25. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o domínio de ligação ao antígeno se ligar a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em IL13Rα2, um antígeno associado com uma atividade de angiogênese, EGFRvIII, EphA2, αVβ3, mesotelina e glicano.

26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o domínio coestimulatório compreender um ou mais dentre os selecionados a partir do grupo que consiste em 4-1BB e um domínio CD28.

27. Polipeptídeo caracterizado por ser representado por qualquer uma sequência dentre SEQ ID NOS: 23 a 30 e 34 a 37.

28. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado por ser destinado ao tratamento de câncer sólido.

29. Célula T CAR caracterizada por um polipeptídeo que compreende o receptor de antígeno quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, ser expresso.

30. Célula T CAR caracterizada por um polipeptídeo que compreende o receptor de antígeno quimérico, conforme definido na reivindicação 27, ser expresso.

31. Vetor de expressão de CAR caracterizado por ser um vetor que expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) e compreender um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembranar; um domínio coestimulatório e um domínio de sinalização citoplásmico, em que o vetor de expressão de CAR compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que o ácido nucleico que codifica um CAR compreende um ácido nucleico que codifica o domínio coestimulatório e um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ como o domínio de sinalização, e que compreende, ainda, um ácido nucleico que codifica IL-7Rα ou uma parte da mesma que está interposta entre o ácido nucleico que codifica o domínio coestimulatório e o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ.

32. Vetor de expressão de CAR caracterizado por ser um vetor que expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) e compreender um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembranar; um domínio coestimulatório e um domínio de sinalização citoplásmico, em que o vetor de expressão de CAR compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que o ácido nucleico que codifica um CAR compreende um ácido nucleico que codifica o domínio coestimulatório e um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ como o domínio de sinalização, e que compreende, ainda, um ácido nucleico que codifica IL-2Rβ ou uma parte da mesma que está interposta entre o ácido nucleico que codifica o domínio coestimulatório e o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ.

33. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por uma parte de IL-7Rα ser uma sequência de SEQ ID NO: 15.

34. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por uma parte de IL-2Rβ ser uma sequência de SEQ ID NO: 17.

35. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ ser um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM dentre os três ITAMs presentes dentro do domínio CD3ζ, um primeiro motivo, YxxL, e um segundo motivo, YxxLHM, são substituídos.

36. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ ser um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM dentre os três ITAMs presentes dentro do domínio CD3ζ, um primeiro motivo, YxxL, e um segundo motivo, YxxL, são substituídos.

37. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ ser um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, é substituído por YxxQ; e uma segunda região de motivo, YxxLHM, é substituída por YxYVTM, em que x é qualquer aminoácido.

38. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o ácido nucleico que codifica o domínio CD3ζ ser um ácido nucleico que codifica um domínio CD3ζ, em que, em uma terceira região de ITAM, um primeiro motivo, YxxL, é substituído por YyyL; e um segundo motivo, YxxL, é substituído por YxxQ, em que x e y são, cada um, qualquer aminoácido.

39. Vetor de expressão de CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizado por compreender, ainda, um ácido nucleico que codifica citocina IL-21.

40. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o ácido nucleico que codifica citocina IL-21 ser unido a um ácido nucleico que codifica um CAR através de um ácido nucleico que codifica um peptídeo de autoclivagem.

41. Vetor de expressão de CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizado por compreender, ainda, um ácido nucleico que codifica um exodomínio TGF-βR2 e um ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar IL18R e um endodomínio IL18R.

42. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o ácido nucleico que codifica um exodomínio TGF-βR2 ser unido a um ácido nucleico que codifica um CAR através de um ácido nucleico que codifica um peptídeo de autoclivagem.

43. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por compreender, ainda, um ácido nucleico que codifica citocina IL-21.

44. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por o ácido nucleico que codifica citocina IL-21 ser unido a um ácido nucleico que codifica endodomínio IL18R através de um ácido nucleico que codifica peptídeo de autoclivagem.

45. Célula T CAR caracterizada por ser preparada por meio da introdução do vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 39.

46. Célula T CAR caracterizada por ser preparada por meio da introdução do vetor, conforme definido na reivindicação 41.

47. Célula T CAR caracterizada por ser preparada por meio da introdução do vetor, conforme definido na reivindicação 43.

48. Agente anticâncer caracterizado por compreender a célula T CAR, conforme definido na reivindicação 45.

49. Vetor de expressão de CAR, de acordo com a reivindicação 37 ou 38,

caracterizado por o domínio coestimulatório ser um ou mais dentre os selecionados a partir do grupo que consiste em um domínio 4-1BB e CD28.