KR102532266B1 - 돌연변이 egfr를 타겟하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EGFR 돌연변이인 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 scFv, 이를 포함하는 CAR 및 이를 발현하는 CAR-T세포에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 scFv를 포함하는 CAR를 발현하는 CAR-T세포는 EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성을 보이며, 뇌암을 유발한 동물모델에서의 유의미하게 우수한 치료 효과를 보임을 확인한 바, 이를 EGFRvIII를 발현하는, 뇌암을 비롯한 다양한 고형암의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

돌연변이 EGFR를 타겟하는 키메라 항원 수용체{Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor}
본 발명은 다양한 암에서 발현되는 돌연변이 EGFR를 타겟하는 키메라 항원 수용체에 대한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 환경오염 물질의 급격한 증가, 고지방 식이 섭취의 증가 등 다양한 원인으로 인해 뇌암, 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가 추세에 있다.
특히 고형암 중 뇌암은 예후가 아주 나쁜 암으로 진단 후 생존기간이 평균 14개월이다. 뇌암을 정복하기 위해 지난 30년간 수많은 연구가 진행되었지만 평균 생존기간을 겨우 6개월 연장시켰을 뿐이다. 현재 뇌암의 표준 치료는 수술, 방사선 치료, 화학적 치료지만, 이들 치료법으로 치유될 확률이 매우 낮으며, 심각한 부작용을 야기하는 문제점도 있다.
한편, CAR(Chimeric antigen receptors)를 발현하는 T세포(CAR-T)는 혈액암에서는 높은 항암 효능을 보임으로써 치료제로서 승인을 받았으나, 고형암의 경우 CAR-T의 효능이 미비한 것으로 보고되고 있다. 더욱이 고형암에서의 CAR-T세포 치료제 개발은 암세포 특이적 항원의 부재로 인하여 표적항원 선정에 어려움이 있다. 대부분의 경우 고형암세포에 과발현하는 항원을 표적으로 CAR-T세포 치료제가 개발되고 있으나 많은 표적항원들이 건강한 조직에 존재하는 정상세포에도 발현하고 있어 CAR-T세포가 정상세포에 존재하는 항원을 공격함으로써 독성을 유발하는 문제점이 존재한다.
따라서 정상세포에는 존재하지 않으나 암세포에는 과발현하는 암 항원의 발굴과 이를 타겟하여 암을 효과적으로 치료할 수 있는 CAR-T의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 고형암 특이적 암 항원을 발굴하고, 이를 특이적으로 타겟하는 scFv를 제작한 후 이를 포함하는 CAR 및 상기 CAR를 발현하는 CAR-T를 제작하였으며, 이의 타겟 항원을 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성 및 암을 유발한 동물 모델에서의 우수한 치료 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 돌연변이 EGFR 특이적 CAR의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR; 또는 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 돌연변이 EGFR 특이적 CAR의 생산 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR; 또는 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 EGFR 돌연변이인 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함하는 CAR를 발현하는 CAR-T세포는 EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성을 보이며, 뇌암을 유발한 동물모델에서 유의미하게 우수한 치료 효과를 보임을 확인한 바, 이를 EGFRvIII를 발현하는, 뇌암을 비롯한 다양한 고형암의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 EGFRvIII를 타겟하는 scFv를 포함하는 CAR 구조체의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 EGFRvIII를 타겟하는 6종의 scFv를 포함하는 CAR 렌티바이러스를 형질도입(transduction)한 세포의 CAR 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 EGFRvIII를 타겟하는 6종의 scFv를 포함하는 CAR 렌티바이러스를 형질도입한 세포를 EGFRvIII 항원을 과발현하는 세포 또는 EGFRvIII 항원을 과발현하지 않는 세포와 다양한 비율로 혼합하여 공동배양한 후, EGFRvIII를 타겟하는 CAR 렌티바이러스를 형질도입한 세포의 활성화 정도를 확인한 결과이다.
도 4 및 도 5는 6종의 scFv를 포함하는 CAR 렌티바이러스를 이용한 CAR-T세포 생산 및 상기 CAR-T세포의 CAR 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 CAR-T 세포(LL(long linker) scFv 포함)의 타겟세포 살상 활성을 확인한 것으로, EGFR을 발현하는 타겟 세포(도 6 중 A) 및 EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포(도 6 중 B)에 대한 결과와, 상기 도 6 중 B를 기반으로 본 발명에 따른 CAR-T의 특이적인 살상(특이적 용해(Specific lysis)(%))를 확인한 결과(도 6 중 C) 및 IL-2(Interleukin-2) 발현에 미치는 영향(도 6 중 D)과 IFN-γ(Interferon gamma) 발현에 미치는 영향(도 6 중 E)을 확인한 결과이다.
도 7은 CAR-T 세포(LL scFv 포함)의 타겟세포 살상 활성을 타겟 세포와 CAR-T세포(LL scFv 포함)의 공동배양 시작부터 완료되는 시점까지 모니터링한 결과로, EGFR을 발현하는 타겟 세포(도 7 중 A) 및 EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포(도 7 중 B)에 대한 결과이다.
도 8은 CAR-T세포(SL(short linker) scFv 포함)의 타겟세포 살상 활성을 타겟 세포와 CAR-T세포(SL scFv 포함)의 공동배양 시작부터 완료되는 시점까지 모니터링한 결과로, 타겟 세포(도 8 중 A) 및 EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포(도 8 중 B)에 대한 결과이다.
도 9는 EGFRvIII 유전자를 도입한 교모세포종 세포주의 EGFRvIII 발현 여부를 확인한 결과(도 9 중 A) 및 세포수 대비 루시퍼라아제(luciferase) 발현을 확인한 결과(도 9 중 B)이다.
도 10은 교모세포종 동물모델에 CAR-T세포(LL scFv 포함)를 주입한 후, 이의 시간 경과에 따른 암의 진행 정도를 확인한 결과이다.
도 11은 교모세포종 동물모델에 CAR-T세포(LL scFv 포함)를 주입한 후, 이의 암 크기에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 12는 교모세포종 동물모델에 CAR-T세포(LL scFv 포함)를 주입한 후, 이의 체중(body weight)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 13은 교모세포종 동물모델에 CAR-T세포(SL scFv 포함)를 주입한 후, 이의 시간 경과에 따른 암의 진행 정도를 확인한 결과이다.
도 14는 교모세포종 동물모델에 CAR-T세포(SL scFv 포함)를 주입한 후, 이의 암 크기에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 15는 교모세포종 동물모델에 CAR-T세포(SL scFv 포함)를 주입한 후, 이의 체중에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다.
본 발명은 고형암에서 특이적으로 발현하는 암 항원, 돌연변이 EGFR인 EGFRvIII를 특이적으로 타겟하며, 상기 EGFRvIII은 accession number: NM_001346941.1인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 19로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 27로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 29로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 30으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 37로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 38로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 39로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 40으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 47로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 49로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 50으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 f) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 57로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 58로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 f) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 59로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 60으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 본 발명의 돌연변이 EGFR 특이적 CAR에 있어서, 상기 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 (GGGGS)m 링커로 연결될 수 있으며, 상기 m은 1 내지 10인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 m은 1 내지 5일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 링커의 m은 1 또는 3으로, 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 본 발명의 CAR에 포함되는 scFv는 경쇄 가변영역과 중쇄 가변영역이 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 링커로 연결된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 즉, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열의 일부 아미노산 서열에 변이를 주어 합성하였다.
서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 LL(long linker)를 포함하는 scFv의 아미노산 서열은 다음과 같다: 서열번호 67(변이 위치: p.E181K 및 p.T221I, L1A LL로 명칭), 서열번호 71(변이 위치: p.V97L 및 p.E181V, L2 LL로 명칭), 서열번호 75(변이 위치: p.L225P, L3A LL로 명칭), 서열번호 79(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E181K, L3B LL로 명칭) 또는 서열번호 83(변이 위치: p.E181K 및 p.S187L, H2C LL로 명칭).
더불어 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 SL(short linker)를 포함하는 scFv의 아미노산 서열은 다음과 같다: 서열번호 69(변이 위치: p.E171K 및 p.T211I, L1A SL로 명칭), 서열번호 73(변이 위치: p.V97L 및 p.E171V, L2 SL로 명칭), 서열번호 77(변이 위치: p.L215P, L3A SL로 명칭), 서열번호 81(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E171K, L3B SL로 명칭) 또는 서열번호 85(변이 위치: p.E171K 및 p.S177L, H2C SL로 명칭).
이에 있어, 상기 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 64로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 66으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 68로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 70으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 72로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 74로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 75로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 76으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 78로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 80으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 82로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 84로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 86으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화;되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열은 이와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질 또는 펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 상기 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또한 상기와 동일한 이유로 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과로, 상기 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
더불어 본 발명의 돌연변이 EGFR 특이적 CAR는 신호 펩티드, 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 펩티드(signal sequence)는 초기 단백질을 소포체로 보내는 역할을 하며, 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, CD8, CD28, GM-CSF, CD4 및 CD137로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에서는 CD8 유래 신호 펩티드를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “줄기 도메인"은 막 관통 도메인을 본 발명의 scFv에 연결하는 기능을 하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 및 CD8 힌지로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 CD8 힌지 도메인을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “막 관통 도메인”은 본 발명에 따른 CAR가 세포의 표면 막 상에서 발현되도록 하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명에 개시된 CAR에 적합한 막 관통 도메인은 (a) 세포, 예를 들어, 면역 세포, 예컨대, 예를 들어, 비제한적으로, 림프구 세포 또는 자연 킬러(NK) 세포의 표면에서 발현되는 능력, 및 (b) 미리 규정된 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 지시하기 위해서 본 발명에 따른 scFv 및 세포내 신호전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다. 막 관통 도메인 또한 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, T 세포 수용체의 알파 쇄, T 세포 수용체의 베타 쇄 및 T 세포 수용체의 제타 쇄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 CD8α 막 관통 도메인을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “세포내 신호전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전송하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 이는 본 발명에 따른 scFv가 표적에 결합된 후, 세포내 신호전달을 담당하여 T세포 활성화를 야기한다. 세포내 신호전달 도메인 또한, 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 세포내 전달 도메인은 CD3ζ, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 및 TNFSF14로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 4-1BB(CD137) 및 CD3ζ를 사용하였다.
본 발명의 돌연변이 EGFR 특이적 CAR는 본 발명에 따른 EGFRvIII을 타겟하는 scFv의 발현 여부를 확인할 수 있는 태그 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 이는 공지된 태그 펩타이드라면 제한없이 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 플래그 펩타이드(Flag peptide)(DYKDDDDK)를 사용하였다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 돌연변이 EGFR 특이적 CAR의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 단백질이 암호화된 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 단백질을 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 단백질의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 생산 방법에 있어서, 상기 “감염”은 “형질전환”을 의미하는 것일 수 있다. 상기 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 일실시예에서는 293T 세포를 숙주세포로 사용하였다. 물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다.
그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함하는 CAR를 발현하는 CAR-T세포는 뇌암을 유발한 동물모델에서 유의미하게 우수한 치료 효과를 보였다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공한다.
상기 T 세포는 알파 베타 T세포, 감마 델타 T세포 또는 NKT세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 T세포는 동종 T세포, 자가 T세포, 조작된 자가 T세포 (eACT), 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)일 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR; 또는 본 발명에 따른 형질전환된 T세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하며, 상기 고형암은 낭종 또는 체액 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리로, 악성 또는 양성일 수 있다. 바람직하게는 EGFRvIII를 발현하는 고형암인 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 상기 암은 뇌암, 유방암, 폐암, 편평세포암 및 항문암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 현재 현저히 발달한 시퀀싱 기술을 통해 EGFRvIII를 발현하는 암종의 종류는 앞으로 현재 공지된 것보다 더 다양해질 수 있다. 또한 EGFRvIII를 발현하지 않는 암종이라 할지라도, 이를 발현할 수 있게 하는 공지의 기술(Ex, 바이러스 전달체)을 이용하여 EGFRvIII를 발현하도록 조작한 후, 본 발명에 따른 돌연변이 EGFR 특이적 CAR; 또는 본 발명에 따른 형질전환된 T세포를 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제형될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로도 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료량"을 언급할 때, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 의사에 의해 결정될 수 있고, 의사는 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 장애에서의 개별적인 차이를 고려한다. 일반적으로, 본 발명의 형질전환된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물이 104 내지 109 개의 세포/체중 kg의 용량, 바람직하게는 105 내지 106 개의 세포/체중 kg의 용량 (이러한 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)으로 투여될 수 있는 것으로 언급될 수 있다. 또한 본 발명의 형질전환된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물은 이러한 용량으로 여러 번 투여될 수 있으며, 면역요법에서 널리 공지된 주사 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988]을 참조한다). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 환자의 질환 징후를 모니터링하고 이에 따라 요법을 조정하는 것을 통해 의료 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
조성물을 대상체에게 투여하는 것은 분무, 주사, 연하, 주입, 착상 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 또는 복막내로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 i.v. 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접적으로 주사될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 형질전환된 T 세포를 치료 수준으로 확장시키기 위해 본원에 기술된 방법 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 세포가 환자에게 임의의 관련된 치료 형태와 조합되어(예를 들어, 이전에 동시에 또는 후속적으로) 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 화학요법, 방사선, 항암제, 면역치료제 등의 고형암 치료를 위한 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. EGFRvIII를 표적하는 CAR 구조체 제작
EGFRvIII를 타겟하여 암세포를 사멸시킬 수 있는 CAR-T를 생산하기 위하여, 먼저 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 scFv를 제작하였다.
scFv는 항체의 경쇄 (light chain)과 중쇄 (heavy chain)의 가변성 부분(variable region)을 연결하는 링커의 길이에 차이를 두어 두 종류로 디자인하였다. LL(long linker)의 경우 GGGGS가 세번 반복된 GGGGSGGGGSGGGGS으로 이루어져 있고, SL(short linker)의 경우 GGGGS로 이루어져 있다.
더불어 scFv의 야생형(wild type) 서열(서열번호 63(430 LL로 명칭) 및 서열번호 65(430 SL로 명칭))을 기반으로 일부 아미노산 서열에 변이를 준 서열의 scFv도 제작하였다. 그 결과 다음과 같은 LL을 포함하는 scFv를 제작하였다: 서열번호 67(변이 위치: p.E181K 및 p.T221I, L1A LL로 명칭), 서열번호 71(변이 위치: p.V97L 및 p.E181V, L2 LL로 명칭), 서열번호 75(변이 위치: p.L225P, L3A LL로 명칭), 서열번호 79(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E181K, L3B LL로 명칭) 또는 서열번호 83(변이 위치: p.E181K 및 p.S187L, H2C LL로 명칭).
더불어 다음과 같은 SL을 포함하는 scFv를 제작하였다: 서열번호 69(변이 위치: p.E171K 및 p.T211I, L1A SL로 명칭), 서열번호 73(변이 위치: p.V97L 및 p.E171V, L2 SL로 명칭), 서열번호 77(변이 위치: p.L215P, L3A SL로 명칭), 서열번호 81(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E171K, L3B SL로 명칭) 또는 서열번호 85(변이 위치: p.E171K 및 p.S177L, H2C SL로 명칭).
상기와 같이 제작한 scFv를 기반으로 EGFRvIII를 타겟하여 암세포를 사멸시킬 수 있는 CAR-T를 생산하기 위한 CAR 구조체를 제작하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, EGFRvIII에 결합할 수 있는 scFv를 T세포 표면에 발현시키기 위하여 CD8 신호전달 서열(signal sequence, signal seg), 힌지(hinge), 막관통 도메인(transmembrane domain, TM)이랑 융합하였고, T세포가 EGFRvIII에 결합한 후 시그널을 받아 증식하기 위한 시그널링 도메인으로 41BB와 CD3ζ를 융합시킨 구조를 디자인하였다. 또한 scFv의 발현 확인을 위하여, scFv N-말단(N-term)에 플래그 펩타이드(Flag peptide (DYKDDDDK))를 태깅(tagging)하였다. 이들 유전자의 서열은 하기 표 1에 나타내었으며, 각 유전자를 합성하여 공지된 방법으로 렌티벡터(Lenti vector, pELPS3)에 삽입한 후 렌티바이러스를 생산하였다.
염기 서열
CD8 신호전달 서열 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
CD8 힌지-막 관통 도메인 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCTAGCCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCGT
41BB TTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD3ζ AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
실시예 2. EGFRvIII를 타겟하는 CAR 렌티바이러스 생산 및 바이러스를 이용한 CAR의 활성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 렌티벡터를 렌티바이러스(Lentivirus) 생산에 필요한 악세서리 유전자를 가진 플라스미스(pRSV_rev, pMD2.5G, pMD_RRE)와 함께 Lenti-X™ 293T 세포 (Clonetech사에서 구입)에 형질주입(transfection)시켜 생산하였다. 생산한 렌티바이러스는 농축하여 역가를 측정한 후 -80℃에 보관하였다.
상기 렌티바이러스의 CAR 발현 및 그 활성을 확인하기 위하여 NFAT reporter(luc)- JurkaT세포(BPS Bioscience 사에서 구입)를 렌티바이러스로 형질도입(transduction)하고 3일 후 세포를 anti-Flag-PE(L5, Biolegend)로 염색한 후 FACS 기기를 이용하여 확인하였다. 이때 렌티바이러스로 형질도입하지 않은 세포 (UTD)를 음성 대조군으로 비교하였다. 그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 각 실험군에서 CAR가 발현되고 있음을 확인하였다.
CAR가 발현된 NFAT reporter (luc)- JurkaT세포의 경우, 항원에 의해 세포가 활성화되면 루시퍼라아제(luciferase) 활성도 증가하기 때문에, 루시퍼라아제 기질을 첨가한 후 발광(luminescence)를 측정함으로써 정량화하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 2에서 확인된, CAR를 발현하는 각각의 NFAT reporter (luc)-JurkaT세포(이펙터(effector) 세포, 2×105 cells)를 EGFRvIII 항원을 과발현하는 293T 세포 (293/EGFRvIII, Celther)(Celther사에서 구입) 혹은 293T 세포(293/EGFRwt, 내재적으로 EGFR 발현하고 있음)(타겟(target) 세포)(ATCC사에서 구입)와 다양한 비율(이펙터 세포:타겟 세포(E:T)=1:0, 1:0.01, 1:0.03, 1:0.1, 1:0.3)로 3시간 동안 배양한 후 이펙터 세포의 활성화 정도를 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로 CD3 항체(OKT3, Biolegend) 1μg/ml을 처리한 실험군을 포함시켰다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 CAR 발현 세포들은 293/EGFRwT세포에 의해서는 활성화되지 않은 반면 293/EGFRvIII 세포에 의해서는 타겟 세포 수에 비례하여 활성화됨을 확인하였다. 또한 동일한 293/EGFRvIII 세포 수를 이용하였을 때의 각 이펙터 세포의 활성화 정도는 앞서 확인한 이펙터 세포 표면의 CAR 발현 정도에 비례하였다(도 2 참고).
따라서 상기 실시예 1을 통해 제작한 CAR들이 EGFRvIII 항원에 특이적으로 반응하여 T세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T세포 생산
상기 실시예 2를 통해 CAR 기능이 확인된 렌티바이러스를 이용하여 CAR-T를 생산하였다. 이를 위하여 건강한 자원자로부터 혈액을 제공받아 피콜(Ficoll) 밀도구배 방법을 이용하여 공지된 절차에 따라 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하였다. PBMC를 TransAct(Miltenyi)를 포함한 배지에서 2일동안 배양하여 T세포를 활성화시켰고, 이에 상기 실시예 1을 통해 제조한 렌티바이러스를 첨가한 후 회전접종(spinoculation) 방법을 이용하여 공지된 절차에 따라 형질도입을 수행하였다. 이후 IL-2(Interleukin-2)가 포함된 배양배지를 2-3일 간격으로 첨가해주며 CAR-T세포를 증식시켰다. 배양된 세포를 anti-Flag-PE 혹은 anti-Flag-APC (L5, Biolegend)로 염색한 후 FACS 기기를 이용하여 세포 표면의 CAR 발현 여부를 확인하여 도 4 및 도 5에 나타내었다. 이때 렌티바이러스로 형질도입하지 않은 세포 (UTD)를 음성 대조군으로 비교하였다.
더불어 기능적 분석(functional assay)을 위하여 CAR를 발현하는 Flag 양성(positive) 세포를 MojoSort Human anti-APC nanobeads(Biolegend)를 이용하여 분리하였다(도 4 중 After sorting 결과 참고).
또한 CAR를 발현하는 세포 중 CD8+T세포가 차지하는 비율을 알아보기 위해서 배양된 일부 세포는 anti-Flag-PE와 anti-CD8-BV786 (SK-1, Biolegend)로 동시에 염색하여 FACS로 분석한 후 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과 도 4 및 도 5와 같이, EGFRvIII를 타겟하는 6 종의 scFv를 포함하는 CAR-T세포를 생산하였다.
실시예 4. CAR-T세포(LL scFv 포함)의 타겟세포 살상 활성(killing activity) 및 사이토카인(cytokine) 분비능 확인
상기 실시예 3의 CAR 발현이 확인된 CAR-T세포의 타겟 세포 살상 활성을 조사하기 위하여, 293/EGFRvIII 세포 혹은 293/EGFRwT세포(타겟 세포)에 루시퍼라아제와 GFP(Green fluorescent protein)를 도입함으로써 타겟 세포의 증식 혹은 살상을 측정하였다.
먼저 MojoSort 시스템을 이용하여 분리한 CAR+세포(LL scFv 포함, 이펙터 세포)를 전날 96 웰 플레이트에 씨드(seed)한 타겟 세포에 다양한 비율(E:T=1:1, 1:5, 1:25)로 첨가하여 20시간동안 공동배양한 후 타겟 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 CAR-T세포의 살상 활성을 확인하였다.
그 결과 도 6 중 B와 같이, EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포(293/EGFRvIII)의 경우, 본 발명에 따른 CAR-T세포 수의 증가에 비례하여 타겟세포의 사멸이 증가함을 확인하였다(루시퍼라아제 활성 감소). 반면 도 6 중 A와 같이, EGFR를 발현하는 타겟 세포(293/EGFRwt)의 경우, 본 발명에 따른 CAR-T세포 수와 관계없이 유사한 루시퍼라아제 활성이 나타났으므로, 본 발명에 따른 CAR-T가 상기 세포는 살상할 수 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 CAR-T가 WT EGFR 인 정상세포에 대해서는 살상능을 나타내지 않고, 암세포에만 존재하는 EGFRvIII 에만 특이적으로 결합하여 선택적인 살상능을 나타냄을 보여주는 결과이다.
더불어 EGFRvIII 항원 발현 타겟 세포에 대한 본 발명에 따른 CAR-T의 특이적인 살상을 확인하여 하기 수학식 1을 통해 도 6 중 C에 나타내었다.
[수학식 1]
특이적 용해(Specific lysis)(%)=(Target세포만 존재할 때의 RLU값)-(Target세포 + CAR-T 공배양 RLU값)}/(Target세포만 존재할 때의 RLU값)
또한, CAR-T는 표적 항원을 만나면 세포가 활성화되어 사이토카인인 IL-2와 IFN-γ(Interferon gamma)를 분비한다고 알려져 있으므로, 도 6 중 B에 나타낸 공동배양한 세포의 배양액을 수거하여 IL-2와 IFN-γ의 발현을 ELISA kit (Biolegend에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 6 중 D(IL-2 발현) 및 도 6 중 E(IFN-γ 발현)와 같이, 본 발명에 따른 CAR-T세포의 사이토카인 분비능은 타겟 세포 살상능과 비례함을 확인하였다.
실시예 5. CAR-T세포(LL scFv 포함)의 타겟세포 살상 활성 모니터링
상기 실시예 4는 본 발명에 따른 CAR-T의 공동배양이 끝난 시점에서의 항원 특이적인 타겟 세포 살상 활성과 사이토카인의 분비능을 확인한 것이기 때문에, 타겟 세포와 CAR-T세포(LL scFv 포함)의 공동배양 시작부터 완료되는 시점인 20시간동안 타겟 세포 살상 활성을 확인하였다. 이를 위하여 인큐사이트(Incucyte (Sartorius))를 이용하여 타겟 세포의 GFP 발현의 변화를 2시간마다 측정하였다.
그 결과 도 7 중 A 및 B에 나타낸 바와 같이, EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포의 경우 E:T 비율이 1:1일 때 타겟 세포의 살상이 확인되었고, E:T 비율이 1:5일 때에는 타겟 세포가 자라지 못하는 것을 확인하였다. 반면 EGFR을 발현하는 타겟 세포 실험군에서는 타겟 세포의 성장에 영향을 주지 못함을 확인하였다(X로 표시된 검은색 선은 타겟 세포만 존재할 경우의 GFP 변화를 나타냄.).
실시예 6. CAR-T세포(SL scFv 포함)의 타겟세포 살상 활성 모니터링
더불어 상기 실시예 5와 마찬가지로, 타겟 세포와 CAR-T세포(SL scFv 포함)의 공동배양 시작부터 완료되는 시점까지의 타겟 세포 살상 활성을 확인하였다. 이때 상기 CAR-T세포(SL scFv 포함)는 도 5에 나타낸 세포로, CAR+세포를 분리하지 않은 것이다. 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 공동배양 시작부터 완료되는 시점인, 18시간동안 타겟 세포의 GFP 발현의 변화를 2시간마다 측정하였다.
그 결과 도 8 중 A 및 도 8 중 B와 같이, EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포의 경우 E:T 비율이 1:2일 때 (이펙터 중 CAR+세포가 50-60%이므로 실제적인 E:T 비율은 약 1:4임)에는 타겟 세포의 살상 활성이 나타났지만, E:T 비율이 1:10일 때(실제적인 E:T 비율은 약 1:20임)에는 타겟 세포의 성장에 영향을 주지 못하였다. 또한 EGFR을 발현하는 타겟 세포와 CAR-T세포를 공동 배양하였을 때에는 CAR-T세포는 타겟 세포의 성장에 영향을 주지 못하였다(X로 표시된 검은색 선은 타겟 세포만 존재할 경우의 GFP 변화를 나타내고, 파란색 선은 CAR-T세포 대신 UTD 세포를 첨가하였을 때의 GFP 변화를 나타냄.).
실시예 7. 동물모델에서의 효능 확인
7-1. 교모세포종 동물 모델 준비
생체 외(In vitro)에서 타겟 세포 살상능이 확인된, 본 발명에 따른 EGFRvIII를 표적하는 CAR-T세포들의 생체 내(in vivo)에서의 효능을 확인하였다. 이를 위하여 먼저 교모세포종(glioblastoma) 세포주를 이용하여 동소(orthotopic) 동물 모델을 확립하였다. 상기 교모세포종 세포주로는 교모세포종 연구에 널리 이용되는 세포주인 U-87MG 세포를 활용하였다. 상기 세포주에 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase)를 도입한 U-87MG-Luc2 세포주를 ATCC로부터 확보하고 이 세포주에 EGFRvIII 유전자를 도입하여 안정적인(stable) 세포주를 확립하였다(이하 U87-EGFRvIII로 명칭). U87-EGFRvIII 세포주가 EGFRvIII를 발현한다는 것을 확인하기 위하여, EGFR을 인식하는 항체(A19002A, Biolegend에서 구입), 그리고 EGFRvIII만을 특이적으로 인식하는 항체(L8A4, Absolute Antibody에서 구입)를 이용하여 공지된 방법에 따라 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다. EGFR과 EGFRvIII에 대한 양성 대조군(positive control)으로는 앞서 타겟 세포로 이용하였던 293/EGFR (도 9 중 A, 레인(lane) 1)과 293/EGFRvIII (도 9 중 A, 레인 2)을 이용하였다.
그 결과 도 9 중 A와 같이, A19002A 항체는 EGFR과 EGFRvIII 사이즈가 다른 두 단백질을 잘 검출(detection)할 수 있었고, L8A4 항체는 EGFRvIII 단백질만을 특이적으로 인식함을 보여주었다. U87-EGFRvIII 세포주는 두 항체 모두에 의해 기대되는 사이즈에서 검출됨으로써 EGFRvIII가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 9 중 A, 레인 3).
또한 도 9 중 B에 나타낸 바와 같이, U87-EGFRvIII 세포주는 세포수에 비례하여 루시퍼라아제 발현이 증가함을 생체외에서 확인하였다.
이 후 세포주를 배양하여 증식시킨 후 수거하여 0.2×106세포를 3μL의 PBS에 현탁하고, 면역결핍(Immunocompromiced) 마우스(NOG, NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull, CIEA에서 구입)의 뇌에 I.C.(intracranial)로 주사하였다. 수일이 지난 후, 루시퍼라아제의 기질인 D-루시페린(D-Luciferin (PerkinElmer)) 150mg/kg을 마우스 복강으로 주사하고 동물을 IVIS(In vivo optical imaging system with X-rays) 기기를 이용하여 광자(photon)을 확인하여 발광정도를 측정함으로써 암의 성장을 모니터링(monitoring)하였다.
7-2. CAR-T세포의 교모세포종 동물모델에서의 생체내 효능 확인
상기 실시예 7-1에서 준비한 교모세포종 동물모델에 본 발명에 따른 CAR-T세포를 주입하여 이의 생체내 효능을 확인하였다. CAR-T세포를 동물 모델에 주사하기 전에 각 동물 모델에 존재하는 암의 크기를 IVIS 기기를 이용하여 광자 값으로 수치화하고, 광자 값에 따라 동물을 그룹당 5마리씩 무작위로 배치하였다. 배양한 CAR-T세포는 수거하여 계수하고, 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로 CAR의 발현 정도를 확인하였다. CAR 발현율에 따라 CAR+ 세포가 동물당 0.5×106 세포가 되도록 수거하고 이를 세척한 후 100μL의 5% HSA(human serum albumin)에 현탁하여 I.V.(Intravenous therapy)로 상기 실시예 7-1의 동물 모델에 주사하였다. 이후 동물 모델은 1주마다 IVIS 기기를 이용하여 광자 값을 측정함으로써 암 크기의 변화를 모니터링하였다. 또한 동물의 몸무게도 매주 측정하였다.
이때 상기 CAR-T는 LL scFv(L1A LL, H2C LL)를 포함하는 CAR-T세포와 SL scFv(430 SL, L1A SL, L2 SL, L3A SL, L3B SL, H2C SL)를 포함하는 CAR-T세포를 각각 처리하였다.
CAR-T세포(LL scFv 포함) 주사 후 217일까지의 결과는 도 10 내지 도 12에 나타내었다. 더불어 CAR-T세포(SL scFv 포함) 주사 후 70일까지의 결과는 도 13 내지 도 15에 나타내었다.
그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, UTD를 주입한 실험군의 경우, 시간 경과에 따라 모든 동물 모델의 암이 진행되었으며, 49일째는 모든 개체가 암으로 인하여 희생되었다. 430 LL를 포함하는 CAR-T를 주입한 실험군의 경우, 시간이 경과함에 따라 대부분의 동물에서 암이 진행되었으며 5개체 중 2개체의 경우 각각 63일과 83일에 암으로 인하여 희생되었다. 남아있는 3개체도 217일까지 관찰한 결과 암이 계속적으로 성장하고 있음을 확인하였다. 반면, L1A LL 또는 H2C LL를 포함하는 CAR-T를 주입한 동물 모델의 경우 뇌암이 제거된 후 217일까지 관찰하는 동안 암의 재발이 관찰되지 않았다. 이때 암이 클수록(광자 값이 높을수록) 붉은 색을 나타내고, 암이 작을수록(광자 값이 낮을수록) 파란색을 나타낸다. 더불어 붉은색 점이 퍼져 있는 결과는 암세포에서 발광되는 루시퍼라아제의 강한 시그널을 의미한다. 또한 *는 뇌암 발병과 관련없는 다른 요인으로 죽은 개체를 의미한다.
각 실험군의 광자 값을 확인한 도 11(CAR-T(LL scFv 포함)를 주입)에 있어서, 430LL를 포함하는 CAR-T세포를 주입한 실험군에서는 217일까지 관찰한 결과, 생존해 있는 2개체에서 암이 계속적으로 진행되고 있음을 확인하였으나 L1ALL 또는 H2CLL를 포함하는 CAR-T세포를 주입한 실험군의 경우, 생존해 있는 거의 모든 개체에서 뇌암의 진행이 억제되는 것을 확인하였다.
또한 도 12에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군의 체중(body weight)는 본 발명에 따른 CAR-T세포(LL scFv 포함) 주입에 영향을 받지 않음을 확인하였다.
더불어 도 13에 나타낸 바와 같이, SL scFv(430 SL, L1A SL, L2 SL, L3A SL, L3B SL, H2C SL)를 포함하는 CAR-T세포를 주입한 경우도 뇌암의 발병을 억제하는 활성을 보였다. UTD를 주입한 실험군의 경우, 시간 경과에 따라 모든 동물 모델의 암이 진행되어 42일째 모든 개체가 희생되었다. 반면 L3A를 제외한 SL scFv를 포함하는 CAR-T를 주입한 실험군의 경우, 70일까지 관찰한 결과 모든 개체에서 뇌암이 제거되어 재발하지 않았다. 이때 암이 클수록(광자 값이 높을수록) 붉은 색을 나타내고, 암이 작을수록(광자 값이 낮을수록) 파란색을 나타낸다. 더불어 붉은색 점이 퍼져 있는 결과는 암세포에서 발광되는 루시퍼라아제의 강한 시그널을 의미한다. 또한 *는 뇌암 발병과 관련없는 다른 요인으로 죽은 개체를 의미한다.
또한 각 실험군의 광자 값을 확인한 도 14에 있어서, L3A를 제외한 SL scFv를 포함하는 CAR-T를 주입한 실험군의 거의 모든 개체에서 뇌암의 진행이 억제되는 것을 확인하였다.
또한 도 15에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군의 체중(body weight)는 본 발명에 따른 CAR-T세포(SL scFv 포함) 주입에 영향을 받지 않음을 확인하였다.
종합적으로, 본 발명은 EGFR 돌연변이인 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 scFv를 제조하고 이를 포함하는 CAR 및 이를 발현하는 CAR-T세포를 제조한 후 이의 활성을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 CAR-T세포는 EGFRvIII를 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성을 보이며, 뇌암을 유발한 동물모델에서의 유의미하게 우수한 치료 효과를 보임을 확인하였다.
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caatggaggg 660 gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg atcaccgtct cctca 705 <210> 71 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L2_Long linker <400> 71 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Met Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His Ala Met His Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Ala Met Ser 165 170 175 His Asp Gly Thr Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Ile 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Glu Gly 210 215 220 Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr Trp Gly Arg Gly Thr Met 225 230 235 240 Ile Thr Val Ser Ser 245 <210> 72 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L2_Long linker <400> 72 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctct agttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctggcggcgg aggaagtggc 360 ggagggggat ctcagatgca gctggtggag tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag 420 tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg 480 gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc 540 gtaaccagct acgcagactc cgtgaagggc cgaatcacca tctccagaga caattccaag 600 agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 660 accgcagagg ggcttcggag caatggaggg gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg 720 atcaccgtct cctca 735 <210> 73 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L2_Short linker <400> 73 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 115 120 125 Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Tyr His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Leu Ala Ala Met Ser His Asp Gly Thr Val Thr Ser Tyr Ala Asp 165 170 175 Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala 180 185 190 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Thr Ala Glu Gly Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr 210 215 220 Trp Gly Arg Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 74 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L2_Short linker <400> 74 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctct agttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctcagatgca gctggtggag 360 tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga 420 ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag 480 tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc gtaaccagct acgcagactc cgtgaagggc 540 cgaatcacca tctccagaga caattccaag agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg 600 agagccgagg acacggccgt gtattactgt accgcagagg ggcttcggag caatggaggg 660 gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg atcaccgtct cctca 705 <210> 75 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L3A_Long linker <400> 75 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Met Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His Ala Met His Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Ala Met Ser 165 170 175 His Asp Gly Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Ile 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Glu Gly 210 215 220 Pro Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr Trp Gly Arg Gly Thr Met 225 230 235 240 Ile Thr Val Ser Ser 245 <210> 76 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L3A_Long linker <400> 76 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctggcggcgg aggaagtggc 360 ggagggggat ctcagatgca gctggtggag tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag 420 tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg 480 gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc 540 gaaaccagct acgcagactc cgtgaagggc cgaatcacca tctccagaga caattccaag 600 agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 660 accgcagagg ggccacggag caatggaggg gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg 720 atcaccgtct cctca 735 <210> 77 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L3A_Short linker <400> 77 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 115 120 125 Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Tyr His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Leu Ala Ala Met Ser His Asp Gly Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp 165 170 175 Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala 180 185 190 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Thr Ala Glu Gly Pro Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr 210 215 220 Trp Gly Arg Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 78 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L3A_Short linker <400> 78 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctcagatgca gctggtggag 360 tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga 420 ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag 480 tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc gaaaccagct acgcagactc cgtgaagggc 540 cgaatcacca tctccagaga caattccaag agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg 600 agagccgagg acacggccgt gtattactgt accgcagagg ggccacggag caatggaggg 660 gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg atcaccgtct cctca 705 <210> 79 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L3B_Long linker <400> 79 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Glu Thr Ser 85 90 95 Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Met Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His Ala Met His Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Ala Met Ser 165 170 175 His Asp Gly Thr Lys Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Ile 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Glu Gly 210 215 220 Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr Trp Gly Arg Gly Thr Met 225 230 235 240 Ile Thr Val Ser Ser 245 <210> 80 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L3B_Long linker <400> 80 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg aaacttctat agttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctggcggcgg aggaagtggc 360 ggagggggat ctcagatgca gctggtggag tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag 420 tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg 480 gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc 540 aaaaccagct acgcagactc cgtgaagggc cgaatcacca tctccagaga caattccaag 600 agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 660 accgcagagg ggcttcggag caatggaggg gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg 720 atcaccgtct cctca 735 <210> 81 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L3B_Short linker <400> 81 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Glu Thr Ser 85 90 95 Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 115 120 125 Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Tyr His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Leu Ala Ala Met Ser His Asp Gly Thr Lys Thr Ser Tyr Ala Asp 165 170 175 Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala 180 185 190 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Thr Ala Glu Gly Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr 210 215 220 Trp Gly Arg Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 82 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L3B_Short linker <400> 82 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg aaacttctat agttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctcagatgca gctggtggag 360 tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga 420 ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag 480 tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc aaaaccagct acgcagactc cgtgaagggc 540 cgaatcacca tctccagaga caattccaag agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg 600 agagccgagg acacggccgt gtattactgt accgcagagg ggcttcggag caatggaggg 660 gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg atcaccgtct cctca 705 <210> 83 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Glu Gly 210 215 220 Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr Trp Gly Arg Gly Thr Met 225 230 235 240 Ile Thr Val Ser Ser 245 <210> 84 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H2C_Long linker <400> 84 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctggcggcgg aggaagtggc 360 ggagggggat ctcagatgca gctggtggag tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag 420 tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg 480 gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc 540 aaaaccagct acgcagactt ggtgaagggc cgaatcacca tctccagaga caattccaag 600 agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 660 accgcagagg ggcttcggag caatggaggg gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg 720 atcaccgtct cctca 735 <210> 85 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H2C_Short linker <400> 85 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Asp Asn Ser Asp Thr Ser 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 115 120 125 Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Tyr His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Leu Ala Ala Met Ser His Asp Gly Thr Lys Thr Ser Tyr Ala Asp 165 170 175 Leu Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ala 180 185 190 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Thr Ala Glu Gly Leu Arg Ser Asn Gly Gly Ala Phe Glu Thr 210 215 220 Trp Gly Arg Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 86 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H2C_Short linker <400> 86 tcctatgagc tgacacagcc cccctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgtact gccaaaacat tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccagttcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattattg tcaatcagta gacaacagtg atacttctgt ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtggc ggaggcggat ctcagatgca gctggtggag 360 tccgggggag gcgtggtcca gcctgggaag tccctgagac tttcctgtgc agcgtctgga 420 ttcaccttca gttaccatgc catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag 480 tggctggcag ctatgtcaca tgatggaacc aaaaccagct acgcagactt ggtgaagggc 540 cgaatcacca tctccagaga caattccaag agtgcgttgt atctacaaat gaacagtctg 600 agagccgagg acacggccgt gtattactgt accgcagagg ggcttcggag caatggaggg 660 gcttttgaga cttggggccg cgggacaatg atcaccgtct cctca 705

Claims (31)

  1. a) 서열번호 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
    b) 서열번호 27로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv;
    c) 서열번호 37로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 38로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv;
    d) 서열번호 47로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv; 및
    e) 서열번호 57로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 58로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 scFv을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 19로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 29로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 30으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 39로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 40으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 49로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 50으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  13. 삭제
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 59로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 60으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 (GGGGS)m 링커로 연결되며, 상기 m은 1 내지 10인 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 68로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 70으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 72로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 74로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 75로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 76으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 78로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 80으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 82로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 84로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 86으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화;되는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 EGFRvIII 특이적 CAR는 신호 펩티드, 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 줄기 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 및 CD8 힌지로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 막 관통 도메인은 FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, T 세포 수용체의 알파 쇄, T 세포 수용체의 베타 쇄 및 T 세포 수용체의 제타 쇄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 막관통 도메인인 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  22. 제 19항에 있어서,
    상기 세포내 전달 도메인은 CD3ζ, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 및 TNFSF14로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
  23. 제 1항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제 1항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  25. 제 1항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, EGFRvIII 특이적 CAR의 생산 방법.
  26. 제 1항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 T세포는 알파 베타 T세포, 감마 델타 T세포 또는 NKT세포인, 형질전환된 T세포.
  28. 제 26항에 있어서,
    상기 T세포는 동종 T세포, 자가 T세포, 조작된 자가 T세포 (eACT), 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)인, 형질전환된 T세포.
  29. 제 1항, 제 6항, 제 8항, 제 10항, 제 12항, 제 14항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR; 또는 제 26항의 형질전환된 T세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  31. 제 29항에 있어서,
    상기 암은 뇌암, 유방암, 폐암, 편평세포암 및 항문암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101870145B1 (ko) * 2017-07-19 2018-06-25 주식회사 파멥신 신규 EGFRvlll 항체 및 이를 포함하는 조성물
KR20210049916A (ko) * 2018-09-05 2021-05-06 공석경 고형암을 위한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t세포

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230159618A1 (en) * 2017-07-25 2023-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhanced chimeric antigen receptors and use thereof
MA51428A (fr) * 2017-12-22 2020-11-04 Bluebird Bio Inc Récepteur d'antigène chimérique multivalent
KR101953299B1 (ko) * 2018-08-02 2019-02-28 의료법인 성광의료재단 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 이용

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101870145B1 (ko) * 2017-07-19 2018-06-25 주식회사 파멥신 신규 EGFRvlll 항체 및 이를 포함하는 조성물
KR20210049916A (ko) * 2018-09-05 2021-05-06 공석경 고형암을 위한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t세포

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