CN117304342A - 嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供嵌合抗原受体、核酸、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其应用，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。本发明的嵌合抗原受体靶向NKp30受体配体，对肿瘤细胞的杀伤活性高，转基因免疫细胞表面NKp30受体表达丰度高。由此，本发明的嵌合抗原受体或表达该嵌合抗原受体的转基因免疫细胞能有效杀伤B7H6阳性肿瘤细胞，并且安全性高。

Description

嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种嵌合抗原受体、核酸、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的效果。CAR分子的抗原识别区通常采用来自抗体的scFv序列，该序列通常来自鼠、兔、羊驼等种属，具有较强的免疫原性。即使对其序列进行人源化改造，仍然存在一定的免疫原性，产生抗药物抗体(ADA)，削弱CAR-T细胞在体内的持久性。近年来，有许多新技术应用于解决该问题，例如采用天然受体蛋白序列作为感受器，以降低免疫原性。
NKp30受体是一种天然的NK细胞活化性受体，在NK细胞上高表达，可识别B7H6分子，进而介导细胞毒性作用。B7H6是B7家族中的一员，B7H6分子通常在多种原发肿瘤细胞上高表达，包括白血病、淋巴瘤、结直肠癌、胃癌和胰腺癌等，而在正常组织细胞上几乎不表达。目前，以NKp30胞外段作为B7H6识别的感受器，以此为基础构建的CAR-T细胞的功能已经在研究中得到验证(An NKp30-based chimeric antigen receptor promotes Tcelleffector functions and antitumor efficacy in vivo.J Immunol.2012Sep 1；189(5):2290-9.doi:10.4049/jimmunol.1103495.专利申请号US14342060，US16882800)。该文献或专利以NKp30氨基酸1-139位为胞外段，构建了表达嵌合抗原受体的T细胞和其他细胞，并观察到免疫细胞对B7H6阳性肿瘤细胞的杀伤活性提高。
基于以上研究和开发现状，有待于进一步研究杀伤活性更高、安全性更好的嵌合抗原受体。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了嵌合抗原受体、核酸、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其应用，本发明的嵌合抗原受体靶向NKp30受体配体，对肿瘤细胞的杀伤活性高，转基因免疫细胞表面NKp30受体表达丰度高。由此，本发明的嵌合抗原受体或表达该嵌合抗原受体的转基因免疫细胞能有效杀伤B7H6阳性肿瘤细胞，并且安全性高。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
自然杀伤(NK)细胞是抗肿瘤免疫的主要成员之一，其可通过多种途径参与抗肿瘤免疫应答。NK细胞表面高表达NK细胞毒性受体(NCR)NKG2D、NKp30、NKp44与NKp46等，其相关配体往往在恶性转化或衰老的细胞上高表达。当NK细胞识别相关配体后可介导强效的细胞毒性作用，清除恶性转化或衰老的细胞。近年来的研究发现，NKp30存在多种变体，分别为NKp30a、NKp30b、NKp30c、NKp30d、NKp30e与NKp30f。不同变体之间的功能存在显著差异。激活NKp30a后，可介导NK细胞最强的杀伤活性与分泌IFN-γ能力，其次是NKp30b，而激活NKp30c后，NK细胞的杀伤活性与分泌IFN-γ能力没有明显提高，反而促进了分泌免疫抑制因子IL-10的能力。
由此，发明人基于天然NKp30a序列，保留了NKp30a序列中第143位的精氨酸，并通过大量试验筛选出了一条NKp30a氨基酸序列(1-147)。进一步试验结果证明，基于该NKp30a氨基酸序列构建的嵌合抗原受体，对NK细胞的激活作用显著增强。由此得到的转基因免疫细胞能有效杀伤B7H6阳性肿瘤细胞，并且安全性高。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
根据本发明实施例的嵌合抗原受体对肿瘤细胞杀伤活性高，转基因免疫细胞表面NKp30受体表达丰度高。由此，本发明的嵌合抗原受体对NK细胞的激活作用显著增强，基于此得到的转基因免疫细胞能有效杀伤B7H6阳性肿瘤细胞，并且安全性高。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。所述核酸包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码前述的嵌合抗原受体。根据本发明实施例的核酸可编码对NK细胞激活作用显著增强的嵌合抗原受体。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。所述表达载体携带前述的核酸。由此，利用构建得到的载体，可有效表达前述嵌合抗原受体和/或前述IL15/IL15Ra融合蛋白。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞。所述转基因免疫细胞包括：
表达前述的嵌合抗原受体；或者携带前述的核酸或前述的表达载体。
根据本发明实施例的免疫细胞是通过转染或者转化所述载体或转化子获得的，所述细胞在合适条件下可高效表达前述嵌合抗原受体和/或IL15/IL15Ra融合蛋白。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。所述药物组合物包括：
前述的嵌合抗原受体、前述的核酸、前述的表达载体或前述的转基因免疫细胞。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合抗原受体、核酸、表达载体和转基因免疫细胞所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的第六方面，本发明提出了前述的嵌合抗原受体、前述的核酸、前述的表达载体或前述的转基因免疫细胞或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗B7H6靶点介导的相关疾病。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合抗原受体、核酸、表达载体和转基因免疫细胞所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1的不同嵌合抗原受体的结构示意图；
图2为本发明实施例2的不同NKR-NK细胞对NCI-H716细胞杀伤效率的统计结果图；
图3为本发明实施例2的NK-92与NKR3-NK-92细胞在不同IL-2培养浓度下的存活率变化曲线图；
图4为本发明实施例2的NK-92与NKR3-NK-92细胞在不同IL-2培养浓度时对NCI-H716细胞杀伤效率的统计结果图；
图5为本发明实施例3的外周血来源NKR3-NK细胞对人结直肠癌NCI-H716细胞荷瘤小鼠模型的抑瘤效果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
术语及定义
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“(G4S)n”等同于“(Gly4Ser)n”，表示4个甘氨酸和1个丝氨酸重复n次，是目前应用广泛的一类连接肽，可位于VHC端和VLN端之间，也可位于VLC端和VHN端之间。目前常用的是(G4S)3，其中甘氨酸是分子质量最小、侧链最短的氨基酸，可以增加侧链的柔性，丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可以增加连接肽的亲水性。因此，(G4S)3具有较好的稳定性和活力。
在本文中，“碳端”和“C端”同义；“氮端”和“N端”同义。
本发明提出了一种嵌合抗原受体、核酸、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其应用，下面将分别对其进行详细描述。
嵌合抗原受体
本发明提供一种嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
需要说明的是，本发明涉及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
根据本发明实施例的嵌合抗原受体对肿瘤细胞杀伤活性高，转基因免疫细胞表面NKp30受体表达丰度高。由此，本发明的嵌合抗原受体对NK细胞的激活作用显著增强，基于此得到的转基因免疫细胞能有效杀伤B7H6阳性肿瘤细胞，并且安全性高。
在本文中，术语“CSR”，等同于“嵌合转换受体”，等同于“Chimeric SwitchReceptor”，是一种人工构建的重组受体，包含胞外的抗原识别结构域、跨膜区及胞内区的信号转导结构域。与嵌合抗原受体“CAR”的胞外抗原识别结构域由单链抗体构成不同，嵌合转换受体的胞外抗原识别结构域主要由免疫细胞的抑制性表面受体构成。
在本文中，术语“表达嵌合抗原受体的免疫细胞”，等同于“CAR-免疫细胞”，是一种转基因免疫细胞，表达特定的嵌合抗原受体，进一步用于疾病的预防和/或治疗。在一些情况下，结合上下文，等同于“嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞”。
根据本发明的实施例，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
根据本发明的实施例，所述共刺激因子结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端相连。
根据本发明的实施例，所述共刺激结构域选自CD3ζ、CD28、4-1BB、2B4、DAP10、DAP12、CD27、CD40、OX40、ICOS胞内段或其片段的至少之一。
根据本发明的实施例，所述共刺激结构域为CD28的胞内段或其片段。
根据本发明的实施例，所述共刺激结构域具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内段或其片段。
根据本发明的实施例，所述胞内信号传导结构域具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述跨膜区为CD28的跨膜段或其片段。
根据本发明的实施例，所述跨膜区具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
由此，可得到肿瘤细胞杀伤活性进一步提高，并且安全性更高的转基因免疫细胞。
核酸
本发明提供一种核酸。所述核酸包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码前述的嵌合抗原受体。
根据本发明实施例的核酸可编码对NK细胞激活作用显著增强的嵌合抗原受体。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。由此，进一步提高前述嵌合抗原受体在免疫细胞上的表达水平。
根据本发明的实施例，所述核酸进一步包括第二核酸分子，所述第二核酸分子和第一核酸分子相连，所述第二核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15Rα和IL-15。根据本发明实施例的包含上述核酸的免疫细胞，能同时表达嵌合抗原受体和融合蛋白。其中，嵌合抗原受体能够使得免疫细胞靶向NKp30受体配体，定位至表达该配体的细胞表面；融合蛋白进一步促进免疫细胞的活化和增殖，维持免疫细胞在肿瘤局部微环境中的数量和活性，使其保持强大的肿瘤杀伤活性，能够有效避免全身高剂量或反复多次注射带来的毒副作用。
根据本发明的实施例，所述IL-15Rα的N端与所述IL-15的C端相连，或者所述IL-15的N端与所述IL-15Rα的C端相连。
根据本发明的实施例，所述IL-15Rα具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。由此，得到
根据本发明的实施例，所述IL-15具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
根据本发明实施例的包含上述核酸的免疫细胞，细胞膜表面能同时表达嵌合抗原受体和IL15/IL15Ra融合蛋白。由此，膜表达的IL15/IL15Ra融合蛋白可进一步提高免疫细胞的体内存活周期和扩增能力，降低IL15相关的副作用，促进免疫应答，由此，进一步增强本发明免疫细胞的体内抗肿瘤活性。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括连接肽。
根据本发明的实施例，所述IL-15Rα的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述IL-15的N端相连接；或
所述IL-15的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述IL-15Rα的N端相连接。
根据本发明的实施例，所述信号肽选自IgE信号肽、CD8α信号肽与GM-CSF信号肽之一。
根据本发明的实施例，所述信号肽为IgE信号肽。
根据本发明的实施例，所述IgE信号肽具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。由此，进一步提高IL15/IL15Ra融合蛋白的膜表达水平。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：21或23所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第二核酸分子具有如SEQ ID NO：22或24所示的核苷酸序列。由此，进一步提高前述IL15/IL15Ra融合蛋白在免疫细胞膜的表达水平。
根据本发明的实施例，所述核酸还包括第四核酸分子，所述第四核酸分子编码第一连接子，所述第一核酸分子和第二核酸分子通过所述第四核酸分子相连。
根据本发明的实施例，还包括第五核酸分子，所述第五核酸分子编码第二连接子。
其中，所述第一核酸分子和第二核酸分子通过所述第四核酸分子相连、所述第二核酸分子和第三核酸分子通过所述第五核酸分子相连；或者
所述第一核酸分子和第三核酸分子通过所述第四核酸分子相连、所述第三核酸分子和第二核酸分子通过所述第五核酸分子相连。
根据本发明的实施例，所述第一连接子或第二连接子各自独立地选自P2A、T2A、E2A和F2A中的至少之一。由此，可得到细胞膜上较均一表达嵌合抗原受体和IL15/IL15Ra融合蛋白的免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述第一连接子和第二连接子均为P2A。由此，可得到细胞膜上均一表达嵌合抗原受体和IL15/IL15Ra融合蛋白的免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述第一连接子和第二连接子均具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。由此，得到细胞膜上均一表达嵌合抗原受体和IL15/IL15Ra融合蛋白的免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述第四核酸分子和第五核酸分子均具有如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。由此，进一步提高前述IL15/IL15Ra融合蛋白在免疫细胞膜的表达水平。
根据本发明的实施例，所述核酸具有如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列。由此，可得到前述嵌合抗原受体表达丰度高的免疫细胞。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本文中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本发明中的分子序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
表达载体
本发明提供一种表达载体。所述表达载体携带上述的核酸。由此，构建得到的表达载体可在宿主细胞中表达本发明的嵌合抗原受体和/或前述IL15/IL15Ra融合蛋白。
在将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。
在本文中，术语“载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
根据本发明的实施例，可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得。本发明中的载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在本文中，术语“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的免疫细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的核酸分子的表达，进而实现所述核酸分子编码的蛋白质在细胞膜的大量表达，由此获得转基因免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核载体或原核载体。
根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒任选自反转录病毒、慢病毒和腺相关病毒之一。
根据本发明的实施例，所述表达载体是慢病毒表达载体。
细胞
本发明提供一种转基因免疫细胞。所述转基因免疫细胞包括：
表达前述的嵌合抗原受体；或者携带前述的核酸或前述的表达载体。
根据本发明实施例的免疫细胞是通过转染或者转化所述载体或转化子获得的，所述细胞在合适条件下可高效表达前述嵌合抗原受体或前述嵌合抗原受体和IL15/IL15Ra融合蛋白。
根据本发明的实施例，所述转基因免疫细胞的免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、γδT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、外周血NK细胞、脐带血NK细胞、NK-92细胞、iPSC来源的或胚胎干细胞培养分化的上述任意一种免疫细胞的至少之一。本发明的前述嵌合抗原受体可通过表达载体(比如慢病毒载体)对T、NK、NKT、γδT、巨噬细胞、iPSC等免疫细胞转导，从而表达在这些免疫细胞表面。
根据本发明的实施例，所述转基因免疫细胞的免疫细胞为NK细胞。
本发明对NK细胞的来源不做严格限制，可以是外周血NK细胞、脐带血NK细胞、iPSC或NK-92细胞等来源的NK细胞。
药物组合物
本发明提供一种药物组合物。所述药物组合物包括：
前述的嵌合抗原受体、前述的核酸、前述的表达载体或前述的转基因免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的嵌合抗原受体、核酸、表达载体或转基因免疫细胞不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合抗原受体、核酸、表达载体和转基因免疫细胞所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
用途
本发明提供一种前述的嵌合抗原受体、前述的核酸、前述的表达载体、前述的慢病毒载体、前述的转基因免疫细胞或前述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗B7H6靶点介导的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述B7H6靶点介导的相关疾病为B7H6阳性肿瘤或癌症。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肝癌、胆管癌、食管癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、胃肉瘤、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌和前列腺癌之一。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌症为结直肠癌。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合抗原受体、核酸、表达载体和转基因免疫细胞所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
预防和/或治疗肿瘤的方法
本发明提供了一种预防和/或治疗B7H6靶点介导的疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的上述转基因免疫细胞或上述药物组合物。
根据本发明的实施例，所述B7H6靶点介导的相关疾病为B7H6阳性肿瘤或癌症。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肝癌、胆管癌、食管癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、胃肉瘤、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌和前列腺癌之一。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌症为结直肠癌。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合抗原受体、核酸、表达载体和转基因免疫细胞所描述的特征和优点，同样适用于该疾病的治疗方法，在此不再赘述。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的转基因免疫细胞或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射方式被给药。
在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或转基因免疫细胞给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述含有嵌合抗原受体的细胞的药物给予有需要的个体。
本发明所述的转基因免疫细胞和药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选地，有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1：核苷酸/氨基酸序列说明表
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下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。
实施例1：表达不同NKR结构的NK细胞的制备
1、不同NKR结构的构建
将不同的CSR序列通过全基因合成，并通过酶切位点XbaI和BamHI克隆至慢病毒载体pCDG-EF1-MCS-TA2-copGFP，经测序验证正确后得到pCDH-EF1a-NKR1、pCDH-EF1a-NKR2与pCDH-EF1a-NKR3。
本实施例嵌合抗原受体的基因元件结构示意图见图1，核苷酸/氨基酸序列见表1。其中，NKp30 1-147、NKp30 1-139和NKp30 1-201的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：1～3，NKR1、NKR2和NKR3的核苷酸序列见SEQ ID NO：32、7、29。其中NKR1序列参考US14342060公开序列。
2、慢病毒的包装
取处于对数生长期的293T细胞5×106接种于10cm的细胞培养皿中，加入10mLDMEM培养基，37℃、5％ CO2培养箱中培养过夜。待细胞培养皿中细胞密度达到80-90％时，更换10mL新鲜的DMEM培养基，并将细胞培养皿继续置于培养箱中备用。配制慢病毒包装体系，分别将慢病毒包装辅助质粒6μg psPAX2与3μg pMD2.G，6μg目的基因载体质粒加入至体积为250μL无血清DMEM培养基中配制质粒混合液，混合均匀。将15μL加到体积为235μL无血清DMEM培养基中，混合均匀。将/>混合液一次性加入到上述质粒混合液中，混匀，室温孵育15min。将混合液加入293T细胞培养皿中。24h后进行换液，将培养皿放回37℃、5％ CO2培养箱中，48h后收取细胞上清，400×g离心5min，去除细胞碎片，将上清用0.45μm的滤头过滤至50mL离心管中。加入5×PEG8000溶液进行病毒液浓缩，上下颠倒离心管混合均匀，放于4℃冰箱中过夜。4℃，4000×g离心20min，弃上清，加适量无血清DMEM重悬病毒沉淀，转移入EP管中，放于-80℃冰箱中保存。
3、慢病毒感染人NK-92细胞
吸取处于生长对数期的NK-92细胞，100×g离心5min收获细胞，加入适量α-MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105个/mL。在24孔板中分别接入5×105个NK-92细胞、0.2mL病毒浓缩液、0.8mLα-MEM培养基与鱼精蛋白(终浓度8μg/mL)，混合均匀。置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。24h后，观察细胞状态，换液，将感染的细胞转移入EP管中，100×g离心5min，加入少量新鲜α-MEM培养基重悬细胞，将细胞转入细胞培养瓶中，加入10mL新鲜α-MEM培养基和IL-2(终浓度为200IU/mL)继续培养48h。将细胞转移入流式管中，加入3mL 1×PBS溶液，100×g离心5min，弃上清，弹起细胞沉淀，使用1×PBS溶液再次洗涤一遍。使用流式仪检测GFP的表达率。继续扩大培养，调整感染后NK-92细胞的状态进行扩增。将感染后的NK-92细胞通过流式仪分选GFP阳性的NKR-NK92细胞，用于后期实验。
实施例2：不同NKR-NK细胞的生物学功能考察
在该实施例中，发明人考察了实施例1得到的不同NKR-NK细胞在体外的杀伤活性、存活率与对IL-2的依赖度。
1、经不同NKR受体修饰后NK-92细胞的体外杀伤活性考察
选择NKp30配体B7H6高表达的结直肠癌细胞系NCI-H716细胞作为靶细胞，对不同NKR-NK细胞进行体外杀伤活性检测。
具体方法如下：使用CFSE对NCI-H716细胞进行荧光标记，按照2x104个细胞/孔接入96孔板中，再将NK-92或不同NKR-NK-92细胞分别接板，与NCI-H716细胞共孵育4h。再加入PI染色区分死活细胞，通过流式细胞仪进行检测杀伤效率。考察效应细胞与靶细胞之比为2∶1。
结果如图2所示。
体外杀伤活性考察结果显示：(1)经本发明实例1的嵌合抗原受体基因修饰的NKR2-NK-92或NKR3-NK-92细胞，对B7H6阳性的NCI-H716细胞的杀伤效率均高于NK-92细胞。(2)NKR2-NK-92、NKR3-NK-92细胞的杀伤效率明显优于NKR1-NK-92(参考US14342060公开序列)细胞。
2、NKR3基因修饰促进NK细胞的存活
发明人进一步验证了膜表达超级IL-15对NK-92细胞的体外存活的促进作用。
具体方法如下：分别将相同细胞数量的NK92和NKR3-NK92细胞接板于24孔板中，并设置不同的IL-2浓度(200IU/mL和0IU/mL)，每24h进行一次流式细胞术检测凋亡率。流式细胞术检测凋亡率根据试剂盒说明书(联科生物，货号AP101)的步骤进行操作，简要为：收集细胞于EP管中，加入1xPBS溶液离心洗涤一次，重悬细胞。每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI。轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5min，重悬细胞进行流式检测。细胞活率为Annexin V-FITC和PI染色双阴性的比例。
培养至96h的NK细胞存活率考察结果如图3所示。
NK-92细胞的体外存活率考察结果显示：NK92组在无IL-2存在时(IL-2 0IU/mL)，细胞存活率从24h开始明显降低，至72h时大部分细胞已发生凋亡；而NKR3-NK-92组细胞即使在完全撤除IL-2的条件下仍能保持较高的细胞活率，很少细胞发生凋亡。
上述结果显示，NKR3-NK-92中膜表达超级IL-15可进一步提高NKR-NK细胞在体内的长期存活和扩增能力。
3、NKR3基因修饰降低NK细胞维持高杀伤活性对IL-2的依赖
发明人进一步验证了NKR3基因中膜表达超级IL-15可降低NK细胞维持高杀伤活性对IL-2的依赖。
具体方法如下：将NK-92与NKR3-NK-92细胞分别在0或200IU/mL浓度IL-2条件下培养48h。再使用CFSE对NCI-H716细胞进行荧光标记，按照2x104/孔接入96孔板中，再将不同NK细胞分别接板，与NCI-H716细胞共孵育4h。再加入PI染色区分死活细胞，通过流式细胞仪进行检测杀伤效率。考察效应细胞与靶细胞之比为2∶1。
试验结果如图4所示。
NK-92细胞的杀伤活性考察结果显示：(1)无IL-2的培养条件下，NK-92细胞的杀伤效率明显下降。(2)在浓度为0和200IU/mL IL-2的培养条件下，经NKR3基因修饰的本发明NKR3-NK-92细胞的杀伤效率无明显差异。(3)本发明NKR3-NK-92细胞的杀伤效率显著高于NK-92细胞。
上述结果显示，NKR3-NK-92中膜表达超级IL-15可降低NK细胞维持高杀伤活性对IL-2的依赖。
实施例3：NKR3-NK细胞的体内抑瘤活性考察
发明人以人结直肠癌NCI-H716细胞建立小鼠皮下荷瘤模型，以NKR3慢病毒感染人外周血原代NK细胞制备外周血来源NKR-NK细胞，观察原代NKR3-NK细胞对结直肠癌荷瘤模型的治疗作用。
具体方法如下：选择6周龄NCG小鼠进行腋下皮下荷瘤，待肿瘤体积达50mm3时开始进行NK细胞治疗。治疗前测量肿瘤体积大小，根据肿瘤体积大小随机分为未治疗组、NK细胞治疗组和NKR3-NK细胞治疗组。在NK细胞治疗组，通过尾静脉回输NK细胞，对小鼠每2天治疗1次，共治疗3次，每次尾静脉回输剂量为8×106CD56+NK细胞，并每2天腹腔注射IL-2维持NK细胞存活；在NKR3-NK细胞治疗组，通过尾静脉回输NKR3-NK细胞，单次治疗，剂量分别为2×106NKR3-NK细胞/只，且不进行IL-2注射。每周两次测量肿瘤体积大小，绘制肿瘤生长曲线，统计肿瘤抑制率。
试验结果如图5所示。
体内抑瘤活性考察结果显示：基于本发明实施例1的NKR3制备的外周血来源NKR3-NK细胞较NK细胞治疗组(对照组，NK细胞未携带任何形式的CAR或CSR)，具有显著增强的抑制肿瘤生长的效果，并且回输NK细胞剂量更低。
上述结果说明，本发明的NKR3-NK细胞对结直肠癌肿瘤具有强大的抗肿瘤效果，并且应用时剂量更低，有望突破免疫细胞疗法对实体瘤治疗效果差的瓶颈。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括：
胞外区，所述胞外区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
2.根据要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域；
任选地，所述共刺激因子结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端相连；
任选地，所述共刺激结构域选自CD3ζ、CD28、4-1BB、2B4、DAP10、DAP12、CD27、CD40、OX40、ICOS胞内段或其片段的至少之一；
任选地，所述共刺激结构域为CD28的胞内段或其片段；
任选地，所述共刺激结构域具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内段或其片段；
任选地，所述胞内信号传导结构域具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
任选地，所述跨膜区为CD28的跨膜段或其片段；
任选地，所述跨膜区具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；
任选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
3.一种核酸，其特征在于，包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体；
任选地，所述第一核酸分子具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，进一步包括第二核酸分子，所述第二核酸分子和第一核酸分子相连，所述第二核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15Rα和IL-15；
任选地，所述IL-15Rα的N端与所述IL-15的C端相连，或者所述IL-15的N端与所述IL-15Rα的C端相连；
任选地，所述IL-15Rα具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
任选地，所述IL-15具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白进一步包括连接肽；
任选地，所述IL-15Rα的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述IL-15的N端相连接；或
所述IL-15的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述IL-15Rα的N端相连接；
任选地，所述连接肽选自(G4S)n、ESGRSGGGGSGGGGS、EGKSSGSGSESKST、EGKSSGSGSESKSTQ、GSTSGSGKSSEGKG、KESGSVSSEQLAQFRSLD、ESGSVSSEELA FRSLD、SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ的至少之一，n为不为零的整数；
任选地，所述连接肽选自(G4S)n，n为2～6之间的任意整数；
任选地，所述连接肽是(G4S)3；
任选地，所述连接肽是SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ；
任选地，所述融合蛋白进一步包括信号肽；
任选地，所述信号肽的C端与所述IL-15Rα的N端相连，或者所述信号肽的C端与所述IL-15的N端相连；
任选地，所述信号肽选自IgE信号肽、CD8α信号肽与GM-CSF信号肽之一；
任选地，所述信号肽为IgE信号肽；
任选地，所述IgE信号肽具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：21或23所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二核酸分子具有如SEQ ID NO：22或24所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，进一步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子编码FcRγ蛋白；
任选地，所述FcRγ蛋白具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；
任选地，所述第三核酸分子具有如SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的核酸，其特征在于，还包括第四核酸分子，所述第四核酸分子编码第一连接子，所述第一核酸分子和第二核酸分子通过所述第四核酸分子相连；
任选地，还包括第五核酸分子，所述第五核酸分子编码第二连接子；
其中，所述第一核酸分子和第二核酸分子通过所述第四核酸分子相连、所述第二核酸分子和第三核酸分子通过所述第五核酸分子相连；或者
所述第一核酸分子和第三核酸分子通过所述第四核酸分子相连、所述第三核酸分子和第二核酸分子通过所述第五核酸分子相连；
任选地，所述第一连接子或第二连接子各自独立地选自P2A、T2A、E2A和F2A中的至少之一；
任选地，所述第一连接子和第二连接子均为P2A；
任选地，所述第一连接子和第二连接子均具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；
任选地，所述第四核酸分子和第五核酸分子均具有如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求3～7任一项所述的核酸；
任选地，所述表达载体是非致病性病毒载体；
任选地，所述非致病性病毒任选自反转录病毒、慢病毒和腺相关病毒之一；
任选地，所述表达载体是慢病毒表达载体。
9.一种转基因免疫细胞，其特征在于，包括：
表达权利要求1～2任一所述的嵌合抗原受体；或者
携带权利要求3～7任一项所述的核酸、或者权利要求8所述的表达载体；
任选地，所述转基因免疫细胞的免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、γδT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、外周血NK细胞、脐带血NK细胞、NK-92细胞、iPSC来源的或胚胎干细胞培养分化的上述任意一种免疫细胞的至少之一；
任选地，所述转基因免疫细胞的免疫细胞为NK细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～2任一所述的嵌合抗原受体、权利要求3～7任一项所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的转基因免疫细胞；
任选地，进一步包括：药学上可接受的辅料。
11.权利要求1～2任一所述的嵌合抗原受体、权利要求3～7任一项所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的转基因免疫细胞或权利要求10所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗B7H6靶点介导的相关疾病；
任选地，所述B7H6靶点介导的相关疾病为B7H6阳性肿瘤或癌症；
任选地，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤；
任选地，所述癌症为结直肠癌。
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