CN101985476A - 抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人NKp30的单克隆抗体，本发明还涉及生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及单克隆抗体的制备方法及鉴定方法，其制备方法为：重组NKp30蛋白的表达、复性和纯化，用重组NKp30蛋白免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水，用ProteinG亲和层析法纯化抗体。单克隆抗体的鉴定方法包括：效价的测定、亲和常数的测定、抗体亚类的测定和特异性的鉴定。本发明还涉及单克隆抗体的应用，本发明的单克隆抗体可以用于NKp30的免疫印迹、免疫沉淀、ELISA和流式细胞术检测。

Description

抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及到一种抗人NKp30单克隆抗体，具体地说，针对NKp30第19至130位氨基酸中序列有反应性的单克隆抗体。本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明还涉及单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。本发明还涉及单克隆抗体的应用及其试剂盒。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)作为主要的天然免疫细胞，在机体杀伤病毒感染细胞以及肿瘤细胞方面起着重要的作用，NK细胞通过其表面不同的活化型受体和抑制型受体来控制NK细胞的活化、增殖和杀伤等功能。NK细胞发挥其细胞毒作用是由NK细胞表面的活化型受体介导的，在这些受体中，有一类直接参与自然细胞毒作用的活化型受体，称为自然细胞毒受体(natural cytotoxicity receptors，NCRs)，它们相对特异地表达在NK细胞表面。NKp30属于NCR家族受体，也被称为NCR3，在静息或活化的NK细胞表面均有表达。NKp30在介导NK细胞杀伤中发挥着重要的作用，另外，NKp30能够介导NK细胞与树突状细胞(DC)之间的交互调节(cross-talk)，从而实现对天然免疫和获得性免疫的调节。

人NKp30是具有190个氨基酸的I型跨膜蛋白，胞外含有一个19个氨基酸组成的信号肽，成熟的多肽为171个氨基酸序列。成熟的NKp30胞外段含有一个IgV结构域，作为识别配体的功能区域，胞外区有两个糖基化位点。跨膜区由19个氨基酸组成，包含一个带正电的精氨酸，胞内区由33个氨基酸组成，通过和细胞膜的CD3ζ链结合，传递信号。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗人NKp30单克隆抗体，具体地说，针对NKp30第19至130位氨基酸中序列有反应性的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G5。

本发明的又一个目的是提供本发明单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在免疫印迹检测NKp30试验中的应用。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在免疫沉淀NKp30试验中的应用。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在ELISA检测NKp30中的应用。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在流式细胞术检测NKp30试验中的应用。

为此，本发明人原核表达NKp30胞外段重组蛋白，通过复性与纯化，获得重组NKp30蛋白。用重组NKp30蛋白免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水，用Protein G亲和层析纯化抗体。并且对单克隆抗体进行效价测定、亲和常数的测定、Ig亚类的测定和特异性的鉴定。NKp30单克隆抗体的制备，为NKp30分子的检测以及NKp30功能的研究提供了基础，NKp30单克隆抗体可以广泛用于分子免疫学的研究中。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种抗人NKp30的单克隆抗体，其针对人NKp30的第19至130位氨基酸序列有反应性。人NKp30的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，DNA序列如SEQ ID No.1所示，本文中原核重组表达的NKp30的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据以上1所述的单克隆抗体，其为IgG1κ亚类。

3.根据以上1所述的单克隆抗体，其是可以由保藏号为CGMCC No.4244的杂交瘤细胞株3G5分泌产生的单克隆抗体P30-3G5。

4.小鼠杂交瘤细胞株3G5，其保藏号为CGMCC No.4244。

5.根据以上1-3中任一项所述的单克隆抗体在检测NKp30中的应用，其中所述检测是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术来进行的。

6.用于检测NKp30的试剂盒，其包含以上1-3中任一项所述的单克隆抗体。

7.根据以上6的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK细胞系或PBMC细胞上的NKp30。

8.一种检测细胞上的NKp30的方法，该方法包括：(1)将以上1-3中任一项所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。

9.根据以上8的方法，其中所述阳性反应是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术检测进行判断的。

有益效果

本发明提供了一种抗人NKp30的单克隆抗体的制备方法、鉴定及应用，和目前商品化的NKp30抗体(克隆号为y4E6、P30-15等)相比，该抗体具有效价高、特异性高等特点，应用也较为广泛。克隆号为P30-15的单克隆抗体制备的免疫原是转染人NKp30胞外段的细胞系，该单克隆抗体针对的表位是NKp30的空间构象，可以很好用于流式细胞术的检测，但不能用于免疫印迹的检测。

与已有的单克隆抗体不同，我们制备的单克隆抗体所用的免疫原是复性的NKp30重组蛋白，其针对的是包含完整功能区域的NKp30胞外段即NKp30第19位至第130位氨基酸序列，通过ELISA筛选对NKp30重组蛋白高反应性的杂交瘤细胞株。本发明的单克隆抗体与已有的抗体针对的NKp30区域或位点不同，其效价、特异性和应用就有差别。本发明的单克隆抗体具有效价高、特异性高和适用范围广等优点，本发明提供的单克隆抗体可以广泛用于免疫印迹、免疫沉淀、ELISA、流式细胞术等不同手段检测NKp30蛋白，为研究NKp30的功能提供了基础。

发明详述

本发明的一个方面涉及一种对人NKp30有特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体针对NKp30(Genbank登记号CAB54004.1)第19位至130位氨基酸中的序列有反应性，优选所述单克隆抗体是P30-3G5。

本发明的另外一个方面涉及一株稳定分泌抗人NKp30单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G5。

本发明的另外一个方面涉及所述单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。其制备方法为：重组NKp30蛋白的表达、复性和纯化，用重组NKp30蛋白免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水，用Protein G亲和层析纯化抗体。单克隆抗体的鉴定方法包括：效价的测定、亲和常数的测定、抗体亚类的测定和特异性的鉴定。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体在免疫印迹检测NKp30试验中应用。用本发明的单克隆抗体用于免疫印迹试验检测NKp30，结果显示，单克隆抗体能用于免疫印迹试验中检测重组NKp30蛋白和细胞内源表达NKp30蛋白。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体在免疫沉淀NKp30试验中的应用。单克隆抗体与NK92细胞裂解物孵育，加入Protein A/G PLUS-Agarose(Santa Cruz)进行免疫沉淀，对沉淀物进行免疫印迹检测。结果显示，单克隆抗体可以特异的沉淀NKp30，而对照组在相应的位置，没有特异的条带。这证明单克隆抗体可以用于免疫沉淀NKp30试验。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体在ELISA检测NKp30试验中的应用。用本发明的单克隆抗体检测不同浓度的NKp30，结果显示，单克隆抗体能用于ELISA检测NKp30。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体在流式细胞术检测NKp30试验中的应用。用本发明的单克隆抗体可以和NKp30受体阳性细胞结合，而不和NKp30受体阴性细胞结合。表明单克隆抗体能用于流式细胞术检测细胞表面NKp30。

本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。

术语“单克隆抗体的反应性”是指在合适的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。

术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法，从原代培养物或者细胞系获得的单细胞培养物。

根据本发明的公开，选择NKp30蛋白的第19位至130位氨基酸序列，按照本文描述的方法制备有特异性的单克隆抗体对本领域的技术人员而言是显而易见的，应该视为包含在本发明的范围内。

附图说明

图1.原核重组表达载体pET22b-NKp30的构建流程图。

图2.NKp30重组蛋白表达与复性后纯化及鉴定。A，重组蛋白诱导表达的结果；B，重组蛋白的免疫印迹鉴定结果；C，重组蛋白复性和纯化的鉴定结果；D，复性的NKp30蛋白的质谱鉴定结果；E，复性蛋白的活性鉴定结果。

图3.单克隆抗体纯度鉴定结果(M：Marker；1：无还原剂(-DTT)条件下纯化的单克隆抗体；2：有还原剂(+DTT)条件下纯化的单克隆抗体)。

图4.单克隆抗体特异性鉴定结果。A，免疫印迹法鉴定单克隆抗体对NKp30特异性的结果；B，竞争ELISA法鉴定单克隆抗体对NKp30特异性结果。

图5.单克隆抗体用于免疫印迹检测NK30的结果。A，检测重组NKp30蛋白的结果；B，检测天然NKp30蛋白的结果。

图6.单克隆抗体用于免疫沉淀NK30的结果(1：NK92细胞裂解液；2：对照小鼠IgG1κ免疫沉淀物；3：P30-3G5抗体免疫沉淀物)。

图7.单克隆抗体用于ELISA检测NK30的结果。

图8.单克隆抗体用于流式细胞术检测NK30的结果。A，检测NK92和YT细胞表达NKp30的结果；B，检测人外周血单个核细胞表达NKp30的结果，图中的3G5代表P30-3G5抗体。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

实施例1原核重组表达载体pET22b-NKp30的构建

提取NK细胞株NK92细胞(ATCC编号CRL-2407)的mRNA，通过RT-PCR扩增NKp30基因开放阅读框架(ORF)全长序列(Genbank登记号AJ223153)，将其克隆到pMD18-T simple载体(Takara)，构建pMD18-T-NKp30重组载体。通过http://expasy.org/tools/在线软件对NKp30的二级结构进行预测，截取序列以包含完整的IgV结构域且不影响蛋白质二级结构为依据，截取NKp30第19位至130位氨基酸序列进行重组表达，在目的序列的氨基端引入8His-Tag，在目的序列的羧基端加入3个终止密码子。设计上游引物：

5’-GGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATCATCATCTCTGGGTGTCCCAGCCCCC-3’和

下游引物：

5’-CCGCTCGAGTTACTATCATTCTTTCTCCACCACCAGCCGAGTCCCATTCCCTGTCCC-3’

以pMD18-T-NKp30重组载体为模板PCR扩增目的片段，PCR产物经过NdeI和XhoI酶切之后克隆到同样用NdeI和XhoI酶切后的pET-22b(+)载体(Novagen公司，货号TB03812/98)中，转入DH5α菌中，筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定，测序结果表明重组表达载体pET22b-NKp30构建成功。原核重组表达载体pET22b-NKp30的构建的流程见图1所示。

实施例2重组NKp30的表达、复性、纯化、鉴定与活性检测

1.重组NKp30蛋白的诱导表达

将重组表达载体pET22b-NKp30转入到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态(Novagen公司，货号70954-3)中，挑选单克隆菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基中，置于摇床中37℃、200转/分培养至OD_600nm＝0.6-0.8时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃继续培养4-6h诱导蛋白表达。4℃、6000g离心10min，菌沉淀用裂菌缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl pH8.5)洗涤，用高压破碎方法裂菌，4℃、12000g离心10min，分别将上清和沉淀部分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)鉴定，如图2A结果显示，和对照相比，IPTG诱导菌裂解液分离的沉淀组分中在14kDa处有一个明显的条带，表明重组蛋白以包涵体的形式存在。对目的条带进行免疫印迹检测，即小鼠抗His-tag抗体(Abmart公司货号M20001)1∶1000稀释作为一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(Boster公司，货号BA1050)1∶5000稀释作为二抗，化学发光显色(Thermo scientific公司，货号34080)检测，图2B显示，表明诱导表达的蛋白为重组蛋白。

2.重组NKp30蛋白的复性及纯化。

采用稀释复性的方法对重组NKp30蛋白进行复性。具体方法：大量诱导Rosetta(DE3)/pET22b-NKp30菌，通过高压破碎，4℃、12000g离心10min，弃上清，沉淀用包涵体洗涤缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，2M尿素，1mM二硫苏糖醇pH8.5)洗涤3次，每次4℃、12000g离心10min，弃上清。包涵体沉淀用包涵体裂解液(50mM Tris，100mM NaCl，8M尿素，1mM二硫苏糖醇pH8.5)溶解，室温搅拌30-60min。4℃、12000g离心10min，取上清，以1∶500比例缓慢加入到复性缓冲液(50mMTris，100mM NaCl，0.5M L-精氨酸，3mM还原型谷胱甘肽，0.3mM氧化型谷胱甘肽pH 9.5)中，4℃静置48h。复性蛋白用Millipore公司的LabScale TEF system(5kDa浓缩膜)进行浓缩，蛋白浓缩液在透析缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl pH9.0)中透析过夜，用镍柱亲和层析纯化，不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，250mM咪唑洗脱液(50mM Tris，100mMNaCl，250mM咪唑pH9.0)洗脱得到纯度较高的复性效果较好的重组NKp30蛋白。将含有目的蛋白的洗脱液在透析缓冲液(50mM Tris，100mMNaCl pH9.0)中透析过夜，用Millipore浓缩管(5kDa)进行浓缩和Bio-Rad蛋白定量试剂盒进行蛋白定量测定，得到纯度为95％、浓度约为10mg/ml的NKp30重组蛋白。蛋白纯化的结果如图2C所示。

3，重组NKp30蛋白的鉴定与活性检测。

将复性好的NKp30重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，将含有目的蛋白的凝胶进行质谱鉴定，结果显示，有21个不同的肽段和NKp30序列相匹配，结果如图2D所示，划线部分为21个肽段所覆盖的序列，几乎覆盖整个NKp30的胞外端，证明该重组蛋白为重组NKp30蛋白。已有报道Hela细胞表面有NKp30的配体表达，可以通过重组NKp30蛋白(含有8His-Tag)和Hela细胞孵育，加入抗His-Tag的小鼠抗体(Abmart公司，货号M20001)以及PE标记的山羊抗小鼠IgG的二抗(Santa Cruz公司，货号3764)，通过流式细胞仪检测重组NKp30蛋白是否和Hela细胞结合来判断重组NKp30蛋白的活性。如图2E结果显示，复性的重组NKp30蛋白可以与Hela细胞结合，表明复性的重组NKp30蛋白是有生物学活性的。

实施例3抗人NKp30单克隆抗体的制备

1.细胞融合前准备

(1)小鼠免疫及脾细胞制备

抗原免疫小鼠的方法：抗原制备，将纯化的NKp30复性蛋白与等体积完全弗氏佐剂混合，充分乳化形成油包水状，NKp30的终浓度为100μg/ml。取8-10周龄的BALB/c雌鼠进行初次免疫，每只小鼠腹腔注射40-60μg抗原。以后每间隔2周加强免疫一次，抗原量相同加不完全弗氏佐剂。共免疫5次后，ELISA检测小鼠的血清效价达到1∶10⁵时，对小鼠进行冲击免疫一次，腹腔注射40-60μg抗原(不含佐剂)，3天后取小鼠脾细胞用于细胞融合。

脾细胞的制备方法：将上述冲击免疫后小鼠眼眶采血后脱臼处死，75％酒精消毒，取脾脏，去除结缔组织，过200目不锈钢细胞筛，收集脾细胞悬液，冰浴自然沉降10min后弃自然沉降物，4℃、750g离心10min，收集细胞，加入1ml红细胞裂解液(0.155M NH₄Cl，10mM KHCO₃，0.1mMNa₂EDTA pH7.4)作用5min，加入10-20ml不完全RPMI-1640培养液终止反应。4℃、750g离心10min，弃上清，细胞沉淀用20-40ml不完全RPMI-1640培养液洗涤2次，每次4℃、750g离心10min。弃上清，细胞沉淀用不完全RPMI-1640培养液重悬，制备脾单个细胞悬液备用。

ELISA检测抗体效价的方法如下：用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液pH9.6)稀释纯化的蛋白至10μg/ml，100μl/孔包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％Tween20-PBS pH7.4)洗3遍，1％BSA封闭，37℃孵育2h。PBST洗3遍，加入待测倍比稀释的小鼠血清(实验组)，设置6-7个稀释度，未免疫健康小鼠血清做阴性对照(阴性对照组)，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗3遍，每孔加入100μl 1∶10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(Boster公司，货号BA1050)，37℃孵育1h。PBST洗3遍，加入3，3，，5，5，-四甲基联苯胺(简写TMB，eBioscience公司，货号00-4201-56)底物液，100μl/孔，避光显色10-15min，加入终止液(1M HCl)100μl/孔，立即用酶标仪进行测定，读取波长450nm的吸光值(OD_450nm)及630nm的吸光值(OD_630nm)，计算ΔOD_450nm＝OD_450nm-OD_630nm，即ΔOD_450nm为OD_450nm减OD_630nm的差值。与PBS孔相比，实验组ΔOD_450nm与阴性对照组ΔOD_450nm的比值大于2.1为阳性。

(2)饲养细胞的制备

在细胞融合前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞，作为饲养细胞。具体方法：将8周龄正常BALB/c小鼠脱臼处死，75％酒精消毒，暴露腹部，剪开腹膜。用10ml注射器吸取5ml RPMI-1640不完全培养液注入小鼠腹腔，反复抽吸数次。用注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。用RPMI-1640不完全培养液洗涤2次，每次4℃、300g离心10min，弃上清。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，调细胞浓度为2×10⁵/ml，加入96孔中，每孔100μl，放入细胞培养箱，37℃、5％CO2条件下培养。

(3)骨髓瘤细胞SP2/0的培养

复苏SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC编号CRL-1581)，保证融合时细胞处于对数生长期，并用8-氮鸟嘌呤(终浓度为20～30μg/ml)筛选，保持次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷。在细胞融合前，SP2/0细胞用30-40ml不完全RPMI-1640培养基洗涤2次，每次4℃、300g离心10min，弃上清。细胞用不完全RPMI-1640培养基重悬备用。

2.细胞融合及杂交瘤细胞的制备

将上述脾细胞悬液和SP2/0细胞分别计数，取10⁸个脾细胞和2.5×10⁷个SP2/0细胞于50ml离心管中，加入30-40ml不完全RPMI-1640培养基洗涤，4℃、300g离心10min，弃上清，用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置于40℃水浴摇床中，加入0.7ml 40℃预热的50％PEG4000(pH8.0-pH8.2)，1min内加完，轻摇1min。之后5min内加入25ml不完全RPMI-1640培养基(40℃预热)，第1min加1ml，第2min加4ml，随后3min将其余20ml加完。4℃、300g离心10min，弃上清，将细胞轻轻悬浮于2×HAT培养液(包含20％小牛血清，20mM次黄嘌呤，80mM氨基蝶呤，3.2mM胸腺嘧啶脱氧核苷的RPMI-1640培养液)，调细胞浓度为2×10⁶/ml，加到预先制备的含饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，放入细胞培养箱，37℃、5％CO2条件下培养。每2天轻轻吸去100μl上清液，加入100μl HAT培养液(包含20％小牛血清，10mM次黄嘌呤，40mM氨基蝶呤，1.6mM胸腺嘧啶脱氧核苷的RPMI-1640培养液)。融合细胞在HAT培养液培养1周，换用HT培养液(包含20％小牛血清，10mM次黄嘌呤，1.6mM胸腺嘧啶脱氧核苷的RPMI-1640培养液)持续培养2-3周，每次换液前用倒置显微镜观察，观察到杂交瘤细胞生长出来，吸取上清液，间接ELISA法检测抗体，同时用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液取代HAT培养液。筛选阳性杂交瘤细胞株，采用有限稀释方法进行亚克隆化。多次筛选后得到杂交瘤细胞株3G5，连续体外培养2个月以上或者液氮冻存6个月之后，该细胞株仍能稳定和大量分泌抗人NKp30的抗体，该单抗被命名为P30-3G5(有时为了简便也称为3G5)。

杂交瘤细胞株3G5已经于2010年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.4244。

3.单克隆抗体的大量制备

制备单克隆抗体主要采用两种方法，增量培养法和小鼠腹腔接种法。增量培养法是将克隆化的细胞在体外低血清浓度培养基进行大量培养，细胞培养2-3天，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。小鼠腹腔接种法是选用8-10周龄的BALB/c雌鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，腹腔注射500μl无菌液体石蜡。一周后，每只小鼠腹腔注射1×10⁶个细胞(500μl PBS重悬)，8天左右产生腹水，收集小鼠腹水，4℃、12000g离心10min，收上清保存或者进行下一步纯化。通过上述方法获得的抗体，可以用盐析和Protein G亲和层析方法纯化，抗体的纯度用SDS-PAGE鉴定。如图3所示，经过纯化的单克隆抗体P30-3G5的纯度达到95％以上，单克隆抗体(Ig(H+L))的分子量约160kDa，其中重链Ig(H)约55kDa，轻链Ig(L)约25kDa。

实施例4单克隆抗体的鉴定

1.间接ELISA测定单克隆抗体效价

经预实验，NKp30重组蛋白的最适包被浓度为2μg/ml，ELISA检测单克隆抗体效价的方法如下：用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.6)稀释NKp30重组蛋白至2μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜。PBST(0.05％Tween20-PBS pH 7.4)洗3遍，1％BSA封闭，37℃孵育2h。PBST洗3遍，加入经过倍比稀释的杂交瘤细胞3G5培养上清或腹水(实验组)，设置12个倍比稀释梯度，用无关的杂交瘤细胞培养上清或腹水作为阴性对照(阴性对照组)，设PBS为调零孔，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(1∶10000稀释)，37℃孵育1h。PBST洗3遍，加入TMB底物液，100μl/孔，避光显色10-15min，加入终止液(1M HCl)100μl/孔，立即用酶标仪进行测定，读取波长450nm的吸光值(OD_450nm)及630nm的吸光值(OD_630nm)，计算ΔOD_450nm＝OD_450nm-OD_630nm。与PBS孔相比，实验组ΔOD_450nm与阴性对照组ΔOD_450nm的比值大于2.1为阳性，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。

2.竞争ELISA测定单克隆抗体的亲和常数。

包被液稀释重组NKp30蛋白至2μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜。制备抗原竞争的单克隆抗体混合液，将抗原稀释成2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0μg/ml，各取50μl与50μl单克隆抗体杂交瘤细胞上清4℃孵育过夜。PBST洗3遍，1％BSA封闭，37℃孵育2h。PBST洗3遍，将各浓度抗原与杂交瘤上清的孵育液100μl加入每孔，设PBS为调零孔，37℃孵育1h。PBST洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(1∶10000稀释)，37℃孵育1h。PBST洗3遍，加入TMB底物液，100μl/孔，避光显色10-15min，加入终止液(1M HCl)100μl/孔，立即用酶标仪进行测定，读取波长450nm的吸光值(OD_450nm)及630nm的吸光值(OD_630nm)，计算ΔOD_450nm＝OD_450nm-OD_630nm。抗体亲和常数计算公式为A0/(A0-A)＝1+Kd/a0，其中A0为竞争抗原为0时的ΔOD_450nm，A为各竞争抗原浓度对应的ΔOD_450nm，a0为抗原总量，Kd为解离常数。根据K＝1/Kd求出K，K为亲和常数，单位L/M。

3.单克隆抗体P30-3G5的亚类测定

采用Sigma-Aldrich提供的小鼠单克隆类型鉴定快速检测试剂盒IsoQuickTM Kit for Mouse Monoclonal Isotyping ISOQ5中的亚类检测试纸进行测定。

单克隆抗体的亚类、细胞培养上清效价、腹水抗体效价和亲和常数的结果见表1。

表1

4.单克隆抗体P30-3G5的特异性鉴定

鉴定单克隆抗体的特异性采用两种方法，免疫印迹法和竞争ELISA法。免疫印迹的实验流程：分别取1μg重组8His-NKG2F蛋白(阴性对照，详细制备方法见下文)和重组8His-NKp30蛋白作为检测样品，SDS-PAGE电泳分离蛋白。蛋白转膜采用湿转方法，电泳槽置于冰浴、150mA转膜2h，将目的蛋白转移至PVDF膜(Millpore公司)。PVDF膜放入5％脱脂牛奶室温封闭1h。1mg/ml的单克隆抗体(1∶500稀释)室温孵育2-3h，TBST(50mM Tris，0.9％NaCl，0.1％Tween 20pH 7.4)洗3次。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(1∶5000稀释)室温孵育1h，TBST洗3次。化学发光显色(Thermo scientific公司，货号34080)检测。经免疫印迹鉴定，如图4A结果展示，在相对分子质量14kDa(8His-NKp30)处有一特异条带，而在17kDa(8His-NKG2F)处没有特异性条带。证明该单克隆抗体P30-3G5是特异性针对NKp30的，而对8His-Tag没有反应性。竞争ELISA方法同竞争ELISA测定单克隆抗体P30-3G5的亲和常数的实验步骤。抑制率＝(A0-A)/A0，其中A0为竞争抗原为0时的ΔOD_450nm，A为各竞争抗原浓度的ΔOD_450nm。如图4B结果显示不同浓度的重组NKp30对3G5杂交瘤细胞株的培养上清有很好的抑制率，说明单克隆抗体P30-3G5对NKp30有较好的特异性。

重组8His-NKG2F蛋白的制备方法：NKG2F(Genebank登记号AJ001683)全序列克隆至原核表达载体pET22b(+)(Novagen公司，货号TB03812/98)，在NKG2F的氨基酸引入8His-Tag，在目的序列的羧基端加入3个终止密码子。重组表达载体pET22b-NKG2F转入到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态(Novagen公司，货号70954-3)中，挑选单克隆菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基中，置于摇床中37℃、200转/分培养至OD600nm＝0.6-0.8时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃继续培养4-6h诱导蛋白表达。4℃、6000g离心10min，菌沉淀用裂菌缓冲液(50mMTris，100mM NaCl pH7.5)洗涤，用高压破碎方法裂菌，4℃、12000g离心10min。IPTG诱导菌裂解液分离的沉淀组分中在17kDa处有一个明显的条带，对目的条带进行免疫印迹检测，即小鼠抗His-tag抗体(Abmart公司货号M20001)1∶1000稀释作为一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(Boster公司，货号BA1050)1∶5000稀释作为二抗，化学发光显色(Thermo scientific公司，货号34080)检测，表明诱导表达的蛋白为重组蛋白。对目的条带进行质谱鉴定，结果表明为NKG2F。将菌沉淀溶解于包涵体裂解液(50mM Tris，100mM NaCl，8M尿素，1mM二硫苏糖醇pH7.5)中，Bio-Rad蛋白定量试剂盒进行蛋白定量测定。

实施例5抗人NKp30单克隆抗体的应用

1)用于免疫印迹检测NKp30

NK细胞系NK92细胞和YT细胞(获自美国国立癌症研究所，参考文献：Yodoi J，Teshigawara K，Nikaido T，Fukui K，Noma T，Honjo T，TakigawaM，Sasaki M，Minato N，Tsudo M，et al.TCGF(IL 2)-receptor inducingfactor(s).I.Regulation of IL 2receptor on a natural killer-like cell line(YTcells).J Immunol.1985Mar；134(3)：1623-1630.)细胞蛋白的制备流程：各取2×10⁷细胞加入200μl细胞裂解液(1％Triton X-100，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，2mMEDTA，，1mM C₇H₇FO₂S，10mM NaF)冰浴30min，间隔10min振荡混匀一次。4℃、12000g离心10min，取上清，Bio-Rad蛋白定量试剂盒对上清中的蛋白进行定量检测。各取50μg总蛋白用于SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测。重组8His-NKp30蛋白分别取8ng、4ng和2ng用于SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测。实验流程同上述单克隆抗体的特异性鉴定中的免疫印迹流程。如图5所展示，该单克隆抗体能够特异地检测重组NKp30蛋白和细胞内源NKp30蛋白。而且，与SantaCruz公司的NKp30抗体(克隆号：y4E6(Santa Cruz))相比较，在同样浓度(1mg/ml)和稀释度(1∶500稀释)情况下，我们制备的单克隆抗体的灵敏度要高。

2)用于免疫沉淀试验

用本发明的单克隆抗体和对照小鼠IgG1κ(Biolend公司，货号400124)进行免疫沉淀试验。具体流程：4×10⁷NK92细胞加入2ml细胞裂解液，冰浴30min，每10min振荡混匀一次。4℃、12000g离心10min，取上清。上清中加入50μl的Protein A/G PLUS-Agarose(Santa Cruz)，于4℃在摇床上温和摇4h进行预清除。4℃、12000g离心10min，取上清。上清等分为两管，其中一管加入本发明的单克隆抗体(10μg)，另一管加入对照IgG1κ(10μg)，于4℃摇床温和摇2h，加入50μl的Protein A/G PLUS-Agarose摇2h。12000g、4℃离心10min，弃上清。离心沉淀用细胞裂解液洗涤3次，每次4℃、12000g离心10min，弃上清。沉淀用50μl PBS重悬，上清中蛋白用Bio-Rad蛋白定量试剂盒进行定量，加入50μl 2×电泳上样缓冲液煮沸10min，4℃、12000g离心10min。上清进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定。如图6结果显示：单克隆抗体可以特异沉淀NKp30分子，而对照组在对应的位置，没有特异的条带。证明单克隆抗体可以用于免疫沉淀NKp30试验。

3)用于ELISA检测NKp30

分别用不同浓度(起始浓度为2μg/ml，倍比稀释)的重组NKp30蛋白包被96孔ELISA板，杂交瘤细胞3G5培养上清作为一抗。实验流程同上述间接ELISA实验流程。计算ΔOD_450nm＝OD_450nm-OD_630nm，做不同浓度重组NKp30蛋白对应的Δ450曲线图，经过拟合，R²可以达到ELISA实验要求。结果见如图7，表明该单克隆抗体能够用于ELISA检测NKp30。

4)用于流式细胞术检测NKp30

流式细胞术检测NKp30在NK细胞系和人外周血单个核细胞(PBMC)表面的表达。单克隆抗体标记NK细胞系(NK92细胞和YT细胞)的具体流程：10⁶个细胞用100μl 3％BSA(PBS配制)重悬，4℃封闭30min。加入2μg小鼠IgG1κ(Biolend公司，货号400124)或纯化的单克隆抗体P30-3G5于4℃孵育30min，PBS洗3次，每次4℃、300g离心5min，弃上清。细胞用100μl PBS重悬，加入1μl PE标记的山羊抗小鼠IgG的二抗(Santa Cruz公司，货号3764)4℃孵育30min。PBS洗3次，每次4℃、300g离心5min，弃上清。细胞用200μl PBS重悬，流式细胞仪(BD公司FACSCalibur)检测和分析。单克隆抗体标记PBMC的具体流程：10⁶个PBMC用100μl 3％BSA(PBS配制)重悬，4℃封闭30min。加入2μg小鼠IgG1κ(Biolend公司，货号400124)或纯化的单克隆抗体P30-3G5于4℃孵育30min，PBS洗3次，每次4℃、300g离心5min，弃上清。细胞用100μlPBS重悬，加入1μl PE标记的山羊抗小鼠IgG的二抗(Santa Cruz公司，货号3764)4℃孵育30min，PBS洗3次，每次4℃、300g离心5min，弃上清。细胞用100μl PBS重悬，加入2μl Alexa Fluor 488标记的小鼠抗人CD56单抗(R&D公司，货号557699)和2μl PE-Cy5标记的小鼠抗人CD3单抗(R&D公司，货号555334)4℃孵育30min，PBS洗3次，每次4℃、300g离心5min，弃上清。细胞用200μl PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD公司FACSCalibur)检测和分析。如图8A所示，所制备的单克隆抗体能够与表达NKp30受体的NK92细胞表面的NKp30受体结合，与不表达NKp30受体的YT细胞没有结合。如图8B所示，所制备的单克隆抗体可以与PBMC中的NK细胞(CD3^-CD56⁺)结合，而不与T细胞(CD3⁺CD56^-)结合。结果表明本发明的单克隆抗体可以用于流式细胞术检测NKp30分子。

序列表描述

SEQ ID No：1-NKp30的DNA序列(EMBL/GenBank/DDBJ，Accessionno.AJ223153)；

SEQ ID No：2-NKp30的蛋白序列(EMBL/GenBank/DDBJ，Accessionno.CAB54004.1)；

SEQ ID No：3-在本发明中原核重组表达的NKp30氨基酸序列。

尽管本发明的具体实施例已经描述如上，但是可以知道本发明可以进行除了上述说明以外的实践。本发明的保护范围不受说明书的限制。

Claims (9)

1.一种抗人NKp30的单克隆抗体，其针对人NKp30的第19至130位氨基酸序列有反应性。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其为IgG1κ亚类。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是可以由保藏号为CGMCCNo.4244的杂交瘤细胞株3G5分泌产生的单克隆抗体P30-3G5。

4.小鼠杂交瘤细胞株3G5，其保藏号为CGMCC No.4244。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体在检测NKp30中的应用，其中所述检测是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术来进行的。

6.用于检测NKp30的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK细胞系或PBMC细胞上的NKp30。

8.一种检测细胞上的NKp30的方法，该方法包括：(1)将权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。

9.根据权利要求8的方法，其中所述阳性反应是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术检测进行判断的。

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