CN115124620A - 一种能够激活nk细胞的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够激活NK细胞的抗体或其抗原结合片段及其用途。本发明还公开了包含所述抗体的双特异性抗体、多特异性抗体、多功能融合蛋白及其组合物，以及在治疗、预防或诊断疾病的药物中的用途。

Description

一种能够激活NK细胞的抗体及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，具体涉及一种能够激活NK细胞的抗体或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
肿瘤免疫
肿瘤是目前世界范围内危害人类健康的重大疾病。机体免疫系统的功能异常与肿瘤的发生和发展具有十分密切的关系。CTLA-4和PD-1等T细胞免疫检查点疗法显著改善了多种转移性和难治性癌症患者的预后，然而它们仅对少数患者有效，有效率在20％左右，并且面临耐药性问题。
自然杀伤细胞和γδT细胞
NK细胞是医学界公认的第一道防线，与其他抗癌免疫细胞相比，NK细胞杀灭肿瘤和病毒感染细胞的作用更强、更有效。它的激活不依赖于肿瘤细胞表面抗原，也不需要像T细胞一样，要经过免疫系统的抗原辨识反应才确定“攻击”目标。NK细胞游弋在全身血管行使免疫监视作用，它能在第一时间发现并迅速启动免疫防御和免疫稳定功能，杀死病变、癌变的细胞。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。人类主要NK细胞活化性受体包括CD16、NKG2D和自然细胞毒性受体(NCRs)，后者包括NKp30、NKp44和NKp46。
目前NK细胞的激活主要是通过抗体Fc区结合CD16，但Fc与CD16的亲和力低，科学家又开发了CD16激动剂，能更有效的引起NK细胞的活化而发挥抗肿瘤作用，但是CD16的缺失或CD16的多态性限制了CD16激动剂的应用。
γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。目前还未有γδT细胞的生物制品激动剂相关报道。
NKp30
NKp30(Natural cytotoxicity triggering receptor 3)由NCR3基因编码，属于自然细胞毒性引发受体(NCRs)家族成员，是细胞表面的一种激活型受体。NKp30表达于所有静息与活化的NK细胞、多种效应NKT细胞、γδT细胞、MAIT细胞(黏膜相关恒定的T淋巴细胞)，激活NKp30能激活NK细胞、γδT细胞等肿瘤杀伤性细胞。重要的是，NKp30可以在没有CD16A结合的情况下激活NK细胞，且激活后杀伤效果强于抗CD16A，抗NKp30抗体与抗CD16A抗体有协同放大作用。
本发明将NKp30作为免疫治疗的靶点，开发了新的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，用于双功能抗体、多功能抗体或多功能融合蛋白的开发。
发明内容
本发明提供了一种抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其能够激活免疫细胞释放细胞因子，优选的，其能够激活NK细胞或γδT细胞释放细胞因子。
在可选的实施方案中，所述细胞因子为淋巴因子，优选为IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL9、IL10、IFN-γ或TNF-α，更优选为IFN-γ、TNF-α或IL2。
在可选的实施方案中，所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，
(a)重链可变区的HCDR1，选自SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：25-30的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的HCDR2，选自SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：31-36的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的HCDR3，选自SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：37-42的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(d)轻链可变区的LCDR1，选自SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：43-48的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)轻链可变区的LCDR2，选自SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：49-54的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；和/或
(f)轻链可变区的LCDR3，选自SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：55-60的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
在可选的实施方案中，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3选自如下(1)-(6)中任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：25所示的HCDR1，SEQ ID NO：31所示的HCDR2，SEQ ID NO：37所示的HCDR3，SEQ ID NO：43所示的LCDR1，SEQ ID NO：49所示的LCDR2，SEQ ID NO：55所示的LCDR3；
(2)SEQ ID NO：26所示的HCDR1，SEQ ID NO：32所示的HCDR2，SEQ ID NO：38所示的HCDR3，SEQ ID NO：44所示的LCDR1，SEQ ID NO：50所示的LCDR2，SEQ ID NO：56所示的LCDR3；
(3)SEQ ID NO：27所示的HCDR1，SEQ ID NO：33所示的HCDR2，SEQ ID NO：39所示的HCDR3，SEQ ID NO：45所示的LCDR1，SEQ ID NO：51所示的LCDR2，SEQ ID NO：57所示的LCDR3；
(4)SEQ ID NO：28所示的HCDR1，SEQ ID NO：34所示的HCDR2，SEQ ID NO：40所示的HCDR3，SEQ ID NO：46所示的LCDR1，SEQ ID NO：52所示的LCDR2，SEQ ID NO：58所示的LCDR3；
(5)SEQ ID NO：29所示的HCDR1，SEQ ID NO：35所示的HCDR2，SEQ ID NO：41所示的HCDR3，SEQ ID NO：47所示的LCDR1，SEQ ID NO：53所示的LCDR2，SEQ ID NO：59所示的LCDR3；或
(6)SEQ ID NO：30所示的HCDR1，SEQ ID NO：36所示的HCDR2，SEQ ID NO：42所示的HCDR3，SEQ ID NO：48所示的LCDR1，SEQ ID NO：54所示的LCDR2，SEQ ID NO：60所示的LCDR3。
在可选的实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下(1)-(6)中的任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13；
(2)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；
(3)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：15；
(4)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：16；
(5)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：17；
(6)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：18；
在可选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段以10nM或更小的KD结合NKp30。
在可选的实施方案中，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
在可选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在可选的实施方案中，所述抗体还包含Fc区，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
本发明还提供了核酸分子，其编码上述任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
在可选的实施方案中，所述核酸分子包含选自如下(1)-(6)中的任意一种：
(1)含有如SEQ ID NO：7所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：19所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(2)含有如SEQ ID NO：8所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：20所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(3)含有如SEQ ID NO：9所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：21所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(4)含有如SEQ ID NO：10所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：22所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(5)含有如SEQ ID NO：11所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：23所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(6)含有如SEQ ID NO：12所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：24所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列。
本发明还提供了重组载体，其包含上述核酸分子。
本发明还提供了重组细胞，其包含上述核酸分子或以上述重组载体转化，并能够表达所述抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种多功能融合蛋白，其包含上述任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
在可选的实施方案中，其多功能融合蛋白还包含一个或多个与其他抗原特异性结合的第二抗体或其抗原结合部分。
在可选的实施方案中，所述结合第二抗体或其抗原结合部分的抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)或免疫检查点。
在可选的实施方案中，其多功能融合蛋白还包含细胞因子。
在可选的实施方案中，所述细胞因子选自IL8、IL10、IL15、IL18、TGF、VEGF、IFNγ、IFNα或GM-CSF。
本发明还提供了上述任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段、多功能融合蛋白在制备用于治疗和/或预防和/或诊断疾病的药物中的用途。
在可选的实施方案中，其中所述用途通过肿瘤免疫疗法、细胞疗法和基因疗法中的一种或多种来实现。
本发明还提供了上述任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段、多功能融合蛋白在制备治疗癌症的药物中的用途。
在可选的实施方案中，其中所述癌为肺癌、肝癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、头颈癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述任一所述抗NKp30抗体或其抗原结合片段和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述任一所述的多功能融合蛋白和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
因此，本发明涉及以下技术方案：
1、一种抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其能够激活免疫细胞释放细胞因子，优选的，其能够激活NK细胞或γδT细胞释放细胞因子。
2、根据方案1所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述细胞因子为淋巴因子，优选为IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL9、IL10、IFN-γ或TNF-α，更优选为IFN-γ、TNF-α或IL2。
3、根据方案1或2所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，
(a)重链可变区的HCDR1，选自SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：25-30的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的HCDR2，选自SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：31-36的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的HCDR3，选自SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：37-42的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(d)轻链可变区的LCDR1，选自SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：43-48的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)轻链可变区的LCDR2，选自SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：49-54的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；和/或
(f)轻链可变区的LCDR3，选自SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：55-60的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
4、根据方案3所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3选自如下(1)-(6)中任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：25所示的HCDR1，SEQ ID NO：31所示的HCDR2，SEQ ID NO：37所示的HCDR3，SEQ ID NO：43所示的LCDR1，SEQ ID NO：49所示的LCDR2，SEQ ID NO：55所示的LCDR3；
(2)SEQ ID NO：26所示的HCDR1，SEQ ID NO：32所示的HCDR2，SEQ ID NO：38所示的HCDR3，SEQ ID NO：44所示的LCDR1，SEQ ID NO：50所示的LCDR2，SEQ ID NO：56所示的LCDR3；
(3)SEQ ID NO：27所示的HCDR1，SEQ ID NO：33所示的HCDR2，SEQ ID NO：39所示的HCDR3，SEQ ID NO：45所示的LCDR1，SEQ ID NO：51所示的LCDR2，SEQ ID NO：57所示的LCDR3；
(4)SEQ ID NO：28所示的HCDR1，SEQ ID NO：34所示的HCDR2，SEQ ID NO：40所示的HCDR3，SEQ ID NO：46所示的LCDR1，SEQ ID NO：52所示的LCDR2，SEQ ID NO：58所示的LCDR3；
(5)SEQ ID NO：29所示的HCDR1，SEQ ID NO：35所示的HCDR2，SEQ ID NO：41所示的HCDR3，SEQ ID NO：47所示的LCDR1，SEQ ID NO：53所示的LCDR2，SEQ ID NO：59所示的LCDR3；或
(6)SEQ ID NO：30所示的HCDR1，SEQ ID NO：36所示的HCDR2，SEQ ID NO：42所示的HCDR3，SEQ ID NO：48所示的LCDR1，SEQ ID NO：54所示的LCDR2，SEQ ID NO：60所示的LCDR3。
5、根据方案3或4所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区选自如下(1)-(6)中的任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13；
(2)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；
(3)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：15；
(4)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：16；
(5)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：17；
(6)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：18。
6、根据方案1-5任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段以10nM或更小的KD结合NKp30。
7、根据方案1-6任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
8、根据方案1-7任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
9、根据方案1-8任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其还包含Fc区，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
10、核酸分子，其编码方案1-9任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
11、根据方案10所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自如下(1)-(6)中的任意一种：
(1)含有如SEQ ID NO：7所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：19所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(2)含有如SEQ ID NO：8所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：20所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(3)含有如SEQ ID NO：9所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：21所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(4)含有如SEQ ID NO：10所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：22所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(5)含有如SEQ ID NO：11所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：23所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(6)含有如SEQ ID NO：12所示的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：24所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列。
12、重组载体，其包含方案11所述的核酸分子。
13、重组细胞，其包含方案11所述的核酸分子或以方案12所述的重组载体转化，并能够表达所述抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
14、一种多功能融合蛋白，其包含方案1-9任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
15、根据方案14所述的多功能融合蛋白，其还包含一个或多个与其他抗原特异性结合的第二抗体或其抗原结合部分。
16、根据方案15所述的多功能融合蛋白，其中所述结合第二抗体或其抗原结合部分的抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)或免疫检查点。
17、根据方案14-16任一所述的多功能融合蛋白，其还包含细胞因子。
18、根据方案17所述的多功能融合蛋白，所述细胞因子选自IL8、IL10、IL15、IL18、TGF、VEGF、IFNγ、IFNα或GM-CSF。
19、方案1-9任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段、方案14-18任一所述的多功能融合蛋白在制备用于治疗和/或预防和/或诊断疾病的药物中的用途。
20、根据方案19所述的用途，其中所述用途通过肿瘤免疫疗法、细胞疗法和基因疗法中的一种或多种来实现。
21、方案1-9任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段、方案14-18任一所述的多功能融合蛋白在制备治疗癌症的药物中的用途。
22、根据方案21所述的用途，其中所述癌为肺癌、肝癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、头颈癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。
23、一种药物组合物，其包含方案1-9任一所述抗NKp30抗体或其抗原结合片段和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
24、一种药物组合物，其包含方案14-18任一所述的多功能融合蛋白和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
有益效果
本发明提供的抗NKp30抗体或其抗原结合片段能够特异性地与NKp30结合，促进NK细胞释放IFN-γ、TNF-α等细胞因子；上述功能接近或超过目前NKp30单抗的水准。
为了帮助理解本文中阐述的发明，现提供以下缩写解释及术语定义。
在本文中使用以下缩写：
CDR：免疫球蛋白中可变区中的互补决定区
HCDR：免疫球蛋白中重链可变区中的互补决定区
LCDR：免疫球蛋白中轻链可变区中的互补决定区
FR：抗体构架区，即抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH：抗体重链可变区
VL：抗体轻链可变区
IgG：免疫球蛋白G
mAb：单克隆抗体
ELISA：酶联免疫吸附测定
FACS：荧光激活细胞分选术
在本说明书中，术语“抗体”是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成而制备的免疫球蛋白。抗体可从天然存在该抗体的血浆或血清等的天然资源、或者产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中、动物免疫血清中、噬菌体文库筛选进行重建得到分离。备选地，可通过使用基因重组等的技术部分或完全地合成。优选的抗体包括，例如，免疫球蛋白的同种型或这些同种型的亚类的抗体。已知人免疫球蛋白包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类别(同种型)。在这些同种型中，本发明的抗体可以包括IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4。
本文使用的术语“单克隆抗体”指均一的仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征，不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法产生，或通过本文其它地方描述的筛选方法获得。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的异源性反应。
本文中所使用的部分抗体由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成，或者只有轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的多肽片段，例如全长抗体的多肽片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(如技术来自Ablynx)、结构域抗体(如技术来自Domantis)、和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即是所利用的宿主细胞外来的，例如由细菌细胞产生的人多肽。本文将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，Clustal W，Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。
术语“分离的多核苷酸”指非自然界中天然存在状态的多核苷酸，包括通过生物学技术从自然界(包括生物体内)分离出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、mRNA或合成的其他RNA，或者它们的组合。本文提供了多个用于编码抗NKp30单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，基于密码子简并性，设计出与以上提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都编码相同的氨基酸序列。这些经改的的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“转染”指外来或外源DNA被细胞摄入，该技术可用于将一种或多种外源DNA部分导入适宜的宿主细胞。可通过理化方法(例如通过氯化钙处理)诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即“感受态”。
术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和各种类型的润湿剂。
附图说明
图1a-图1d为鼠源抗NKp30抗体或其抗原结合片段与稳定表达细胞系结合FACS结果；
图2a和图2b为鼠源抗NKp30抗体或其抗原结合片段刺激NK细胞激活释放细胞因子实验结果。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除专门提及的内容之外，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明实施例中的对照抗体选自Biolegend公司的抗CD337(NKp30)抗体。
以下通过更具体的实施例来说明本发明。
实施例1：动物免疫
用重组人NKp30，Fc tag蛋白(ACRO，Cat：NC3-H5259)作为免疫原，免疫Balb/c或者SJL小鼠，为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只。提前3天采取阴性血清，首次免疫，腹腔免疫50μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组人NKp30-Fc蛋白，分别在第14天，第35天进行第二次和第三次免疫，25μg/次/只，弗氏不完全佐剂乳化，腹腔注射。并在第二次和第三次免疫1周后采尾血，用重组人NKp30-his包被ELISA板，检测小鼠血清效价。在>1：10000的稀释度下检测到抗人NKp30抗体时，认为达到融合标准。融合前三天以20μg/只，无佐剂腹腔加强免疫一次，可收获鼠脾脏和淋巴结，进行细胞融合。
实施例2：细胞融合
骨髓瘤细胞SP2/0于融合前一天将细胞传代，使实验时细胞处于对数生长期，融合前将细胞收集于离心管中，经1000转/分离心5分钟，弃上清液并加入10mL无血清DMEM培养基将细胞混匀备用。实验用B淋巴细胞和淋巴结细胞取自达到融合标准的小鼠，融合前将小鼠处死取出脾脏和淋巴结，加入10mL无血清DMEM培养基将细胞压磨过网，得细胞悬液经2000转/分离心10分钟，弃上清液并加入无血清DMEM培养基将细胞混匀备用。融合时选择培养中所用的饲养细胞取自未经免疫的动物腹腔中的巨噬细胞；50mL HAT选择培养基混匀，分装于5块24孔培养板中，以辅助新融合的杂交瘤生长。
将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1混合，将其悬浮液以1000转/分离心10分钟，取沉淀，用融合液洗两次。再取沉淀加融合液至细胞密度为1E07，5min内，将细胞悬液移至融合室内。盖上融合室盖子，30s内，根据已调节好的参数，按下AUTO键开始融合，至wait键闪亮后熄灭。将细胞室温于静置内静置不超过5min，轻柔的将细胞从融合室内移至含有HAT的完全培养基内，37℃孵育60min。孵育后将细胞铺在已含有饲养细胞的96孔板内，37℃，5％CO2培养。
实施例3：间接ELISA方法筛选阳性克隆
采用建好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体情况。具体方法如下：以1*PBS(pH7.4)为包被液，稀释抗原人NKp30-his蛋白(KACTUS；Cat：NKP-HM430)浓度为1.0μg/ml，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜；0.05％PBST(0.05％吐温20，1*PBS，pH7.4)洗涤3次，每孔加入300μL封闭液(2％BSA)，37℃孵育1h；0.05％PBST洗涤3次，生物安全柜中将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，每孔100μL，SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫多抗血清作为阳性对照，37℃孵育1h；0.05％PBST洗涤3次，加入山羊抗小鼠二抗HRP(Abcam cat：ab6789)(1：20000稀释)，每孔100μL，37℃孵育45min，0.05％PBST洗涤后，TMB显色10min，IM盐酸终止，酶联检测仪测定OD450的值。被测孔OD450读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。
实施例4：FACS方法进一步筛选阳性克隆
取NK细胞悬液离心(3min，2000rpm)后弃上清，加稀释液(1％BSA-PBS)重悬计数，取3E05 cells/孔分于96孔U型板中，稀释液清洗1次(3min，2000rpm)弃上清。将杂交瘤细胞培养上清加入有细胞的96孔U型板中，每孔100μL，混匀。稀释液作为阴性对照(不加二抗为BLANK，加二抗为NC)，对照抗体稀释至20μg/ml为阳性对照，另设同型抗体为无关抗体，4℃孵育1h。稀释液清洗1次(3min，2000rpm)弃上清，加入山羊抗小鼠二抗FITC(Abcam cat：ab6785)(1：500稀释)，每孔100μL，4℃孵育45min。稀释液清洗2次(3min，2000rpm)弃上清，加稀释液重悬，每孔100μL，流式细胞仪测定荧光信号。
实施例5：抗体的生产和纯化
获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。将细胞株扩增至在T75培养瓶内，培养至细胞覆盖率为80-90％，将细胞上清弃去，加入30mL hybridoma-SFM(Gibco)，37℃，5％CO2培养。培养2-3天后添加30mL hybridoma-SFM，细胞活率低于30％则可添加新鲜的活细胞。培养6-7天，待细胞存活率低于20％，低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。
用rProteinA sepharose Fast Flow(GE公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1M Tris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的杂交瘤细胞培养上清加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度。
实施例6：抗体与细胞结合能力检测
取待测抗体按照40μg/mL为初始终浓度，3倍稀释，稀释8个梯度。取出培养箱内NK细胞，将细胞悬液转至15mL离心管中，离心，PBS重悬计数。留出空白对照组(Blank)、阴性对照组(NC)、实验组和无关抗体组。按照约3×105个细胞/孔，将细胞悬液铺于96孔板中。
离心(1000rpm，5min)后用PBS清洗，再离心，重复两次去除培养基残留。弃去上清，实验组、无关抗体组分别加入100μL的一抗溶液、无关抗体溶液，重悬细胞后，室温孵育1h。Blank、NC组使用等量的PBS进行孵育。
1h后离心，加入PBS清洗两次。弃上清后，除Blank组加入100μL PBS外，其余样品组分别加入100μL荧光二抗稀释液(鼠源二抗来自Abcam ab6785)，室温避光孵育0.5h后，离心加入PBS清洗两次。弃去上清后，加入120μL的PBS重悬并按顺序进行流式细胞检测其平均荧光强度。结果见图1a-图1d。由图1a-图1d可知，抗体1至抗体6均具有较好的亲和力。
实施例7：抗NKp30抗体与NKp30亲和力验证
设备：OCTET Red96e(Fortebio)。
传感器：AMQ。
(1)实验设置：
传感器准备：在使用前以0.02％PBST(0.02％吐温20，pH7.4，1*PBS)作为缓冲液浸润AHC传感器600s，除去传感器表面覆盖的蔗糖。
根据样品的实际加样位置设置样品板及传感器位置。
设置需要进行的步骤，并设置时间和转速，实验温度设置为30℃，震荡速度为1000rpm。
(2)固化及捕获：
AHC传感器以0.02％PBST(0.02％吐温20，pH7.4，1*PBS)作为缓冲液平衡60s，固化样品板中的NKp30抗体300s，二次平衡缓冲液180s。100nm的人NKp30-his蛋白(KACTUS；Cat：NKP-HM430)与NKp30抗体结合300s，然后解离600s。解离后以10mM甘氨酸(pH2.0)作为再生缓冲液，再生30s。
(3)再生：
用10mM甘氨酸(pH2.0)再生传感器。
(4)数据分析：
从测试结果图中减去参考通道H1的结果图。实验数据符合1：1结合模型。用分子量35kDa计算人NKp30蛋白的摩尔浓度。结果见表1。
表1
K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
抗体1 4.39E-10 1.61E+06 7.08E-04
抗体2 1.97E-10 1.08E+06 2.12E-04
抗体3 2.03E-09 9.59E+05 1.94E-03
抗体4 8.46E-10 3.99E+05 3.38E-04
抗体5 8.21E-10 6.73E+05 5.52E-04
抗体6 5.43E-09 1.08E+06 5.85E-03
对照抗体 5.75E-10 1.08E+06 6.22E-04
由表1可知，抗体1至抗体6均具有与NKp30较好的亲和能力。
实施例8：抗体刺激NK细胞激活释放细胞因子实验
取出96孔板，将待测抗体、阳性对照抗体和同型对照抗体按照150nM起始，3倍稀释，进行7个梯度稀释，设置2个平行孔，PBS溶解，置于96孔板中。放于4℃冰箱孵育过夜约16h后取出进行后续操作。
取出96孔板，弃抗体孵育液，用PBS清洗2次。取出NK细胞细胞计数，设置细胞数为4×104个/孔用含终浓度为400U的IL-2(STEMCELL，78036)的培养基进行重悬，200μL/孔加入抗体孵育完成的96孔板中，设置空白对照孔和阴性对照孔。处理好的96孔板放置在37℃CO2恒温培养箱孵育约24h后，提取上清，将离心后的上清用试剂盒(Biolegend Cat：430104)测其IFN-γ的数值，结果见图2a和图2b。
分析结果表明，抗NKp30抗体刺激的NK细胞释放细胞因子的效果显著优于对照抗体和同型抗体。
综上所述，只有抗NKp30抗体与NKp30的亲和力高，才能刺激NK细胞激活释放细胞因子，但是如果亲和力太高，又会导致自身杀伤力太大，因此，抗体1-抗体6是同时具备了亲和力高和能够刺激NK细胞激活释放细胞因子的优势。
实施例9：单克隆抗体的测序
综合亲和力和刺激NK细胞激活释放细胞因子实验，选取6个NKp30 mAb与NKp30SPR亲和力最佳的单克隆抗体进行测序；并最终获得了抗体1、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5和抗体6的氨基酸/核苷酸序列。
(1)抗体1重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：37；
抗体1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
抗体1重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：7；
抗体1轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：55；
抗体1轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：13；
抗体1轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：19。
(2)抗体2重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；
抗体2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；
抗体2重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：8；
抗体2轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：56；
抗体2轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：14；
抗体2轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：20。
(3)抗体3重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：39；
抗体3重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；
抗体3重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：9；
抗体3轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：57；
抗体3轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：15；
抗体3轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：21。
(4)抗体4重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；
抗体4重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
抗体4重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：10；
抗体4轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：58；
抗体4轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：16；
抗体4轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：22。
(5)抗体5重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：41；
抗体5重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
抗体5重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：11；
抗体5轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：59；
抗体5轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：17；
抗体5轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：23。
(6)抗体6重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：42；
抗体6重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6；
抗体6重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：12；
抗体6轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：60；
抗体6轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：18；
抗体6轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：24。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
序列表
<110> 盛禾（中国）生物制药有限公司
<120> 一种能够激活NK细胞的抗体及其应用
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Glu Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Phe Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Asp Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Pro Asn Tyr Glu Ile Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Gly Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Asn Gly His Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Lys Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Thr Phe Thr Glu Glu Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Gly Tyr Tyr Ser Val Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Leu Ile Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Phe Gly Asp His Asp Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Asp Asn Arg Tyr Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggtccagc tgcaacagtt tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattgcatat attaatccta actatgagat tactacttac 180
aaccagaagt tcaagggaaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagagggagg 300
gggggttacg accccgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 8
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaggtccagc tgcaacagtt tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattgcatat attaatccta actatgagat tactacttac 180
aaccagaagt tcaagggaaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagagggagg 300
gggggttacg accccgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 9
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagggtcagc tgcagcagtc tggagctgag gtgatgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg ctaatggcca cacatttggt agttattgga tagagtggat aaaacagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggcag taaaaagtat 180
aatgagaagt tcgagggcaa ggccacattc actgaagaaa catcctccaa cacagcctac 240
atggaactca ccagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgttc aagagggggt 300
tactacggaa gtaggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 10
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatggca tgtcttggat tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaagc attagtagtg gtgggactta tacttactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca gtgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacgcgat 300
ggttattatt ctgtggaata ttggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 11
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcctaattt taaaagagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agttatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggcccttt attattgtgc aagacatttt 300
ggggatcacg acggctatgt tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 360
tca 363
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg gttctggcta cacattcact gattatgcta tgcactgggt gaagcagagt 120
catgcaaaga gtctagagtg gattggaatt attagtactt actatggtga tgctagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240
atggagcttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagagactac 300
gataataggt acgctgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Leu Cys Gln Gln Asp Asn Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Asn Tyr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Glu Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Arg Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtaa cttggtccca acagaagcca 120
gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt gtgtcagcag gataatagta ctcctcctac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtaa cttggtccca acagaagcca 120
gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt gtgtcagcag gataatagta ctcctcctac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatgttgttc tgacccaaac tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60
atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180
tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
<210> 22
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caaattgttc tcacccagtc gccagcaatc atgtctgcct ctccaggggg ggaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagttc aagtgtaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttttgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctactcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actactaacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaatcaaa 318
<210> 23
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cattaggaca gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctttta aatagtagca atcaaaagag caatttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatattttgc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg gttcataggc agtggatctg ggacagattt ctctcttacc 240
atcagaagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ctatagcact 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339
<210> 24
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ser Tyr Trp Met Glu
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ser Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ser Tyr Asp Met Ser
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Tyr Ile Asn Pro Asn Tyr Glu Ile Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Lys Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Ile Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gly Gly Asp Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gly Arg Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Arg Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Arg Asp Gly Tyr Tyr Ser Val Glu Tyr
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
His Phe Gly Asp His Asp Gly Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Asp Tyr Asp Asn Arg Tyr Ala Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Thr
1 5 10
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met His
1 5 10
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Ser Asn Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Gln Gln Asp Asn Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Phe Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5

Claims (10)

1.一种抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其能够激活免疫细胞释放细胞因子，优选的，其能够激活NK细胞或γδT细胞释放细胞因子。
2.根据权利要求1所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述细胞因子为淋巴因子，优选为IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL9、IL10、IFN-γ或TNF-α，更优选为IFN-γ、TNF-α或IL2。
3.根据权利要求1或2所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，
(a)重链可变区的HCDR1，选自SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：25-30的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的HCDR2，选自SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：31-36的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的HCDR3，选自SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：37-42的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(d)轻链可变区的LCDR1，选自SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：43-48的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)轻链可变区的LCDR2，选自SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：49-54的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；和/或
(f)轻链可变区的LCDR3，选自SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：55-60的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3选自如下(1)-(6)中任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：25所示的HCDR1，SEQ ID NO：31所示的HCDR2，SEQ ID NO：37所示的HCDR3，SEQ ID NO：43所示的LCDR1，SEQ ID NO：49所示的LCDR2，SEQ ID NO：55所示的LCDR3；
(2)SEQ ID NO：26所示的HCDR1，SEQ ID NO：32所示的HCDR2，SEQ ID NO：38所示的HCDR3，SEQ ID NO：44所示的LCDR1，SEQ ID NO：50所示的LCDR2，SEQ ID NO：56所示的LCDR3；
(3)SEQ ID NO：27所示的HCDR1，SEQ ID NO：33所示的HCDR2，SEQ ID NO：39所示的HCDR3，SEQ ID NO：45所示的LCDR1，SEQ ID NO：51所示的LCDR2，SEQ ID NO：57所示的LCDR3；
(4)SEQ ID NO：28所示的HCDR1，SEQ ID NO：34所示的HCDR2，SEQ ID NO：40所示的HCDR3，SEQ ID NO：46所示的LCDR1，SEQ ID NO：52所示的LCDR2，SEQ ID NO：58所示的LCDR3；
(5)SEQ ID NO：29所示的HCDR1，SEQ ID NO：35所示的HCDR2，SEQ ID NO：41所示的HCDR3，SEQ ID NO：47所示的LCDR1，SEQ ID NO：53所示的LCDR2，SEQ ID NO：59所示的LCDR3；或
(6)SEQ ID NO：30所示的HCDR1，SEQ ID NO：36所示的HCDR2，SEQ ID NO：42所示的HCDR3，SEQ ID NO：48所示的LCDR1，SEQ ID NO：54所示的LCDR2，SEQ ID NO：60所示的LCDR3。
5.根据权利要求3或4所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区选自如下(1)-(6)中的任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13；
(2)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；
(3)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：15；
(4)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：16；
(5)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：17；
(6)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：18。
6.根据权利要求1-5任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段以10nM或更小的KD结合NKp30。
7.根据权利要求1-6任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
8.根据权利要求1-7任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
9.根据权利要求1-8任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其还包含Fc区，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
10.核酸分子，其编码权利要求1-9任一所述的抗NKp30抗体或其抗原结合片段。
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