CN115521360A - 特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的应用 - Google Patents

特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的应用 Download PDF

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CN115521360A CN202110704816.2A CN202110704816A CN115521360A CN 115521360 A CN115521360 A CN 115521360A CN 202110704816 A CN202110704816 A CN 202110704816A CN 115521360 A CN115521360 A CN 115521360A
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Abstract

本发明公开了特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的STAMBPL1多肽，所述STAMBPL1多肽为特异性结合Sestrin2蛋白的多肽，可通过竞争结合阻断Sestrin2与STAMBPL1的相互作用。本发明还提供了包括STAMBPL1多肽和穿膜肽、具有细胞渗透性的嵌合肽tat‑STAMBPL1。本发明多肽和嵌合肽亲和力高，靶点明确，靶向Sestrin2/STAMBPL1相互作用位点，可以有效抑制肿瘤(尤其是消化道肿瘤)形成。本发明还提供了包含所述STAMBPL1多肽和/或嵌合肽tat‑STAMBPL1的抗肿瘤药物。

Description

特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的应用。
背景技术
消化道肿瘤是发生在食管、胃、肝脏、大肠、小肠等部位的一类肿瘤，由于早期症状隐匿，此类肿瘤被发现时往往处于晚期。其中，结直肠癌(Colorectal cancer)是最常见的消化道肿瘤，其与遗传因素、人口老龄化、不良饮食习惯、肥胖、缺乏锻炼、吸烟等密切相关。结直肠癌的确诊较为困难，早期的诊断率仅有10-15％，因此了解结直肠癌发生发展机制并进行针对性治疗，将有利于改善和提高病患的生存率。
目前针对结直肠癌的治疗手段已有多种报道，其中包括：早期的内镜手术及外科手术切除，放射治疗，化疗(Fluorouracil、Oxaliplatin、Oxaliplatin)，通路抑制剂(抗VEGF和EGFR药物)，新型/抢救型药物(Regorafenib、TAS-102)，免疫治疗及靶向治疗(BRAF或BRAF联合MEK抑制剂)等。传统的治疗手段往往具有药物毒副作用大、容易产生耐药性、易发生转移等问题，具有一定的局限性，而新型的靶向治疗可以在分子水平上特异性针对致癌位点发挥作用以抑制肿瘤细胞的增殖，副作用相对更小。因此研究和开发新型靶向小分子是癌症治疗的一个重要的研究方向。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(Mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1)作为代谢过程中关键的调控蛋白复合体，可以感知环境中营养物质的含量从而直接调节细胞的代谢情况。Sestrin2作为细胞质中的亮氨酸感应蛋白，可以直接结合亮氨酸。Sestrin2能够在未结合亮氨酸时抑制mTORC1的活性，从而避免细胞合成代谢的过度活化。而mTORC1信号通路的过度激活往往会导致细胞过度生长进而导致癌症的发生，因此针对该通路中存在的促癌因子的靶向治疗将为癌症的治疗提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以抑制Sestrin2与STAMBPL1相互作用的、特异性结合Sestrin2蛋白的抗肿瘤多肽。本发明所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
本发明首先提供了特异性结合Sestrin2蛋白的多肽，命名为STAMBPL1多肽，所述STAMBPL1多肽为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个及以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且特异性结合Sestrin2蛋白的多肽；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合多肽。
所述STAMBPL1多肽为特异性结合Sestrin2蛋白的多肽，可通过竞争结合阻断Sestrin2与内源STAMBPL1的相互作用。
所述STAMBPL1多肽可为人源STAMBPL1蛋白第59-78位氨基酸之间的肽段，共计20个氨基酸。
A3)所述标签如表1所示：
表1：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了嵌合肽，命名为tat-STAMBPL1，所述嵌合肽包括所述STAMBPL1多肽和穿膜肽。
所述穿膜肽能促进所述嵌合肽被细胞摄取。
进一步地，所述穿膜肽可与所述STAMBPL1多肽的N末端连接。
术语“嵌合肽”是这样一种肽，其具有不天然彼此相关联的双组分肽或多组分肽，其作为融合蛋白或通过化学连接而彼此接合。
术语“穿膜肽”(penetratin)也称为细胞膜转导肽、细胞穿透肽或内化肽，在蛋白质药物领域被广泛使用，其功能是促进与其结合的活性肽被细胞摄取和吸收，即可以将多肽分子或药物分子等带入到细胞内发挥生物学活性。这类物质均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，二级结构皆具有α-螺旋的空间构象。迄今为止已发现多种天然存在及人工合成的细胞穿膜肽，如人类免疫缺陷病毒HIV的转录反式激活因子Tat、果蝇同源异型转录因子ANTP、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)转录因子VP22以及人工合成的多聚精氨酸和多聚赖氨酸等。
进一步地，所述穿膜肽包含至少5个精氨酸或赖氨酸残基，并且所述穿膜肽的总长度为5-30个氨基酸。优选的穿膜肽(内化肽)是来自HIV病毒的Tat蛋白。
进一步地，所述穿膜肽为Tat肽。
作为非限制性的一个实例，所述穿膜肽的氨基酸序列可如SEQ ID No.2所示，SEQID No.2为标准的Tat肽序列。
本领域技术人员应当理解，将活性肽和内化肽嵌合的目的主要在于使活性肽更好地到达作用靶点，因此，适用于本申请的内化肽并不局限于特定种类，只要能实现穿膜、内化的目的即可。进一步地，所述嵌合肽还可包括接头(linker)，所述接头用于连接所述穿膜肽和所述STAMBPL1多肽。
进一步地，所述穿膜肽可与所述STAMBPL1多肽的N末端通过所述接头连接。
在本发明的一个实施方案中，所述接头为两个甘氨酸接头(Gly-Gly)。
进一步地，所述嵌合肽tat-STAMBPL1的氨基酸序列可如SEQ ID No.3所示。
前文任一所述的多肽或嵌合肽能够任选地被衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)以促进其亲合力、促进其跨越细胞膜被转运的能力或促进其稳定性。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：
B1)编码所述STAMBPL1多肽的DNA分子；
B2)编码所述嵌合肽tat-STAMBPL1的DNA分子。
进一步地，所述编码所述STAMBPL1多肽的DNA分子的核苷酸序列可如SEQ ID No.4所示，SEQ ID No.4所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的STAMBPL1多肽。
进一步地，所述编码所述嵌合肽tat-STAMBPL1的DNA分子的核苷酸序列可如SEQID No.5所示，SEQ ID No.5所示的DNA分子编码SEQ ID No.3所示的嵌合肽tat-STAMBPL1。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码肽的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的肽的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码本发明肽且具有本发明肽的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述肽可包括STAMBPL1多肽或嵌合肽tat-STAMBPL1或穿膜肽。
上述75％或者更高同一性，可为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本发明还提供了抗肿瘤药物，所述药物包括所述STAMBPL1多肽和/或嵌合肽tat-STAMBPL1。
所述药物可含有一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
本发明还提供了所述STAMBPL1多肽，和/或本文中任一所述的嵌合肽tat-STAMBPL1，和/或所述核酸分子在在制备预防、改善或治疗由mTORC1信号通路异常所引起疾病的药物或产品中的应用。
上述应用中，所述由mTORC1信号通路异常所引起疾病可为肿瘤或消化道肿瘤。
上述应用中，所述肿瘤可为消化道肿瘤。
所述消化道肿瘤可为消化道癌。
上述应用中，所述消化道肿瘤包括直结肠癌、食道癌、胃癌或肝胆胰腺癌。
针对我们最新发现的Sestrin2-STAMBPL1这一机制在结直肠癌中的关键促癌作用，我们合成了模拟STAMBPL1上与Sestrin2结合区域的氨基酸片段(目的肽，即本发明STAMBPL1多肽)，并揭示了其在抑制癌症(尤其是消化道癌症)中的重要作用。本发明合成的多肽具有细胞渗透性，可以进入细胞并通过竞争结合特异性阻断Sestrin2与内源STAMBPL1相互作用，该多肽靶向Sestrin2/STAMBPL1相互作用的位点，能够特异性地与Sestrin2结合，从而阻断Sestrin2与内源STAMBPL1的结合，进一步促进Sestrin2抑制mTORC1通路的活性，避免细胞合成代谢的过度活化而导致癌症的发生。
实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明特异性结合Sestrin2蛋白的多肽亲和力高，靶点明确，靶向Sestrin2/STAMBPL1相互作用位点，可以有效地抑制肿瘤细胞的形成。
(2)发明的多肽药物具有全新的分子结构，作用机制明确，活性高、用药剂量小、毒副作用低、没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控。
附图说明
附图中目的肽表示嵌合肽tat-STAMBPL1。
图1为嵌合肽tat-STAMBPL1对于Sestrin2与STAMBPL1互作的影响。
图2为嵌合肽tat-STAMBPL1对于Sestrin2泛素化水平的影响。
图3为嵌合肽tat-STAMBPL1对结直肠癌细胞(LS174T)mTORC1水平的影响。
图4为嵌合肽tat-STAMBPL1对于结直肠癌细胞(LS174T)生长速度的影响。图4中，纵坐标的单位是细胞密度(106个/孔)。
图5为嵌合肽tat-STAMBPL1处理48小时对于结直肠癌细胞(LS174T)大小的影响。
图6为嵌合肽tat-STAMBPL1对于结直肠癌细胞(LS174T)克隆形成的影响。图6中，纵坐标的单位是克隆数(个/孔)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1嵌合肽tat-STAMBPL1的序列及合成
发明人前期实验结果证明mTORC1通路负调控因子Sestrin2在亮氨酸充足情况下，通过与去泛素化酶STAM结合蛋白样1(STAM binding protein like 1，STAMBPL1)结合从而被去除泛素化，进而解除对于mTORC1通路的抑制，从而促进细胞生长。发明人通过生物信息分析发现STAMBPL1基因作为mTORC1通路的正调控因子，在多种癌症中表达量上调，尤其是在消化道癌症如结直肠癌、胃癌等。在这些类型的癌症病人样本中，基因组测序结果显示STAMBPL1有一个高频突变：K405Rfs*21。发明人通过进一步实验证明了这个突变通过增加其与Sestrin2结合的能力，异常激活mTORC1信号通路从而促进癌症的发生。STAMBPL1作为促癌基因通过激活mTORC1信号通路参与肿瘤细胞的增殖，敲除STAMBPL1基因或给予mTORC1信号通路抑制剂Rapamycin(mTOR蛋白特异性抑制剂)能够显著抑制肿瘤发生，因此针对STAMBPL1基因的药物研发将为结直肠癌治疗提供新的靶点。
针对发明人最新发现的Sestrin2-STAMBPL1这一机制在结直肠癌中的关键促癌作用，合成了模拟STAMBPL1上与Sestrin2结合区域的氨基酸片段(活性肽，即本发明STAMBPL1多肽，SEQ ID No.1)，并设计合成了具有细胞渗透性的嵌合肽tat-STAMBPL1，所述嵌合肽tat-STAMBPL1的氨基酸序列如下所示：
YGRKKRRQRRR-GG-ERMASVYLEEGNLENAFVLY(SEQ ID No.3)
该嵌合肽tat-STAMBPL1的序列由三部分组成：
1.N端为穿膜肽，来自HIV-1Tat蛋白的转导域序列，即Tat肽(SEQ ID No.2)，使STAMBPL1多肽能够进入细胞；
2.两个甘氨酸作为linker连接前后两段序列(连接穿膜肽和STAMBPL1多肽)；
3.C端为STAMBPL1与Sestrin2结合的区域(STAMBPL1多肽，SEQ ID No.1)，序列自人源STAMBPL1蛋白的第59位氨基酸开始，至78位氨基酸结束，共计20个氨基酸。STAMBPL1多肽为特异性结合Sestrin2蛋白的多肽，可通过竞争结合阻断Sestrin2与内源STAMBPL1的相互作用。
下述实施例设置了对照肽1和对照肽2。对照肽1：YGRKKRRQRRR-GG-ERVRALSKLGCNITISEDIT；对照肽2：YGRKKRRQRRR-GG-SEDITPRRYFRSGVEMERMA。
本发明多肽(嵌合肽tat-STAMBPL1、对照肽1和对照肽2)的合成采用Fmoc固相合成法，多肽序列及纯度使用质谱及色谱进行验证。多肽粉末用超纯膜过滤无酶水(Invitrogen)溶解至1mM，于-20℃保存。
实施例2嵌合肽tat-STAMBPL1对于Sestrin2与STAMBPL1互作的影响
根据发明人的研究结果，STAMBPL1作为Sestrin2的去泛素化酶，能够降低Sestrin2的泛素化水平。合成的目的多肽(嵌合肽tat-STAMBPL1)，而非对照多肽，进入细胞后将与细胞内源的STAMBPL1竞争结合Sestrin2，从而抑制Sestrin2与STAMBPL1的互作。
下述步骤中的表达HA标签的STAMBPL1质粒为重组载体pcDNA3.3-HA-STAMBPL1，它是以HEK293T细胞的cDNA作为模板，设计STAMBPL1两端的同源引物进行PCR，从而获得STAMBPL1片段，将STAMBPL1核酸片段克隆至pcDNA3.3-HA载体中，得到的表达STAMBPL1基因的重组表达载体。
具体实验操作步骤如下：
取对数生长期的人胚肾细胞(HEK293T)以2×106个/碟的密度接种于6厘米碟中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基(HyClone)于37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞生长面积达70％左右时进行转染。聚乙烯亚胺(PEI,Santa Cruz)为质粒的转染试剂。每个6厘米碟转染2μg表达HA标签的STAMBPL1质粒(pcDNA3.3-HA-STAMBPL1)得到重组细胞。转染8小时后进行换液。换液12小时后，将一个6厘米碟的细胞均分至两个6厘米碟。待细胞贴壁后，用含有20μM嵌合肽tat-STAMBPL1的Opti-MEM溶液替换正常培养基以对细胞进行处理，同时设置对照组为使用不含嵌合肽tat-STAMBP L1的Opti-MEM溶液或添加对照肽1：YGRKKRRQRRR-GG-ERVRALSKLGCNITISEDIT；对照肽2：YGRKKRRQRRR-GG-SEDITPRRYFRSGVEMERMA。具体实验操作如下：
目的肽实验组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将嵌合肽tat-STAMBPL1稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
阴性对照组(“/”)：用减血清的Opti-MEM(Gibco)替换正常培养基与细胞孵育。
对照肽1组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将对照肽1稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
对照肽2组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将对照肽2稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
多肽处理24小时后，弃去培养液，每个6厘米碟加入0.5mL的TX-100裂解液(150mMNaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,2.5mM sodium pyrophosphate,1mMβ-glycerophosphate，1％Triton X-100,20mM Tris-HCl,pH 7.4(使用前需要添加蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(bimake))裂解细胞，冰上孵育15分钟后，将细胞裂解液转移至1.5mL管中于4℃以12000rpm速度离心15分钟。离心结束后取60μL上清与4x加样缓冲液(Laemmli SampleBuffer，Bio-Rad)混合，100℃煮样15分钟后完成制样进行SDS-PAGE(图1中的“Celllysate”所示)。将其余上清转移至新1.5mL管，加入1mL TX-100裂解液，并与预先洗好的Anti-HA琼脂糖珠(sigma)混合，4℃孵育4小时。完成孵育后，用1mL TX-100裂解液将琼脂糖珠洗涤三遍，最终用30μL 1.2x加样缓冲液洗脱，样品于100℃煮10分钟。通过蛋白质印迹法检测STAMBPL1与细胞内源Sestrin2蛋白互作情况(图1中的“IP：HA”所示)。
结果如图1所示，目的多肽(嵌合肽tat-STAMBPL1)处理后的细胞相较于对照组，STAMBPL1与Sestrin2的互作受到抑制。由此说明目的多肽(嵌合肽tat-STAMBPL1)能够进入细胞，抑制STAMBPL1与Sestrin2的互作。
实施例3嵌合肽tat-STAMBPL1对于Sestrin2泛素化水平的影响
嵌合肽tat-STAMBPL1进入细胞后，与细胞内源的STAMBPL1竞争结合Sestrin2，阻止内源STAMBPL1蛋白去泛素化Sestrin2，从而实现Sestrin2的泛素化水平上调。
下述步骤中的表达Flag标签的Sestrin2质粒为重组载体pcDNA3.3-Flag-Sestrin2，它是以HEK293T细胞的cDNA作为模板，设计Sestrin2两端的同源引物进行PCR，从而获得Sestrin2片段，将Sestrin2核酸片段克隆至pcDNA3.3-Flag载体中，得到的表达Sestrin2基因的重组表达载体。
具体实验操作步骤如下：
取对数生长期的人胚肾细胞(HEK293T)以2×106/碟的密度接种于6厘米碟中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基(HyClone)于37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞生长面积达70％左右时进行转染。聚乙烯亚胺(PEI,Santa Cruz)为质粒的转染试剂。每个6厘米碟转染4μg表达Flag标签的Sestrin2质粒(pcDNA3.3-Flag-Sestrin2)以及0.3μg表达myc标签的K63-Ub质粒(Ub蛋白只保留63位赖氨酸，突变其余位置赖氨酸，Chen,J.,Ou,Y.,Yang,Y.etal.KLHL22 activates amino-acid-de pendent mTORC1 signalling to promotetumorigenesis and ageing.Nature 557,585–589(2018))。转染8小时后进行换液。换液12小时后，将一个6厘米碟的细胞均分至两个6厘米碟。待细胞贴壁后，用含有20μM嵌合肽tat-STAMBPL1的Opti-MEM溶液替换正常培养基以对细胞进行处理，对照组为使用不含多肽的Opti-MEM溶液或添加对照肽1：YGRKKRRQRRR-GG-ERVRALSKLGCNITISEDIT；对照肽2：YGRKKRRQRR R-GG-SEDITPRRYFRSGVEMERMA。具体实验操作如下：
目的肽实验组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将嵌合肽tat-STAMBPL1稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
阴性对照组(“/”)：用减血清的Opti-MEM(Gibco)替换正常培养基与细胞孵育。
对照肽1组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将对照肽1稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
对照肽2组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将对照肽2稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
多肽处理24小时后，弃去培养液，每个6厘米碟加入0.5mL含1％SDS的RIPA裂解液(50mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,1％NP-40,1％sodium deoxycholate,2.5mM sodiumpyrophosphate,1mMβ-glycerophosphate,20mM Tris-HCl,pH 7.4(使用前需要添加蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(bimake))裂解细胞，冰上孵育15分钟后，将细胞裂解液转移至1.5mL管中进行超声。超声完成后将裂解液于100℃静置煮样10分钟。完成煮样后，在室温静置10分钟，再于4℃以15000rpm速度离心15分钟。离心结束后取60μL上清与4x加样缓冲液(Laemmli Sample Buffer，Bio-Rad)混合，100℃煮样15分钟后完成制样(图2中的“Celllysate”所示)。将其余上清转移至新1.5mL管，加入两倍体积的RIPA裂解液以稀释SDS的浓度，并与预先洗好的Anti-Flag琼脂糖珠(sigma)混合，4℃孵育4小时。完成孵育后，用1mL含有0.1％SDS的RIPA裂解液将琼脂糖珠洗涤三遍，最终用30μL 1.2x加样缓冲液洗脱，样品于100℃煮10分钟。通过蛋白质印迹法检测Sestrin2的泛素化水平(图2中的“IP：FLAG”所示)。
结果如图2所示，嵌合肽tat-STAMBPL1处理后的细胞中Sestrin2的泛素化水平高于对照组。由此说明我们生产的嵌合肽tat-STAMBPL1能够进入细胞，上调Sestrin2的泛素化水平。
实施例4嵌合肽tat-STAMBPL1对结直肠癌细胞(LS174T)mTORC1水平的影响
Sestrin2的泛素化水平高低能够影响mTORC1的活化水平，嵌合肽tat-STAMBPL1进入细胞后能够上调Sestrin2的泛素化水平，从而抑制mTORC1的活化。
具体实验操作步骤如下：
取对数生长期的人结直肠癌细胞系LS174T(简称LS174T)以1.75×105个/孔的密度接种于24孔板，用含20％胎牛血清的EMEM培养基(ATCC)于37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞生长面积达80％左右时，分为4个实验组：目的肽实验组、阴性对照组(“/”)、对照肽1组和对照肽2组。
目的肽实验组：用减血清的Opti-MEM(Gibco，其货号为31985070)将嵌合肽tat-STAMBPL1稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
阴性对照组(“/”)：用减血清的Opti-MEM(Gibco)替换正常培养基与细胞孵育。
对照肽1组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将对照肽1稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
对照肽2组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将对照肽2稀释至20μM后，替换正常培养基与细胞孵育。
孵育4小时后，吸取培养液，每孔加入4℃预冷的50μL RIPA裂解液(50mM NaCl,1mMNa2EDTA,1mM EGTA,1％NP-40,1％sodium deoxycholate,2.5mM so dium pyrophosphate,1mMβ-glycerophosphate,20mM Tris-HCl,pH 7.4(使用前需要添加蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(bimake))裂解细胞。24孔板于冰上静置15分钟后，转移至1.5mL离心管中，12000rpm 4℃离心15分钟。离心结束后取上清与4x加样缓冲液混合，100℃煮样15分钟后完成制样。分别用抗S6K1抗体、抗p-S6K1抗体、抗S6抗体、抗p-S6抗体、抗LC3BI抗体、抗LC3BII抗体、抗Akt抗体、抗p-Akt抗体和抗GAPDH抗体通过蛋白质印迹法检测mTORC1特异底物蛋白磷酸化水平来指征mTORC1活化水平(图3)。
结果如图3所示，S6K1是mTORC1的直接磷酸化底物蛋白，S6是S6K1的直接磷酸化底物蛋白，mTORC1活化后会对S6K1进行磷酸化，S6K1随即可以磷酸化S6，因此p-S6K1和p-S6的水平反映了mTORC1活化水平。同时mTORC1的活化会抑制自噬的发生，其指征是LC3B切割形式LC3BII会大量减少。Akt信号通路在mTORC1信号通路的上游，上游激酶Akt的磷酸化在此可以作为对照。相较于阴性对照组，嵌合肽tat-STAMBPL1处理组S6K1和S6蛋白水平几乎不变，而p-S6K1和p-S6水平显著降低，同时LC3BII大量产生，说明自噬正在启动，作为对照Akt的磷酸化水平却没有变化，由此我们认为嵌合肽tat-STAMBPL1处理能够明显抑制结直肠癌细胞LS174T的mTORC1活化水平。
实施例5嵌合肽tat-STAMBPL1对于结直肠癌细胞(LS174T)生长的影响
mTORC1信号通路的过度激活往往会导致细胞过度生长，嵌合肽tat-STAMBPL1进入细胞后通过抑制mTORC1的活化，实现对肿瘤细胞生长的抑制。
具体实验操作步骤如下：
取对数生长期的人结直肠癌细胞(LS174T)以1.75×105个/孔的密度接种于24孔板，用含20％胎牛血清的EMEM培养基(ATCC)培养，待细胞生长面积达80％左右时，分为Peptide组和阴性对照组(Ctrl)。Peptide组：用减血清的Opti-MEM(Gibco)将嵌合肽tat-STAMBPL1稀释至20μM后，替换正常培养基进行细胞孵育(Peptide组)。用减血清的Opti-MEM培养液作为阴性对照组(Ctrl)。Peptide组和阴性对照组(Ctrl)分别在培养24小时(1天)，48小时(2天)，72小时(3天)和96小时(4天)后，消化细胞，用细胞计数仪(CountStar)检测细胞密度及细胞直径。每个实验组做4个重复(图4)。
结果如图4和图5所示，在嵌合肽tat-STAMBPL1处理24、48、72和96小时后检测细胞密度以及细胞直径，其细胞数量相较于阴性对照组显著减少，细胞直径相较于阴性对照组明显小。因此，嵌合肽tat-STAMBPL1处理显著抑制结肠癌细胞LS174T细胞生长。采用Prism8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用双尾t检验，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例6软琼脂克隆形成实验检测嵌合肽tat-STAMBPL1对于结直肠癌细胞(LS174T)成瘤能力影响
克隆形成试验(clony-formation test)是评价抗肿瘤药物作用的简便、可靠的体外方法，目前较为常用。克隆形成的大小和数量反映了细胞的成瘤能力。mTORC1信号通路的过度激活可能会导致癌症发生，嵌合肽tat-STAMBPL1进入细胞后通过抑制mTORC1的活化，实现对细胞成瘤能力的抑制。
具体实验操作如下：
以双蒸水作为溶剂，分别配制质量浓度为1.2％和0.7％的低熔点琼脂糖(Sigma)。实验中下层胶由1.2％低熔点琼脂糖与2×DMEM培养基1：1混合配制而成(将溶液置于42℃水浴锅中备用)，每个六孔板的孔需要1.5mL下层胶(注意尽量避免气泡产生)。下层胶铺完以后，将六孔板于室温放置至少30分钟，待胶完全凝固后再进行上层胶的配制。取对数生长期的人结直肠癌细胞LS174T进行充分消化，分为4个实验组：目的肽实验组、阴性对照组(“/”)、对照肽1组和对照肽2组。
目的肽实验组：将细胞以1×104个/mL的密度重悬于含40μM嵌合肽tat-STAMBPL1的Opti-MEM(向Opti-MEM中加入tat-STAMBPL1至tat-STAMBPL1的含量为40μM得到的液体)中，得到细胞悬液。
阴性对照组(“/”)：将细胞以1×104个/mL的密度重悬于不含嵌合肽tat-STAMBPL1的Opti-MEM溶液得到细胞悬液。
对照肽1组：将细胞以1×104个/mL的密度重悬于含40μM对照肽1的Opti-MEM(向Opti-MEM中加入对照肽1至对照肽1的含量为40μM得到的液体)中，得到细胞悬液。
对照肽2组：将细胞以1×104个/mL的密度重悬于含40μM对照肽2的Opti-MEM(向Opti-MEM中加入对照肽2至对照肽2的含量为40μM得到的液体)中，得到细胞悬液。
每个实验组做3个重复。细胞悬液与0.7％低熔点琼脂糖1：1均匀混合后，加至已经完全凝固的下层胶上，每孔需要1.5mL上层胶(注意尽量避免气泡产生)。轻轻晃动孔板使细胞均匀分布于每个孔后将孔板置于室温。待上层胶完全凝固后，将六孔板于37℃、5％CO2细胞培养箱培养。此后每隔2天，给每孔补100μL Opti-MEM防止凝胶变干而影响细胞生长。两周后，向每个孔加入1mL 0.005％的结晶紫(溶于5％甲醇)对细胞进行染色。37℃染色1小时后，用PBS洗涤一遍。将每孔的克隆形成情况拍照，并用Image J进行分析。采用Prism 8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用双尾t检验，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
结果如图6所示，根据软琼脂克隆形成实验结果，目的肽组相较于对照组形成的克隆形态较小，且在数据统计和分析后，嵌合肽tat-STAMBPL1处理组形成的克隆数量明显少于对照组。表明嵌合肽tat-STAMBPL1处理后的LS174T细胞生长受到抑制，成瘤能力显著下降，证明该多肽(嵌合肽tat-STAMBPL1)能抑制肿瘤的形成，具有良好的抗肿瘤(尤其是结直肠癌)功能。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Glu Arg Met Ala Ser Val Tyr Leu Glu Glu Gly Asn Leu Glu Asn Ala
1 5 10 15
Phe Val Leu Tyr
20
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Glu Arg Met
1 5 10 15
Ala Ser Val Tyr Leu Glu Glu Gly Asn Leu Glu Asn Ala Phe Val Leu
20 25 30
Tyr
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gagaggatgg cgtctgtgta tttggaagaa ggaaatttgg aaaatgcctt tgttctttat 60
<210> 5
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
tatggcagga agaagcggag acagcgacga agaggcggcg agaggatggc gtctgtgtat 60
ttggaagaag gaaatttgga aaatgccttt gttctttat 99

Claims (10)

1.多肽，其特征在于，所述多肽为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个及以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且特异性结合Sestrin2蛋白的多肽；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合多肽。
2.嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽包括权利要求1所述的多肽和穿膜肽。
3.根据权利要求2所述的嵌合肽，其特征在于，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
4.根据权利要求2或3所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽还包括接头。
5.根据权利要求2-4中任一所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
6.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：
B1)编码权利要求1所述多肽的DNA分子；
B2)编码权利要求2-5任一所述嵌合肽的DNA分子。
7.抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的多肽和/或权利要求2-5中任一所述的嵌合肽。
8.权利要求1所述的多肽，和/或权利要求2-5中任一所述的嵌合肽，和/或权利要求6所述的核酸分子在制备预防、改善或治疗由mTORC1信号通路异常所引起疾病的药物或产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述由mTORC1信号通路异常所引起疾病为肿瘤或消化道肿瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤或消化道肿瘤为直结肠癌、食道癌、胃癌或肝胆胰腺癌。
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