CN109847060A - 牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109847060A
CN109847060A CN201910315358.6A CN201910315358A CN109847060A CN 109847060 A CN109847060 A CN 109847060A CN 201910315358 A CN201910315358 A CN 201910315358A CN 109847060 A CN109847060 A CN 109847060A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pasteurella multocida
disease
mannheimia haemolytica
vaccine
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910315358.6A
Other languages
English (en)
Inventor
朱战波
赫鸣睿
刘宇
周金玲
何泊宁
范春玲
杨玉英
周玉龙
闻晓波
陈楠楠
吴陈华
黄雯静
岳山
贾斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Heilongjiang Bayi Agricultural University
Original Assignee
Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Heilongjiang Bayi Agricultural University filed Critical Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority to CN201910315358.6A priority Critical patent/CN109847060A/zh
Publication of CN109847060A publication Critical patent/CN109847060A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，该疫苗的有效成分含有抗原和佐剂，其中，抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02。本发明还涉及上述疫苗的制备方法和注射剂量。1、本发明的灭活疫苗对目前流行的牛纤维素性化脓性肺炎和肉牛地方流行肺炎提供良好的免疫保护效力，疫苗安全性好，免疫效果稳定，免疫持续期长；2、本发明灭活疫苗的注射剂量为2ml，提高了临床注射操作便利性和疫苗包装利用率；3、疫苗种子液培养过程中不需通气搅拌发酵培养等传统方法，简便了抗原制备生产工艺，既能提高疫苗抗原纯度又能增强抗原的免疫原性。

Description

牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其 制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，特别涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
在养牛业发达地区，牛呼吸道疾病综合症(Bovine respiratory diseasecomplex,BRDC)是最普遍的疾病。常见可引起牛呼吸道疾病的病原有：牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、昏睡嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性支气管炎病毒、牛副流感3型病毒等，细菌繁殖迅速传播性强，一旦引起动物发病就会造成广泛的流行趋势。
多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原可分为A、B、C、D、E、F六个型，感染牛引起发病的多杀性巴氏杆菌主要是牛B型多杀性巴氏杆菌和牛A型多杀性巴氏杆菌，由牛B型多杀性巴氏杆菌造成的牛出血性败血症(牛出败)在我国已经流行几十年，我国兽医研究人员对牛出败的预防与治疗也取得了显著成效，国内青海生物药品厂、齐鲁动物保健品有限公司和四川伊禾动物药品有限公司都生产预防牛出败的商品化疫苗，由牛A型多杀性巴氏杆菌引起的牛纤维素性肺炎在我国一直未受到重视，21世纪初我国牛A型多杀性巴氏杆菌的流行趋势逐年上升，由牛A型多杀性巴氏杆菌感染引起的犊牛肺炎在中国多个地区规模化牛场中频繁发生，造成犊牛大批死亡，降低了牛场的经济效益并严重影响养牛业的发展。
溶血性曼氏杆菌是引起反刍动物肺炎和败血症的病原菌，根据菌体表面的蛋白抗原差异和血凝试验分为17个血清型，该菌可在健康反刍动物的上呼吸道内寄生，其中A6型溶血性曼氏杆菌在犊牛肺炎中占主导地位，能够引起肉牛的地方流行性肺炎，还会导致绵羊肺炎和新生羔羊急性败血症，溶血性曼氏杆菌发现于20世纪末，近几年溶血性曼氏杆菌在我国黑龙江地区流行率较高，在我国其他省份呈地方性流行，给我国的养牛业和养羊业带来巨大的经济损失。
现在饲料中由于化学添加剂、糖皮质激素及其他免疫抑制剂的大量使用导致动物体免疫功能降低，使家畜患细菌性传染病的几率大大增高。致病菌株抗生素耐药谱的不断扩大，导致供选择药物的种类越来越少，家畜传染病进行抗生素治疗已不再是最佳方案，依靠疫苗免疫来预防细菌性传染病尤为重要。国外已有商品化同时预防牛源溶血性曼氏杆菌病和牛A型多杀性巴氏杆菌病等多种疾病的联合疫苗，但由于不同地区的菌株差异性，这种商品化疫苗不适用于中国的牛病预防，国内兽药市场虽然有预防牛出败的商品化疫苗，研究发现A型和B型多杀性巴氏杆菌之间不能产生完全的交叉保护，免疫牛出败疫苗无法对牛A型多杀性巴氏杆菌产生预防效果，而国内兽药市场尚无同时预防血清A6型牛溶血性曼氏杆菌病和荚膜A型牛多杀性巴氏杆菌病的有效疫苗。本发明所使用的抗原为地方流行菌株，具有地域代表性，对于该地区牛溶血性曼氏杆菌病和牛多杀性巴氏杆菌病的预防更具有现实意义，为了防控牛血清A6型溶血性曼氏杆菌和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌引发的疾病，研制有效疫苗迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的问题，提供一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，可以同时防控牛血清A6型溶血性曼氏杆菌和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌引发的疾病。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，有效成分包括抗原和佐剂，所述的抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02。
具体的，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL。
具体的，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×1010CFU/mL。
具体的，牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株包含omp87、fimA、ompA、tonB、exbD、Fur、hgbA、sodC、pmHAS、Tbp A、hsf-2、hsf-1、pfh A、ptfA、sodA、nanH、plpB、exbB、tadD共19种毒力基因。
具体的，牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗被免疫动物所产生抗体的ELISA检测方法，
(1)抗原包被多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白(4μg/mL)、多杀性巴氏杆菌LY01全菌体蛋白(160μg/mL)；
(2)抗原包被溶血性曼氏杆菌LktA蛋白(5μg/mL)、溶血性曼氏杆菌LY02全菌体蛋白(100μg/mL)。
二、上述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、通过PCR技术对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株进行鉴定。
步骤二、将步骤一鉴定合格的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株用不通气发酵的方式分别在气浴恒温振荡器中进行液体悬浮增殖培养；
步骤三、步骤二得到的两个菌液离心浓缩、灭活；
步骤四、步骤三得到的灭活后的两个菌液混合制成抗原液，再加入佐剂，充分混合均匀，得牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗。
步骤五、步骤四得到二联灭活疫苗分装，加塞密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
具体的，以牛多杀性巴氏杆菌LY01株提取DNA，根据荚膜A型多杀性巴氏杆菌特异性基因hyaD设计引物进行基因扩增，以牛溶血性曼氏杆菌LY02株提取DNA为模板根据溶血性曼氏杆菌A6血清型特异性基因TupA设计引物进行基因扩增，以牛多杀性巴氏杆菌LY01株提取DNA，根据荚膜A型多杀性巴氏杆菌毒力基因omp87、fimA、ompA、tonB、exbD、Fur、hgbA、sodC、pm HAS、Tbp A、hsf-2、hsf-1、pfh A、ptfA、sodA、nanH、plpB、exbB、tadD等设计引物进行基因扩增。
引物由Sangon Biotech生物工程(上海)股份有限公司合成，
扩增hyaD基因的PCR运行参数：1)94℃预变性10min；2)94℃热变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；3)72℃延伸10min；
扩增TupA基因的PCR运行参数：1)95℃预变性15min；2)94℃热变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；3)72℃延伸10min。
扩增多杀性巴氏杆菌毒力基因的PCR运行参数：1)94℃预变性2min；2)94℃热变性30s，54℃～55℃退火40s，68℃延伸25s～50s，循环35次；3)68℃延伸5min。
表1引物列表
具体的，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株的培养方法为：将荚膜A型多杀性巴氏杆菌LY01株以脑心浸液培养基总体积1％的接种量接种于制苗用脑心浸液培养基(BHI)，37℃采用振荡方法培养18-24h。
具体的，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株的培养方法为：将溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株以脑心浸液培养基总体积1％的接种量接种于制苗用脑心浸液培养基，37℃采用悬浮振荡方法培养18-24h。
具体的，增殖培养时，封闭培养皿瓶口，保持菌液与外界环境隔绝并以不搅拌的方式进行培养，培养全程封闭培养皿瓶口不需要通入空气，以保持菌液抗原成分不受外环境污染。
具体的，离心浓缩的离心参数为8000r/min，离心时间30min，保留部分菌液上清液重悬菌体，制成10～100倍浓缩菌液。
具体的，离心浓缩后采用终浓度为0.3％的甲醛溶液灭活，灭活温度37℃，灭活时间24h。
具体的，步骤四中灭活后的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01抗原菌液和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02抗原菌液按照体积比1：1混合制成混合抗原菌液，再按佐剂与混合抗原菌液体积比为4：1加入佐剂，所述的佐剂为氢氧化铝胶。
三、上述牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗免疫犊牛的剂量为2mL/头。
采用上述技术方案的积极效果：(1)本发明的二联灭活苗对目前流行的牛纤维素性化脓性肺炎和肉牛地方流行肺炎提供良好的免疫保护效力，可通过一针免疫牛，同时预防牛纤维素性化脓性肺炎和肉牛地方流行肺炎两种疾病、疫苗安全性好，免疫效果稳定，免疫持续期长；(2)本二联灭活疫苗的注射剂量为2ml，与传统的巴氏杆菌单苗注射剂量4-6ml相比，极大的提高了临床注射操作便利性，和提高了疫苗包装利用率；(3)本发明选择LY01株作为牛巴氏杆菌荚膜A型菌抗原和LY02株作为血清A6型溶血性曼氏杆菌抗原，所选择的菌株具有黑龙江地区代表性，与地方流行菌株抗原高度一致，疫苗种子液培养过程中不需通气搅拌发酵培养等传统方法，简便了抗原制备生产工艺，既能提高疫苗抗原纯度又能增强抗原的免疫原性；(4)本发明在二联灭活疫苗在效力检验中建立小鼠与牛的效力检验平行关系模型，部分效力检验采用小鼠即可替代本动物牛的效力检验，维护了动物福利，以及极大程度地节省了人力、物力和财力。
附图说明
图1为多杀性巴氏杆菌分型鉴定PCR结果；
其中1：阳性对照；2：LY01株；3.阴性对照；M：DL2000marker
图2为溶血性曼氏杆菌分型鉴定PCR结果；
其中1：阴性对照；2：LY02株；3.阳性对照；M：DL2000marker
图3为多杀性巴氏杆菌毒力基因检测PCR结果；
其中1：omp87；2：fimA；3：ompA；4：tonB；5：exbD；6：Fur；7：hgbA；8：sodC；9：pm HAS；10：Tbp A；11：hsf-2；12：hsf-1；13：pfh A；14：ptfA；15：sodA；16：nanH；17：plpB；18：exbB；19：tadD；M：DL2000marker
图4多杀性巴氏杆菌LY01株攻毒被免疫小鼠的生存曲线；
图5溶血性曼氏杆菌LY02株攻毒被免疫小鼠的生存曲线；
图6为小鼠血清抗多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白抗体消长规律；
图7为小鼠血清抗溶血性曼氏杆菌LktA蛋白抗体消长规律；
图8～图11免疫菌数为108cfu/mL疫苗的小鼠肺、肝、脾、肾病理切片结果；
图12～图15免疫菌数为109cfu/mL疫苗的小鼠肺、肝、脾、肾病理切片结果；
图16～图19免疫菌数为1010cfu/mL疫苗的小鼠肺、肝、脾、肾病理切片结果；
图20小鼠血清抗多杀性巴氏杆菌LY01全菌蛋白抗体消长规律；
图21小鼠血清抗多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白抗体消长规律；
图22小鼠血清抗溶血性曼氏杆菌LY02全菌蛋白抗体消长规律；
图23小鼠血清抗溶血性曼氏杆菌LktA蛋白抗体消长规律；
图24免疫氢氧化铝胶佐剂菌数1010cfu/mL疫苗小鼠经不同菌株攻毒结果；
图25免疫氢氧化铝胶佐剂对照组小鼠经不同菌株攻毒结果；
图26牛血清抗多杀性巴氏杆菌LY01全菌蛋白抗体消长规律；
图27牛血清抗多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白抗体消长规律；
图28牛血清抗溶血性曼氏杆菌LY02全菌蛋白抗体消长规律；
图29牛血清抗溶血性曼氏杆菌LktA蛋白抗体消长规律；
图30免疫氢氧化铝胶佐剂疫苗犊牛的直肠温度。
具体实施方式
菌种：荚膜A型牛多杀性巴氏杆菌LY01株，血清A6型牛溶血性曼氏杆菌LY02株：牛溶血性曼氏杆菌小鼠感染模型建立及灭活疫苗免疫原性研究，周金玲，硕士论文，授予单位：黑龙江八一农垦大学，导师：朱战波，发表时间：2018年。
实施例1
实施例1说明多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备。
1、材料
5％兔血营养琼脂配制：称取33g NA粉末加入1000mL蒸馏水中充分混匀后，121℃灭菌15min。冷却至37℃～45℃按照培养基体积的5％加入兔全血充分均匀后，倾倒平板备用。
BHI培养基配制：称取37g BHI粉末加入1000ml蒸馏水中，充分混匀后，121℃灭菌15min。
2、疫苗的制备
2.1、疫苗种子制备
一级种子繁殖：分别将多杀性巴氏杆菌LY01株和溶血性曼氏杆菌LY02株冻干菌粉末3-5mg置于含BHI肉汤的试管中，将含菌试管放入气浴恒温振荡器培养24h，培养条件为180r/min，温度为37℃。将菌液使用接种环划线于5％兔血营养琼脂培养基上，放置于恒温培养箱内培养24h作为一级疫苗种子。在2～8℃保存，使用期不超过20d。
二级种子繁殖：取多杀性巴氏杆菌LY01株和溶血性曼氏杆菌LY02株一级疫苗种子培养基上经鉴定合格的典型单个菌落，将菌落置于洁净的BHI肉汤中，培养条件为180r/min，温度为37℃，培养时间为24h。取样经纯粹检验合格后，置2～8℃保存，使用期不超过7d。纯粹检验按2010版《中国兽药典》附录进行纯粹检验，结果应为纯粹。
2.2、抗原制备：按照BHI培养液总体积的1％～2％分别加入多杀性巴氏杆菌LY01株的二级种子液和溶血性曼氏杆菌LY02株的二级种子液，培养24h，培养条件为180r/min37℃，培养全程封闭培养皿瓶口不需要通入空气，保持菌液抗原成分不受外环境污染。取LY01株和LY02株封闭式液体培养后的菌液采用活菌计数法进行细菌计数，然后采用离心法对菌液进行浓缩，离心条件为8000r/min，温度为4℃，离心时间为30min，保留部分菌液上清液重悬菌体，制成10～100倍浓缩菌液，灭活按浓缩菌悬液量加入终浓度0.3％甲醛溶液，37℃灭活24h，期间搅拌数次，灭活检验按2010版《中国兽药典》附录进行灭活检验，结果应无菌生长。
2.3、疫苗配苗：将鉴定合格的LY01株和LY02株疫苗灭活菌液按照1：1的比例混合，使用玻璃棒搅拌混合均匀，加入氢氧化铝胶佐剂，佐剂与抗原液比例为4：1，搅拌15～20min，配制好的疫苗4℃保存，最终疫苗中含两种抗原为1.0×1010CFU/ml，LY01株和LY02鉴定结果如图1、图2所示，多杀性巴氏杆菌毒力基因检测PCR结果如图3所示。
2.4半成品检验按2010版《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。
2.5分装经无菌检验合格后，定量分装，分装期间应随时搅拌，使其混合均匀，加塞密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。
LY01株和LY02株封闭式液体培养后的菌液采用活菌计数法进行细菌计数，结果为：牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌LY01株和牛血清A6型溶血性曼氏杆菌LY02株培养24h后的细菌数分别为4.16×109cfu/mL和4.08×108cfu/mL。
实施例2
实施例2说明疫苗的安全性试验。
1材料
1.1试剂
辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TMB底物显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2试验动物
选用体重18-22g昆明系小白鼠。
2方法
确定小鼠最佳免疫剂量：选120只小白鼠雌雄各半，每10只为一组共分成12组，每组雌雄小鼠各5只，每只小鼠皮下注射0.2mL疫苗或佐剂，ELISA法检测小鼠抗体情况，1-8组是攻毒试验组，9-12组是血清采集组。
表2小鼠免疫分组
2.1攻毒试验
按Reed–Muench法计算细菌的LD50，LD50＝死亡率高于50％的稀释倍数的倒数的对数+距离比例×稀释系数的对数，距离比例＝(大于50％的死亡率－50)/(大于50％的死亡率－小于50％的死亡率)。
经计算得：LY01株2倍LD50为4.16×105CFU，LY02株2倍LD50为3.8×106CFU。
以LY01株2倍LD50和LY02株2倍LD50攻毒，免疫后第10d进行攻毒，1、2、3、4组每只小鼠腹腔注射4.16×105CFU多杀性巴氏杆菌LY01菌液，5、6、7、8组每只小鼠腹腔注射3.8×106CFU溶血性曼氏杆菌LY02菌液，观察10d内小鼠的生存情况，攻毒试验结果见图4、图5。
2.2鼠血清IgG的ELISA检测方法
9、10、11、12组小鼠免疫第7、14、21、28、35d采小鼠血清，全血放置4℃过夜后于4000r/min离心10min，取上清。ELISA法测定血清中抗体效价，同时设阴性与空白对照。抗原包被多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白(4μg/mL)、溶血性曼氏杆菌LktA蛋白(5μg/mL)、酶标二抗选择稀释浓度为1：5000。方法为：
(1)包被抗原蛋白，蛋白用0.05M pH9.6的CBS进行稀释每孔加入100μL稀释后的抗原蛋白，密封96孔板，放置在4℃冰箱包被24h，弃掉包被液，用PBST洗涤5次，每次5min。
(2)96孔板中，每孔加入200μL含1％BSA的PBST封闭液，37℃温育封闭2h。弃掉后用PBST洗涤5次，每次5min。
(3)各孔加入系列稀释的待检血清，每孔加入100μL，稀释液为0.01M PBS(pH7.4)。37℃作用1h后弃掉。PBST洗涤5次，每次5min，拍干。
(4)每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体，用5％BSA进行1:5000稀释。每孔加入100μL，37℃作用1h。弃掉废液。PBST洗涤5次，每次5min，拍干。
(5)每孔加100μL TMB-H2O2显色液(现配现用最好不超过10min)，室温避光作用10min。
(6)各孔加入50μL的0.5mol/L硫酸终止液终止显色。
酶标仪测定OD450nm测吸光值，进行结果判定。判定公式P/N＝(标本OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)。以P/N值大于或等于2.1为阳性阈值，小鼠血清抗体消长规律结果见图6、图7。
2.3免疫小鼠的病理学检查
检查注射含菌数108cfu/mL、109cfu/mL、1010cfu/mL疫苗小鼠内脏器官的病理变化。
(1)取材：取材部位包括病变最典型最明显的部位、健康部位、病变与健康部位交界处和该器官的主要成分，组织新鲜，死后不超过24h。
(2)固定：5～20倍组织体积的中性福尔马林溶液进行组织固定，保持组织和细胞的形态结构，将所取组织全部浸泡在中性福尔马林溶液中，固定时间为24h。
(3)脱水：使用85％、95％、100％三种浓度酒精依次进行脱水，每种酒精脱水时间在20～30min，将组织内水分最大限度脱干。
(4)组织包埋：使用液体石蜡对组织进行酒精置换，石蜡选用熔点为52-54℃、56℃和58-60℃三种熔点的石蜡，将脱水后的组织在三种石蜡液中按照熔点由低到高的顺序依次浸泡，浸泡时间为每种石蜡液50min。
(5)切片：刀刃与蜡块呈5°夹角，标本切全，组织较硬处在上，切片越薄越利于组织观察，组织切片放置在洁净的载玻片上。
(6)脱蜡：将切片上石蜡脱掉，二甲苯2-5min(重复2次)→无水乙醇1min→90％乙醇1min→80％乙醇1min→70％乙醇1min→清水洗2min→蒸馏水洗2min。
(7)染色：Harris苏木素液7min→蒸馏水洗1min→1％盐酸乙醇分化30s→蒸馏水洗1min→饱和碳酸锂1min→蒸馏水1min→伊红5min。
(8)封固：将染色后的组织切片晾干水分，组织中间滴加适量松节油，盖上盖玻片，注意不要有气泡。
(9)使用高倍显微镜在40×10视野下观察切片情况。鼠病理切片结果见图8～图19。
攻毒试验结果表明：疫苗含菌数为1010cfu/mL剂量组的免疫小鼠以LY01株攻毒后生存率为50％以LY02株攻毒后生存率为60％。以上结果表明以疫苗含菌数为1010cfu/mL剂量组的免疫小鼠攻毒后生存率最高，说明该免疫剂量组的保护性较高。
ELISA结果表明：含菌量1010cfu/mL剂量组免疫小鼠血清各时间点检测OD值最高，该组在抗体水平下降阶段的OD值也大于含菌量108cfu/mL剂量组和含菌量109cfu/mL剂量组的OD值。以上结果说明该组的免疫剂量免疫小鼠后能刺激小鼠产生较多抗体。
病理学检查结果表明：注射过氢氧化铝胶佐剂疫苗的小鼠脏器没有发生明显病理变化，肺脏、脾脏、肝脏和肾脏无异常。说明该疫苗对动物内脏器官不造成破坏，疫苗安全。
实施例3
实施例3说明疫苗对小鼠免疫效力试验。
取70只小白鼠分成7组，1～6组注射氢氧化铝胶佐剂+菌数1010CFU/mL疫苗，7组注射氢氧化铝胶佐剂0.2mL，共免疫3次免疫间隔21d，最后一次免疫结束后间隔10d攻毒，1组每只小鼠腹腔注射4.16×105CFU荚膜A型多杀性巴氏杆菌LY01菌液，2组每只小鼠腹腔注射3.8×106CFU血清A6型溶血性曼氏杆菌LY02菌液，3组每只小鼠腹腔注射4.6×108CFU荚膜A型多杀性巴氏杆菌WC16552菌液，4组每只小鼠腹腔注射1.58×107CFU血清A6型溶血性曼氏杆菌JS0165菌液，5组每只小鼠注射1.98×108CFU血清A1型溶血性曼氏杆菌WC16493菌液。6组和7组小鼠作为血清采集组，分别在首免后第7至第77d采血，ELISA法检测血清内IgG，小鼠血清抗体消长规律结果见图20～图23。除6组外其余组攻毒实验结果如图24所示。
取60只小白鼠分成6组，1组每只小鼠腹腔注射4.16×105CFU荚膜A型多杀性巴氏杆菌LY01菌液，2组每只小鼠腹腔注射3.8×106CFU血清A6型溶血性曼氏杆菌LY02菌液，3组每只小鼠腹腔注射4.6×108CFU荚膜A型多杀性巴氏杆菌WC16552菌液，4组每只小鼠腹腔注射1.58×107CFU血清A6型溶血性曼氏杆菌JS0165菌液，5组每只小鼠注射1.98×108CFU血清A1型溶血性曼氏杆菌WC16493菌液，6组注射氢氧化铝胶佐剂0.2mL，攻毒试验结果见图25。
抗原包被多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH(4μg/mL)、溶血性曼氏杆菌白细胞毒素蛋白LktA(5μg/mL)、多杀性巴氏杆菌LY01全菌蛋白(160μg/mL)、溶血性曼氏杆菌LY02全菌蛋白(100μg/mL)，酶标二抗选择稀释浓度为1：5000。具体实施步骤参照实施例2中2.2鼠血清IgG的ELISA检测方法。
攻毒试验结果表明疫苗对牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株保护率为50％，对牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌弱毒株WC16552保护率为70％，对血清A6型溶血性曼氏杆菌强毒株LY02攻毒保护率为80％，对血清A1型溶血性曼氏杆菌WC16493攻毒保护率为40％，研究发现该疫苗具有延缓动物发病的作用。
ELISA实验结果表明：免疫后的小鼠体内抗体水平持续升高，第三次免疫后21d基本达到峰值。说明该疫苗具有较强的免疫原性，可引起小鼠的体液免疫反应。
实施例4
实施例4说明疫苗剂量对犊牛免疫效力试验
1、试验动物：40-50d健康易感犊牛24头。
2、方法：
犊牛分4组，每组6头犊牛，1组每头犊牛注射氢氧化铝胶佐剂+菌数1010CFU/mL疫苗，2组每头犊牛注射氢氧化铝胶佐剂+菌数109CFU/mL疫苗，3组每头犊牛注射氢氧化铝胶佐剂+菌数108CFU/mL疫苗，4组每头犊牛注射氢氧化铝胶佐剂。2mL/头份。共免疫3次免疫间隔21d，分别在首免后第7至第77d采血，ELISA法检测血清内IgG。犊牛血清内抗体消长规律结果见图26～图29，被免疫犊牛体温结果见图30。
抗原包被为多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白(4μg/mL)、溶血性曼氏杆菌白细胞LktA蛋白(5μg/mL)、多杀性巴氏杆菌全菌体蛋白(160μg/mL)、溶血性曼氏杆菌全菌体蛋白(100μg/mL)，设置阴性对照和空白对照，酶标二抗的稀释浓度为1：5000。方法为：
(1)包被抗原蛋白，0.05M pH9.6CBS稀释抗原蛋白稀释后每孔加入100μL，放置在4℃恒温箱包被24h后弃掉包被液，用PBST洗涤5次，每次3-5min。
(2)向96孔板中，每孔加入200μL含5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃温育封闭2h。用PBST洗涤5次，每次5min。
(3)在各孔中加入经系列稀释后的待检血清，每孔中加入100μL，稀释液为0.01MPBS(pH 7.4)。37℃作用1h后弃掉。用PBST洗涤5次，每次5min，拍干。
(4)每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体，用5％脱脂乳进行1:5000稀释。每孔加入100μL，37℃作用1h。然后弃掉废液。用PBST洗涤5次，每次5min，用力拍干。
(5)每孔加入100μL TMB-H2O2显色液(现用现配)室温避光作用10min。
(6)向各孔加入50μL的0.5mol/L硫酸终止液终止显色。
实验结果表明：该疫苗可以刺激犊牛产生相应抗体，疫苗注射后犊牛体温升高但在数小时内缓解，氢氧化铝胶佐剂+疫苗菌数1010CFU/mL免疫组犊牛抗体产生情况最佳，本研究疫苗能够刺激犊牛产生体液免疫，本制品的本动物效力检验可用小鼠效力检验替代。综合以上结果，为提高疫苗免疫效力又能节约生产成本，本发明疫苗的最佳免疫剂量为疫苗菌数1010CFU/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，在本发明基础上，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。最后应该说明的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制。

Claims (10)

1.一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：有效成分包括抗原和佐剂，所述的抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02。
2.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×1010CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株包含omp87、fimA、ompA、tonB、exbD、Fur、hgbA、sodC、pm HAS、Tbp A、hsf-2、hsf-1、pfh A、ptfA、sodA、nanH、plpB、exbB、tadD共19种毒力基因。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗被免疫动物所产生抗体的ELISA检测方法，其特征在于：
(1)抗原包被多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白4μg/mL、多杀性巴氏杆菌LY01全菌体蛋白160μg/mL；
(2)抗原包被溶血性曼氏杆菌LktA蛋白5μg/mL、溶血性曼氏杆菌LY02全菌体蛋白100μg/mL。
6.一种根据权利要求5所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一、通过PCR技术对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株进行鉴定。
步骤二、将步骤一鉴定合格的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株用不通气发酵的方式分别在气浴恒温振荡器中进行液体悬浮增殖培养；
步骤三、步骤二得到的两个菌液离心浓缩、灭活；
步骤四、步骤三得到的灭活后的两个菌液混合制成抗原液，再加入佐剂，充分混合均匀，得牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗。
步骤五、步骤四得到二联灭活疫苗分装，加塞密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
7.根据权利要求6所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤四中灭活后的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01抗原菌液和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02抗原菌液按照体积比1：1混合制成混合抗原菌液，再按佐剂与混合抗原菌液体积比为4：1加入佐剂，所述的佐剂为氢氧化铝胶。
8.根据权利要求6所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤二中牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02以1％接种量接种于培养基中，37℃采用振荡方法培养18-24h。
9.根据权利要求6所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤三中离心的参数为8000r/min，离心时间30min，保留部分菌液上清液重悬菌体，制成10～100倍浓缩菌液，灭活采用终浓度为0.3％的甲醛溶液灭活，灭活温度37℃，灭活时间24h。
10.权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗免疫犊牛的剂量为2mL/头。
CN201910315358.6A 2019-04-19 2019-04-19 牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法 Pending CN109847060A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910315358.6A CN109847060A (zh) 2019-04-19 2019-04-19 牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910315358.6A CN109847060A (zh) 2019-04-19 2019-04-19 牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109847060A true CN109847060A (zh) 2019-06-07

Family

ID=66889285

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910315358.6A Pending CN109847060A (zh) 2019-04-19 2019-04-19 牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109847060A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088182A (zh) * 2019-12-20 2020-05-01 北京华夏兴洋生物科技有限公司 一种溶血性曼氏杆菌及其应用
CN112695112A (zh) * 2021-01-20 2021-04-23 西藏农牧学院 一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用
CN113801812A (zh) * 2021-09-02 2021-12-17 华中农业大学 一株多杀性巴氏杆菌及其应用
CN115161211A (zh) * 2021-04-01 2022-10-11 金宇保灵生物药品有限公司 一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101087803A (zh) * 2004-12-22 2007-12-12 英特威国际有限公司 出血败血性巴斯德氏菌疫苗
CN102458461A (zh) * 2009-04-24 2012-05-16 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 包含减毒的牛支原体菌株的疫苗和减毒的方法
WO2014039978A2 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Szathmary Dr Susan Vaccine to prevent mycoplasmal infection in waterfowl
CN106868167A (zh) * 2017-03-23 2017-06-20 山东师范大学 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒
CN107569681A (zh) * 2017-08-30 2018-01-12 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法
CN108578687A (zh) * 2018-04-24 2018-09-28 黑龙江八农垦大学 多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101087803A (zh) * 2004-12-22 2007-12-12 英特威国际有限公司 出血败血性巴斯德氏菌疫苗
CN102458461A (zh) * 2009-04-24 2012-05-16 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 包含减毒的牛支原体菌株的疫苗和减毒的方法
WO2014039978A2 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Szathmary Dr Susan Vaccine to prevent mycoplasmal infection in waterfowl
CN106868167A (zh) * 2017-03-23 2017-06-20 山东师范大学 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒
CN107569681A (zh) * 2017-08-30 2018-01-12 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法
CN108578687A (zh) * 2018-04-24 2018-09-28 黑龙江八农垦大学 多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何泊宁等: "牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测", 《中国兽医科学》 *
周金玲: "牛溶血性曼氏杆菌小鼠感染模型建立及灭活疫苗免疫原性研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》 *
高佳滨: "多杀性巴氏杆菌OmpH与溶血性曼氏杆菌lktA蛋白的融合表达与免疫原性研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088182A (zh) * 2019-12-20 2020-05-01 北京华夏兴洋生物科技有限公司 一种溶血性曼氏杆菌及其应用
CN111088182B (zh) * 2019-12-20 2021-09-10 北京华夏兴洋生物科技有限公司 一种溶血性曼氏杆菌及其应用
CN112695112A (zh) * 2021-01-20 2021-04-23 西藏农牧学院 一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用
CN115161211A (zh) * 2021-04-01 2022-10-11 金宇保灵生物药品有限公司 一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法
CN115161211B (zh) * 2021-04-01 2023-07-14 金宇保灵生物药品有限公司 一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法
CN113801812A (zh) * 2021-09-02 2021-12-17 华中农业大学 一株多杀性巴氏杆菌及其应用
CN113801812B (zh) * 2021-09-02 2023-07-25 华中农业大学 一株多杀性巴氏杆菌及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109847060A (zh) 牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法
CN102499982A (zh) 副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法
CN107569681A (zh) 一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法
CN102827275A (zh) 鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法
CN103497934B (zh) 鸡传染性支气管炎病毒疫苗株（hf2株）及其应用
CN108904796A (zh) 兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法
CN108018230B (zh) 一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用
CN107513506A (zh) 猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用
CN104981252B (zh) 包含支原体抗原的免疫原性组合物
CN110201153A (zh) 一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法
CN117844686A (zh) 一株具有交叉保护作用的副鸡禽杆菌血清a型菌株的分离、鉴定及应用
CN116836854A (zh) 一种牛荚膜a型多杀性巴氏杆菌及其灭活疫苗
CN104511015B (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法与应用
CN104611274A (zh) 一种副猪嗜血杆菌及其应用
CN104774796B (zh) 禽致病性大肠杆菌灭活疫苗及其制备方法
US11883477B2 (en) Triple vaccine for diseases caused by Salmonella typhimurium, Riemerella anatipestifer and Escherichia coli
CN105031635B (zh) 一种鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用
CN104096222A (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN104288760A (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN103194412A (zh) 一株血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株
CN106190988A (zh) 猫嵌杯病毒ch‑jl5株灭活疫苗
CN105754905A (zh) 一种水貂绿脓杆菌及其应用
CN110862938B (zh) 一株猪致病性大肠杆菌菌株及其灭活疫苗
CN103157101A (zh) 副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及其制备方法
CN112646750A (zh) 一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190607

RJ01 Rejection of invention patent application after publication