CN115161211B - 一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法 - Google Patents

一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法，属于兽用生物制品制备技术领域。提供的灭活疫苗中抗原为经筛选获得的增殖能力和毒力均较强的牛溶血性曼氏杆菌CGMCC No.16895，由其制备的灭活疫苗注射剂量为3ml时即可对免疫牛产生有效且稳定的免疫保护效果，并且安全性良好，不会在注射部位产生脓肿和结节，可以对流行的“船运热”疫病提供良好的预防效果。

Description

一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制 备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品制备技术领域，具体涉及一种牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的灭活疫苗和疫苗制备方法，尤其涉及一种具有较高的毒力效果的牛溶血性曼氏杆菌菌株及由其制备的具有良好的安全性和免疫保护效果的牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗。
背景技术
牛曼氏杆菌病是牛的重要呼吸道传染病，又称为“船运热”，引发该病的病原为牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)，属于曼氏杆菌属(Mannheimia)，是健康牛上呼吸道中的条件致病菌，在应激因素作用下，可引起内源性感染，一般在受到应激1～2周后出现典型的肺炎症状，潜伏期最短为1～3天。
牛曼氏杆菌病多呈地方性流行或散发，发病动物以幼龄为主，病死率较高。该病的发生一般无明显的季节性，但在冷热交替、气候剧变、闷热、潮湿、多雨的季节发生较多。体温失调、抵抗力降低也是该病的主要诱因之一。目前，发生疫病流行的地区主要采取一些减少或降低对动物应激反应的预防措施，发生疫病后只能采取对症治疗，普遍采用的方法是大范围使用抗生素，防治效果均不理想，也极易导致具备多种药物抗性的溶血性曼氏杆菌变种的出现。
对牛曼氏杆菌病疫情防控的最有效策略是疫苗防控，然而目前国内外对于牛溶血性曼氏杆菌的研究基本集中在菌种特性、致病机理上，疫苗制造也多在实验室阶段。高佳滨等人(高佳滨，陈为宏等，牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗的制备与检定，中国生物制品学杂志，2014年8月第27卷第8期，以下称文献1)采用牛溶血性曼氏杆菌菌液与弗氏佐剂或灭菌氢氧化铝胶混合制备牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗，两种灭活疫苗对小鼠的保护效果分别达到90％和80％，但是将疫苗注射昆明小鼠后，弗氏佐剂灭活疫苗组小鼠在注射部位产生结节，氢氧化铝胶佐剂灭活疫苗组小鼠在注射部位产生脓肿和结块，因此，该文献1的灭活疫苗的安全性较差，不宜用于临床。专利文献CN109847060A(以下称文献2)公开一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其中抗原采用荚膜A型牛多杀性巴氏杆菌LY01株和血清A6型牛溶血性曼氏杆菌LY02株，能够同时针对性预防目前流行的牛纤维素性化脓性肺炎和肉牛地方流行肺炎，但是该二联灭活疫苗注射后会造成免疫牛短时间内(注射后48h内)的体温升高，存在潜在的安全性风险，并且对小鼠的免疫攻毒试验结果也表明，该文献2公开的二联灭活疫苗对两种病原菌株攻毒的保护能力仍有不足，其中保护能力最高仅为80％，最低只能实现40％的保护效果。专利文献CN111088182A(以下称文献3)也公开一种溶血性曼氏杆菌灭活疫苗，其采用的抗原为溶血性曼氏杆菌A1型M164株，但是在使用该灭活疫苗的免疫攻毒试验中，在攻毒后仅连续观察4日，不能准确反映该灭活疫苗对试验牛的免疫保护效果，并且各免疫组试验牛的肺脏剖检结果多出现较大面积的牛曼氏杆菌病特征性病灶，甚至超过对照组试验牛，反映出该文献3公开的灭活疫苗存在安全性问题，并且间接反映出该灭活疫苗的免疫保护能力仍不足。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种牛溶血性曼氏杆菌菌株，其保藏编号为：CGMCC No.16895，保藏日期为：2018年11月27日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明另一方面提供一种牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗，其包含佐剂和抗原，其中所述抗原为权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895。
上述牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗中，所述抗原的有效含量不低于1.3×1010CFU/ml。
上述牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗中，所述佐剂和抗原的体积比为1:3～1:7。
上述牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗中，所述佐剂为氢氧化铝胶佐剂。
本发明再一方面还提供了上述的牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1：培养权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895，获得培养菌液；
T2：将步骤T1获得的培养菌液浓缩，灭活，得到灭活抗原菌液；
T3：将步骤T2获得的灭活抗原菌液与佐剂混匀，制备得到灭活疫苗。
上述方法中，步骤T1中所述获得培养菌液的具体操作为：将所述牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895按1％～2％(v/v)的接种量接种于TSB培养基，置37±1℃，100～150r/min培养8～12h，获得培养菌液。
上述方法中，步骤T1中所述获得培养菌液的具体操作为：
一级种子繁殖：将所述牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895冻干菌种接种于TSB培养基，置37±1℃，100～150r/min培养8～12h，然后划线接种于TSA平板，37±1℃培养8～12h，显微镜下挑选典型菌落，分别接种TSA斜面若干支，37±1℃培养8～12h，作为一级种子；
二级种子繁殖：取所述一级种子接种于TSB培养基，置37±1℃、100～150r/min，培养8～12h，作为二级种子；
培养菌液制备：将所述二级种子按1％～2％(v/v)的接种量接种于TSB培养基，37±1℃、100～150r/min，培养8～12h。
上述方法中，步骤T2中所述培养菌液浓缩的具体操作为：2500～3500r/min，4±1℃，离心15～25min，随后收集菌体沉淀，并用pH 7.2～7.4的无菌PBS重悬，制成浓缩菌液。
上述方法中，步骤T2中所述灭活的具体操作为：按浓缩菌液量的0.1％～0.15％(v/v)加入甲醛溶液，37±1℃灭活8～10小时，期间摇匀数次，制备得到灭活抗原菌液。
基于以上技术方案提供的牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895具有较强的毒力效果和繁殖能力，可以作为一种具有潜在的良好安全性和免疫保护效果的疫苗株。经实施例结果证明，利用该菌株作为抗原制备的牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗确实具有良好的安全性、稳定性和免疫保护效果，其中使用该灭活疫苗对健康易感牛进行的一次单剂量(3ml)接种试验、单剂量重复接种试验和一次超剂量(6ml)接种试验的结果均表明在接种部位均未见红肿和结节形成，并且各组健康易感牛体温、呼吸情况、精神状态、食欲等均正常；使用各批次的该灭活疫苗的免疫攻毒试验结果也证明该灭活疫苗能对健康易感牛实现良好的免疫保护效果，并且经免疫攻毒后的试验牛脏器没有发生明显病理变化，剖检的肺脏也无明显的牛曼氏杆菌病特征性病灶。因此本发明提供的灭活疫苗可以对目前流行的“船运热”提供良好的预防效果，并且无潜在的安全性风险。
附图说明
图1为牛溶血性曼氏杆菌划线接种培养照片和革兰氏染色后的镜检照片，其中A幅为划线接种培养照片，B幅为革兰氏染色后的镜检照片；
图2为鉴定牛溶血性曼氏杆菌的PCR产物的凝胶电泳图像。
具体实施方式
针对目前存在的用于预防牛“船运热”疫病的牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗存在的安全性风险和/或免疫保护能力不足的缺陷，本发明旨在提供一种具有潜在的良好安全性和免疫保护效果的牛溶血性曼氏杆菌菌株，并基于该菌株提供一种具有良好安全性、稳定性和免疫保护效果的牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗和该灭活疫苗的制备方法。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
以下实施例中涉及的引物均用已有技术和成。
实施例1：牛溶血性曼氏杆菌菌株的分离和鉴定
1.1、牛溶血性曼氏杆菌的分离
将从内蒙古呼和浩特市托克托县得到病牛病料组织划线接种(如图1中A幅所示)于绵羊血琼脂平板中，恒温箱中37℃培养24h。挑取血琼脂平板上可疑曼氏杆菌菌落(呈圆形、湿润、光滑、半透明，伴有微弱的β溶血(菌株连续传代培养后，溶血性会减弱或消失)，如图1中A幅所示)，无菌操作抹片，进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态及染色结果，结果如图1中B幅所示，可见革兰氏染色后，镜下观察到呈多形态的、革兰氏阴性短杆菌。
1.2、牛溶血性曼氏杆菌的鉴定
1.2.1、PCR鉴定
1)将上述步骤1)经镜检的可疑曼氏杆菌单菌落蘸取一点，分别接种于适量4％血清马丁肉汤培养基(编号1-10)中，37℃过夜120r/min培养约18h，获得细菌培养液；
2)取上述细菌培养液各200μL作为检测样品(对应马丁肉汤培养基编号1-10)，分别提取基因组DNA，并以此作为模板，进行牛溶血性曼氏杆菌基因特异性PCR扩增(张培君等，溶血性曼氏杆菌PCR检测方法的研究，动物医学进展，2003，24(4)：73-76)，然后将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳；电泳结果如图2所示，可见除了2、4和10号泳道没有条带外，其余7个泳道均出现约453bp大小的特异性条带，鉴定为阳性溶血性曼氏杆菌。
1.2.2、测序鉴定
将上述PCR鉴定后的牛溶血性曼氏杆菌菌液(对应编号1、3、5-9)分别划线接种于血琼脂平板上纯化，并接种于胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)(称取TSB粉末30g，加入注射水1L中，充分混匀后，116℃灭菌30min，灭菌后按照培养基体积加入0.1％(v/v)裂解血球全血)中增菌(37℃培养10h)，连续纯化三代，取最后代次的菌液，用16S rDNA基因序列引物(F：ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT，R：CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，取30μL的PCR产物送上海英维捷基公司测序。测序结果进行在线同源性比对(GeneBank)，比对结果为各菌株的16S rDNA基因序列与溶血性曼氏杆菌基因序列同源性达99％，测序结果确定分离的病原菌菌株均为溶血性曼氏杆菌。
1.2.3、生化鉴定
将上述经PCR和测序鉴定的牛溶血性曼氏杆菌菌液分别接种麦康凯(MacConkey)琼脂培养基，以及分别含吲哚、尿素、乳糖、鸟氨酸脱羧酶、蕈糖、木糖、甘露醇、山梨醇或硫化氢的培养基中，37℃培养18～24h，观察结果。结果如下表1所示，各菌株(编号1、3、5-9)的生化鉴定结果一致。
表1：牛溶血性曼氏杆菌的生化鉴定结果
Figure BDA0003003625890000051
1.3、菌落计数及保菌
根据以上PCR、测序和生化鉴定(高佳滨，陈为宏等，牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗的制备与检定，中国生物制品学杂志，2014年8月第27卷第8期)结果，可知本发明确实分离获得了牛溶血性曼氏杆菌菌株。将各编号对应的菌株以0.1ml菌液腹腔注射2只小鼠(南模生物)进行攻毒，按照攻毒24h后小鼠全部死亡的标准选择其中毒力效果较好的菌株作为疫苗株。其中编号1和3对应的菌株在攻毒后24h不能使小鼠死亡，编号为5、8和9对应的菌株在攻毒后24h仅能使1只小鼠死亡，编号为6和7对应的菌株虽然在攻毒后24小时均能使小鼠全部死亡，但编号为6对应的菌株攻毒后导致小鼠死亡的时间相对编号为7对应的菌株要相对较早(可能存在因毒力较强的安全风险)，因此选择其中编号为7所对应的菌株作为具有相对较好毒力效果的疫苗株，命名为YSF株。将该YSF菌株按2％接种量克隆于100mL的含4％牛血清的马丁肉汤中，37℃条件下120r/min过夜培养约18h，用含4％血清马丁琼脂平板菌落计数，CFU约为1×109个/mL，冻干保存克隆菌落。
申请人已于2018年11月27日将该菌株YSF保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为：CGMCC No.16895，分类命名为：牛溶血性曼氏杆菌(Bovine haemolytic mannheimia)，参据的生物材料(株)为：Bovine-YSF(鼻)/NM/G10/20180313。
实施例2：牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗的制备
在该实施例中，利用上述实施例1中分离获得的牛溶血性曼氏杆菌菌株YSF株制备牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗，具体包括以下步骤。
2.1、对牛溶血性曼氏杆菌YSF株进行发酵培养，获得发酵菌液，具体为：
1)一级种子繁殖：将牛溶血性曼氏杆菌YSF株冻干菌种200μL接种于10mL TSB培养基(商购)，置37℃，120r/min培养10h，然后划线接种于TSA(胰酪胨大豆肉汤培养基琼脂，其配方为：称取TSB粉末30g，琼脂粉15g加入注射水1L中，加热充分混匀后，116℃灭菌30min，冷却至45℃～50℃时，按照培养基体积加入0.1％(v/v)裂解血球全血和4％(v/v)新生牛血清，充分混匀后倾倒平板备用)平板，37℃培养10h，显微镜下挑选典型菌落，分别接种TSA斜面若干支，37℃培养10小时，作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不超过7日；
2)二级种子繁殖：取一支一级种子，用4mL含0.1％裂解血的TSB培养基将TSA斜面上的菌苔冲下下来，接种于200mL含0.1％裂解血的TSB培养基，置37℃、120r/min，培养10h，经纯粹检验合格后，在2～8℃保存，作为二级种子；
3)发酵菌液制备：菌液培养采用摇瓶培养溶血性曼氏杆菌菌液。将TSB培养基，116℃高压灭菌30min，待培养基温度冷却至37℃左右时，加入绵羊裂解血，使培养基中的裂解血含量达到0.1％(v/v)，按培养基总量的1％～2％(v/v)加入二级种子液，混合均匀37℃、120r/min，培养10h。
菌液培养完成后，取样按2015版《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹；同时取样进行活菌计数。
2.2、将步骤2.1获得的发酵菌液进行浓缩，灭活，获得灭活抗原菌液，具体为：
1)发酵菌液浓缩：采用离心的方法对发酵菌液进行浓缩，其中离心条件为：3000r/min，4℃，离心20min，随后收集菌体沉淀，并用pH 7.2～7.4的无菌PBS重悬，制成10倍浓缩菌液；
2)发酵菌液灭活：按浓缩菌液量的0.1％～0.15％(v/v)加入甲醛溶液，37℃灭活8～10小时，期间摇匀数次，制备得到灭活抗原菌液。灭活检验按2015版《中国兽药典》附录进行灭活检验，应无菌生长。
2.3、将步骤2.2获得的灭活抗原菌液与氢氧化铝胶佐剂按照体积比3:1～7:1(优选5:1)混匀，制备得到灭活疫苗，具体为：
在乳化罐中先加入步骤2.2获得的灭活抗原菌液，低速搅拌5分钟，再按1份佐剂5份抗原菌液体积比例缓慢加入氢氧化铝胶佐剂，充分搅拌15～20分钟，使其充分混合。经验证，最终疫苗中含YSF株抗原不低于1.3×1010CFU/ml，注射剂量为3ml即可以对免疫动物产生持续稳定有效的免疫保护效果。按2015版《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。
2.4、分装
经上述无菌检验合格后，定量分装，分装期间应随时搅拌，使其混合均匀，加塞密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。
按照以上方法步骤，该实施例利用YSF株共制备了三批次牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗(疫苗批号为：B18001、B18002、B18003)，还利用实施例1中经验证为牛溶血性曼氏杆菌的编号为6所对应的牛溶血性曼氏杆菌菌株(命名为06菌株)制备了一批次牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗(疫苗批号为：B18004)。
实施例3：牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗的安全性试验
该实施例将实施例2制备的四批次牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗(疫苗批号为：B18001、B18002、B18003、B18004)在健康易感牛(6月龄左右)上进行安全性试验，具体操作如下所述。
3.1、一次单剂量接种的安全性试验
将16头健康易感牛(呼和浩特周边某牧场)作为试验牛随机分成4组，每组4头，将四个批次的疫苗分别以一次单剂量3.0ml(1头份)通过颈部肌肉接种一组试验牛，另设条件相同的3头健康易感牛，按照相同的方法接种灭菌PBS作为对照。观察试验牛和对照牛临床表现，并于每日同一时间测量体温，观察14日。观察结果见下表2所示。
表2：一次单剂量接种健康易感牛的安全性试验观察结果
Figure BDA0003003625890000071
上表2结果显示：利用YSF菌株制备的三个批次的疫苗以一次单剂量接种后，观察期内各组试验牛的体温、呼吸情况、精神状态、食欲等均正常，注射部位均未见红肿和结节形成，试验牛未出现牛溶血性曼氏杆菌病临床症状，与对照组没有明显差异。而利用06菌株制备的一批次的疫苗以一次单剂量接种后，在观察期内试验牛注射部位有结节形成，因此该批次疫苗具有潜在的安全风险。
3.2.单剂量重复接种的安全性试验
将16头健康易感牛作为试验牛随机分为4组，每组4头，将四个批次的疫苗分别以一次单剂量3.0ml(1头份)通过颈部肌肉接种一组试验牛，另设条件相同的3头健康易感牛，按照相同的方法接种灭菌PBS作为对照。首次接种后14日，采用相同的方式再接种一次。重复接种后观察试验牛和对照牛临床表现，并于每日同一时间测量体温，观察14日。观察结果见下表3所示。
表3：单剂量重复接种的安全性试验观察结果
Figure BDA0003003625890000072
上表3结果显示：利用YSF菌株制备的三个批次疫苗以单剂量重复接种后，观察期内各组试验牛的体温、呼吸情况、精神状态、食欲等均正常，注射部位均未见红肿和结节形成，试验牛未出现牛溶血性曼氏杆菌病临床症状，与对照组没有明显差异。而利用06菌株制备的一批次的疫苗以单剂量重复接种后，在观察期内试验牛注射部位有红肿和结节形成，因此该批次疫苗具有潜在的安全风险。
3.3.一次超剂量接种的安全性试验
将16头健康易感牛作为试验牛随机分为4组，每组4头，将四个批次的疫苗分别以一次超剂量6.0ml(2头份)通过颈部肌肉接种一组试验牛，另设条件相同的3头健康易感牛，按照相同的方法接种灭菌PBS作为对照。观察试验牛和对照牛临床表现，并于每日同一时间测量体温，观察14日。观察结果见下表4。
表4：一次超剂量接种的安全性试验观察结果
Figure BDA0003003625890000081
上表4结果显示：利用YSF菌株制备的三批次疫苗以一次超剂量接种后，观察期内各组试验牛的体温、呼吸情况、精神状态、食欲等均正常，注射部位均未见红肿和结节形成，试验牛未出现牛溶血性曼氏杆菌病临床症状，与对照组没有明显差异。而利用06菌株制备的一批次的疫苗以单剂量重复接种后，在观察期内试验牛注射部位有红肿和结节形成，因此该批次疫苗具有潜在的安全风险。
由以上表2-表4结果可知，相对于利用06菌株制备的一批次的疫苗(B18004)，本发明利用YSF菌株制备得到的三批次牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗(B18001、B18002、B18003)对健康易感牛进行的一次单剂量接种试验、单剂量重复接种试验和一次超剂量接种试验的结果均显示：在观察期内，各组试验牛体温、呼吸情况、精神状态、食欲等均正常，注射部位均未见红肿和结节形成，未出现牛溶血性曼氏杆菌病临床症状，与对照组无明显差别。可见，本发明利用牛溶血性曼氏杆菌YSF株CGMCC No.16895制备得到的灭活疫苗具有良好的安全性，注射部位未出现红肿和结节形成，且各组试验牛体温、呼吸情况、精神状态、食欲等均正常，可进一步用于临床应用。
实施例4：牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗对豚鼠的免疫效力
将15只健康豚鼠随机分为3组，每组5只，将上述实施例2制备的三批次疫苗(B18001、B18002、B18003)分别以0.3ml剂量通过豚鼠腿部肌肉接种，另设条件相同的5只对照豚鼠，按照相同的方法接种灭菌PBS作为对照。接种后21日后对15只免疫豚鼠和5只对照豚鼠分别进行牛溶血性曼氏杆菌攻毒(YSF株菌液，攻毒剂量为1×109CFU)，随后连续观察10日，观察豚鼠死亡情况，判定保护情况。试验结果见下表5。
表5：对试验牛的效力试验结果
疫苗批号 免疫剂量(ml) 豚鼠数量 攻菌数(CFU) 保护情况
B18001 0.3 5 1×109 5/5
B18002 0.3 5 1×109 4/5
B18003 0.3 5 1×109 5/5
对照 0.3 5 1×109 0/5
由上表5结果可知：对试验豚鼠进行牛溶血性曼氏杆菌攻毒后，B18001和B18003批次疫苗均表现出5/5的免疫保护效果，B18002表现出4/5的免疫保护效果。而对对照豚鼠溶血性曼氏杆菌攻毒后，该组中5只豚鼠均死亡。以上结果表明本发明制备的牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗在接种豚鼠后，可以使免疫豚鼠获得对攻毒菌株的有效保护，并且各批次灭活疫苗的免疫效果稳定。
实施例5：牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗对试验牛的免疫效力
该实施例采用实施例2中制备的三批次牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗(疫苗批号为：B18001、B18002、B18003)在健康易感牛(5月龄左右)上进行效力试验。
将12头健康易感牛作为试验牛随机分组，每组4头，将上述三批次的疫苗分别以1头份(3.0ml)剂量通过颈部肌肉接种一组试验牛，另设条件相同的3头健康易感牛，按照相同的方法接种灭菌PBS作为对照。接种后21日，进行二免，二免10日后对12头试验牛和3头对照牛分别进行牛溶血性曼氏杆菌攻毒(YSF株菌液，攻毒剂量为1×1010CFU)，随后连续观察10日，观察试验牛和对照牛临床症状，每日同一时间测量体温，攻毒后第10日，对试验牛及对照牛剖检，观察并记录肺部病理变化，分析判定牛的发病和保护情况。试验结果见下表6。
表6：对试验牛的效力试验结果
Figure BDA0003003625890000091
注：“—”表示该项未出现对应的症状，“+”表示该项出现对应的症状。
由上表6结果可知：对试验牛进行牛溶血性曼氏杆菌攻毒后，B18001和B18003批次疫苗均表现出4/4的免疫保护效果，B18002表现出3/4的免疫保护效果，免疫保护的试验牛脏器没有发生明显病理变化，剖检的肺脏无异常。而对对照组牛进行牛溶血性曼氏杆菌攻毒后，该组中3头牛均发病，剖检的肺脏有明显的牛曼氏杆菌病病灶。以上结果表明本发明制备的牛溶血性曼氏杆菌灭活疫苗在接种牛后，可以使免疫牛获得对攻毒菌株的有效保护，无潜在的安全性风险，并且各批次灭活疫苗的免疫效果稳定。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牛溶血性曼氏杆菌菌株，其保藏编号为：CGMCC No.16895，保藏日期为：2018年11月27日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗，其包含佐剂和抗原，其中所述抗原为权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895。
3.根据权利要求2所述的牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗，其中所述抗原的有效含量不低于1.3×1010CFU/ml。
4.根据权利要求2或3所述的牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗，其中所述佐剂和抗原的体积比为1:3～1:7。
5.根据权利要求2或3所述的牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗，其中所述佐剂为氢氧化铝胶佐剂。
6.权利要求2-5中任一项所述的牛溶血性曼氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1：培养权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895，获得培养菌液；
T2：将步骤T1获得的培养菌液浓缩，灭活，得到灭活抗原菌液；
T3：将步骤T2获得的灭活抗原菌液与佐剂混匀，制备得到灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，步骤T1中所述获得培养菌液的具体操作为：
将所述牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895按v/v为1％～2％的接种量接种于TSB培养基，置37±1℃，100～150r/min培养8～12h，获得培养菌液。
8.根据权利要求6或7所述的方法，步骤T1中所述获得培养菌液的具体操作为：
一级种子繁殖：将所述牛溶血性曼氏杆菌菌株CGMCC No.16895冻干菌种接种于TSB培养基，置37±1℃，100～150r/min培养8～12h，然后划线接种于TSA平板，37±1℃培养8～12h，显微镜下挑选典型菌落，分别接种TSA斜面若干支，37±1℃培养8～12h，作为一级种子；
二级种子繁殖：取所述一级种子接种于TSB培养基，置37±1℃、100～150r/min，培养8～12h，作为二级种子；
培养菌液制备：将所述二级种子按v/v为1％～2％的接种量接种于TSB培养基，37±1℃、100～150r/min，培养8～12h。
9.根据权利要求6或7所述的方法，步骤T2中所述培养菌液浓缩的具体操作为：2500～3500r/min，4±1℃，离心15～25min，随后收集菌体沉淀，并用pH 7.2～7.4的无菌PBS重悬，制成浓缩菌液。
10.根据权利要求6或7所述的方法，步骤T2中所述灭活的具体操作为：按浓缩菌液体积的0.1％～0.15％加入甲醛溶液，37±1℃灭活8～10小时，期间摇匀数次，制备得到灭活抗原菌液。
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