CN100394926C - 一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法 - Google Patents

一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法 Download PDF

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Abstract

一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，包括如下步骤：1)将红假单胞菌混悬液与0.2%～0.85%NaCl溶液制成含菌量为30～300亿/ml的宿主菌混悬液；2)将pH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液用水10倍稀释，再加入CaCl2和MgCl2使所得溶液中两者含量均为10～100mg/L，制成培养液；3)在该培养液中加入与其体积比为5%～30%的宿主菌混悬液，再加入与已加宿主菌混悬液的培养液体积比为2%～3%噬菌蛭弧菌液，在28～30℃温度条件下培养72～120小时，即得成品。本发明解决用大肠杆菌作为宿主菌很难进行工业化生产及环境污染问题，保证了噬菌蛭弧菌的裂解活性，提高了其防治病害的效果。

Description

一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法。
背景技术
国内外在水产养殖及动物疾病防治中，目前主要使用抗生素等化学制剂。这些制剂的副作用，如药物残留、病原菌的抗药性、抑制有益菌群等，给人类健康及畜牧业生产带来的不良影响越来越明显。近年来微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是噬菌蛭弧菌的研究受到人们的青睐。
噬菌蛭弧菌自1963年被发现以来，因其是一种寄生菌，能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等动物致病菌，而其本身对人和动物无毒无害，还可以改善水环境等，日益受到人们的关注。在研究开发中，人们都用大肠杆菌作为宿主菌。用活的大肠杆菌培养生产噬菌蛭弧菌，受多种技术条件的限制，很难进行大规模工业化生产，同时影响生态环境。因而有人提出用高温(70-150℃)或化学药物(氯仿等)将大肠杆菌杀死，制造灭活的宿主菌，用来生产噬菌蛭弧菌。实践证明，用这种方法生产的噬菌蛭弧菌制剂，会降低噬菌蛭弧菌对活的宿主菌的裂解能力，甚至降到无裂解能力，因此，对防治动物细菌性疾病效果不稳，同时该制剂保存时间短，使制剂开发应用受到限制，在水产养殖中更受到制约。
发明内容
本发明目的在于提供一种新的噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，为噬菌蛭弧菌的工业化生产提供一种新的活性宿主菌，解决原大肠杆菌作为宿主菌很难进行工业化生产及造成环境污染的问题，并保证噬菌蛭弧菌的裂解活性，进一步提高其防治病害的效果。
为了达到上述目的，本发明的主要技术方案如下：一种噬菌蛭弧菌的生产方法，该方法由以下步骤组成：
1.宿主菌混悬液的制备：将培养好的光合细菌中的浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101混悬液静置24～96小时，除去上清液(占全部溶液体积的1/2～2/3)，加入与除去的上清液等体积量的0.2％～0.85％NaCl溶液，摇匀，再静置24～72小时，除去上清液(占全部溶液体积的1/2～2/3)，再加入0.2％～0.85％NaCl溶液，配成原全部溶液体积1/2～2/3的宿主菌混悬液备用。
2.配制培养液：将PH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液用水10倍稀释，然后加入CaCl2和MgCl2制成培养液，培养液中CaCl2和MgCl2含量均为10～100mg/L。
3.噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在所制成的培养液中，加入与培养液体积比为5％～30％的由步骤1制备的宿主菌混悬液，再加入与已加宿主菌混悬液的培养液体积比为2％～3％的噬菌蛭弧菌液(含菌量大于105pfu/ml)，在28～30℃温度条件下培养72～120小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
步骤1中最后制得的宿主菌混悬液的含菌量为30～300亿/ml；且浑球或沼泽红假单胞菌混悬液优选的静置时间为24～48小时。
步骤2培养液中加入少量的CaCl2和MgCl2有助于促进后面的噬菌蛭弧菌的生长，且培养液中的优选含量为20mg/L；同时PH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液可以是PBS。
本发明经过多年研究提出，光合细菌中的浑球或沼泽红假单胞菌可作为生产培养噬菌蛭弧菌的新宿主菌，从而解决了用大肠杆菌作为宿主菌很难进行工业化生产的难题，还避免了用大肠杆菌作为宿主菌所造成的环境污染；同时新宿主菌作为一种活菌，保证了噬菌蛭弧菌的裂解活性，因而其防治病害效果显著提高。如上海奉贤农场实验表明，使用本发明制得的制剂后，对虾幼苗育成率达98％以上；又如，南京福润德生物有限公司使用本发明制得的制剂防治青蟹疾病，成活率达87％以上，而对照组仅为51.5％，效果极显著。同时本发明缩得制剂对鳗鱼因弧菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌等引起的疾病亦有明显的防治效果。
因为光合细菌本身是水产养殖和改善水质的有益菌，且与噬菌蛭弧菌具有协同作用，因此本发明中采取光合细菌中的浑球或沼泽红假单胞菌可作为生产培养噬菌蛭弧菌的新宿主菌进一步提高了噬菌蛭弧菌制剂的使用效果，还延长噬菌蛭弧菌的保存期，可达6～12个月。由本发明制得的制剂在改善水质方面效果明显，使水体PH值稳定，降低水体中化学需氧量、以及氨态氮和亚硝酸盐含量等，中国水产研究所淡水渔业研究中心实验表明，使用噬菌蛭弧菌后，氨态氮由0.35降为0.22(mg/L)，COD由6.4降为4.2(mg/L)。本制剂对防治仔鸡白痢，仔猪黄白痢等幼禽畜下痢也有显著效果。
具体实施方式
以下为本发明噬菌蛭弧菌制剂生产方法的多组具体实施例，包括新宿主菌——光合细菌培养液的制备方法和噬菌蛭弧菌的发酵工艺：
实施例1：1.宿主菌混悬液的制备——将培养好的光合细菌红假单胞菌混悬液(培养方法见中国微生态学杂志p.78.1990.3，菌株包括：浑球红假单孢菌P4或沼泽红假单孢菌101，菌种购买于上海交通大学生物技术所)，静置24小时，除去占全部溶液体积1/2的上层溶液；加入与除去的上层溶液等体积量的0.2％NaCl溶液，摇匀，再静置24小时，除去占全部溶液体积1/2的上层溶液，再加入0.2％NaCl溶液，配成原全部溶液体积2/3的宿主菌混悬液，含菌量为30～300亿/ml，获得的宿主菌混悬液备用。
2.配制培养液：将PH7的磷酸盐缓冲液(可以是PBS)用水10倍稀释，然后加入CaCl2和MgCl2制成培养液，培养液中CaCl2和MgCl2含量均为20mg/L。
3.噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在所制成的培养液中，加入与培养液体积比为10％的由步骤1制备的宿主菌混悬液，再加入与已加宿主菌混悬液的培养液体积比为2％的含菌量大于105pfu/ml的噬菌蛭弧菌液(培养方法见动物微生态研究进展p190，2000年，中国农业大学出版社，菌种包括Bd1或Bd6，购买于江苏省卫生防疫站)，在28～30℃温度条件下培养80小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
实施例2：1.宿主菌混悬液的制备——将培养好的光合细菌红假单胞菌混悬液(培养方法见中国微生态学杂质p.78.1990.3，菌株包括：浑球红假单孢菌P4或沼泽红假单孢菌101，菌种购买于上海交通大学生物技术所提供)，静置48小时，除去占全部溶液体积2/3的上层溶液；加入与除去的上层溶液等体积量的0.75％NaCl溶液，摇匀，再静置48小时，除去占全部溶液体积2/3的上层溶液，再加入0.3％NaCl溶液，配成原全部溶液体积1/2的宿主菌混悬液，含菌量为30～300亿/ml，获得的宿主菌混悬液备用。
2.配制培养液：将PH7.5的磷酸盐缓冲液(可以是PBS)用水10倍稀释，然后加入CaCl2和MgCl2制成培养液，培养液中CaCl2和MgCl2含量均为60mg/L。
3.噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在所制成的培养液中，加入与培养液体积比为20％的由步骤1制备的宿主菌混悬液，再加入与已加宿主菌混悬液的培养液体积比为3％的含菌量大于105pfu/ml的噬菌蛭弧菌液(培养方法见动物微生态研究进展p190，2000年，中国农业大学出版社，菌种包括Bd1或Bd6，购买于江苏省卫生防疫站)，在28～30℃温度条件下培养100小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
本发明经过申请人大量实验，证实其对防治鱼虾疾病，改善水质均有显著效果：
1.将浑球红假单孢菌P4培养的噬菌蛭弧菌Bd1制剂用于对虾幼苗，用100ppm浸泡15～20分钟，可使幼苗成活率平均达98％；本制剂对大肠杆菌、弧菌、嗜水气单胞菌有很好的裂解效果。以嗜水气单胞菌为例，其裂解动态见下表：
2.本制剂防治青蟹疾病，每次用5ppm，洒入水池，10～15天使用一次，成活率达87％以上，而对照组仅为51.5％。
3.用本制剂改善水质实验结果表明，每次用量10ppm，30天使用1次，结果氨态氮(mg/L)由0.35降为0.22。COD(mg/L)由6.4降为4.2，pH值稳定。

Claims (4)

1.一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征是该方法由以下步骤组成：
1)宿主菌混悬液的制备：将培养好的光合细菌中的浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101混悬液静置24～96小时，除去上层溶液，加入与除去的上清液等体积量的0.2％～0.85％NaCl溶液，摇匀，再静置24～72小时；除去上层溶液，再加入0.2％～0.85％NaCl溶液，配成原全部溶液体积1/2～2/3的宿主菌混悬液备用；两次除去的上层溶液均占全部溶液体积的1/2～2/3，制得的宿主菌混悬液含菌量为30～300亿/ml；
2)配制培养液：将PH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液用水10倍稀释，再加入CaCl2和MgCl2制成培养液，培养液中CaCl2和MgCl2含量均为10～100mg/L；
3)噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在所制成的培养液中，加入体积比为5％～30％的由步骤1制备的宿主菌混悬液，再加入与已加宿主菌混悬液的培养液体积比为2％～3％、含菌量大于105pfu/ml的噬菌蛭弧菌液，在28～30℃温度条件下培养72～120小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
2.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征为步骤1中浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101混悬液的静置时间为24～48小时。
3.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征为步骤2中的磷酸盐缓冲液为PBS。
4.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征为步骤2中制成的培养液中CaCl2和MgCl2含量均为20mg/L；
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