CN101381757B - 抗菌肽的固体发酵制备方法及应用 - Google Patents
抗菌肽的固体发酵制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗菌肽的制备方法，包括步骤：(1)制备一级种子；(2)固体发酵。本发明由于采用固态发酵方式制备抗菌肽，无需大规模的设备投入，生产工艺简便，经驯化的工程菌易于培养繁殖、生产，且发酵产物无需分离纯化，可直接应用，易于推广。此外，采用该方法生产的抗菌肽具有广谱的抗菌活性，不仅对金黄色葡萄球菌、霉菌等有害细菌和真菌有很强的杀伤作用，而且对病毒有杀灭作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌肽的制备方法，以及该抗菌肽产物在制备饲料添加剂、药品及防腐剂产品中的应用。
背景技术
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20～60个氨基酸组成，分子量在2000～7000道尔顿左右。自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又在昆虫、两栖类、水产动物，以及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少900余种抗菌肽。这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱杀菌作用，有些则对某些病毒、原虫及肿瘤细胞也有杀灭作用。临床试验表明，在机体感染病菌或者可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。由于抗菌肽在预防和治疗各种感染性疾病方面所表现出来的独特效果，对它的研究越来越成为生物技术、畜牧业及医药领域中的热门课题。如何通过简单易行的方法生产抗菌肽则是实现其大规模应用不可缺少的重要环节。
中国专利CN1397647公开了一种抗菌肽AD基因转化酵母发酵生产方法，将含抗菌肽AD基因质粒转化的工程酵母在合适的培养基和培养条件下，表达抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外。这种方法工艺复杂，要严格控制发酵条件，因此需要很高的设备投入。同时，通过这种方法生产的抗菌肽溶解在发酵液中，不能直接添加到饲料中加以应用，而将液体发酵产物经过干燥处理后则容易导致抗菌肽构象发生改变，从而降低抑菌活性。
美国专利US0227321公开了一种多肽的廉价生产方法，主要是通过串联重组表达的手段来提高表达产物的丰度。但是这涉及到一系列复杂的分子生物学操作，将串联表达产物酶切成有活性的单体蛋白存在较大的不确定性。而且串联表达可能影响产物的正确折叠，进而降低产物活性。
发明内容
本发明实施例所要解决的一技术问题在于提供一种杀菌活力高、工艺简单、易于生产应用的抗菌肽制备方法。
本发明实施例所要解决的另一技术问题在于提供上述方法制得的抗菌肽产物在兽药、防腐剂和人用抗菌药物的制备中的应用。
本发明实施例是这样实现的，一种抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子：向PDA液体培养基中接种一环转化有抗菌肽基因的酿酒酵母后进行培养；
(2)固体发酵：取固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为2～10％的接种量，将所述一级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，制得二级种子；取固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为5～15％的接种量将所述二级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，得第三级种子
(3)取所述固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为5～15％的接种量将所述三级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，制得第四级种子；取所述固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为5～15％的接种量将所述四级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，制得第五级种子；
所述步骤(2)中固体发酵培养基，由质量比为1∶1～2的固体干基和无菌水混合而成，其中，干基含有面粉96.95～98.50wt％，尿素0.2～1wt％，K2HPO40.5～2wt％，生物素0.01～0.05wt％。
本发明实施例由于采用固态发酵方式制备抗菌肽，无需大规模的设备投入，生产工艺简便，经驯化的工程菌易于培养繁殖、生产，且发酵产物无需精制，可直接应用，易于推广。此外，采用该方法生产的抗菌肽具有广谱的抗菌活性，不仅对金黄色葡萄球菌、霉菌等有害细菌和真菌有很强的杀伤作用，而且对病毒有杀灭作用。
按照上述方法制备的抗菌肽可直接作为饲料添加剂，添加到各种饲料中，添加量为饲料的0.2～1％；也可以制备兽药用于家禽、家畜和水产动物，以治疗动物感染性疾病，包括猪无名高热病、蓝耳病、奶牛乳房炎等。同时，应用此方法制备的抗菌肽产品也可以用于人用抗菌药品及防腐剂的制备。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种与现有技术相比，杀菌活力高、工艺简单、易于生产应用的抗菌肽制备方法，为此，本发明实施例采用固态发酵方式制备抗菌肽。
实施例1
抗菌肽(Clavanin H)的制备按如下步骤操作：
(1)菌株活化：本实施例的真菌菌种选用本领域常用真菌菌种，优选酵母属(Saccharomyces)真菌为菌种，名为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏号CICC1795，购于广东省微生物研究所。面包酵母又称酿酒酵母，含有符合机体需求的优质蛋白、膳食纤维、复合维生素B和有机铬、锌、硒、铁、钙等元素，其本身即是一种纯天然、无污染、生物态的健康营养源。同时，由于酵母与同为真核生物的动植物细胞具有很多相同的结构，又类似于原核生物容易培养，因此在现代分子和细胞生物学中被用作真核模式生物，是一种理想的基因工程表达菌。利用酵母菌通过简易的固体发酵来表达抗菌肽，不仅可以大大降低生产成本，而且其表达产物抗菌肽具有绿色、无残留、无污染的特点，是未来抗生素的优良替代物。面包酵母的形态特征为：菌株在显微镜下呈球形或者卵形，直径5～10μm；将抗菌肽基因转化该酵母菌株获得基因工程酵母菌株。按照划线法将此工程酵母菌株接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养3天。斜面培养基为PDA斜面培养基，即：新鲜马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，PH自然。
(2)制备一级种子：该一级种子为液体种子，采用本领域常用的方法进行接种、培养。具体说来，将上述保存菌株用牙签挑取少许移接到100ml PDA液体培养基中，于28℃，转速为200rpm的摇床上培养1天，得一级种子。一级种子培养基为PDA液体培养基，即：新鲜马铃薯200克，葡萄糖20克，蒸馏水1000毫升，pH自然。
(3)配制固体发酵培养基。将质量比为1∶1～2的固体干基和无菌水混合制成固体发酵培养基，其中，每100g干基含面粉98.49g，尿素0.5g，K2HPO41.0g，生物素0.01g，面粉优选玉米面和白面各占50％的面粉。当然，干基采用含有面粉96.95～98.50wt％、尿素0.2～1wt％、K2HPO40.5～2wt％和生物素0.01～0.05wt％的干基都是可行的，其中面粉采用含40～60wt％玉米面和40～60wt％白面是可行的。
(4)固体发酵：取固体发酵培养基，采用本领域常用方法进行灭菌、冷却处理，具体于121℃、20min灭菌、冷却后，按照质量比为10％的接种量，将一级种子接入其中，搅拌混匀，保持湿度为60％，pH为自然值，于28℃培养1天，得二级种子。当然，接种量质量比在2～10％的范围内都是允许的。保持湿度为50～70％，pH为自然值，培养温度为18～30℃，培养时间是1～2天都是允许的范围，以下步骤中亦如此，不再赘述。
取固体发酵培养于121℃、20min灭菌、冷却后，按照质量比为10％的接种量，将二级种子接入其中，搅拌混匀，保持湿度为60％，pH为自然值，于28℃培养1天，培养得第三级种子。当然接种量质量比在5～15％的范围内都是可行的。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，其固体发酵步骤还包括：
取固体发酵培养基于121℃、20min灭菌、冷却后，按照质量比为10％的接种量将三级种子接入其中，搅拌混匀，保持湿度为60％，pH为自然值，于28℃培养1天，制得第四级种子；取固体发酵培养基经121℃、20min灭菌、冷却后，按照质量比为10％的接种量将四级种子接入其中，搅拌混匀，保持湿度为60％，pH为自然值，于28℃培养1天，制得第五级种子，即所述抗菌肽产物。当然，该步骤中接种量质量比在5～15％的范围内都是可行的。
将产生的抗菌肽可直接作为饲料添加剂，添加到各种饲料中，添加量为饲料的0.2～1％；也可以制备兽药用于家禽、家畜和水产动物，以治疗动物感染性疾病，例如猪无名高热病、蓝耳病、奶牛乳房炎，以及制备人用抗菌药物和防腐剂等。
实施例2
抗菌肽灭活病毒实验。狂犬病毒和流感病毒溶液由长春生物制品厂生产，滴度为10-6～10-8LogLD50/ml。抗菌肽按实施例2所述方法制备，浓度为0.5mg/ml。将上述狂犬病毒用PBS缓冲溶液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L，pH7.2～7.4)稀释10倍后与抗菌肽产品等体积混合，于温度33℃放置12小时，期间每2小时摇一次或放振荡器上振荡以灭活病毒。同时取未加灭活剂的狂犬病毒10倍稀释液摇匀放33℃12小时后随灭活狂犬病毒一起送中国农科院北京畜牧兽医研究所检测病毒灭活效果。将上述流感病毒用PBS溶液稀释10倍后与抗菌肽产品等体积混合，于温度22℃放置96小时，期间每2小时摇一次或放振荡器上振荡以灭活病毒。取未加灭活剂的流感病毒10倍稀释液摇匀放22℃96小时后随灭活流感病毒一起送中国农科院北京畜牧兽医研究所检测病毒灭活效果。
检测结果表明，按照以上方法，加了抗菌肽的上述两种病毒全部被灭活，而没有加抗菌肽的对照组中的病毒活力没有减弱。采用上述实施例方法制得的抗菌肽产品具有杀灭病毒的效果。
实施例3
抗菌肽抑制奶牛乳房炎致病菌实验。试验中选择乳室发炎肿大、皮肤发红、温热、乳汁排出不畅、稀薄带黄色并混有絮状物和凝乳块等表现明显奶牛乳房炎症状的奶牛乳汁。实验组为5ml上述奶牛乳汁与浓度为0.5mg/ml的采用上述实施例方法得到的抗菌肽等体积震荡混合30分钟，对照组为5ml上述奶牛乳汁与灭菌生理盐水等体积震荡混合30分钟。将上述混合溶液分别涂布到LB固体培养基上，观察奶牛乳房炎致病菌生长情况。实验结果表明加入有抗菌肽的奶牛乳汁涂布到培养基上，乳房炎致病菌完全没有生长；而没有加抗菌肽的奶牛乳汁涂布在培养基上则有大量乳房炎致病菌生长。说明采用本发明方法制备的抗菌肽有杀灭乳房炎致病菌的作用。
实施例4
抗菌肽稳定性试验。与上述实施例3不同之处在于，所使用的抗菌肽在100℃水浴中放置10分钟。其抑菌结果与实施例3一致。说明采用本发明方法制备的抗菌肽具有良好的稳定性。
实施例5
抗菌肽降低母猪分娩死胎率，提高小猪成活率的实验。实验母猪品种为长白与大白二元杂交种，小猪品种为杜长大三元杂交种。实验组按3‰的比例将采用上述实施例1方法制备的抗菌肽产品添加到仔猪饲料和母猪饲料。试验场内设栏将试验组分隔饲养，每组均设置三次以上重复。
结果表明：在母猪和仔猪添加上述抗菌肽后，分娩死胎率下降1倍以上，而且极少见有木乃伊胎出现。猪仔在断奶、保育阶段的成活率均提高2％以上。
表一：实验母猪分娩活(死)仔率统计
表二：猪仔断奶、保育阶段存活率统计
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子：向PDA液体培养基中接种一环转化有抗菌肽基因的酿酒酵母后进行培养；
(2)固体发酵：取固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为2～10％的接种量，将所述一级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，制得二级种子；取固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为5～15％的接种量将所述二级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，得第三级种子；
(3)取所述固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为5～15％的接种量将所述三级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，制得第四级种子；取所述固体发酵培养基经灭菌、冷却后，按照质量比为5～15％的接种量将所述四级种子接入其中，搅拌混匀，进行培养，制得第五级种子；
所述步骤(2)中固体发酵培养基，由质量比为1∶1～2的固体干基和无菌水混合而成，其中，干基含有面粉96.95～98.50wt％，尿素0.2～1wt％，K2HPO40.5～2wt％，生物素0.01～0.05wt％。
2.如权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述干基含面粉98.49wt％，尿素0.5wt％，K2HPO41.0wt％，生物素0.01wt％。
3.如权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述固体发酵过程中各级种子培养于湿度50～70％，自然pH值，18～30℃环境下进行，培养时间为1～2天。
4.如权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述湿度为60％。
5.如权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述固体发酵过程中各级种子接种投加量为10％。
6.如权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述面粉由玉米面和白面组成，含有玉米面占面粉总重量40～60wt％。
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