JP2002501004A - 肥満の処置 - Google Patents
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Abstract
Description
に関するが、本発明はまた、例えば、食物生産に使用される家畜の肉質の改善の
ための、非ヒト哺乳類の肥満の処置にも拡大されると理解すべきである。
されている。詳細な分子研究の不足のため、このホルモンの脂質制御および炭水
化物代謝における影響はあまり明らかではない。
残基182と189の間で小ループに折りたたまれていることは十分に文献で証
明されている。最近の結晶学的研究はまたhGH分子が、左巻きのしっかりと密
集した螺旋形の束中に配置された4個の逆平行α−螺旋を含むことを示す1。ホ ルモンの特異的代謝作用を担うhGH分子内の別々の機能的ドメインが存在する
という概念は一般的に受け入れられている。アミノ末端はhGH分子のインシュ
リン様作用を担う機能的ドメインとして同定されている2、3。
Hは同等な生物学的効力および薬物動態特性を有するように見える4、5。この多 機能性ホルモンの現在の供給は、ヒトおよび動物の実験的治療のタイプおよび数
をもはや限定しない。子供および大人の低身長の治療のためのhGHの使用は確
立している6。女性不妊症へのhGHの治療効果も報告されている7、8。hGHで
のヒト肥満の処置は多くの問題に遭遇する。証拠は、この多機能性ホルモンが、
分子内の種々の生物作用ドメインにより、インビボでしばしばいくつかの不利な
作用を同時に発揮することを示す9、10。
り記載された11。脂質代謝におけるこのホルモンの調節の役割は、GH−欠損お
よびGH−処置ヒト12、13およびブタ14、15の体組成研究によりその後支持された
。Gertnerの発見は、hGHが、“GH−脂肪サイクル”として既知の一連の相 互作用を介して脂肪組織分散に関連していることを示す16。しかし、これらの生
化学的および生理学的変化を起こす事象は殆ど未知のままである。脂肪および他
の組織へのインビボでのGHの代謝効果は可変性で複雑で、少なくとも二つの要
素である初期インシュリン様作用、続く遅いより深い抗インシュリン作用からな
るように見える17。後者の作用の結果は、脂肪分解の促進および脂質生成の阻害
の両方を含み得る。hGHの抗脂質生成作用は脂肪細胞中のグルコーストランス
ポーターGLUT 4の発現の減少18、脂肪組織中のアセチル−CoAカルボキ
シラーゼ活性の阻害19、20および単離細胞および組織中の脂質へのグルコース取 り込みの減少21、22による証明により実証されている。
いて遭遇する問題の観点から、本発明を導く研究は、所望の生物作用を残し、望
ましくない副作用を欠くhGH誘導体が合成できるかの調査に向かっている。 合成ホルモンフラグメントでのhGHの構造−機能研究は、hGH分子のカル
ボキシル末端が、脂質代謝の調節に関するホルモンの機能的ドメインであるよう
に見えることが明らかにされ20、23、カルボキシル末端を基本にした配列を有す る合成ペプチドが実験肥満動物モデルにおける体重増加および脂肪組織量を減少
することが示されている。
求の範囲および図面を含む全体の内容を、その全部を引用して本明細書に包含さ
せる。
提供する。このペプチドはヒト成長ホルモンまたはヒト以外の哺乳動物の成長ホ
ルモンのカルボキシル−末端配列の類似体を含み得る。上記のように、成長ホル
モンのカルボキシル−末端配列は、生物作用脂質代謝ドメインを含む。本発明の
一つの態様において、ペプチドは、アミノ酸残基177−191を含むヒト成長
ホルモンのカルボキシル末端配列または非ヒト哺乳類成長ホルモンの対応する配
列を含む類似体を含む。類似体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換、またはヒ
ト成長ホルモンまたはヒト以外の哺乳動物の天然カルボキシル−末端配列の化学
的修飾により得られ得る。
端配列の類似体を含むペプチドの有効量を投与することを含む、肥満の処置法を
提供する。処置はヒトを含む任意の動物に施し得る。 本発明はまた、上記のような成長ホルモンのカルボキシル−末端配列の類似体
を含むペプチドの有効量を、1種またはそれ以上の薬学的に許容される担体およ
び/または希釈剤と共に含む、肥満の処置に使用する医薬組成物を提供する。
造における、上記のような成長ホルモンのカルボキシル−末端配列の類似体を含
むペプチドの使用を提供する。
体を含むペプチドの有効量を動物に投与することを含む、動物の肥満の処置法を
提供する。
る。好ましくは、また、ペプチドはアミノ酸残基177−191を含むヒト成長
ホルモンのカルボキシル−末端配列の類似体を含む(以後、hGH177−19 1と呼ぶ)。あるいは、ペプチドは、hGH177−191ペプチドに対応する 、ウシ属、ブタ、ヒツジ、ウマ科、ネコ科またはイヌ科成長ホルモンのような他
の非ヒト哺乳類種の成長ホルモンのカルボキシル−末端配列の類似体を含み得る
。
な脂肪組織量の両方を意味し、相応じて肥満の処置の言及は、肥満動物の体重増
加の減少および脂肪組織量の減少の両方を含む。 肥満の処置の予期される結果は、体重、特に体脂肪組織量の減少である。体脂
肪組織量の減少は、二つの生化学的過程−脂質生成(脂肪産生)および脂肪分解( 脂肪減少)−により直接調節され、一般に、これらの生化学的過程は鍵となる代 謝酵素、特に脂肪減少の鍵となる酵素(ホルモン−感受性リパーゼ)および脂肪産
生の鍵となる酵素(アセチルCoAカルボキシラーゼ)により制御される。
受性リパーゼの刺激および脂肪産生鍵酵素であるアセチルCoAカルボキシラー
ゼの阻害に有効であることが示された。これは、代謝最終正産物のインビトロお
よびインビボでの測定で、hGH177−191の存在下で、脂肪利用が促進さ
れるが脂肪産生は減少することを示すデータにより更に支持される。加えて、こ
れらの分子作用の機構は、細胞性2次メッセンジャーであるジアシルグリセロー
ルの産生の活性化によりもたらされるものであることが確立された。
ノ酸配列の類似体、例えば、ヒト成長ホルモンの配列172−191または他の
ヒト以外の哺乳動物の対応する配列の類似体であるペプチドの使用にも拡大して
及ぶものである。
(isofunctional)または同等立体性(isostereo)のアミノ酸が対応し合うように同
等な配列(必要であれば、理論的欠失を含む)を整列させることにより決定し、相
同性を最大とする。選択した哺乳動物の成長ホルモンの刊行された対応するC−
末端領域の配列は、標準一文字表記で下記に表示する26:
の生理活性、即ち、肥満動物における体重増加および脂肪組織量の減少をする能
力を保持する限り、ヒト成長ホルモンまたは他の動物種の成長ホルモンの天然カ
ルボキシル末端配列の類似体である、および、天然または合成(組換えを含む)源
由来であるペプチドの使用に拡大される。特に、これらの類似体はジスルフィド
結合により誘導され得る環状構造を示し得る。
失または置換、または化学的修飾、またはアミノ酸側鎖の間への環状アミド結合
の挿入に由来し得る。アミノ酸挿入類似体は、1個または複数個(例えば、10 個まで、好ましくは5個まで)のアミノ酸のアミノおよび/またはカルボキシル 末端融合ならびに配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列類似体は、1個またはそ
れ以上のアミノ酸残基がタンパク質の予定された部位に挿入されているものであ
るが、無作為挿入が得られる生産物の適当なスクリーニングを伴って可能である
。欠失類似体は、1個またはそれ以上(例えば、5個まで、好ましくは3個まで)
のアミノ酸の配列からの除去により特徴付けられる。置換アミノ酸類似体は配列
内の少なくとも一つの、好ましくは1個または2個のアミノ酸残基が他の20種
の主要タンパク質アミノ酸より、または非タンパク質アミノ酸により置換されて
いるものである。天然カルボキシル末端配列の化学的修飾は、アミノ末端のアセ
チル化および/またはカルボキシル末端のアミド化および/または天然カルボキ
シル末端配列の側鎖環化を含む。
するヒト成長ホルモンまたは他の動物種の成長ホルモンの天然カルボキシル−末
端配列の類似体は、天然配列と同じかまたは類似の生理学的活性、特に肥満動物
の体重増加および脂肪組織量を減少させる能力を示すと予期できる。
は上記のように非ヒト哺乳類成長ホルモンの対応するペプチドの類似の類似体に
拡大できることは理解されるべきである。
加塩を含み得る。 hGH177−191ペプチドの類似体は、上記の抗肥満特性を保持しながら
、天然配列の任意の位置の1個またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失または挿入
により得られ得る。好ましくは、類似体は環状立体配座である。 あるいは、hGH177−191ペプチドの類似体は、天然配列の任意の位置
の1個またはそれ以上のアミノ酸残基の置換により得られ得る。
たインビトロおよびインビボ活性のスクリーニングは、上記の生物作用に重要な
hGH177−191のアミノ酸の位置および関係を示す。現在の発明の好まし
い類似体は (i)hGHの182および189位のアミノ酸が結合により一緒になって、環状
立体構造を助成しており;そして/または (ii)hGHの183および186位のアミノ酸が塩架橋または共有結合により結
合している hGH177−191のペプチド類似体を含む。
得、この場合、hGHの182および189位のアミノ酸は好ましくはL−また
はD−CysまたはPenであり得る。
これらのアミノ酸は好ましくは各々(XおよびY)または(YおよびX)であり得、
ここで: XはL−またはD−Arg、LysまたはOrnのような陽性荷電アミノ酸、そ
して YはL−またはD−AspまたはGluのような陰性荷電アミノ酸である。
この結合はアミド結合であり得、この場合、これらのアミノ酸は好ましくは各々
(XおよびY)または(YおよびX)であり得、ここで: XはL−またはD−LysおよびOrnからなる群から選択され、そして YはL−またはD−AspおよびGluからなる群から選択される。
たはOrnのような陽性荷電アミノ酸である。
または両端での、例えば、水溶液への溶解性を増加させるための1個またはそれ
以上の親水性アミノ酸での伸長によっても得られ得る。このような類似体は、好
ましくは環状ジスルフィド形の以下の配列を含む:
る群から選択され、mおよびnは各々0、1、2または3であるが、少なくとも
mまたはnは1である〕。 [明細書を通して、下線は天然hGH177−191配列との差異を意味し、特 記しない限り、182および189に対応する位置のアミノ酸はジスルフィド結
合により結合している。]
特性を示す一つの伸長類似体は下記である(Ref No. 9604)
れ得る。このような類似体は、配列:
らなる群から選択される〕;または配列:
である。
たはアミノ酸の側鎖の間への環状アミド結合の挿入により得られ、抗肥満特性を
示す具体的hGH177−191類似体は、以下のものを含む:
配置である。上の全てのペプチドは、適当な場合、Cys(182)とCys(1 89)またはPen(182)とPen(189)の間に環状ジスルフィト結合を有 する。
い作用に到達するのに十分であるが、重篤な副作用または不利な反応をもたらす
ほど大量ではないペプチドの量を意味する。
端配列の類似体を含むペプチドの、動物の肥満の処置への、または動物の肥満を
処置する医薬組成物の製造への使用を提供する。
−末端配列の類似体を含むペプチドの有効量を、1種またはそれ以上の薬学的に
許容される担体および/または希釈剤と共に含む、動物の肥満の処置に使用する
ための医薬組成物を提供する。
な量を投与した時、動物における肥満の処置に有利な治療活性を示す。例えば、
1日当り体重キログラム当り約0.5μgから約20mgを投与し得る。投与レジメ
は、最適予防的または治療的応答を提供するように調節し得る。例えば、1回ま
たは分割した投与量を、毎日、毎週、毎月または他の適当な時間間隔で投与し得
、または投与を臨床状態の緊急性により示されるように、比例して減少し得る。
出装置の使用)のような慣用の方法で投与し得る。容易な投与のために、経口投 与が好ましいが、非経口投与もかなり簡便である。投与経路に依存して、活性成
分は酵素、酸または他の該成分を不活性にし得る天然状態から該成分を保護する
物質でコートすることが必要であり得る。例えば、成分の低親油性のために、ペ
プチド結合の開裂ができる酵素により胃腸管で、および酸加水分解により胃で破
壊され得る。組成物を非経口投与以外で投与するために、活性成分をその不活性
化から防止する物質でコートするか、または該物質と共に投与し得る。
らの混合物中、および油中に調剤された分散剤としても投与し得る。貯蔵および
使用の通常の条件下で、これらの製剤は通常微生物の生育を防止するための防腐
剤を含む。
菌注射溶液または分散剤のその場での準備のための滅菌粉末を含む。全ての場合
、この形は無菌でなければならず、容易に注射できる(syringability)程度に液 体でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌
および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピ レングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等)、これらの適当な混合物 および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、
レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒子サイズの
持続によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用からの保護
は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、ソルビン酸、チオモルサール等によりなすことができる。多くの場合、
等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物
の延長された吸収は、例えば、吸収を遅延させる薬剤の組成物中での使用により
なすことができる。
挙した種々の他の成分と共に挿入し、続いて濾過滅菌する。一般に、分散剤は滅
菌活性成分を、基本的分散媒体および上記に列挙した必要な他の成分を含む滅菌
賦形剤に挿入することにより調剤する。滅菌注射用溶液の調剤のための滅菌粉末
の場合、調剤の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥法であり、活性成分と
予め滅菌濾過した溶液付加的な所望の成分の粉末を得る。
釈剤または同化できる食用担体と共に、経口で投与されるか、または硬または軟
殻ゼラチンカプセル内に包含し得るか、または錠剤に圧縮し得るか、または直接
規定食の食物に挿入し得る。経口投与に関して、活性成分を賦形剤と共に挿入し
、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シ
ロップ、カシェ剤等の形で使用し得る。このような組成物および製剤は、少なく
とも0.01重量%およびより好ましくは少なくとも0.1−1重量%の活性成分
を含むべきである。組成物および製剤の割合は、もちろん変化し得、簡便には単
位の約5から約80重量%の間であり得る。医薬組成物中の活性成分の量は、適
当な投与量が得られるものである。本発明の好ましい組成物または製剤は、例え
ば、経口投与単位形が約0.5μgから200mg、およびより好ましくは10μg から20mgの間の活性成分を含むように調剤し得る。
ントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤;リン酸二
カルシウムのような賦形剤;コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸等の
ような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤;およびスクロース、
ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤を添加し得るか、ペパーミント、冬
緑油、またはサクランボ香味のような香味剤。投与単位形がカプセルである時、
それは、上記タイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。種々の他の物質がコ
ーティングとしてまたはそうでなければ投与単位の物理的形を修飾するために存
在し得る。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルは、セラック、糖または両方でコ
ートし得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてスクロー
ル、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびサクランボまたは
オレンジフレーバーのような香味を含み得る。もちろん、投与単位形を準備する
のに使用する物質は、医薬的に純粋であり、用いる量で実質的に非毒性でなけれ
ばならない。加えて、活性成分は持続性放出製剤および製剤に包含し得る。
および全ての溶媒、分散媒体、水溶液、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、
等張性および吸収遅延剤等を含む。医薬的に活性な物質に対するこのような媒体
および薬剤の使用は当分野で既知であり、例示の方法で、Remington's Pharmace
utical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, US
Aに記載されている。任意の慣用の媒体または薬剤が活性成分と不適合である範 囲以外は、本発明の医薬組成物へのそれらの使用が考慮される。追加的な活性成
分も組成物中に挿入できる。
特に有利である。本明細書で使用する投与単位形は、処置するヒト患者への単一
の投与量に適した物理的に別々の単位を意味する;各単位は、望ましい治療効果
を生ずることを計算された予定された量の活性成分を、必要な薬学的担体および
/または希釈剤と共に含む。本発明の新規投与単位形に関する詳述は、(a)活性
成分の独特な特性および達成する具体的な治療効果、および(b)肥満の処置のた
めの活性成分のような調剤の分野に固有の限定により指図され、直接依存する。
要求しない限り、“含む”または“含み”または“含んで”のようなその語尾変
化した語は、記載した完全なものまたは完全なもののグループを含むが、他の完
全なものまたは完全なもののグループを排除しないことを意味することは理解さ
れる。
ではない以下の実施例および添付する図面により明らかになるであろう。
/6J(ob/ob)マウスの1日当りの食餌消費の平均(g/マウス/日)を示す。動物の四つ
のグループへの処置は、図1Aおよび1Bの説明のとおりである。各点は6動物
体の平均±SEMを表わす。全ての時間において、グループ間の有意性は確認でき なかった。
たは27日処置期間中における体重増加でのhGH177-191ペプチドの効果を説 明する。動物に、動物の腹部の4分下部へ食塩水またはペプチド(500μg/kg 体重)(3A)を毎日腹膜内投与するか、または徐々に放出する錠剤(500μg/日
/kg体重)を皮内移植した。対照グループに偽薬錠剤を同じ方法で移植した。各点
は6動物体の平均±SEMを表わす。
動物体の平均±SEMを表わす。全ての時間において、試験グループ間の有意性は 確認できなかった。
雄マウス(5A)および雌マウス(5B)の脂肪組織中における脂質生成の生体に基
づいた効果を示す。データは[C14]-脂質形成割合を示しており、脂質中に組込 まれた[C14]-グルコースとして示される(pmol/mg組織/min)。値は、各グループ
の6動物体からの12測定の平均±SEMを意味する。hGH177-191処置と食塩水
対象グループとの違いは、統計上有意であった。
雄マウス(6A)および雌マウス(6B)の脂肪組織中における脂質生成の生体に基
づいた効果を示す。データは、脂肪組織から放出されるグリセロールの割合を示
す(Pmol/mg組織/分)。各値は、各グループの6動物体からの12測定の平均±SE
Mを意味する。hGH177-191処置と食塩水対象グループとの違いは、統計上有意
であった。
脂肪細胞からのジアシルグリセロールの放出における、hGH177-191のインビ トロ効果を説明する。放射性酵素アッセイを使用してジアシルグリセロールの量
を測定し、その結果を基底レベルに対する増加%として示した。
定による、雄ツッカー脂肪質(fa/fa)ラットの単離含脂肪組織中のホルモン感受 性リパーゼ活性に基づいたhGH177-191のインビトロ効果を示す。
燥重量による、正常ラットの単離含脂肪組織(10A)および肝細胞(10B)中の
アセチル-CoAカルボキシラーゼに基づいたhGH177-191のインビトロ効果を
示す。ここでアセチル-CoAカルボキシラーゼ1単位を、毎分の1μmolアセチ
ル-CoAのカルボン酸エステルとして規定した。
(対照用)またはペプチド類似体(500μg/kg体重)何れかを毎日腹膜内投与した
。各点は、6動物体の平均±SEMを表わす。
間中の、26週C57BL/6J(ob/ob)マウスの1日当りの食餌消費の平均(g/マウス/日
)を示す。2つの動物グループへの処置は図11Aの説明のとおりである。各点 は6動物体の平均±SEMを表わす。全ての時間において試験グループと対照との 間で有意性は確認できなかった。
/ob)マウスおよび脂肪質ツッカー(fa/fa)ラットを使用して例示説明する。同じ 齢および性別の動物体を任意に2つのグループに分け、ケージ毎に6匹を収容し
、Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, C
layton, Australiaの動物収容所で、室温25℃に一定にして標準の12時間明/
暗サイクルを維持した。動物には予め決めた量の動物用固形飼料(Clark King, M
elbourne, Australia)を無制限に与え、いつでも自由に水を飲めるようにした。
動物に合成ペプチド(200-500μg/kg体重)または同体積の生理食塩水(0. 9%食塩)の何れか0.1mlを、適当な日数の間毎日腹腔内投与した。この腹腔内 投与は、30G×1/2”(0.31×13mm)針の1-ml使い捨てツベルクリンシ リンジで行ない、投与部分は動物の腹部の4分下部とした。hGH177-191およ びその類似体の制御された放出の影響を調べるために、徐々に放出するペプチド
粒剤(直径3mm)を、麻酔をしてツッカーラットの腹部領域に皮内移植した。体重
および食餌摂取を表示した期間の間監視した。
固相合成技術を使用して調製した。この固相合成は、例えばα-アミノ保護アミ ノ酸を使用して、ペプチドのC末端から開始することができる。例えば必要なア
ミノ酸をWang樹脂(4-アルコキシベンジルアルコール樹脂)、またはRinkアミド 樹脂(アミノメチル樹脂に2,4-ジメトキシ-4’-[カルボキシメチルオキシ]-ベ
ンズヒドリルアミンが結合)、またはPAM樹脂(4-ヒドロキシメチルフェニル-酢 酸樹脂)に付着させるなどして、適切な出発物質を調製できる。これらの樹脂はA
uspep Pty. Ltd., Parkville, Victoria, Australiaで市販されている。
樹脂に結合させた。最初のカップリング後、α-アミノ保護基を有機溶媒中ピペ リジンで室温で除去した。次いでα-アミノ保護基を取り除き、残存する保護ア ミノ酸を所望の順序で順次カップリングした。4倍過剰量の各保護アミノ酸を、
塩化メチレン(DCM)-N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)混合溶媒中、ジイ ソプロピルカルボジイミド(DIC)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(H
OBt)などの適切なカルボキシ基活性剤とともに、反応に一般的に使用した。
ルオロメタンスルホン酸(TFMSA) などの、樹脂からペプチドを切り離す試 薬で処理して、ペプチドを樹脂支持体から切り離し、同様にCys(Acm)に対
するものを除く側鎖保護基全てを外した。Wang樹脂を使用したときは、TFA処
理で遊離ペプチド酸が形成された。Rinkアミド樹脂を使用したときは、TFA処
理で遊離ペプチドアミドが形成された。PMA樹脂を使用したときは、TFMS
A処理で遊離ペプチド酸が形成された。標的ペプチドは、合成後の修飾が必要な
環状ジスルフィド形態で存在するだろう。
を限定する意図のものではない。
No.9401)で示す)を含むペンタデカペプチドの合成
応容器からDCM溶液を排出した。この洗浄を二度繰り返した。
oc-Phe、0.388g、1.0mmol)およびNMP 1.0ml中DIC(0.135g
、1.0mmol)を反応容器中で10分間混合した。混合物に、DMF 0.6ml中4
-ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.074g、0.06mmol)を加えた。溶液
中の反応を、室温で68分間続けさせた。次いで、この溶液を排出し、樹脂をN
MP(4ml×3)およびDCM(4ml×3)で洗浄した。このFmoc-Phe-Wang樹 脂複合体を減圧下で一晩乾燥し、原料0.781gを得た。Fmoc-ピペリジン付加
物の分光光度測定を使用して、樹脂へのアミノ酸カップリングレベルを測定した
ところ、0.80mmol/g樹脂であった。
反応容器から溶液を排出した。
応容器中の樹脂から溶液を排出した。この洗浄操作を二度繰り返した。反応容器
にDMF(2ml)を加え、樹脂を膨潤させたままにしておいた。
μg;0.8mmol)を加えた。混合物を10分間撹拌し、アミノ酸活性化を開始し た。次いでこの溶液をさきに反応容器に移した樹脂に加えた。得られた混合物を
1.5時間またはニンヒドリン試験陰性結果が得られるまで撹拌した。反応容器 から溶液を排出した。
した。次いで、反応容器からこの溶液を排出した。この洗浄操作を二度繰り返し
た。
シケーターに入れ、減圧下で一晩乾燥した。得られたペプチド-樹脂は0.635
gであった。乾燥したペプチド-樹脂を反応容器から取り出し、マグネティック撹
拌子を含む50ml丸底フラスコに入れた。TFAによる樹脂からのペプチド切り
出しを、以下の手順で行なった:フェノール 0.75g、H2O 0.5ml、チオア
ニソール 0.5ml、およびエタンジチオール 0.25mlを含むスカベンジャー溶
液を丸底フラスコに加えた。得られた混合物を5分間撹拌した。勢いよい撹拌を
続けながら、TFA 10mlをフラスコに徐々に滴下して加えた。得られた混合 物を室温で2.5時間撹拌した。
-ペプチド溶液を、冷ジエチルエーテル 200mlを含む別の500ml丸底フラス
コに減圧下で吸引した。エーテル溶液を4℃下で一晩放置してペプチドを沈殿さ
せ、混合物を微多孔フリットガラス漏斗で濾過して集めた。フィルター上のペプ
チド沈殿物を冷エーテル(10ml×3)で洗浄し、スカベンジャーを取り除いた。
ペプチド沈殿物を25%酢酸水溶液に溶かし、凍結乾燥して、粗ペプチドを得た
(乾燥重量約400mg、純度〜80%)。
)カラム(細孔のサイズ:120Å、粒子サイズ:12μm、表面積:190m2/g;Su
pelco, Bellefonte, PA, U. S. A.)を使用し、室温、流速5.0ml/分で精製を行
なった。直線勾配プログラムを使用し、ここで溶媒Aは0.1% TFA水溶液、
溶媒Bはアセトニトリル-水(50/50:v/v、0.1% TFAを含む)であった。
勾配を80分間で20%から100%にあげた。Perkin-Elmer LC-100インテグ レーターを使用して、分離プロフィルを記録し、分析した。所望のペプチド部分
を抜き取り、Pharmacia Model FRAC-100自動フラクションコレクター(Uppsala、
Sweden)を使用して集めた。同一成分のフラクションをあわせ、凍結乾燥した。 精製したペプチド(乾燥重量275mg、純度98%以上)、Cys(Acm)6,13-ペン
タデカペプチドを、-20℃で冷凍保存した。
してシステイン保護基(Acm)を外し、同時に分子内ジスルフィド橋を形成させ
て行なった。Cys(Acm)6,13-ペンタデカペプチド(275mg、0.155mmol) を80% 酢酸水溶液 50mlに溶かした。この溶液を、激しく撹拌した80% 酢酸水溶液 100ml中ヨウ素(378mg、1.4mmol)を含む250ml丸底フラス
コに加えた。室温で2時間反応を続け、得られた溶液にアスコルビン酸(ビタミ ンC)を加えて反応を終わらせた。ロータリーエバポレーターで溶液体積を減ら し、凍結乾燥してペプチドを元の形態に戻した。環化ペプチドをRP-HPLC で上述の直鎖ペプチドの精製と同様にして精製した。凍結乾燥後、純度96%の
環状ペンタデカペプチド 165mgを得た。合成の全収率は46%であった。
換える変更を含む。
に置き換え、デスアミノペンタデカペプチドを得る合成とする変更を含む。
た後、DMF中20%無水酢酸溶液 5mlを加えた。5分後、ジイソプロピルエ チルアミン(DIEA) 71μl(0.4mmol)を加え、発生したプロトンを中和し た。ペプチドのアシル化を室温で30分間行なった。ペプチド-樹脂をDMFで 二度、DCMで二度洗浄し、N-アセチルペプチド樹脂を実施例Aに示すとおり のTFA開裂に供した。
)を入れた。樹脂をDCM(4ml)で、2分間勢いよく撹拌して洗浄した。反応容 器からDCM溶液を排出した。この洗浄をもう一度繰り返した。
2分間撹拌した。次いで、この溶液を反応容器から排出した。混合時間を18分
にしてこの脱保護操作をもう一度繰り返した。溶液を反応容器から排出した。D
CM(4ml)を反応容器に加え、2分間そのままにしておいた。溶液を再び樹脂か
ら除去した。この洗浄操作を二度繰り返した。10% DIEA/DMF(4ml)を
反応容器に加えた。得られた混合物を1分間そのままにしておき、前述のとおり
溶液を取り除いた。この脱保護操作をもう一度繰り返した。反応容器中の樹脂複
合体にDMF(4ml)を加えた。得られた溶液を2分間そのままにしておき、次い
で容器から溶液を排出した。この洗浄操作を4回繰り返した。最後に、樹脂を膨
潤させたままに保つためにDMF(2ml)を反応容器に加えた。
08mg;0.8mmol)およびDIC(128μg;0.8mmol)を、DMF 2mlを含 む10ml-試験管に加えた。この混合物を10分間撹拌し、アミノ酸を活性化し た。この溶液を反応容器中の樹脂に加えた。得られた混合物を1.5時間または ニンヒドリン試験陰性結果が得られるまで撹拌した。次いで、この溶液を反応容
器から排出した。
し、上澄み液を取り除いた。この洗浄操作を二度繰り返した。
時間を18分にしてもう一度繰り返した。この溶液を反応容器から排出した。
の溶液を反応容器樹脂から排出した。この洗浄操作を二度繰り返した。樹脂を膨
潤させたままとするためDMF 2mlを反応容器に加えた。
erに結合させた。結合が完了した後、ペプチド-樹脂を含む反応容器をデシケ ーターに移し、減圧下で一晩乾燥した。次いで、ペプチド-樹脂を10ml-反応容
器に移した。DCM(4ml)を反応容器に加えた。2分間勢いよく撹拌し、樹脂を
洗浄した。反応容器からDCM溶液を排出した。この洗浄をもう一度繰り返した
。
u基をそれぞれ外した。
ート(BOP)(400mg;0.90mmol)、HOBt(122mg、0.90mmol)およ
びDIEA(400μg、2.25mmol)を1.5% DIEA/DMF 3.4mlに溶 かし、反応容器に加えた。得られた混合物を3時間またはニンヒドリン試験陰性
結果が得られるまで撹拌し、反応容器から上澄み液を取り除いた。次いで、反応
容器にDMF(8ml)を加えた。得られた溶液を勢いよく2分間撹拌した。反応容
器から溶液を排出した。この洗浄操作を二度繰り返した。
のα-アミノ基からFmoc基を取り除いた。
oc基を取り除き、脱保護ペプチド樹脂を得た。このペプチド樹脂を含む反応容器
をデシケーターに移し、減圧下で一晩乾燥した。ペプチド-樹脂 604mgを得た
。乾燥したペプチド樹脂を反応容器から取り出し、マグネティック撹拌子を含む
25ml-丸底フラスコに入れた。トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)/T
FA切り離し手順を使用し、PAM樹脂からペプチドを切り離した:チオアニソ
ール 500μlおよびエタンジチオール 250μlを含むスカベンジャー溶液を
フラスコに加えた。得られた混合物を室温で10分間撹拌した。勢いよく撹拌し
ながら、TFA 5mlをフラスコに徐々に滴下した。フラスコを氷浴中に移し、 勢いよく撹拌しながらフラスコにTFMSA 500mlを徐々に加えた。得られ た混合物を氷浴中で10分間撹拌し、室温でさらに15分間撹拌した。冷ジエチ
ルエーテル(50ml)をフラスコに加え反応を停止し、切り出したペプチドを沈殿
させた。混合物を微細多孔フリットガラス漏斗に通して、このペプチドをフィル
ター上に集め、冷エーテルで洗浄し(10ml×3)スカベンジャーを取り除いた。
このペプチド沈殿物を50% アセトリトリル/H2O 30mlに溶かし、冷10%
NH4HCO3 5mlを加えて溶液を中和した。凍結乾燥後、粗ペプチド(519m
g、純度約69%)を得た。
すとおりである。
した食餌量とを測定した。動物は覆いのある室に入れて体重測定期間中できるだ
け運動できないようにした。食餌消費は元の食餌量から容器中に残した量を引い
て算出した。
血漿をサンプルから取り出し、代謝アッセイに使用した。血漿トリグリセリドお
よび全コレステロールの測定は酵素分光測定法で行った。試薬は、修飾グリセロ
ール・ホスフェート・オキシダーゼ(GPO)−Trinder型カラー反応またはコレ ステロール・オキシダーゼ−4−アミノアンチピリン法に基づく。すべてのアッ セイは、自動ピペッター、遠心分析器および分光測定記録器を備えたCentrifiCh
em System 400 (Union Carbide)で行った。Seronorm Lipid (Nycomed Pharma Co
., Oslo, ノルウェー)を較正器として用いた。
に発表されているのと同様の方法で、全精巣上体脂肪パッドまたは子宮傍脂肪パ
ッドの白色脂肪性組織を、マウスを殺した後直ちに切除した。組織を冷生理食塩
水で洗い、乾かし、秤量した。エクスビボ脂肪アッセイに、血管のない脂肪性組
織の部分を用いた。
177−191ペプチドおよび類似体の脂肪分解作用を検査するモデルを用いた
。このアッセイでは[C14]トリオレインをHSLの基質として用いた。加水分解
[C14]オレイン酸の量を測定し、HSL活性の指標とした。
断し、消化媒体10ml含有のシリコン処理ガラス製バイアルに入れた。消化媒体
は、微生物性コラゲナーゼ(II型)をKrebs-Ringerリン酸緩衝液中1mg/mlの濃度で
、半Ca2+の強度で、2%(w/v)ウシ血漿アルブミン(BSAフラクションV)で 、含有している。37℃、1時間、95%O2/5%CO2気体下で消化後、脂肪 性細胞を脂肪性組織の残留片から、3−4mm開口を持つ5.0mlピペットで緩や かに懸濁液を吸い取り、遊離した。組織から分離した脂肪性細胞をナイロン製シ
フォンで濾過し、シリコン処理ガラス管に入れて、コラーゲンを含まないアルブ
ミン緩衝液6mlで2回洗浄した。単離した脂肪性細胞をコラーゲンを含まない緩
衝液10mlに再び懸濁し、脂肪性細胞の濃度の測定を、顕微鏡上で予め定めた量
の細胞のアリコットを計数することにより行った。通常は、Krebs-Ringerリン酸
緩衝液(pH7.4)中の脂肪性細胞は約109細胞/mlであった。
)、15μモルの乳化[C14]−トリオレインおよび108細胞を最終的に含有す る液中で行った。基質、[C14]−トリオレインは非標識トリオレインで予め乳化
し、15μモルのトリオレインおよび0.1ml中375,000cpmを含有する
最終乳化液とする。異なる濃度のhGH177−191ペプチドまたは類似体を
加えて、HSL活性に対する効果を調べた。反応の停止には、オレイン酸50μ
g含有のクロロホルム−メタノール−ベンゼン−2:2:4:1の脂肪酸抽出混 合液1mlを加え、次いで0.5NのNaOH 67mlを加えた。遊離脂肪酸を抽出
および単離するために、サンプルを20秒間攪拌し、次いで1000×gで5分
間遠心分離にかけた。脂肪酸含有のアルカリ性の上部水相から200μlをシン チレーションバイアルに移した。[C14]放射活性を液体シンチレーション計数 で測定した。残りの細胞懸濁液でタンパク質含量を調べた。HSL活性をU/ml タンパク質で表すと、1時間当たりのオレイン酸1nモルの放出は酵素活性1U
に当たる。
なる。単離した脂肪性細胞および肝細胞の両方のhGH177−191ペプチド
または類似体の存在下におけるアセチル−CoAカルボキシラーゼ活性を測定し
、ペプチドの抗脂肪作用を検査した。アセチル−CoAカルボキシラーゼ活性は
、[C14]ビカルボネート固定反応−アセチル−CoA依存性H[C14]O3の[C
14]マロニル−CoAへの取り込み率によって決定した。
ウスの肝臓からコラゲナーゼ消化によりつくった。肝臓をハサミで細かく切断し
、消化媒体30mlを含有する250mlのエーレンマイヤー・フラスコに移した。
消化媒体は微生物性コラゲナーゼ(IV型)を、カルシウムを含まないKres-Ringer リン酸緩衝液(pH7.4)およびグルコース(5mM)中30mg/mlの濃度で含有して
いる。消化を15分間37℃、95%O25%CO2で行った後、組織から遊離し
た肝細胞をナイロン製シフォンで濾過し、シリコン処理ガラス管に入れ、コラー
ゲンなしの新鮮な消化媒体で2回洗った。単離した細胞を、EDTA(0.45m
モル)、ゼラチン(0.7ml)、2−{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エ
タン硫酸(TES)(0.9mモル)を含有する媒体45mlに再懸濁し、使用前に9 5%O2/5%O2を導入した。
)およびBSM(0.8mg/ml)含有の混合液中でまず予めインキュベートした。反 応の開始には、予めインキュベートした細胞を、50mMのTris-HCl緩衝液(p
H7.5)、10mMクエン酸カリウム、10mMのMgCl2、1mMジチオトレイト ール(DTT)、BSA(0.8mg/ml)、3.75mMのATP、0.125mMアセチル
CoAおよび12.5mMのNaH[C14]O3(0.44μCi/μモル)を含有する アッセイ混合液(最終量500μl)に加えた。37℃で10分間インキュベート した後、反応終了のために6MのHCl 0.1mlを加えた。反応混合物を減圧デ
シケーターに30分間放置し、未反応のNaH[C14]O3を除去し、次いで遠 心分離を1500gで10分間行い不溶物をなくした。上澄液アリコット0.5m
lを取りシンチレーションバイアルに移した。[C14]放射活性の測定をシンチレ
ーション計数器で行った。残る細胞懸濁液についてタンパク質含量を調べた。酵
素の比活性をmU/g細胞乾燥重量で表した。アセチルCoAカルボキシラーゼの 1Uは、1分間に1μモルアセチルCoAのカルボキシル化を触媒する量と定義
される。
、37℃インキュベーションにおけるグリセロールおよび遊離脂肪酸の媒体中へ
の放出で表した。
で組織を、Krebs-Ringerビカルボネート(KRB)緩衝液2ml、4%脱脂肪BSA
および5.5mMグルコースを含有の25mlバイアル中で、炭素原大気(95%O2/
5%CO2)下、37℃で1時間インキュベートした。次いで組織を新しい媒体含
有の別のバイアルに移し、hGH177−191ペプチドまたは類似体をバイア
ル中に加え、インキュベーションを開始した。混合物を37℃で90分間インキ
ュベートした。インキュベート後、細胞を除去し、媒体から取り出したサンプル
のアリコット(200μl)についてグリセロールまたは遊離脂肪酸(FFA)の含 量を酵素アッセイ(グリセロールキナーゼ)または比色(銅色素)分光法でアッセイ
した。生じたNADAまたは色素を、夫々340nmまたは610nmでの吸収によ
ってモニターした。
作用の検査のために、C14パルミチン酸から移行した[C14]O2を測定した。 [C14]O2、FFA酸化の最終産物をヒアミン・ハイドロキサイドで捕捉し、 液体シンチレーション計数器で測定した。FFA酸化の比率は[C14]放射活性
で決定した。
組織を、Krebs-Ringerリン酸(KRP)緩衝液2mlおよび2%脱脂肪ウシ血漿アル
ブミン(BSA)を含有の25mlバイアル中で、37℃で30分間、炭素原大気( 95%O2/5%CO2)下で予めインキュベートした。次いで組織を、0.15mM[
C14]パルミチン酸ナトリウム(最終[C14]比活性、0.20μCi/μモル)お
よびhGH177−191ペプチドまたは類似体(1−1000nM)を含有する新
鮮なインキュベーション媒体を入れたコンテフラスコに移した。濾紙ロールをフ
ラスコの内壁に入れ、フラスコをゴム製隔壁のストッパーで密封した。インキュ
ベーションを、37℃で1時間炭素原大気下で続け、4.5MのH2SO4 25 0μlを針でもって隔壁からフラスコの媒体中に入れて、停止し、ヒアミンハイ ドロオキサイド250μlを中壁中の濾紙ロールに注入した。フラスコをさらに 1時間インキュベートし、ヒアミンハイドロオキサイドによる[C14]O2の吸収
を完了した。濾紙ロールを取り出し、シンチレーション・バイアルに移した。[
C14]放射活性を液体シンチレーション計数器により測定した。[C14]パルミ
チン酸酸化の[C14]O2に対する比率を計算し、μモル/g組織/時間で表した 。
177−191の抗脂肪形成活性の指標として測定した。
グルコース(0.1mg/ml)を含有するKrebs-Ringerビカルボネート(KRB)緩衝液
中に入れ、95%O2−0.5CO2を37℃で導入した。1時間予めインキュベ ートした後、組織を、[C14]グルコース(最終比活性0.05μCi/μモル)お
よび0.3μMのhGH177−191含有の新しい媒体2mlに移し、インスリ ンの存在または不存在下でさらに90分間インキュベートした(条件は上記に同 じ)。組織を取り出し、KRB緩衝液で完全に洗い、脂質をクロロホルム/メタノ
ールで抽出した。抽出液を、0.1%MgCl2含有のMeOH−H2O溶液2mL で洗った。洗浄抽出液の2.5mlアリコットを取り、シンチレーション・バイアル
に移した。[C14]放射活性を液体シンチレーション計数器で測定した。全脂質 合成の比率を、脂質/g組織/時間中に取り込まれた[C14]グルコースのμモル として表した。
定量には、放射酵素アッセイ、E.Coli DAGキノーゼおよび一定の混合ミセル 条件を用いて、DAGを溶解し、[33P]−γ−ATPの存在下での[33P]ホ
スファチジン酸への定量的移行を調べた。いくつかの抽出工程で未反応[33P]
−γ−ATPを除去した後、[33P]ホスファチジン酸の単離に1ml Am-Prep( 商標)ミニカラムを用いた。
的処置を、蓄積的な体重増加および毎日の食餌消費を含むいくつかのパラメータ
ーで測定評価した。処置期間中、蓄積的体重増加の減少がhGH177−191
処置の雄および雌の動物群において、適当な対照に比較して、認められた(図1 A、1B)。データを解析し、毎日の体重増加で表すと、体重減少は処置雄動物 では0.22±0.03から0.16±0.04g/日であり、処置雌動物では0.3
0±0.02から0.22±0.04g/日であった。雄雌両方の処置動物の1日の
平均体重増加は、適当な対照群に比べると約27%低かった。しかし、4群間で
1日の平均食餌消費量には有意の差がなかった(図2A、2B)。同様の好ましい
結果が500μg/kg/日の経口投与においても認められている。Ref No.9403
(図11A)のような、種々の類似体のこれらの抗肥満作用は、肥満マウスで観察
された。合成類似体は、処置動物の食欲に影響を与えないで、体重増加を制御す
る。同様の体重増加の減少が、Zucker肥満(fa/fa)ラットにおいても、毎日の腹 腔内投与または徐放ペレットの皮内植込みによるhGH177−191処置の期
間中に認められた(図3A、3B)。処置Zuckerラットの食餌消費は処置期間中不
変であった(図4A、4B)。これらのデータが明らかなように、hGH177−
191ペプチドの慢性的処置は食餌消費に影響を与えずに体重増加を減少した。
物において有意な脂肪性組織重量の減少があり、雄では20%、雌では12%の
減少が夫々の対照に比して認められた(表1)。脂肪形成は、グルコースおよびア
セテートなどの前駆代謝体の供給に基づいている。従って、hGH177−19
1または類似体の作用の決定のために、単離脂肪性組織における[C14]グルコ
ースの脂質への取り込みを測定した。肥満Zuckerラットの単離組織において、ペ
プチドhGH177−191および類似体は、対照に比して25%以上もインビ
トロでの脂肪形成活性を低下した(表5)。hGH177−191処置マウスから
単離された脂肪性組織の脂肪形成が低下したことは明白である。(図5A、5B)
。組織の脂肪形成の低下は、雄マウスで2.80±0.33から2.33±0.21
pモル/mg組織/分、雌マウスで0.36±0.13から0.299±0.21pモル
/mg組織/分であった。hGH177−191処置肥満動物の脂肪性組織における
脂肪分解活性は、雄雌の両方で有意に増大した(図6A、6B)。この結果は、上
記した脂肪性組織質量および蓄積的体重増加の減少についての観察と適合する。
H177−191処置の作用を示す。血漿中の全コレステロールは、雄で4.4 4±0.56から3.52±0.39mモル/lに有意に減少したが、処置雌でのコ レステロール血漿レベルは対照に比して僅かに低かったに過ぎない。一方、hG
H177−191はトリグリセリド血漿レベルに雄雌とも影響を与えなかった。
hGH177−191および種々の類似体の存在下で、肥満動物から単離された
脂肪性組織における脂肪酸の酸化(図7)およびグリセロールの放出(表4)が上昇
した。このことは、hGH177−191処置脂肪性組織の脂肪分解活性の増大
と適合する。合成hGH177−191および類似体による脂質代謝に対するこ
れらすべてのインビボおよびインビトロの作用は、細胞性メッセンジャージアセ
チルグリセロールの放出促進の結果のようである(図8)。このジアセチルグリセ
ロールは、標的臓器における重要な脂肪分解酵素ホルモン感受性リパーゼ(図9)
および脂肪形成酵素アセチルCo−Aカルボキシラーゼ(図10A、10B)を順
に調節するものである。
の代表的類似体(Ref No.9604および9605)のインビトロ抗脂肪形成お よび脂肪分解活性を示す。
結果からもたらされる期待は、1種類の哺乳動物で示されたhGH177−19
1およびそのペプチド異型の効果がすべての哺乳動物で適用し得ることである。
ヒト以外の哺乳動物の対応配列がヒト配列の効果的なペプチド異型であるので、
これらの対応配列がヒトを含む他の哺乳動物においても効果的であることが期待
される。
4および9605についてのインビボ活性の上昇と適合する。
の長期間経口投与の結果を示す。
一般的に不活性である(Ref No.9402、9411、9611および9617は
非環状)。178、183および186位でのアニリン置換によっても不活性と なる。これ以外のすべてのアラニン置換(非環状となる182および189位は 除く)では活性は保持され、2つのd−アラニン置換(Ref No.9501)でも同様
である。178位がLysにより置換されたArgのRef No.9606も活性を 保持し、Lysにより置換されたArg(183)のRef9407、およびLys(
183)とGlu(186)との間にアミド結合を追加的に有するRef9408も活
性を保持する。
とは、hGH177−191におけるArg(183)およびGlu(186)上の
対立電荷間の塩橋相互作用の重要性と適合する。Ref No.9408(Lys(18 3)とGlu(186)とのアミド結合を有する)およびRef No.9407(Arg( 183)が同じ正電荷のLys(183)で置換されている)が活性を保持すること
は、183位と186位との間に共有結合か塩橋かで安定な結合が存する必要性
と適合している。
hGH177-191ペプチドの効果。動物に、hGH177-191(200μg/kg体重)また
は同容積の食塩水(対照用)の何れかを、毎日腹腔内投与した。全てのデータは、
6動物体の平均±SEMを示す(*p<0.1;**p<0.05)。
ールの、血漿レベルへの合成hGH177-191の効果。麻酔した動物の尾部の先端 を切断して、血液サンプルを集めた。データは、6動物体の平均±SEMを示す(*p
<0.05)
プル数=各グループ6体)。マウスに、Ref No. 9403の類似体(500μg/kg 体重)または食塩水を、18日間、毎日腹腔内投与した。18日後、全動物体に もう18日間食塩水を投与した。
ツッカー脂肪質(fa/fa)ラット(12〜14週令)から脂肪組織を単離し、異なる 濃度のペプチドまたは食塩水と共にインキュベートした。各試験グループは6つ
のサンプルを含む。
a/fa)ラット(12〜14週令)から単離した脂肪組織を、外来性インシュリンを 含むKRB緩衝液(0.1mU/ml)中、ペプチド(0.3μM)と共にインキュベート した。[C14]- 脂質中に取込まれる[C14]-グルコースの割合(nmol/g組織/時間)
を、脂肪組織の脂質生成活性として測定した。各試験グループは6測定を含む。
lを、毎日腹膜内投与した。各点は、6動物体の平均±SEMを表わす。
57BL/6J(ob/ob)マウスの1日当りの食餌消費の平均(g/マウス/日)を示す。動物の
四つのグループへの処置は、図1Aおよび1Bの説明のとおりである。各点は6
動物体の平均±SEMを表わす。全ての時間において、グループ間の有意性は確認 できなかった。
0または27日処置期間中における体重増加でのhGH177-191ペプチドの効果 を説明する。動物に、動物の腹部の4分下部へ食塩水またはペプチド(500μg
/kg体重)(3A)を毎日腹膜内投与するか、または徐々に放出する錠剤(500μg
/日/kg体重)を皮内移植した。対照グループに偽薬錠剤を同じ方法で移植した。 各点は6動物体の平均±SEMを表わす。
は6動物体の平均±SEMを表わす。全ての時間において、試験グループ間の有意 性は確認できなかった。
J(ob /ob)雄マウス(5A)および雌マウス(5B)の脂肪組織中における脂質生成の
生体 に基づいた効果を示す。データは[C14]-脂質形成割合を示しており、脂質中に 組込まれた[C14]-グルコースとして示される(pmol/mg組織/min)。値は、各グル
ープの6動物体からの12測定の平均±SEMを意味する。hGH177-191処置と食
塩水対象グループとの違いは、統計上有意であった。
/ob)雄マウス(6A)および雌マウス(6B)の脂肪組織中における脂質生成の生体
に基づいた効果を示す。データは、脂肪組織から放出されるグリセロールの割合
を示す(Pmol/mg組織/分)。各値は、各グループの6動物体からの12測定の平均
±SEMを意味する。hGH177-191処置と食塩水対象グループとの違いは、統計上
有意であった。
た含脂肪細胞からのジアシルグリセロールの放出における、hGH177-191のイ ンビトロ効果を説明する。放射性酵素アッセイを使用してジアシルグリセロール
の量を測定し、その結果を基底レベルに対する増加%として示した。
の測定による、雄ツッカー脂肪質(fa/fa)ラットの単離含脂肪組織中のホルモン 感受性リパーゼ活性に基づいたhGH177-191のインビトロ効果を示す。
胞乾燥重量による、正常ラットの単離含脂肪組織(10A)および肝細胞(10B)
中のアセチル-CoAカルボキシラーゼに基づいたhGH177-191のインビトロ効
果を示す。ここでアセチル-CoAカルボキシラーゼ1単位を、毎分の1μmolア
セチル-CoAのカルボン酸エステルとして規定した。
塩水(対照用)またはペプチド類似体(500μg/kg体重)何れかを毎日腹膜内投与
した。各点は、6動物体の平均±SEMを表わす。
置期間中の、26週C57BL/6J(ob/ob)マウスの1日当りの食餌消費の平均(g/マウ ス/日)を示す。2つの動物グループへの処置は図11Aの説明のとおりである。
各点は6動物体の平均±SEMを表わす。全ての時間において試験グループと対照 との間で有意性は確認できなかった。
:20)類似体の使用における、16週C57BL/6J(ob/ob)マウスへの長期処置の体
重増加への影響を示す。
塩。
の有効量を、1またはそれ以上の医薬的に許容される担体成分および/または希
釈成分とともに含む、動物の肥満処置用医薬組成物。
の全部を引用して本明細書に包含させる。
Claims (36)
- 【請求項1】 成長ホルモンのカルボキシル末端配列の類似体を含むペプチ
ド。 - 【請求項2】 ヒト成長ホルモンのカルボキシル末端配列の類似体を含む、
請求項1に記載のペプチド。 - 【請求項3】 ヒト以外の哺乳動物成長ホルモンのカルボキシル末端配列の
類似体を含む、請求項1に記載のペプチド。 - 【請求項4】 アミノ酸残基177−191、 Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe, を含有する、ヒト成長ホルモンのカルボキシル末端配列の類似体、または、ヒト
以外の哺乳動物成長ホルモンの対応する配列、 それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸付加塩、 を含む、請求項1に記載のペプチド。 - 【請求項5】 アミノ酸残基177−191を含有する、天然型ヒト成長ホ
ルモンのカルボキシル末端配列の類似体のアミノ酸側鎖、におけるアミノ酸の延
長、挿入、削除または置換により、または該側鎖の化学的修飾により、または該
側鎖間に環状アミド結合を導入することにより、得られるもの、それらの環状ジ
スルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸付加塩である、請求項1に記
載のペプチド。 - 【請求項6】 ペプチド中、 (i)hGHの182位および189位アミノ酸が結合し一緒になって環状構造
を助成しており、そして/または、 (ii)hGHの 183位および186位アミノ酸が塩橋または共有結合で結合し
ている、 請求項5に記載のペプチド。 - 【請求項7】 hGHの182位および189位アミノ酸間の結合がジスル
フィド結合である、請求項6に記載のペプチド。 - 【請求項8】 hGHの182位および189位アミノ酸が、L−Cys、
D−Cys、L−Penおよび D−Penからなる群から選択される、請求項 6に記載のペプチド。 - 【請求項9】 hGHの183位および186位アミノ酸が、塩橋により結
合しており、そして、それぞれ(XおよびY)または(YおよびX)である、但
し、 Xは、プラス荷電アミノ酸であり、そして、 Yは、マイナス荷電アミノ酸である、 請求項6に記載のペプチド。 - 【請求項10】 XはL−またはD−Arg、LysおよびOrnからなる
群から選択され、YはL−またはD−AspおよびGluからなる群から選択さ
れる、請求項9に記載のペプチド。 - 【請求項11】 hGHの183位および186位アミノ酸が、アミド共有
結合により結合している、請求項6に記載のペプチド。 - 【請求項12】 hGHの183位および186位アミノ酸が、それぞれ(
XおよびY)または(YおよびX)である、但し、 Xは、L−またはD−LysおよびOrnからなる群から選択され、そして、 Yは、L−またはD−AspおよびGluからなる群から選択される、 請求項11に記載のペプチド。 - 【請求項13】 配列: X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n 式中、X1およびX2は、それぞれ、L−またはD−Arg、His、Lysおよ
びTyrからなる群から選択され、そしてmおよびnは、それぞれ0、1、2ま
たは3であるが、但し、少なくともmまたはnは1である、 のペプチド、それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸
付加塩である、請求項5に記載のペプチド。 - 【請求項14】 配列: Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe 式中、Y1は、デアミノ型(H)、アセチル(CH3CO−)および他のアシル基
からなる群から選択される; のペプチド、それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸
付加塩である、請求項5に記載のペプチド。 - 【請求項15】 配列: Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2 式中、Y2は、CONH2およびアルキルアミド基の群から選択される、 のペプチド、それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸
付加塩である、請求項5に記載のペプチド。 - 【請求項16】 【表1】 式中、用いたアミノ酸残基略号はペプチド標準命名法に従ったものである: Gly=グリシン; Ile=イソロイシン; Glu=グルタミン酸; Phe=フェニルアラニン; Cys=システイン; Arg=アルギニン; Gln=グルタミン; Leu=ロイシン; Ser=セリン; Val=バリン; Lys=リジン; Ala=アラニン; Asp=アスパラギン酸; His=ヒスチジン; Orn=オルニチン; Tyr=チロシン; Pen=ペニシラミン(β,β'-ジメチル−システイン)、 但し、グリシン以外の全てのアミノ酸は、D−絶対配置と特記しない限りL−絶
対配置のものであり、そして、ペプチドは、適当する場合、Cys(182)と
Cys(189)との間に、または、Pen(182)とPen(189)との
間に環状ジスルフィド結合を有している、 から選択されるペプチド、または、それらの有機もしくは無機酸付加塩である、
請求項5に記載のペプチド。 - 【請求項17】 成長ホルモンのカルボキシル末端配列の類似体を含むペプ
チドの有効量を動物に投与することを含む、動物の肥満処置方法。 - 【請求項18】 動物がヒトである、請求項17に記載の方法。
- 【請求項19】 ペプチドが、ヒト成長ホルモンのカルボキシル末端配列の
類似体を含むものである、請求項17または請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 ペプチドが、ヒト以外の哺乳動物成長ホルモンのカルボキ
シル末端配列の類似体を含むものである、請求項17または請求項18に記載の
方法。 - 【請求項21】 ペプチドが、アミノ酸残基177−191、 Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe, を含有する、ヒト成長ホルモンのカルボキシル末端配列の類似体、または、ヒト
以外の哺乳動物成長ホルモンの対応する配列、 それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸付加塩、 を含むものである、請求項17または請求項18に記載の方法。 - 【請求項22】 類似体が、アミノ酸残基177−191を含有する、天然
型ヒト成長ホルモンのカルボキシル末端配列のアミノ酸側鎖、におけるアミノ酸
の延長、挿入、削除または置換により、または該側鎖間に環状アミド結合を導入
することにより、または該側鎖の化学的修飾により、得られるもの、それらの環
状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸付加塩である、請求項1
7または請求項18に記載の方法。。 - 【請求項23】 類似体が、 (i)hGHの182位および189位アミノ酸が結合し一緒になって環状構造
を助成しており、そして/または、 (ii)hGHの 183位および186位アミノ酸が塩橋または共有結合で結合し
ている、 ペプチドを含むものである、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 hGHの182位および189位アミノ酸間の結合がジス
ルフィド結合である、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 hGHの182位および189位アミノ酸が、L−Cys
、D−Cys、L−Penおよび D−Penからなる群から選択される、請求 項23に記載の方法。 - 【請求項26】 hGHの183位および186位アミノ酸が、塩橋により
結合しており、そして、それぞれ(XおよびY)または(YおよびX)である、
但し、 Xは、プラス荷電アミノ酸であり、そして、 Yは、マイナス荷電アミノ酸である、 請求項23に記載の方法。 - 【請求項27】 XはL−またはD−Arg、LysおよびOrnからなる
群から選択され、YはL−またはD−AspおよびGluからなる群から選択さ
れる、請求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 hGHの183位および186位アミノ酸が、アミド共有
結合により結合している、請求項23に記載の方法。 - 【請求項29】 hGHの183位および186位アミノ酸が、それぞれ(
XおよびY)または(YおよびX)である、但し、 Xは、L−またはD−LysおよびOrnからなる群から選択され、そして 、 Yは、L−またはD−AspおよびGluからなる群から選択される、 請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 類似体が、配列: X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n 式中、X1およびX2は、それぞれ、L−またはD−Arg、His、Lysおよ
びTyrからなる群から選択され、そしてmおよびnは、それぞれ0、1、2ま
たは3であるが、但し、少なくともmまたはnは1である、 のペプチド、それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸
付加塩を含むものである、請求項22に記載の方法。 - 【請求項31】 類似体が、配列: Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe 式中、Y1は、デアミノ型(H)、アセチル(CH3CO−)および他のアシル基
からなる群から選択される、 のペプチド、それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸
付加塩を含むものである、請求項22に記載の方法。 - 【請求項32】 類似体が、配列: Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2 式中、Y2は、CONH2およびアルキルアミド基の群から選択される、 のペプチド、それらの環状ジスルフィド、または、それらの有機もしくは無機酸
付加塩を含むものである、請求項22に記載の方法。 - 【請求項33】 類似体が、 【表2】 式中、用いたアミノ酸残基略号はペプチド標準命名法に従ったものである: Gly=グリシン; Ile=イソロイシン; Glu=グルタミン酸; Phe=フェニルアラニン; Cys=システイン; Arg=アルギニン; Gln=グルタミン; Leu=ロイシン; Ser=セリン; Val=バリン; Lys=リジン; Ala=アラニン; Asp=アスパラギン酸; His=ヒスチジン; Orn=オルニチン; Tyr=チロシン; Pen=ペニシラミン(β,β'-ジメチル−システイン)、 但し、グリシン以外の全てのアミノ酸は、D−絶対配置と特記しない限りL−絶
対配置のものであり、そして、ペプチドは、適当する場合、Cys(182)と
Cys(189)との間に、または、Pen(182)とPen(189)との
間に環状ジスルフィド結合を有している、 から選択されるペプチド、または、それらの有機もしくは無機酸付加塩を含むも
のである、請求項20に記載の方法。 - 【請求項34】 ペプチドが経口的に投与される、請求項17ないし33の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項35】 請求項1ないし16のいずれかに記載のペプチドの、動物
の肥満処置用医薬組成物製造への使用。 - 【請求項36】 請求項1ないし16のいずれかに記載のペプチドの有効量
を、1またはそれ以上の医薬的に許容される担体成分および/または希釈成分と
ともに含む、動物の肥満処置用医薬組成物。
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