JP3908286B2

JP3908286B2 - 肥満治療剤

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Publication number: JP3908286B2
Application number: JP30779094A
Authority: JP
Inventors: マン−ウーンエヌジーフランク; ヘレンアンナナテラシリア; ジャンウォイ−ジア
Original assignee: メタボリックファーマシューティカルズリミティド
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1994-12-12
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: JPH08165250A; AU7772794A; AU693478B2; US5869452A; CA2135813A1; NZ264912A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は動物の肥満の治療剤に関する。本発明は詳しくは、ヒトの肥満の治療剤に関するが、本発明は、例えば食品製造に用いられる家畜の肉の品質を改善するためのヒト以外の哺乳動物の肥満治療法も含むと解すべきである。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
ヒトの生後発育時のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の重要な役割はよく知られている。脂質および炭水化物の代謝の調節に対する上記ホルモンの影響は、詳細な分子研究がなされていないので余り明らかでない。
【０００３】
ｈＧＨの主な形態は、分子量が約２２，０００ダルトン（２２ＫＤ）であり、一本鎖の１９１個のアミノ酸残基で構成され、その一本鎖は２個のジスルフィド結合によって折り畳まれ、カルボキシル末端において残基１８２と１８９の間に小さなループをもっている。また最近の結晶学的研究によれば、ｈＧＨ分子は４個の逆平行αヘリックスを有し、そのヘリックスは左巻きで密に詰ったらせん束状構造で配列されている。ｈＧＨの特異的な代謝作用に関与する別々の機能領域がｈＧＨ分子内に存在しているという概念は広く容認されている。そのアミノ末端は、ｈＧＨ分子のインシュリン様作用に関与する機能領域として同定されている^2,3。
【０００４】
組換ＤＮＡ技術によってヒト成長ホルモンの大規模商業生産への道が開かれ、その組換えｈＧＨは、同等の生物学的効力と薬理学的特性をもっているようである^4,5。この多機能ホルモンは現在供給されているので、ヒトと動物の実験治療の種類と回数はもはや制限されることはない。小児および成人の低身長を治療するのにｈＧＨを使用することは充分確立されている⁶。女性不妊症の場合のｈＧＨの治療効果も報告されている^7,8。ｈＧＨによってヒトの肥満を治療することは、脂質代謝によって体組成に対して顕著な作用があるので推奨されている⁹。しかし、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ｈＧＨを臨床に用いると種々の問題にぶつかる。この多機能ホルモンは、その分子内の各種の生物活性領域によって、生体内でいくつかの副作用を同時に発生することが多いことを示唆する証拠がある¹⁰。
【０００５】
ＧＨによる脂質代謝の調節については、ＲａｂｅｎとＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇが１９５９年に初めて報告した¹¹。ＧＨを投与した後に血漿の遊離脂肪酸量が急激増大することが、ＧＨの上記代謝機能の主な証拠であった。続いて、脂質代謝においてＧＨが調節する役割は、ＧＨが欠乏がしているヒト^12,13とブタ^14,15およびＧＨで治療したヒト^12,13とブタ^14,15の体組成の研究結果によって裏付けられた。Ｇｅｒｔｎｅｒの知見は、ｈＧＨが“ＧＨ−脂肪サイクル”として知られている一連の相互作用によって脂肪組織分布に関連していることを示唆している¹⁶。
【０００６】
しかしこれらの生化学的および生理学的変化に対して起こる分子現象はほとんど分かっていないままである。脂肪組織などの組織に対する生体内でのＧＨの代謝作用は可変性で複雑であるが、少なくとも二つの要素、すなわち早期のインシュリン様作用とこれに続く後期の一層強い抗インシュリン作用によって構成されていることは明らかである¹⁷。後者の作用の結果には、脂肪分解の刺激と脂質生合成の阻害の両方が含まれる。ｈＧＨの抗脂質生合成作用は、脂肪細胞内でのグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４の発現の減少¹⁸、脂肪組織内でのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性の阻害^19,20、および分離細胞と分離組織の両者内でのグルコースの脂質への取り込みの減少^21,22を証明することによって立証されている。
【０００７】
無傷のｈＧＨの多機能作用とこの無傷のホルモンを臨床に用いる場合に遭遇する問題にかんがみ、所望の生物活性を保持し、望ましくない副作用がないｈＧＨ誘導体を合成できるか否かを研究することによって本発明に到達した。この研究で、ｈＧＨの構造機能の研究が行われ、この多機能ホルモンの代謝作用の分子機能が解明されたのである。
【０００８】
合成のホルモン断片によるｈＧＨの構造機能の研究によって、ｈＧＨ分子のカルボキシル末端が脂質代謝の調節を行うホルモンの機能領域のようであるということが明らかになってきた^20,23,24,25。そしてそのカルボキシ末端領域に基づいた配列を有する合成ペプチドが、肥満実験動物のモデルで、体重増加と脂肪組織の重量を減少させることが分かったのである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの態様によって、成長ホルモンのカルボキシル末端の配列を含んでなるペプチドの有効量を動物に投与することを含んでなる動物の肥満の治療方法が提供される。
【００１０】
“肥満”という用語が本明細書全体にわたって用いられる場合、動物の過剰体重と過剰な脂肪組織の重量の両者を含めて用いられ、したがって、肥満の治療に言及した場合は、肥満動物の体重増加の減少と脂肪組織重量の減少の両者が含まれる。
【００１１】
動物としてはヒトが好ましいが本発明にはヒト以外の哺乳動物の治療法も含まれている。また本発明のペプチドは、好ましくは、アミノ酸残基１７７〜１９１（以後ｈＧＨ１７７−１９１と呼ぶ）を含有するヒト成長ホルモンのカルボキシル末端配列で構成されている。あるいは本発明のペプチドは、他のヒト以外の哺乳動物の種例えばウシ、ブタ、ヒツジもしくはウマの成長ホルモンのｈＧＨ１７７−１９１ペプチドに相当する、成長ホルモンのカルボキシル末端配列で構成されていてもよい。
【００１２】
勿論、本発明には、成長ホルモンの特定の配列１７７−１９１より長いアミノ酸配列、例えばヒト成長ホルモンの配列１７２−１９２または他のヒト以外の哺乳動物の種の成長ホルモンの相当する配列を有するペプチドの使用も含まれることは明らかである。しかし本発明には、無傷で全長のヒト成長ホルモンまたは他の動物種の成長ホルモンの使用は含まれない。
【００１３】
また本発明には、ヒト成長ホルモンまたは他の動物種の成長ホルモンの未変性カルボキシル末端配列の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）、類自体、変異体、変種（Ｖａｒｉａｎｔ）もしくは誘導体であるペプチド、および天然もしくは合成（組換えを含む）の起源由来のペプチドが、本願に記載されている未変性のカルボキシル末端の配列の生物活性すなわち肥満動物の体重増加と脂肪組織の重量を減少させる性能を保持しているならばそれらのペプチドの使用が含まれる。
【００１４】
これらの相同体、類似体、変異体、変種または誘導体は、未変性カルボキシル末端配列中のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換、または該配列の化学的修飾によって誘導することができる。アミノ酸の挿入誘導体としては、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合体、および単一もしくは複数のアミノ酸の配列内挿入体がある。挿入アミノ酸配列の変種は、一つ以上のアミノ酸残基がタンパク質の予め決められた部位に導入されている配列であるが、得られた生成物を適切にスクリーニングするならばランダム挿入することも可能である。
【００１５】
欠失変種は、配列から一つ以上のアミノ酸を除いたことを特徴とする配列である。置換アミノ酸の変種は、配列中の少なくとも一つのアミノ酸残基が、別の２０個の一次タンパク質アミノ酸または非タンパク質のアミノ酸で置換された配列である。未変性カルボキシル末端配列の化学的修飾としては、アミノ末端のアシル化および／又はカルボキシル末端のアミド化および／または未変性カルボキシル末端配列の側鎖の環化がある。
【００１６】
“有効量”という用語は、本願で用いる場合、動物の肥満を治療する際に所望の効果を達成するのに充分なペプチドの量を意味するが、重大な副作用もしくは有害反応を起こすほど大量でないペプチドの量を意味する。
他の態様で、本発明は、動物の肥満を治療する際または動物の肥満を治療するのに用いる医薬組成物を製造する際の、上記の成長ホルモンのカルボキシル末端配列からなるペプチドの有効量の用途を提供するものである。
【００１７】
さらに別の態様で、本発明は、上記の成長ホルモンのカルボキシル末端配列を含んでなるペプチドの有効量ならびに一つ以上の医薬として許容される担体および／又は希釈剤を含んで、動物の肥満を治療する際に用いる医薬組成物を提供するものである。
【００１８】
本発明の上記態様の医薬組成物の活性成分であるペプチドは、動物の肥満を治療する際、特定の症例に対して適切な量で投与すると有利な治療活性を示す。例えば、１日当り体重１kgについて約０．５μｇ〜約２０mgを投与する。投与計画は最適の予防応答もしくは治療応答が得られるように調節することができる。例えば、１つ以上の分割した投与量を１日毎、１週間毎、１ケ月毎または他の適切な時間間隔をおいて投与してもよく、または投与量は臨床状態の要件が示すのに対応して減らしてもよい。
【００１９】
活性成分は、例えば経口、非経口（腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内および骨髄内への注射を含む）、鼻腔内、皮内もしくは坐剤の経路、または移植（例えば遅延放出分子を使用する）による便利な方式で投与することができる。投与が容易であるため、経口投与が好ましいが、非経口投与も非常に便利である。投与経路によっては、活性成分は、酵素類、酸類、および活性成分を不活性化する他の自然条件から保護する物質でコートする必要がある場合がある。例えば成分の親油性が低いと、成分は胃腸器官内でペプチド結合を開裂することができる酵素により、および胃の中で酸加水分解反応によって破壊されることがある。非経口投与以外の方法で組成物を投与するために、活性成分は、その不活性化を防止する物質でコートするかまたはそのような物質とともに投与してもよい。
【００２０】
また活性成分は、グリセリン、液状ポリエチレングリコール類、および／またはその混合物、ならびに油で調製した分散液に入れて投与してもよい。貯蔵および使用の通常の条件下では、これら製剤は通常、微生物の増殖を防止するため保存剤を含有している。
【００２１】
注射用に適切な医薬剤形としては滅菌水剤（水溶性の場合）もしくは滅菌分散剤、および滅菌の注射用の水剤もしくは分散剤を必要に応じて調製するのに用いる滅菌粉末剤がある。いずれの場合も、その剤形は滅菌されていなければならず、かつ容易に注入できる流体でなければならない。またその剤形は製造と貯蔵の条件下で安定でなければならずかつ細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保護しなければならない。担体としては溶媒もしくは分散媒体があり、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、ならびに植物油が挙げられる。
【００２２】
例えばレシチンのようなコーティングを用い、分散剤の場合は必要な粒径を維持し、かつ界面活性剤を用いることによって適正な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、各種の抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオモロサール（ｔｈｉｏｍｏｒｏｓａｌ）などを用いて行うことができる。多くの場合、等張剤例えば糖類もしくは塩化ナトリウムを含有させることが好ましい。注射用組成物吸収時間の延長は、例えば吸収を遅延させる薬剤を組成物に用いることによって行うことができる。
【００２３】
滅菌注射用水剤は、必要量の活性成分を、必要に応じて先に列挙した他の成分のいくつかとともに、適切な溶媒に入れ、次いで濾過滅菌を行うことによって製造される。一般に、分散剤は、基本的な分散媒体と先に列挙したものの中の他の必要な成分を含有する滅菌賦形剤中に、滅菌活性成分を混合することによって調製される。滅菌注射用水剤を製造するのに用いる滅菌粉末剤の場合、その好ましい製造方法は、活性成分プラス追加の所望の成分の粉末をその予め濾過滅菌された溶液から得る真空乾燥法と凍結乾燥法である。
【００２４】
活性成分を上記のように適切に保護する場合、組成物は、例えば不活性の希釈剤もしくは吸収可能な食用担体とともに経口投与するか、または硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセル中に封入するか、または食事の食品に直接混合する。経口投与を行う場合、活性成分は賦形剤と混合され、吸収可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用される。
【００２５】
このような組成物と製剤は、活性成分を少なくとも０．０１重量％およびより好ましくは少なくとも０．１〜１重量％含有していなければならない。組成物および製剤の百分率は、勿論変えてもよく、１ユニットの約５〜約８０重量％が好都合である。医薬組成物中の活性成分の量は、適切な投与量が得られるような量である。本発明の好ましい組成物または製剤は例えば経口投与単位剤形が活性成分を約０．５μｇ〜２００mg、より好ましくは１０μｇ〜２０mg含有するように製造される。
【００２６】
また錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは以下のものを含有していてもよい。すなわちトラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；およびスクロース、ラクトースもしくはサッカリンのような甘味剤を添加してもよく、またはペパーミント、冬緑油もしくはさくらんぼの香味のような香味剤を添加してもよい。投与単位剤形がカプセルの場合は、上記の物質に加えて、液状担体を含有させてもよい。
【００２７】
種々の他の物質が、コーティングとして、または投与単位の物理的形態を別の方法で改変するために存在していてもよい。例えば錠剤、丸剤もしくはカプセル剤またはシェラック、糖または両者でコートしてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンとプロピルパラベン、色素およびさくらんぼもしくはオレンジの香味のような香味剤を含有している。勿論、投与単位剤形を製造するのに用いられるどの物質も、医薬として純品でかつ使用量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、本発明の活性成分は、徐放性の製剤と配合物に混合することができる。
【００２８】
本発明で用いられる医薬として許容される担体と希釈剤としては、すべての溶媒、分散媒体、水溶液、コーティング、抗菌剤と抗真菌剤、等張性で吸収遅延性の薬剤などがある。医薬として活性な物質に対して上記の媒体と薬剤を使用することは、当該技術分野では公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences ，第18版，（米国，ペンシルベニア州，Mack Publishing Company 社）に記載されている。従来の媒体もしくは薬剤は、活性成分と非相溶性である場合を除いて、本発明の医薬組成物に用いてもよい。補助活性成分も本発明の組成物に混合してもよい。
【００２９】
投与が容易でかつ投与量が均一になるように、組成物を投与単位剤形に配合することが特に有利である。本発明で用いられる投与単位剤形は、治療されるヒト被検体に対して一回の薬用量として適切な物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要な医薬用の担体および／又は希釈剤と組合わせて所望の治療効果を生じるように計算されて予め決められた量の活性成分を含有している。本発明の新規な投与単位剤形の仕様は、（ａ）活性成分の独特の特性と達成される特別の治療効果および（ｂ）このような活性成分を肥満を治療するために配合する当該技術分野に付随する制約によって指定されかつ直接決まる。
【００３０】
この明細書および特許請求の範囲を通じて、特にことわらない限り、“を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”という用語は、述べられたものの全体を含むことを意味するが、他のものを除外することを意味しないと解される。
本発明のその外の詳細は、下記の実施例と添付図面から明らかになるであろう。なおこれらの実施例と添付図面は例示を目的として示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００３１】
【実施例】
図１と図２はそれぞれ雄と雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの１８日間の治療期間の累積体重増加に対するｈＧＨ１７７−１９１ペプチドの効果を示す。これらの動物には、０．１mlの食塩水（●，▼）または合成のｈＧＨ１７７−１９１ペプチド（２００μｇ／kg体重）（○，▽）を毎日腹腔内に注射した。体重の変化は３日毎に測定し、各点は６頭の動物の平均値±ＳＥＭを示す。食塩水の対照グループとｈＧＨ１７７−１９１で治療したグループ間の差は統計的に分析した。^*ｐ＜０．０５および^**ｐ＜０．０２５は対応する対照と比較した。
【００３２】
図３は、ｈＧＨ１７７−１９１ペプチドによる１８日間の治療期間におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの１日当り餌消費量の平均値（ｇ／マウス／日）を示す。４グループの動物の治療法は図１に示したのと同じである。各グループの餌消費量は３日毎に測定し、各点は６頭の動物の平均値±ＳＥＭを示す。いずれの場合もグループ間に有意差は全くみとめられなかった。
【００３３】
図４は、ｈＧＨ１７７−１９１による１８日間の治療後のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの脂肪組織の脂質生合成に対する生体外での効果を示す。脂肪組織は、１％脱脂ＢＳＡと１mMグルコースを含有するクレブス−リンゲル重炭酸緩衝液（Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer)(pH7.4）中で３７℃にて一時間前インキュベーションを行った。前インキュベーションを行った後、組織を〔¹⁴Ｃ〕−グルコース（０．０５μCi／μmol ）を含有する新しい培地に移してさらに９０分間インキュベーションした。
【００３４】
データは¹⁴Ｃ−脂質合成の速度を示し、脂質中に取り込まれた¹⁴Ｃ−グルコース（pmol／mg組織／min ）として表わしてある。数値は、各グループの６頭の動物から得た１２個の測定値の平均値±ＳＥＭである。ｈＧＨ１７７−１９１で治療されたグループと食塩水の対照のグループとの差は統計的に有意であった（^*ｐ＜０．１，^*ｐ＜０．０５）。
【００３５】
実施例
材料と方法
動物と治療法
この試験には１２〜１３週齢の１２頭づつの雄と雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスを使用した。同じ性別の動物を無作為に２グループに分割し、一ケージ当り６頭づつ入れ、オーストラリア、クレートン所在のMonash University 生化学部の動物室中、２５℃の一定室温下、標準の１２時間明暗サイクルに保持した。
【００３６】
マウスには、予め決められた量のマウスペレット（オーストラリア、メルボルン所在のClark King社）を適宜に与え、かつ水には常に自由に近づけるようにした。マウスには０．１mlのｈＧＨ１７７−１９１ペプチド（２００μｇ／kg体重）または同容積の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を毎日１８日間行った。このｉ．ｐ．注射は１ml使い捨てツベルクリン注射器の３０Ｇ×１／２″（０．３１×１３mm）の針で行い、そして注射部位はマウスの腹部の下方左側の１／４区であった。
【００３７】
ペプチドの合成
ｈＧＨ１７７−１９１すなわちLeu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe （２個のCys はジスルフィド結合を形成している）を、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性化反応を利用するＦ_MOC法の手動固相合成法で調製した。そのカップリング反応はニンヒドリン法²⁶を用いて監視した。アセトアミドメチル（Acm ）基を２個のCys 残基の側鎖の保護基として使用した。反応を完了してから、ペプチドを樹脂から開裂させ、次いでAcm 以外の側鎖保護基をReagent K²⁷を用いて除去した。
【００３８】
２個のAcm 基の除去および、同時に、ｈＧＨ１７７−１９１のCys182とCys189間のジスルフィド結合の形成を、シリル−スルホキシド法²⁸を用いて実施した。あるいは直接ジスルフィド結合を生成させる他の方法を用いてもよい。ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した後、得られた酸化されたｈＧＨ１７７−１９１ペプチドの特性決定を行った。すなわちWaters Pico Tag (PITC)システムを用いてアミノ酸分析を行い〔Arg ：1.92 (2), Cys ：測定されなかった (2)，Glu ／Gln ：2.00 (2)，Gly ：2.27 (2)，Ile ：0.84 (1)，Leu ：1.19 (1)，Phe ：1.10 (1)，Ser ：1.54 (2)，Val ：1.84 (2)〕、そして高速原子衝撃質量分析分光計（ＦＡＢ−Ｍａｓｓ）を用いて分子量を測定した〔（Ｍ＋Ｈ）⁺１６５１．９（計算値）に対して＋１６５２．０（実験値）〕
【００３９】
累積体重増加と餌消費量
体重とケージ内に残っている食べられていない餌を測定することによって、累積体重増加と餌消費量を３日毎に測定した。マウスは、体重測定期間中運動を最低にするためふたをしたチャンバー内にいれた。餌消費量のデータは、ケージ中に残っている食べられていない餌の量を元の供給量から差し引いて得た。
【００４０】
血漿中のトリグリセリドと全コレステロールの検定
ｈＧＨ１７７−１９１の最終の投与を行ってから１２時間後に、ナトリウムペントバルビトン（８０mg／kg体重）を用いて実験動物に麻酔をかけた。麻酔薬を投与してから４５分後に、麻酔をかけた動物の尾の静脈から血液試料を採取した。血液試料を２０００×ｇで５分間遠心分離に付してから血漿を血液試料から取り出し代謝検定に用いた。血漿中のトリグリセリドと全コレステロールを酵素−分光測定法によって測定した。
【００４１】
試薬類は、改変グリセロールリン酸オキジダーゼ（ＧＰＯ）−トリンダー型（Trinder's type）呈色反応²⁹またはコレステロールオキシダーゼ−４−アミノアンチピリン法³⁰に基づいたものである。検定はすべて、自動ピペッター、遠心分離分析機および記録式分光光度計を備えたCentrifichem System 400 (Union Carbide社）を用いて行った。Seronorm Lipid（ノルウェーオスローに所在のNycomed Pharma Co.社）を標準物質として用いた。
【００４２】
脂肪組織の重量の測定
無傷の副睾丸の脂肪パッドを単離して測定する手順を、ＧＨ欠乏（１ｉｔ／１ｉｔ）マウスの副睾丸の増殖について予め試験して確立した。この試験では、白色脂肪組織すなわち全副睾丸脂肪パッドまたは子宮傍結合組織の脂肪パッドを、マウスを殺した直後に、すでに報告されているのと同じ方法²²で切取った。その組織を冷生理食塩水中で洗浄し、液体をぬぐいとって重量を測定した。生体外の脂質生合成の検定を行うために、血管なしの脂肪組織の部分を使用した。
【００４３】
脂質生合成活性の検定
脂肪組織中の全脂質への外因性〔¹⁴Ｃ〕−グルコースの取り込み速度を脂質生合成活性の指標として測定した^25,31,32。脂肪組織を各々約２００mgづつのセグメントにスライスし、１％脱脂ＢＳＡと１mMグルコースを含有し、９５％Ｏ₂−５％ＣＯ₂でガス処理をしたクレブス−リンゲル重炭酸（ＫＲＢ）緩衝液（pH７．４）（３７℃）中に入れた。
【００４４】
前インキュベーションを１時間行った後、組織を、〔¹⁴Ｃ〕グルコースを含有する新しい培地（最終比活性０．０５μCi／μmol ）の別の２ml中に移してさらに９０分間インキュベートした（上記条件と同じ）。次いで組織を取り出しＫＲＢ緩衝液で充分洗浄し、脂質をクロロホルム／メタノール混合物で抽出した³³。¹⁴Ｃの放射能をWallac 1410 Liquid Scintillation Counterで計数した。全脂質合成の速度は、１分間に１mgの組織当り脂質中に取り込まれた〔¹⁴Ｃ〕グルコースのpmolとして示した。
【００４５】
統計的分析
試験結果を分析するのにスチューデントのＴ検定法を使用した。データはすべて平均値±ＳＥＭで示した。ｐ値が＜０．０５の場合は統計的に有意であるとみなした。
【００４６】
試験結果
合成物のｈＧＨ１７７−１９１ペプチドによる肥満マウスの継続（ｃｈｒｏｎｉｃ）治療法を、累積体重増加と１日当りの餌消費量を含むいくつかのパラメータの測定値によって評価した。図１と図２は、対照の雌のマウスは、その対応する対照の雄のマウスより、累積体重増加の平均値が高いようであることを示している。このことはＩｎｇａｌｌｓらがすでに報告している観察結果³⁴と類似している。
【００４７】
１８日の治療期間で、適切な対照と比較すると、ｈＧＨ１７７−１９１で治療された雄と雌の動物には、累積体重増加の明白な減少が認められた。これはｈＧＨフラグメントが肥満マウスモデルにおいて体重増加を減少させることを示している。データを一日当りの体重増加として表すと、治療された雄の動物は、その体重増加が０．２２±０．０３ｇ／日から０．１６±０．０４ｇ／日まで減少し、そして雌の動物は０．３０±０．０２ｇ／日から０．２２±ｇ／日まで減少した。治療された雄と雌の動物の両者の１日当り体重増加の平均値は、適切な対照群より約２７％低いことを示した。
【００４８】
しかし、１日当り餌消費量の平均値は、４グループ間に有意差が試験期間を通じて全くみとめられなかった（図３）。１日当りの餌消費量：１日当りの体重増加の比率は、治療された動物と対照動物間に差異があり、すなわち雄のマウスの場合は２５±４から３６±８に変わり、雌のマウスの場合は１８±２から２７±６に変わったことには注目すべきである。これらのデータは、ｈＧＨ１７７−１９１ペプチドによる継続治療によって、餌の消費量に影響を与えることなしに体重増加が減少したことを明確に証明している。
【００４９】
副睾丸脂肪パッドと子宮傍結合組織の脂肪パッドの測定値が示すように、治療されたマウスは、その脂肪組織の重量が、同じ性別の対照と比べて雄の場合は２０％まで雌の場合は１２％まで有意に減少した（表１）。脂質の生合成は、グルコースおよびアセテートのような前駆代謝産物の供給を受ける。したがって、脂質生合成に対するｈＧＨ１７７−１９１の作用は、分離された脂肪組織中の脂質中への〔¹⁴Ｃ〕−グルコースの取り込み量を測定することによって決定した。ｈＧＨ１７７−１９１ペプチドは、脂質生合成を、雄の場合２．８０±０．３３pmol／mg組織／分から２．３３±０．２１pmol／mg組織／分まで阻害し、雌の場合３．３６±０．１３pmol／mg組織／分から２．９９±０．２１pmol／mg組織／分まで阻害した（図４）。
【００５０】
これらの試験結果は、先に観察した脂肪組織の重量と累積体重増加の減少と一致している。表２は、流血中のトリグリセリドとコレステロールの濃度のプロフィールに対するｈＧＨ１７７−１９１による治療の効果を示している。血漿中の全コレステロールは、雄動物の場合、４．４４±０．５６mmol／ｌから３．５２±０．３９mmol／ｌへと有意に減少したが、治療された雌の動物の血漿中のコレステロール濃度は対照よりわずかに低くなったに過ぎない。この点については、雄と雌のマウス間にはｈＧＨ１７７−１９１による治療に対する応答に差があるようである。一方、雄と雌のマウスの両者の血漿中のトリグリセリドの濃度に対しｈＧＨ１７７−１９１は影響を与えなかった。
【００５１】
【表１】

【００５２】
【表２】

【００５３】
参照文献
１．Ultsch, M.H., Somers. W., Kossiakof, A.A. and DeVos, A.M.(1944), J. Mol. Biol. 236: 286-299.
２．Ng, F.M., Bornstein, J., Welker, C., Zimmet, P.Z. and Taft, P. (1974). Diabetes 23: 943-949.
３．Frigeri, L.G., Teguh, C., Lind. N., Wolff, G.L. and Lewis, U.J. (1988). Endocrinology 122: 2940-2945.
４．Moore, W.V., Moore, K.C., McLachlan, C.G., Fuller, N.J., Burnett, G.B. and Frane, J.W. (1988). Endocrinology 122: 2920-2926.
５．Zeisel, H.J., Petrykowski, W.V. and Wais, U. (1992). Horm. Res. 37 (Suppl.2): 5-13.
【００５４】
６．Wabitsch, M. and Heinze, E. (1993). Horm. Res. 49: 5-9.
７．Christman, G.M. and Halme, J.K. (1992) Fertil. Steril. 57: 12-14.
８．Jacobs, H.S. (1992) Horm. Res, 38 (Suppl.1): 14-21.
９．Crist, D.M., Peake, G.T., Loftfield, R.B., Kraner, J.C. and Egan, P.A. (1991) Mech. Ageing Dev. 58: 191-205.
10．Strobl, J.S. and Thomas, M.J. (1994) Pharm. Rev. 46: 1-34.
11．Raben, M.S. and Hollenberg, C.H. (1959) J. Clin. Invest. 38: 484-488.
12．Bengtsson, B.A., Eden, S., Lonn, L., Kvist, H., Stokland, A., Lindstedt, G., Bosaeus, I., Tolli, J., Sjostorm, L. and Isaksson, O.G.P. (1993) J. Clin. Endocrinol. Metab. 76: 309-317.
【００５５】
13．Skaggs, S.R. and Crist, D.M. (1991) Horm. Res. 35: 19-24.
14．Etherton, T.D., Wiggins, J.P., Evock, C.M., Chung, C.S., Rebhun, J.F., Walton, P.E. and Steele, N.C. (1987), J. Anim. Sci. 64: 433-443.
15．Jiang, W.J., Shih, I.L., Tsai, H., Huang, Y.T. and Koh, T.J. (1993). 13th American Peptide Symposium, Edmonton, Canada, P-334 (Abstract).
16．Gertner, J.M. (1993) Horm. Res. 40: 10-15.
17．Davidson, M.B. (1987) Endocrine Rev. 8: 115-131.
18．Tai, P.K., Liao, J.F., Chen, E.H., Dietz, J., Schwards, J. and Carter-Su, C. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21828-21834.
19．Dobo, M. (1975) PhD. Thesis, Department of Biochemistry, Monash University, Australia.
20．McNeillie, E.M. and Zammit. V.A. (1982) Biochem. J. 204: 273-288.
【００５６】
21．Gertner, J.M. (1992) Horm. Res. 38 (Suppl.2): 41-43.
22．Ng, F.M., Adamafio, N.A. and Graystone, J.E. (1990) J. Mol. Endocrinol. 4: 43-49.
23．Ng, F.M. and Heng, D. (1988) Asia Pacific Commun. Biochem. 2: 47-51.
24．Wu, Z. and Ng, F.M. (1993) Biochem. Mol. Biol. Int.30: 187-96.
25．Wijaya, E. and Ng, F.M. (1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 31: 543-552.
26．Applied Biosystems, Inc. (1989). Peptide Synthesizer User Bulletin 29, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif., USA.
【００５７】
27．King, D.S., Fields, C.G. and Fields, G.B. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255-266.
28．Akaji, K.A., Tatsumi, T., Yoshida, M., Kimura, T., Fujiwara, Y. and Kiso, Y. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 4137-4143.
29．Fossati, P., Prencipe, L. (1982) Clin. Chem. 28: 2077-80.
30．Allain, C.C., Poon, L.S., Chan, C.S.G., Richmond, W. and Fu. P.C. (1974) Clin. Chem. 20: 470-475.
【００５８】
31．Salem, M.A.M. and Wolff, G.L. (1989) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 191: 113-123.
32．Harris, D.M., Dunshea, F.R., Bauman, D.E., Boyd, R.D., Wang, S.Y., Johnson, P.A. and Clarke, S.D. (1993) J. Anim. Sci. 71: 3293-3300.
33．Folch, J., Lees, M. and Sloane-Stanley, G.H. (1957) J. Biol. Chem. 226: 397-503.
34．Ingalls, A.M., Dickie, M.M. and Snell, G.D. (1950) J. Hered. 41: 317-318.
【図面の簡単な説明】
【図１】雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの１８日間の治療期間の累積体重増加に対するｈＧＨ１７７−１９１ペプチドの効果を示すグラフである。
【図２】雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの１８日間の治療期間の累積体重増加に対するｈＧＨ１７７−１９１ペプチドの効果を示すグラフである。
【図３】ｈＧＨ１７７−１９１ペプチドによる１８日間の治療期間におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの１日当り餌消費量の平均値（ｇ／マウス／日）を示すグラフである。
【図４】ｈＧＨ１７７−１９１ペプチドによる１８日間の治療後のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスの脂肪組織の脂質生合成に対する生体外での効果を示すヒストグラムである。

Claims

ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基177−191から成るペプチドを含有する、肥満の治療剤。
１又は複数の医薬として許容されるキャリヤー及び／又は希釈剤、ならびに有効量のペプチドを含んでなる、肥満を治療するための医薬組成物において、前記ペプチドが、ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基177−191から成るポリペプチドである、ことを特徴とする医薬組成物。
ヒトにおける肥満の治療のための医薬の製造における、ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基177−191から成るペプチドの使用。
ヒトにおける肥満の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の治療剤の使用。