JPH06507715A - 配位子作用薬および拮抗薬の選択 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 配位子作用薬および拮抗薬の選択 本発明はポリペプチド配位子と受容体の相互作用の分野に関する。具体的には、 本発明はポリペプチド配位子に関する拮抗薬と作用薬を選別およびスクリーニン グする分野に関する。

背景技術の説明 配位子（リガンド）が誘発する受容体のオリゴマー化は、細胞外配位子結合ドメ インを含有するチロシンキナーゼ受容体の大きなファミリーにとって信号変換の 作用機序であると提唱されてきた（概略にライてはＹａｒｄｅｎ、　Ｙ、ら、　 Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ５７：４４３−４７８（１９８８）　；　 Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、ら、Ｃｅ１１６１：２０３−２１２（１９９０）を参照 のこと）。これらのモデルでは１受容体（Ｒ）につき１ホルモン分子（またはサ ブユニツト）（Ｈ）の結合がＨ２Ｒ２複合体の形成を誘発すると考えられている 。例えば架橋性および非解離性の電気泳動的研究は、表皮成長因子（ＥＧＦ）が ＥＧＦ受容体の二量化を促Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５８：８４６ −８５３（１９８３）　：　Ｙａｒｄｅｎ、　Ｙ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ、@２６：１４３４−１４４２（＋９ ８７）　；　Ｙａｒｄｅｎ、　Ｙ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：１４ ４３−１４５１（１９ｇ？））。インスリン受容体（Ｋａｈ氏B Ｃ，Ｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７５：４ ２０９−４２１３（１９７８）　；　Ｋｕｂａｒ　Ｊ、ら、@Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒ Ｓ２８：］］０８６−１０９３１９８９）　；　Ｈｅｆｆｅｔｚ、　Ｄ、ら、　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６１　：８８９−８９４（P９８６））、血小 板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（Ｈｅｌｄｉｎ、　Ｃ，Ｈら、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４　：８９０５−８９１２（１９８９）　：　Ｒａｔ ｎｍａｃｈｅｒ、　Ａ、ら、　ＥＩＩＢＯＪ、　８：２４８９−２４９５（１９ ８９）　；　５ｅｉｆｅｒｔ、　Ｒ，O、ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　２６４　：８７７１−８７７８（１９８９））およびインスリン様成長因 子（ＩＧＦ−１）受容体（Ｉｋａｒｉ。

Ｎら、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　２：８３１−８３７）を含む他の チロシンキナーゼ受容体の研究（よ、受容体のオリゴマー化がその生物学的効果 と強く共役していることを示してＬＸる。

他のグループは最近、その細胞外結合ドメインと錯化したポリペプチドホルモン を結晶化させている（Ｌａｍｂｅｒｔ、　Ｇら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２６４　：　１２７３０−１２７３６（１９８９）　；@Ｇｕｎｔｈ ｅｒ、　Ｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：２２０８２−２２０ ８５（１９９０））。しかし、これらの受容体または他の受容体において配位子 が誘発する変化に関する構造上の摂動と必要条件のより詳細な分析は、これらの 膜結合系の複雑さと、高度に精製された天然の受容体または組換え受容体の量が 適当でないという理由によって妨害されてきた。

精製された受容体が利用可能な場合、その検定法はしばしばホルモン−受容体複 合体の性實が認識されないほどに組織化されていた。米国特許第５０５７４１７ 号では、組換えｈＧＨ受容体の細胞外ドメイン（ｈＧＨｂｐ）またはｈＧＨ結合 タンパク質への結合に関する非標識ｈＧＨと”Ｉ−ｈＧＨの競争を用いてｈＧＨ 結合検定を行い、形成した複合体を沈殿させるために、得られた複合体をｈＧＨ ｂｐに対する抗体＋ポリエチレングリコールで処理している。これらの免疫沈殿 検定法はｈＧＨがｈＧＨｂｐと１−１の複合体を形成することを示唆した。この 免疫沈殿検定法は結合した”Ｉ−ｈＧＨの量を正しく検出したが、誤って１：１ のモル比を示した。

ｈＧＨの受容体と結合タンパク質に関する様々な固相検定法が使用されてきた。

そのような検定法は結合したｈＧＨの量を検出したが、受容体に対するｈＧＨの モル比を検出するものではなかった。固相またはｈＧＨ受容体を含有する膜画分 を用いる結合検定法は、活性な受容体の総量および／または結合した内因性ｈＧ Ｈの量を検出することができなかったので、受容体に対するｈＧＨのモル比を決 定するには適していなかった。ＥＧＦに関するものなど、先の研究に基づいて、 ｈＧＨ−受容体複合体はＨ２Ｒ２四量体であろうと推測されていた。

ヒト肝臓カラクローニングされたｈＧＨ受容体（Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、　ｆら、　 Ｎａｔｕｒｅ、　３３０：５３７（１９１１１７））は１つの細胞外ドメイン（ 〜２８　ｋ　Ｄ）、貫膜セグメントおよび細胞内ドメイン（〜３０　ｋ　Ｄ）を 有し、既知のチロシンキナーゼまたは他のタンノくり質のいずれとも相同でない 。それにもかかわらずｈＧＨ受容体の細胞外部分はプロラクチン受容体（Ｂｏｕ ｔｉｎ、　Ｊ、　１１ら、Ｃｅ１ｌ　６９（１９８８））の細胞外ドメインに構 造的に関連しており、概していえば少なくとも８つの他のサイトカインおよび関 連受容体に構造的に関連している。大腸菌内で発現されるｈＧＨｂｐは１リツト ルにつき数十ミリグラム分泌されている（Ｆｕｈ、　Ｇ、ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、　２６５：３１１１−３１１５（１９９０））。高度に精製され たｈＧＨｂｐは血清中に認められる天然のｈＧＨｂｐと比較して、ｈＧＨについ て同じ特異性と高い親和性を保持している（Ｋｏ＝０．４ｎＭ）。

ｈＧＨは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチンおよび成長ホルモンの他の遺伝的変 種および種変種を含む相同なホルモンファミリーの一構成要素である（Ｎｉｃｏ ｌｌ。

Ｃ１Ｓら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　７　：　１６９（１９８ ６））。ｈＧＨは広範な種特異性を示し、クローン化された休園性受容体（Ｌｅ ｕｎｇ、　Ｄ、　ｆら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５３７）またはプ ロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ、　Ｊ、　Ｍら、　Ｃｅ１１．５３：６９）の いずれかに結合する点で、これらの中では珍しいものである。クローン化された ｈＧＨの遺伝子は大腸菌中で分泌型とシテ発現されており（Ｃｈａｎｇ、　Ｃ， Ｎ、ら、Ｇｅｎｅ　５５：１８９（１９８７））、そのＤＮＡとアミノ酸配列変 種に報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８１　：５４４ （１９７９）　；　Ｇｒａｙら、　Ｇｅｎｅ３９・２４７（１９８５））。ｈＧ Ｈの三次元構造はこれまで利用できなかった。しかしブタ成長ホルモン（ｐＧＨ ）に関する三次元折り畳みパターンが中ぐらいの解像度と精度で報告されティる （Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ、　Ｓ、　Ｓ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＪＳＡ、　８４@：６４３４　（１９ ８７））。相同体走査（ｈｏｍｏｌｏｇ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異導入法（ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１３３０．１９８９）によ ってｈＧＨ受容体および抗体結合部位が同定されている。Ｎ−末端アミノ酸が欠 失または変化しているＧＨは知られている。Ｇｅｒｔｌｅｒら、　Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏｇｙ　１１８ニア２０（１９８６）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２１：４１４（１９８７）、Ｂｉ獅р■秩A　Ｍ ｏ１．　Ｅｎｄｏ、　、　７：１０６０−１０６８（１９９０）およびＷ０９０ １０５１８５を参照のこと。ｈＧＨの拮抗薬変種はＣｈｅｎら、　Ｍｏ１．　Ｅ ｎｄｏ、　、　５（１０）　：１８４５（１９９１）とその参考書目に記載の文 献およびＷ０９１１０５８５３に記述されている。ｈＧＨ変種はＣｕｎｎｉｎｇ ｈａｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４：１０８１（１９８９）および５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４３：１３３０−１３３６（１９８９）に開示されている。

多くのポリペプチド配位子のそれらの受容体との相互作用の様式は未だ不明のま まであるから、所望の特性を達成するべ（それらの配位子のアミノ酸配列変種を 工作することは困難であった。基本的には、おそらくある場合には同様に作用す る配位子または動物相同体の相同性分析や、例えば断片（例・トリブシン消化断 片）の分析からもたらされる指針の下に、無作為に変異を導入してきた。次いで 、所望の活性（例・作用薬または拮抗薬活性）について候補物質をスクリーニン グし、できた。これらのスクリーニング法は単調で退屈であり、がっ、費用のか がるものであった（例・形質転換動物の使用（Ｗ０９１／０５８５３））。候補 物質の選択の効率を改善する方法がめられている。具体的には、拮抗薬または作 用薬であると思われる候補物質に集中させる方法がめられている。拮抗薬は天然 の配位子の生物学的活性を抑制、阻害または妨害する物質であり、一方、作用薬 は活性自体は天然の配位子より強い活性を示すが、それ自身は生物学的活性をも たない。

したがって本発明の目的は作用性または拮抗性ポリペプチド配位子を効率よく選 別するための改善された方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、その受容体と逐次的に１．２の複合体を形成する配 位子を検出する方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は上述の１．２配位子一受容体複合体の形成を妨害また は促進する能力について候補物質を検定することである。

さらなる目的は作用薬または拮抗薬として作用することができるポリペプチド配 位子のアミノ酸配列変種を提供することである。

本発明のその他の目的、特性および特長は下記の説明と添付の請求の範囲を考膚 すればより明白になるであろう。

発明の要約 我々は予想外にも、成長ホルモンとそれらが属する立体配座的な配位子の一群が それらの受容体と１．２の複合体を形成することができ、その場合、第１の配位 子部位（部位１）が１つの受容体に結合し、次いで第２の配位子部位（部位２） がもう１分子の受容体に結合することによって１　２の複合体を与えることを発 見した。本発明を適用することができる配位子は、両末端が非螺旋アミノ酸配列 で終わっていて、かつ、非螺旋アミノ酸配列によって分断されている４つの両親 媒性逆手行アルファ螺旋ドメインを含有する単量体配位子である。以下に詳述す るように、成長ホルモン、プロラクチンおよび胎盤性ラクトゲンを用いた我々の 研究への類比によって、部位１および／または２にアミノ酸配列変異を導入する ことによって上記配位子の作用性または拮抗性アミノ酸配列変種を効率よく設計 することが可能になった。

配位子作用薬または拮抗薬である物質についてスクリーニングするために、２部 位複合体形成検定法を用いる。このような物質は基本的には制約がなく、配位子 のアミノ酸配列変種および結合タンパク質または受容体変種と共に、非タンパク 質性有機化合物が含まれる。

このようなアルファ螺旋配位子の新しいアミノ酸配列変種についても記述する。

具体的には、部位２における受容体への配位子の親和性を減少もしくは排除する アミノ酸配列突然変異を部位２に含む、ポリペプチド配位子に関する拮抗薬を提 供する。理想的には、該配位子拮抗薬類縁体は部位２における受容体への親和性 か低いか、もし《はそのような親和性を有さす、部位１における受容体への親和 性が増大しているであろう。

また、一部位または両部位の配位子親和性を増大させる突然変異を部位１および ／または部位２に有する作用薬配位子アミノ酸配列変種をも本明細書に開示する 。好ましい態様として、二量体複合体中の配位子の平均滞在時間が、所望の細胞 応答を達成するためにその複合体が必要とする時間と同じかそれ以上であるよう に、両部位の速度定数を選択する。配位子のポリペプチド作用薬変種は、（ａ） 配位子に突然変異を導入して作用薬候補を作成し、（ｂ）その候補物質が第１の 配位子部位を介して受容体に結合する親和性を決定し、（ｃ）その候補物質が第 ２の配位子部位を介して受容体に結合する親和性を決定し、（ｄ）その候補物質 が第１および第２部位の一方または両方で天然の配位子よりも高い親和性で結合 する場合にそれを作用薬として選択することからなる方法によって同定される。

本発明によれば、ポリベブチト配位子の作用薬または拮抗薬候補を検出する方法 であって、該配位子が通常逐次的に、まず第１の配位子部位を介して受容体ボリ ペプチドに結合し、次いで第１の部位とは異なる第２の配位子部位を介してもう 】つの受容体ポリベブチドに結合し、配位子の第２の受容体結合部位における受 容体に関するポリベブチド配位子の親和性に対する該候補の効果を決定すること からなる方法が提供される。部位１の相互作用は後述するＭａｂ５などの部位２ 遮断抗体を用いる免疫沈殿によって決定される。あるいは、実質的に受容体と１ 　１の複合体のみを形成する野生型配位子の量を決定し、次いで受容体に関して 上記の比率で天然の配位子と競合するという候補物質の能力を決定する。３要素 複合体を形成するという候補物質の能力を追跡することによって部位２の相互作 用を検定する。

候補物質が配位子のポリペプチド類縁体である場合には、部位２におけるその類 縁体の結合の欠如が拮抗薬活性と正の相関を示す。受容体部位２に天然の配位子 より高い親和性で結合する能力は作用薬活性と相関する。拮抗薬活性と作用薬活 性は共に、部位１において天然の配位子より高い親和性で結合するという候補物 質の能力と正に相関する。部位１および／または部位２に対する天然の配位子の 結合を促進または抑制するというそれらの能力について、小分子または他の非類 縁体候補物質を検定する。拮抗薬は、部位２および／または部位１（好ましくは 部位２）における天然の配位子一受容体結合を妨害するというそれらの能力につ いてスクリーニングする。これは、例えばその配位子の部位２ｔｉ傷変種を陽性 対照として用いて、部位１における配位子受容体結合を抑制しないが、部位２結 合を妨害する拮抗薬の同定を可能にする。

候補物質の効果は、天然のポリペプチド配位子の存在下で、もしくは天然のポリ ベブチド配位子の活性と比較して、測定することができる。第１の選択肢では、 野生型配位子による受容体相互作用に対する候補物質の効果を測定する。第２の 選択肢では、野生型配位子の活性を陽性対照として使用し、候補物質（通常は配 位子のアミノ酸配列変種）の受容体結合特性を野生型配位子の非存在下で測定す る。しかし一般的には、野生型配位子の存在下における競争型検定法として、作 用薬または拮抗薬候補に関する検定を行うことが最善である。

我々は、ＧＨ受容体を結合することができる選択された抗体がＧＨの拮抗薬また は作用薬として作用することをも決定した。したがって成長ポルモンの欠損また は過剰の治療におけるＧＨの拮抗性または作用性のための方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１ａおよび図１ｂ　図１ａ　：　ｈＧＨと｝ｌＧＨｂｐの間の複合体の結晶。

１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭＮａＣＩで平衡化した セ７７デックスＧ７５−１００サイズ排除カラムでｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ複合体を 精製することによって、この複合体をｍ製した。この複合体を含有する高分子量 ピークを遊離のｈＧＨから分離し、貯蔵し、濃縮した。これらの成分を１ｍ１／ 分の流速での直線的なアセトニトリル勾配で無勾配的（図１ｂ）に溶出させた。

矢印の時点で勾配を開始し、これを破線で示す。２１４ｎｍでの吸光度を実線で 表す。

図２．４：ｌ、３・１、２・１、１：１、０．５：１に対応するさまざまな比率 のｈＧＨｂｐとｈＧＨのゲル濾過クロマトグラフィー。各混合物中のｈＧＨｂｐ とｈＧＨ（ｈＧＨをそれぞれ２０μＭおよび４０μＭとした１：１おヨヒ０．　 ５１の比率を例外として１０μＭに固定した）の濃度は２８０ｎｍの吸光度に基 づく。１００μＪのタンパク質試料をセフ７ロース１２ＦＰＬＣ力ラム（ファル マノア）に適用し、溶出させた。ピークを２８０ｎｍでの吸光度について監視し た。

図３，様々な抗ｈＧ｝Ｉｂｐモノクローナル抗体によって複合体を沈殿させた場 合のｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合に関するスキャッチャード分析。

図４．ｈＧＨｂｐと、ｈＧＨｂｐに結合するように工作したヒトプロラクチン（ バネルＡ）またはヒト胎盤性ラクトゲン（バネルＢ）の変種もしくはｈＧＨ（バ ネルＣ）との２：１比のゲル濾過クロマトグラフィー。ゲル濾過クロマトグラフ ィーによって試料を分析した。

図５．ｈＧＨｂｐによるｈＧＨの滴定熱量測定。ｈＧＨｂｐ（１０ｍＭ　Ｔｒ　 ｉｓ（ｐＨ８．０）中１５μＭ濃度）を１．３７ｍｌ滴定セル（ＭＣ２滴定熱量 計，　Ｍｉｃｒｏｃａｌ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ．　マサチューセッツ州ノ ーサンプトン）に入れ、２５℃で平衡化した。この溶液にｈＧＨ（１０ｍＭＴｒ ｉｓ（ｐＨ８，０）中４３７　μＭ）を４μＬづつの増加単位で添加した。各注 入間の間隔を５分間とし、各注入を８秒間にわたって行った。

図６．ｈＧＨとｈＧＨｂｐの２つを１＝１の比率で混合する前（−）および後（ ・・・・）のｈ　Ｇ　ＨとｈＧＨｂｐの個々のスペクトルの和の遠ＵＶ（／＜ネ ルＡ）または近ＵＶ（パネルＢ）における円二色スペクトル。遠ＵＶおよび近Ｕ Ｖスペクトルをそれぞれ０．０１ｃｍおよび１．　Ｏｃｍセル中で０．２μｍお よびＱ、５ｏｍ間隔で集めた。

図７．ｈＧＨとｈＧＨｂｐの２つを１・１の比率で混合する前（−）および後（ ・・・・）のｈＧＨとｈＧＨｂｐの個々のスペクトルの和の蛍光放射スペクトル 。

図８．ｈＧＨの連続的添加による１０ｎＭ　５２３７Ｃ−ＡＦのホモクエンチン グ。インキュベーションの後、島津ＲＦ５０００Ｕ分光蛍光光度計を用いて４９ Ｑｎｍの励起λと５１２μｍの放射λ（バンド幅はそれぞれ３μｍおよびＩＯｎ ｍである）て蛍光測定を行った。

図９．ｈＧＨが誘発する５２３７Ｃ−ＡＦの三量化に関するＩＣｓ。の決定。結 合緩衝液（２０ｍＭ　ｔｒｉｓ・Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）、０．１％ＢＳＡ、０． ０２％ＮａＮ５）中の３２３７Ｃ−ＡＦ（図８に記述のように調製したもの）の 連続的希釈液（３倍）を２０ｎＭから０．０８　ｎＭの範囲にわたって調製し、 １．Ｏｍｌづつ検定管に分注した。同様に１μＭから０００４μＭの範囲１；わ ｔこってｈＧＨを連続的に希釈した。ｈ　Ｇ　Ｈ希釈液の一部（１０μ］）（Ｓ ２３７Ｃ−ＡＦに対して１：２モル比のｈＧＨを与える）と緩衝液のみを５２３ ７Ｃ−ＡＦ含有検定管６二加え、混合し、平衡化するために暗所で２５℃で５時 間インキュベートしｔこ。平衡イヒの後、上述（図８）のように蛍光を測定した が、ここでは励起ノくンド幅をｌＱｎＭとした。４変数曲線フィツトから決定さ れる半最大ΔＦ　／　Ｆ　ｅ値を与えるｈＧＨの濃度としてＩｃｓ。値を計算し た。６回の独立した実験の平均から０．５４（＋／−０，１４）ｎＭのＩＣ５ｏ を計算した。

図１０　過剰のｈＧＨまたはｈＧｉ（突然変異体による、ｈＧＨが誘発する５２ ３７Ｃ−ＡＦ二量化の反転。５２３７Ｃ−ＡＦとｈＧＨをそれぞれ１０ｎＭと５ ０Ｍの濃度で結合緩衝液中に希釈し、１　Ｏｍｌづつ検定管に分注した。次に、 ｈＧＨ１突然変異体または緩衝液のみのいずれかの連続的希釈液を加え、平衡化 のためにその混合物を暗所で２５℃で５時間インキュベートし、図１について記 述したように蛍光を測定した。データ点は３つ１組の測定の平均であり、・はｈ ＧＨ、ムはに１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ、閣はｈＰＬリクルートを表す。誤差線はＳ ＥＭを与える。

図１１．ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２の結晶構造。中央上部の濃い線はｈＧＨ分子を 表す。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子に結合しており、その１つは左側 にあり、もう１つは右側にある。これらのｈＧＨｂｐ分子のそれぞれは一本鎖に よって連結した２つのドメインを有し、上部ドメインはｈＧＨ分子と同じ高さに あり、他のドメインは垂直に配向し、図の下に向かって突き出ている。ｈＧＨｂ ｐのこれら最後の２つのドメインは最底部で互いに接触している。

図１２．成長ホルモン受容体に特異的な抗体に対する応答としての体重増加。

モノクローナル抗体Ｍａｂ２６３を８匹のラットに投与しく１．０５ｍｇ／ｋｇ ）、対照群には賦形剤のみを投与した。体重測定を毎日行った。

図１３．ｈＧＨ−ｍＧ−Ｃ８Ｆノ＼イブリッド受容体（９）を含有するＦＤＣ− Ｐｌ細胞の、ｈＧＨが誘発する増殖。ＩＯＵ／ｍｌ　ＩＬ−３，１０ａＭβ−メ ルカプトエタノールおよび１０％牛脂児血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭ１１６ ４０培地中て５％ＣＯ２，３７℃で細胞を成長させた（８）。ＩＬ−３を含まな い同じ培地で細胞を洗浄し、増大する濃度のｈＧＨで１８時間処理する前に、４ ×１０５／ｍ１　（０）、２×１０５／ｍｌ（釦および１×１０５／ｍｌ（ロ） の密度で１００μｌづつ９６穴プレートに接種した。ＤＮＡ合成を測定するため に、培地２０μｍ中１μＣｉ／ウェルの添加によって細胞を［３Ｈ］−チミジン でノくルス処理した。４時間後、細胞を収集し、ガラスフィルター上で洗浄した 。シンチレーションカクテル２ｍｌを加え、ベックマンＬＳＩ７０１シンチレー ション計数器で計数した。各データ点は３つ１組の測定の平均値を表し、誤差線 はＳ、Ｄ、である。

図１４．ｈＧＨが誘発する細胞増殖のｈＧＨ変種による拮抗。細胞を図１３と同 様に調製し、１μＭｈＧＨ＋増大する・量の部位１突然変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ １７６ＡＸ・へ部位２突然変異体（Ｇ１２ＯＲＸ口）、組合わされ増進された部 位１突然変異体／部位２突然変異体（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４に／Ｅ１７４Ａ／Ｇ１２ ０Ｒ）（−）および野生型ｂＧＨ（○）と共にインキュベートした。

図１５８９図１５ｂおよび図１５ｃはＩ　Ｌ−６拮抗薬または作用薬を調製する 際の変異に適した推定α螺旋部位のホイールプロットを表す。これらの図の番号 付与はＮ−末端ブレ残基から開始するものであることに注意のこと。

好ましい態様の説明 本発明の方法は作用薬ポリペプチド配位子または拮抗薬ポリペプチド配位子の同 定を容易にする。一般に本発明は下記の如〈実施される。

第１に、受容体との１２の３要素後合体に関与する配位子を同定するために、配 位子と受容体の会合の化学量論を決定する。会合の化学量論は下記の方法の１つ を用いて生理学的条件下で受容体に対する配位子の比率を測定することによって 決定される。例えばＸ線結晶学、セパロースゲルでのサイズ排除クロマトグラフ ィー、抗体結合試験、走査熱量測定、ＢＩＡ−コア分析、ＣＤスペクトル分析ま たは蛍光スペクトル分析。配位子−受容体複合体のＸ線結晶構造は有用であるが 、決して化学量論を決定するために必要なわけではないことに注意すべきである 。好ましくは、本明細書にさらに記述するフルオレセイン・ホモクエンチング法 を使用する。この方法では、滴定によって決定されるように２つの受容体分子が 配位子によって結合された時に、フルオレセイン分子が互いにクエンチ（消光） し、その溶液の蛍光が減少するように位置するフルオレセインで受容体を標識す る。本明細書に記述する分析技術それ自体はよく知られており、当業者の技術の 範囲内である。

好ましくは、受容体の細胞外ドメインを化学量論分析に使用する。即ち、貫膜ド メインが欠失しているか、さもなくば膜挿入または疎水性会合の能力がな（なっ ている受容体変種を用いて、この分析をインヒドロで溶液中で行う。随意に細胞 質領域を欠失させてもよい。そのような受容体は既知であり、組換え細胞培養中 で発現させて、そこから回収することができる。

受容体が１より多数のポリペプチド鎖を含有する時には、その受容体調製物が受 容体ポリペプチド鎖のすべてを含有することが好ましい。また３要素後合体が２ つの異なる受容体鎖からなる時（例えばアルファ鎮とベータ鎮を含有するＩＬ− ２または１Ｌ−３受容体複合体の場合など、例：　Ｔｅｓｈｉｇａｗａら、Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　１６５：２２３−２３８［１９７μｌ）には、両鏡 を用いて分析を行う。この例では各受容体鎮に対する結合が１つの順序のみで逐 次的に進行する。会合の順序は異なる受容体分子を関与させると容易に決定され る。

いくつかの受容体が１．２複合体を形成し得るが、これらの受容体はそれぞれ１ より多数の鎖を含有し得る。配位子がそれらの鎖の１つにのみ結合し、他の鏑が 結合鎖の適性な立体配座の維持に必要でない場合には、長鎖受容体の使用は必要 でなく、配位子結合に必要な鎖が存在するだけでよい。

１：２の複合体を形成する配位子は２つの分離した結合部位によってそれらの受 容体に結合する。受容体がこれら２つの部位に逐次的に、即ち、まず１つの部位 （部位１）に、それから他の部位（部位２）に結合することを発見したことは本 発明の重要な特徴である。逆の順序で起こることは観測されていない。この理解 は拮抗性配位子の調製にとってとりわけ重要である。第１部位に関する配位子の 親和性を増進しないとしても保存することが重要である。さもなくば、配位子類 縁体は受容体に全く結合しない。他方、第２部位結合の効果的な破壊または阻害 は拮抗薬活性を意味する。

本発明に従って配位子結合部位とそれらの付加順序を決定する。以下に詳述する 方法で成長ホルモンの立体配座と候補配位子の立体配座を比較することによって 、部位１と部位２が同定される。それらはアラニン走査突然変異法や他の系統的 突然変異法（例・カセット突然変異法、ＰＣＲ突然変異法またはａｌａ走査）に よってより完全に解析される。立体配座分析は変種を作成してスクリーニングす る前に潜在的な部位１残基および部位２残基の範囲をかなり減縮することを可能 にする。

いずれの場合にも、不能にする部位２の突然変異と機能的な部位１を伴う配位子 類縁体を、３要素配位子・受容体複合体を形成させ得ないことによって同定する 。ただしそのような変種は受容体と１・１の複合体を形成させ得るであろう。

他方、不能にする部位１の突然変異と機能的な部位２を伴う類縁体は受容体に全 く結合できないであろう。この決定のために使用される検定法はポリペプチドの 会合を検出する検定法のいずれかであり、後述するホモクエンチング検定法やゲ ル濾過などを使用することができる。

立体配座分析は両親媒性アルファ螺旋単量体配位子の一部から配位子候補を選択 することを容易にする。このような配位子は成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンお よびプロラクチンと立体配座的に関連するので、成長ホルモンの構造との類推に よってこれらの配位子の部位１および部位２を決定することは容易である。皮肉 なことに、ＥＰＯ、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ＧＭ −Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆおよびインターロイキン２．３．４．６および７などの配 位子の一部アミノ酸配列は成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンまたはプロラクチン との相同性が乏しい。しかし、（一般にサイトカインまたはホルモンである）こ れラノ配位子を従来の立体配座構造原理（Ｂａｚａｎら、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 Ｔｏｄａｙ、　１１　：３５０−３５４（１９９１）、　Ｃｈｏｕら、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１３：２２２［１９７４］）によって分析すれば、若干 の共通する構造上の特長を示すことが分かる。最も注目すべきことは、それらが それぞれの前と後ろに実買上螺旋でない構造（螺旋間のループおよびそのタンパ ク質末端のＮ−末端およびＣ−末端配列）を伴う４つの主たる両親媒性アルファ 螺旋によって特長づけられることである。主たるアルファ螺旋は典型的には約１ ５〜３０残基長である。これらをＮ−末端から順にＡ−Ｄと命名する。短い螺旋 セグメントは主たる螺旋を結合するループ中に存在し得る。

この種類の配位子のアルファ螺旋は両親媒性性である。即ち、これらは一般に螺 旋の一方の側に疎水性残基を含有し、螺旋の他方の側に親水性残基を含有する。

螺旋の連続する各３６残基を螺旋状はしごの意味で１回転（ターン）と呼ぶ。螺 旋の末端ではいくらかの微小なほつれが予期されるべきである。即ち、各アルフ ァ螺旋末端は使用するアルゴリズムと当業者の判断に応じて約１〜３残基変化す るであろう。この配位子群間の総合的な相同性の欠如にもかかわらず、いくつか の保存された残基が上記螺旋中に認められ、これらを用いて成長ホルモンと配位 子を構造的に並列させる際の補助とすることができる。

成長ホルモンおよび相同な配位子プロラクチン並びに胎盤性ラクトゲンに関する 我々の分析は、４要素アルフア螺旋サイトカインおよびホルモンのこの群の部位 ２が基本的に（ａ）Ｎ−末端から螺旋Ａの最初の３〜４回転までに延びる配列と （ｂ）螺旋Ｃのほぼ中央の４〜５回転とからなることを立証した。したがって部 位２は非連続的であるが、両セグメントはそのタンパク質中で密接な近位にあり 、その様式で受容体と相互作用する。部位２ドメインのいずれかもしくは両方を 突然変異させる。突然変異のために候補残基を選択する際には一般に螺旋疎水性 残基を無視する。ただし時としてそれらは該候補の機能的保全に影響を与え得る 。さらに部位２内の残基のすべてが受容体結合に機能的または構造的な関与を示 すわけではなかろう。しかし、本明細書に記載の原理の適用は、拮抗薬活性また は作用薬活性についてスクリーニングする必要がある候補物質の数を著しく減少 させる。

拮抗薬変種は、以下の詳述するように、候補位置における天然の残基の電荷、疎 水性または嵩高さの本質的な変化によって特長つけられる。これは一般に問題の 残基を置換するか、もしくはそれを削除することによって達成される。場合によ っては、機能的または構造的に活性な部位２残基に隣接する残基を挿入すること によって所望の効果を達成することができる。拮抗薬の製造における目標は部位 ２における受容体結合を排除すること、もしくは天然の配位子との関連で少なく とも２倍はそれを減少させることである。これは、受容体との構造的な相互作用 （水素結合、塩橋形成、疎水相互作用など）に重要である１またはそれ以上の天 然の残基の特長を激しく変化させることによって最も効果的に達成される。その ような残基を接触残基と呼ぶ。別法として、受容体と直接接触しない位置にある が、接触相互作用に関与する残基の適性な配ｊｉｌｔことって重要である残基を 選択する。そのような残基を機能的残基と呼ぶ。

典型的な場合、約２０個を越えない位置（残基）が部位２変種（疎水的両親媒性 性残基を除く）を作成する際に潜在的に重要であろう。これらのうち各アミノ酸 群の代表的な構成要素のみを使用して候補物質を作成する。即ち、通常（ま、部 位２内の各残基について残り１９種の天然に存在する残基を表す１９変種をスフ １ノーニングする必要はない。その代わりに残基群の代表的構成要素を選択する 。一般にこれらの群は、（ａ）正に荷電した残基（Ｋ、ＲおよびＨ）、（ｂ）負 ；こ荷電した残基（ＤおよびＥ）、（ｃ）アミド（ＮおよびＱ）、（ｄ）芳香族 （Ｆ、ＹおよびＷ）、（ｅ）疎水性（Ｐ、Ｇ１、へ、■、ＬＳ　ＩおよびＭ）並 び１こ（ｆ）シト荷電親木性残基（ＳおよびＴ）である。さらに拮抗薬候補を作 成する際には５種類の代表的残基をスクリーニングするよりはむしろ、典型的に は１〜３種類だけを選択することで充分である。なぜなら適当な残基における本 質的な変異はしλずれも部位２を不能にするてあろうからである。下記の表１ａ を参照のこと。最も極端な置換１ま特長の相反する組み合わせを選択することに よって作成される。例え（ｆ天然の残基カベアラニン（小さい疎水性残基）であ るならば、極端な置換（ま親水性で嵩高く荷電してしするグルタミン酸であろう 。さらに進化論的な多様性を示すもの力１ら残基を選択する。

即ち、ある動物種の配位子がｈｕ受容体部位２１＝結合すること力（できなし１ 場合（＝は、変異残基を候補として選択する。拮抗薬を含有する可能性の高ＬＸ 突然変異体の充分なプールは典型的な場合、約２０から約６０までの部位２変種 を含有するであろう。部位２における作用薬候補を選択するに１ま微／］＼相違 法を用（洩る。部位１に関する下記の議論を参照のこと。このようなブールの作 成とスフ１ノーニングは過度の実験を必要とせず、充分に当業者の技術の範囲内 であろう。

置換アミノ酸の選択でもその残基がアルファ螺旋構造内１こ位置する力λ、１Ｉ ｌ−螺旋構造内に位置するかを考慮すべきである。その残基カベ螺旋回転の一部 である場合には、その置換がプロリンやグリノンなどの螺旋破壊残基でなＬｌこ と力（好ましし１゜他方、プロ１ルまたはグリノンが野生型螺旋内↓こ認められ る残基である場合０ゎ１ま、それらを自由に置換することができる。なぜならそ れらの置換は螺旋立体配座を不安定化しないだろうからである。

部位１も非連続的な部位である。これは（ａ）螺旋Ａの中央４０％（おそらく螺 旋Ａ中の部位２のＣ−末端と重複している）内、（ｂ）螺旋Ａと螺旋Ｂを連結し ているループのＣ−末端２／３（好ましくはＣ−末端１／２）および（ｃ）螺旋 りのＣ−末端１／２（好ましくは１／３）に位置する３つのセグメントからなる 。比率はアミノ酸残基の直線的な配列について述べている。部位２拮抗薬突然変 異で用いた方法とは対照的に、部位１ドメイン内の残基を改変せずに残しておく （突然変異によって部位２のみを不能にする拮抗薬の場合）か、改変するとすれ ば、結合を破壊しないように部位１の変異を選択する。その理由は、部位１を不 能にすることはほとんどの態様で望ましくないからである。その代わりに部位１ の親和性を約１０％から２倍以上にまで増大させることが目標である。したがっ て一般的にはこれらのドメイン内の残基を（欠失させたり隣接する挿入に付すの ではなくて）置換し、立体障害決定基（その残基の嵩高い側鎖が、特に荷電して いる場合に、配位子−受容体結合相互作用を妨害または阻害するもの）を同定す るために、最初のスクーニングをアラニン走査で行う。立体障害残基を同定した ら、作用薬もしくは拮抗薬のための部位１置換を、表１ａの「作用薬」置換とい う表題のところから選択する。種多様性分析も作用薬を同定する際に同様に有用 であろう。やはり約２０個以下の位置を部位１変異のために選択することが必要 であろう。一般に各位置における突然変異は、元来の残基が属する群の残りの構 成要素、並びに、嵩高さがより少ない側鎖を含有する、かつ／または、非荷電の 、次に最も近い関係にある群（表１ａ）の残基による置換であろう。

置換候補の表 Ａｓｎ（Ｎ）　ａ、ｃ　Ｑ、Ｓ、　Ａ　ｂ、ｄ、ｅ　ｂＧｌｎ（Ｑ）　ａ、ｃ　 Ｎ、Ｓ、Ａ　ｂ、ｄ、ｅ　ｂＧｌｕ（Ｅ）　ｂ、ｃ　Ｄ、Ｓ、Ａ　ａ、ｄ、ｅ　 ａＧｌｙ（Ｇ）　ｅ、ｆ　Ｐ、Ａ　ａ、ｂ、ｃ、ｄ　ｄＨｉｓ（Ｈ）　ａ　Ｅ、 Ｒ，Ｓ、Ａ　ｂ、ｄ、ｅ　ｂｌｌｅ（１）　ｅ　Ｌ、１．Ｖ、Ａ　ａ、ｂ、ｃ、 ｄ、ｆ　ａ、ｂ、ｃＬｅｕ（Ｌ）　ｅ　１．　Ｌ、　’ｖ’、　Ａ　ａ、ｂ、ｃ 、ｄ、ｆ　ａ、ｂ、ｃＬｙｓ（Ｋ）　ａ　Ｒ，Ｓ、Ａ　ｂ、ｄ、ｅ　ｂＭｅｔ（ Ｍ）　ｅ　Ｌ、１．Ｖ、Ａ　ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆ　ａ、ｂ、ｃＰｈｅ（Ｆ）　ａ 、ｄ　１．１５．Ｙ、Ｖ、Ａ　ｂ、ｃ、ｅ、ｆ　ｆＰｒｏ（Ｐ）　ａ、ｄ　Ｇ、 Ｆ、　Ａ　ｂ、ｃ、ｅ、ｆ　ｆＳｅｒ（Ｓ）　ａ、ｆ　Ａ、　Ｔ　ａ、ｂ、ｅ、 ｄ、ｅ　ｄ各部位は数個の非連続的なドメインを含有するのて、これらのドメイ ンのいずか１つに変異を導入する。即ち、与えられた部位の各ドメインを変化さ せる必要はない。部位２の螺旋ドメイン（螺旋ＡまたはＣ）（好ましくは螺旋Ｃ ）は部位２に関する好ましい突然変異導入部位である。部位１の螺旋ドメイン（ 螺旋ＡまたはＤ）（好ましくは螺旋Ｄ）は部位１の変異にとって好ましい位置で ある。各部位の各ドメイン（部位２については２、部位１については３）中の少 なくとも１残基を変化させることが本発明の範囲に色素されるが、典型的な場合 、各部位について１残基のみを変化させる。他の態様として、２またはそれ以上 の残基であって、通常は約５残基までを各ドメインで変化させる。

突然変異導入または変化のための螺旋残基の選択は図１５ａ、ｂおよびＣに示す ような螺旋ホイール図の構築によって容易になる。これらは従来の方法で作成さ れ、部位１および部位２の螺旋部分の変化について標的位置を同定する際に有用 である。興味深い特定の残基は親水性残基、嵩高くない残基または螺旋立体配座 を不安定化する傾向のある残基である。

置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせはスクリーニングの候補物質を作成 する際に有用であるが、残基変化の効果は残基変化そのもの以上に拡大し得る。

例えば受容体結合を防止するべく部位２を改変するのに適した方法は部位２内に Ｎ−または０−グリコジル化部位を導入することである。この部位は酵母や高等 真核細胞中で発現された時にグリコジル化さね、立体的障害によって部位２の結 合を妨害するであろう。この方法の１つの利点は部位２の構造的残基の正確な位 置を決定する必要がないということである。なぜなら嵩高い隣接基の挿入が結合 の阻害に必要な条件のすべてであり得るからである。他の利点は循環半減期を増 大させるなどの変調とその変種の免疫原性を減少させることができるという能力 である。したがって、例えば本明細書に記載の配位子（例えばＩＬ−２）の螺旋 Ａおよび／またはＣ（好ましくはＣ）内にグリコジル化部位を挿入することは本 発明に包含される。

候補作用薬または候補拮抗薬を、作用薬または拮抗薬として機能的に作用すると いうそれら候補物質の能力についてスクリーニングする。そのような検定法は従 来から知られおり、例えば野生型配位子の効力と活性を検定するために典型的に 使用される従来の検定法など、広く利用可能である。別法として、あるいは上記 に加えて、受容体の化学量論を決定するために使用する検定法を、（とりわけ部 位１で結合するが、部位２では結合しない拮抗薬を同定するために）使用するこ とができる。これらの検定法自体は日常的なものであり、はなはだしい実験を必 要としない。

ヒト成長ホルモンに関して部位２の構造的残基にはＴ３、Ｉ４、Ｆ６、Ｒ９、Ｎ １２、Ｌ１２、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｇ２２、’ｌ’　１０３、Ｎ１０９、Ｄ１１６ 、Ｆ１１９、Ｇ１２０およびＴ１２３が含まれる。部位２の機能的残基にはＦｌ 、１４、Ｆ６、Ｒ８，０１１６およびＦ１１９が含まれる。これらの位置の１ま たはそれ以上でいずれかの残基を置換するか、天然の残基を欠失させるか、もし くはそれらに隣接して別の残基を挿入する。上述のように、通常は拮抗薬作用を めるか、作用薬作用をめるかに応じて、同じ種類または異なる種類の構成要素を 置換する３、これらの位置の１またはそれ以上に、あるいはそれらに隣接して導 入される変異は部位２結合に影響を与えるであろう。一般に突然変異にとって好 ましい残基には、Ｎ−末端トメイン、螺旋Ａ内の指定された領域の少なくとも１ つの突然変異と、Ｃ螺旋内のもう１つの突然変異が含まれる（具体的にはＦｌ、 Ｔ４．１，６、Ｉ）　ｌ　１９およびＧ１２０）。ｂ　Ｇ　Ｈ拮抗薬の例には１ ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ１２０Ａ　ｈＧＨ，ｌ　４Ａ　’Ｌ６Ａ／Ｇ］２ＯＡ／Ｔ１２ ３Ａ　ｈＧＨ，ＦＩＡｌ　４Ａ、Ｃ；１２０　Ｉ／Ｔｌ２３Ａ　ｈＧＨ，ＦＩＡ ／Ｉ　４Ａ／Ｇｌ　２０Ｆ　ｈＧ■］およびＦＩＴ・１４Ｆ／ｌ、６Ｒ／Ｇ１２ ０Ｒ／Ｔ１２３Ｄ　ｈＧＨと共に、受容体に対する部位１の親和性を増大させる Ｆ１７４、■］２１、Ｒ６４、Ｋ１７２および、・′またはＦ１７６などの残基 における追加の突然変異を伴う上記のいずれかが含まれる。例えばＦ１７４はＳ に突然変異させることが好ましいが、他の態様てはＧ、〜７．Ｌ、Ｌ　Ａ、ＴＳ Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ，ＫＳＲ，Ｍ、Ｆ、ＹＳＷまたはＰから選択される残基に突然変 異させる。Ｆ１７６は）′に突然変異させることが好ましく、随意にＥ１７４Ｓ 、Ｒ１６８Ｎ、Ｄ１７１Ｓ／Ａおよび／または１１．７９Ｔ（螺旋りから）およ び螺旋ＡからのＦＩＯＡ、Ｍ１４Ｗ、Ｒ１８ＤおよびＨ２ＩＮと組み合わせて使 用してもよい。ファージミドスクリーニングによって野生型のホルモンよりも約 ３０倍強いＧＨｂｐへの結合を示す２つの部位１ｈＧＨ変種を同定した　Ｆ１０ Ａ／Ｍ１４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２ＩＮ／Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１ＳまたはＡ／Ｅ１７ ４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ／Ｉ　１７９Ｔ０作用薬または拮抗薬を作成するために、これ らの部位の突然変異を部位２における上述の突然変異と組み合わせる。拮抗薬の 例にはＦＩＡ／１４Ａ／ＦＩＯＡ／Ｍ１４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２ＩＮ／Ｇ１２ＯＲ ，Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＩ／Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１ＳまたはＡ／Ｅ１７４Ｓ またはＡ／Ｆ１７６Ｙ／１７９Ｔ　ｈＧＨ，ＦＩＡ／１４Ａ／Ｈ２１Ａ／Ｒ６４ に／Ｅ１７４Ａ　ｈＧ）ｌ、夏４Ａ／Ｇ１２０Ｒ／Ｅ１７４ＡｈＧＨおよび１４ Ａ１０１２０１／Ｆ１７４Ａ　ｈＧＨが含まれる。

他の拮抗薬態様では＋４Ａ、Ｌ６Ａ、Ｆｌおよび／またはＧ１２０を欠失させ、 これらの残基の１またはそれ以上を欠失させる一方て残りの残基を置換し、かつ ／または、これらの残基に隣接して１またはそれ以上の残基を挿入する。置換、 欠失および挿入の組み合わせは有用である。単にそれらを選択することは成長ホ ルモンの活性を最適化する問題であろう。このような組み合わせの例にはＦｌ（ △）、／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０Ｉ／Ｅ１７４Ａおよび１４（△）／Ｇ１２０（Ｋ）／ Ｅｌ　７４Ａが含まれる。

部位１および部位２中の位置における突然変異の効果は一般に結合および親和性 を抑制することてあろう。ただしこれらの部位において選択された改変が日常的 なスクリーニングによって決定されるように親和性の増大をもたらすこともある 。例えばＥｌ、７４（Ｓ、Ｇ、ＡまたはＴ）および位置２１．１８および６４で の変異はＧＨｂｐに対する部位１の親和性を増大させることが明らかになってい る。

ＨＧＨ部位１構造的残基はＲ１８、Ｒ２１、Ｇ２２、Ｆ２５、Ｋ４１、Ｙ４２、 Ｌ、４５、Ｇ４６、Ｆ６１．Ｓ６２、Ｎ６３、Ｒ６４、Ｆ６６、Ｒ１６７、Ｋ１ ６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｔ１７５、Ｒ１７８およびＣ１８９である。部位１ の機能に影響を与える側鎖を有する残基はＦ５、Ｆ６、ＦＩＯ１Ｍ１４、Ｆ５４ 、Ｆ５６、Ｔ５８、Ｓ６２、Ｎ６３、Ｒ６４、Ｆ６６、Ｇ６８、Ｆ１６４、Ｄ１ ７１、Ｋ１７２、Ｆ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｔ１７９、Ｃ１８ ２および〜ｒ１８５である。受容体に対する部位１の親和性を増大させるために 好ましい残基はＲ２１、Ｒ６４およびＦ１７４である。一般に部位１残基には置 換のみを施し、削除したり、それらに隣接して残基を挿入したりしない。さらに 、表１ａに記したように、部位１置換は一般に天然の残基と同じ群か、あるいは 密接に関連する群から選ばれるであろう。作用薬活性と拮抗薬活性は共に部位１ が受容体に結合することを必要とするので、部位１の激しい摂動は通常望ましく ない。

それでもなお例外（例えばＥ１７４Ａ）が存在し、したがって最適な置換を決定 するために一部の置換体をスクリーニングすることが望ましい。

他の成長ホルモンにおける類似の残基は容易に同定され、同じ方法で改変される 。例えばｈＧＨ中のＩ４はｂＧＨ中のＭ４に対応する。他の種から得られる成長 ホルモンやｈＧＨの他のアレルを比較する際に残基番号に多少の変化が存在し得 ることに注意すること。動物のＧＨが相同な位置にヒトＧＨと同じ残基を含有し ない場合には、置換される残基はその位置における動物残基とは異なるもの、好 ましくはその位置におけるヒト残基とは異なるものである。さもな（ば、突然変 異導入のための残基の選択を上述した方法と同じ方法で実行する。

構造分析または分子モデリングを用いて他の配位子（即ち、４つの逆平行両親媒 性アルファ螺旋を含有する単量体ポリペプチド）中の変異のために類似する配列 を同定する。チョウーファスマン分析を用いて候補配位子の構造を決定し、次い で各配位子について部位１と部位２内に位置する類似の残基を同定する。いくつ かの例では構造的研究が既に公表されており、必要なことは部位１と部位２を同 定するために様々なドメイン中の残基を成長ホルモンと比較することだけである 。単量体配位子は正常な生理学的条件下で循環する単量体として発見されるもの である。

そのような配位子の現在知られている例にはＥＰＯ，ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ 。

インターロイキン２．３．４．６および７、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチ ン、アルファーインターフェロン、ベーターインターフェロンが含まれる。その 他の配位子も将来同定されるであろうし、本発明の教示はそれらにも等しく適用 される。

これらの配位子に関する拮抗薬候補を作成するために、２つの領域：（ａ）Ｎ− 末端からＡ螺旋の最初のＮ−末端１／３まで、および、（ｂ）Ｃ螺旋のほぼ中央 の１／２（好ましくは１／３）の一方または両方に本質的な突然変異を導入する 。これらのドメインはｈＧＨの部位２ドメインに対応する。作用薬は部位１およ び／または部位２に嵩高さが低く、かつ／または、電荷が少ない置換を導入する ことによって作成される（表１を参照のこと）。最適な拮抗薬は、受容体結合を 防止するか、実質上欠失させるために部位２を突然変異させることによって、並 びに、受容体に対する親和性を増大させるために部位１を突然変異させることに よって作成される。理解されるであろうが、作用薬態様と拮抗薬態様の両方にお いて、受容体に対する親和性を増大させるべく部位１を改変する。

成長ホルモン以外の配位子の拮抗薬変種および作用薬変種を作成する方法の例と して、下記の表１ｂを参照する。表１ｂはｈＰＲＬ％ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ −４、ＩＬ−６、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ８ＦおよびＥＰＯに関する推定の部位１ および部位２生要部および核決定基を開示するものである。各配位子の螺旋ドメ インを同定し、それらをｈＧＨの類似するドメインと比較することによって各部 位に関する螺旋決定基を選択した。ｈＧＨ以外の配位子の構造または機能に寄与 する非螺旋ドメインを同定する際にも同じ分析を適用する。表１ｂは、Ｎ−末端 内の部位２ドメインよりも部位２螺旋残基を標的にすることによって拮抗薬変種 が好ましく作成されるという我々の確信を反映している。しかし、部位１および 部位２に関する非螺旋類似残基を変化させることもできる。部位１および部位２ について推測した表１ｂの残基は、表にした配位子の受容体と構造的または機能 的に相互作用する少なくとも１残基を含有するものと考えられる。これは３螺旋 ドメインまたはその一部の１ないし３の遮断アラニン走査または相同体走査、該 ドメインまたはその一部の欠失、Ｏ−またはＮ−結合型グリコソル化部位を作成 するための３ドメインの１またはそれ以上の中の残基の置換によって容易に確認 される。

ドメインの活性を確認すれば、重要な機能的または構造的残基を同定するために 残基毎のアラニン走査を用いることは容易な問題である。

表１ｂの螺旋構造情報は、ＤｅＶｏｓら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５　：　３ ０６−３１２（１９９２）　（ｈ　Ｇ　ＨＧ　）、Ｂａｚａｎら、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　Ｔｏｄａｙ、　］］１：３５０−３５４１９９１Ｘｈ　Ｐ　ＲＬ、　Ｉ 　Ｌ−６、ＩＬ−２およびＥＰＯ）、Ｌｏｋｋｅｒら、ＥＭＢＯＪ、、１０：２ １２５−２１３１（１９９１）、Ｂａｚａｎら、前掲（ＩＬ−２）およびＤｉｅ ｄｅｒｉｃｈｓら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４：１７７９−１７８２（ＧＭ−Ｃ Ｓ　Ｆ　）から得た。上述のように、他の配位子に関するこのような情報は、モ デリング、ｎｍｒあるいは好ましくはＸ線結晶学的分析によって得られる。

表１ｂにおける部位指定は、螺旋Ａの長さの０．０７ないし０．５と螺旋Ｃの長 さの０．５ないし０８である部位２に基づく接触片を計算することによって到達 した。これらの部位は概略と見なされるべきであり、おそらく適度の改善を必要 とするであろう。各部位は記載の配列から±１〜５残基に位置し得る。

拮抗薬の製造では、標的螺旋残基に導入する残基または構造が一般には同じ種類 （上記を参照のこと）のものでなく、置換される残基よりも嵩高いことが好まし い。他の態様では、部位残基を欠失させるか、他の残基（ＧやＰの如き螺旋破壊 残基など）を部位残基に隣接して挿入する。次に一部の候補物質を作成し、最適 な候補物質を同定するために本明細書に記載の方法によってスクリーニングする 。

しかし、たとえ変種配位子が天然の配位子との比較で作用薬または拮抗薬として 作用し得ないとしても、その変種はその配位子にとっての従来からの用途（変種 が天然の配位子にほぼ等しい活性を保持している場合）に、あるいはそれが受容 体に結合できない場合には免疫学的な（例えば診断用の）試薬として有用である ということは強調されるべき点である。

ＩＬ−２拮抗薬候補を調製するための代表的な計画を表ＩＣに記載する。この計 画では、表１ｂで同定した推定上の部位２残基を、受容体結合を減じるのに好適 なアミノ酸で置換する。追加の代替的な置換をもこの表に示す。

表１０ ＩＬ−２拮抗薬候補を作成するための置換突然変異残基　野生型　好ましい置換 　代替的な置換１３　ＯＡ、ＲＮ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，Ｉ、Ｌ、Ｍ、 Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ１４　Ｌ　Ａ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、 Ｇ、Ｈ，ｌ、に、Ｍ、Ｆ、ｐ、Ｓ、ｗ、Ｙ、Ｖ１５　Ｅ　Ａ、ＲＮ、Ｄ、Ｂ、Ｃ ，Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，ｌ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖｌｓ　ＨＡ、ＲＮ 、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ１７ 　Ｌ　Ａ、ＲＤ、Ｂ、Ｃ，Ｏ，Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、 Ｗ、Ｙ１１３　Ｌ　Ａ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｏ，Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，ｌ、に、Ｍ 、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｖ１９　Ｌ　’　Ａ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ 、Ｇ、Ｈ，ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｖ２）　ＯＡ、ＲＮ、Ｂ、Ｃ，Ｑ 、Ｚ、Ｇ、Ｈ，ｌ、Ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖｇ３Ｎ　Ａ、ＲＤ 、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，Ｉ、Ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ ９１　Ｖ　Ａ、Ｗ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，Ｉ、Ｌ、に、Ｍ 、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＹＯ２１Ａ、Ｗ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ ，Ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｖ９３　Ｖ　Ａ、Ｗ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、Ｇ、）１，１．Ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ９４　Ｌ　Ａ、 Ｗ　Ｒ，Ｎ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，Ｑ、Ｅ、Ｚ、Ｇ、Ｈ，ｌ、に、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、 Ｙ、Ｖ９５　Ｅ　Ａ、ＲＮ、Ｄ、Ｂ、Ｃ，０，２，Ｇ、Ｈ，Ｉ、Ｌ、に、Ｍ、Ｆ 、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、ＶＩＬ−６螺旋Ａ、ＣおよびＤに関する代表的な螺旋ホ イールプロットをそれぞれ図１５ａ、ｂおよびＣに記載する。螺旋Ａ中で潜在的 興味深い残基はＤ５４、Ｒ５８、Ｒ５１、Ｒ５５、Ｔ４８、Ｒ５２、Ｑ５６およ び５４９Ｔあり、螺旋ＣＴはに１５７、Ａ１５８、Ｇ１５５、Ｇ１５２、Ｋ１５ ６お、１：びＶ１４９１’ある。

ｈＰＲＬに関する同様のプロットは、部位２を改変するための位置が残基Ｊ（５ ８、Ｄ６９、Ｒ５５、Ｄ４８、Ｎ５９、ＶＳ２、Ｄ４５、ＶＳ６およびＲ４９（ 螺旋Ａ）と、Ｋ１４３、Ｇ１５０、Ｇ１５７、Ｒ１４６、Ｇ１６４、Ｒ１５３、 Ｒ１６０，５１４２、Ｒ１４９，５１６３、ｖ１４５、Ｋ１５２、Ｒ１４８、Ｒ １６６、Ｒ１５６およびＲ１５９（螺旋Ｃ）であることを示唆している。

１１１ＨＪｉいｈＰＲＬｉ位１（螺旋Ｄ）残基ｆｉｃ２０２、Ｒ２２０Ｓｓ１９ １、Ｋ２Ｏ９、Ｎ１９８、Ｒ２１６、Ｒ２Ｏ５，５１９４、Ｎ２１２、Ｈ２Ｏ１ 、Ｃ２１９、Ｒ１９０、Ｈ２Ｏ３、Ｙ２Ｏ２、Ｎ２１５、Ｒ２０４、Ｄ２１１、 Ｒ１９３、Ｒ２００およびに２１８である。ｈＰＲＬ残基にはプレ配列のＮ−末 端Ｍ＝１として番号を付与している。

当然のことながら本明細書でいう作用薬および拮抗薬は、部位１および／または ２に認められる残基以外の追加の残基へ変異が導入されている配位子をも包含す る。例えば候補物質を他のポリペプチドに融合させたり（例・免疫アフィニティ ー精製を容品にするため）、所望の活性に関与しない残基および適性な立体配座 の維持に必要でない残基を欠失、置換または挿入したり（例：配位子の活性な断 片を作成するため）、さもなくば従来の慣用に従って変化させる。

配位子が受容体に結合する際のＫａまたは親和性定数は、問題の部位で配位子が 受容体に結合する速度（「結合」速度）を配位子が受容体から脱離する速度（「 脱離」速度）で割った比である。高親和性相互作用とは「結合」速度が優勢であ る相互作用をいう。拮抗薬は一般に部位１に高親和性変異を有するであろう。た いていは、いずれかの部位での高親和性変異が受容体の性質に応じて作用薬にと って望ましい。配位子が受容体に結合し、３要素受容体複合体が連続的な信号で はなく単一を信号を発する場合には、受容体に対して極度に高い親和性を有する 配位子類縁体が実際に充分な時間受容体を占めるので実質的に拮抗薬としての作 用を開始する。例えば細胞の特徴の変化（例・タンパク質の放出、有糸分裂の刺 激など）を信号化するのに二重化した受容体が２０〜３０分を必要とするならば 、時間単位で受容体を占めるような速度定数を作用薬配位子が保持する必要はな いであろう。したがって最適には、受容体の信号化事象が完了するのに必要な時 間とほぼ同じ時間後に受容体から変種が脱離するように作用薬の親和性を最適化 すべきである。高い（〉野生型の倍）部位ＩＫａは不活性な部位２を有する拮抗 薬にとってまさしく望ましい。なぜならこれがその拮抗薬による受容体部位１の 占有を増進し、それによって、そうでなければ天然の配位子にとって利用可能に なるかもしれない受容体を拘束するであろうからである。したがって最も望まし くは、作用薬突然変異は二重化した受容体の信号化特性と合致する速度定数を有 し、他方、拮抗薬は部位１において高い親和性を示し、部位２においてより低い 親和性（または親和性の欠如）を示すであろう。Ｋａは、例えばＰｈａｒｍａｃ ｉａがら市販されているＢＩＡ−コア装置の使用などによって、与えられた配位 子変種について容易に決定される。

３要素複合体を形成するという配位子とその受容体の能力は、該複合体の形成に 影響を与えるが配位子アミノ酸配列変種ではない物質の便利な検定終点としても 機能する。例えば一群の候補非ペプチド分子または短いペプチド分子を作用薬効 果または拮抗薬効果についてスクリーニングしようとするならば、その候補物質 の存在下と非存在下で３要素複合体の形成を追跡するだけでよい。複合体形成を 抑制する候補は拮抗薬として作用し、複合体を形成するのに必要な配位子と受容 体の量を減少させるものは作用薬候補であろう。受容体または配位子に対する非 特異的な効果（例・タンパク質変性）は従来からの分析法（例：ＣＤ研究）によ って排除される。

さらにこの検定法は変種受容体とそれらの活性を検出するためにも有用である。

例えば、配位子結合部位に関して天然の受容体と競争する能力を測定することに よって、配位ｆに正しく結合するという能力について突然変異受容体を検定する 。

ホモクエンチングを用いるこのような検定法では、フルオレセイン標識受容体を 天然の配位子の制限量に加え、標識された受容体と競争するという候補受容体の 能力を受容体標準との関連で増大した蛍光によって測定する。蛍光のクエンチン ゲ（消光）や増進は、受容体集団の半分を１つの発蛍光団で標識し、残りの半分 を増進分子またはクエンチング分子で標識することによって検出することもでき る。

このような系は広く知られており、一般に上記の３要素検定に適用することがで きる。この検定法を、単に複合体の分子サイズを追跡するだけで部位１または部 位２結合の分析を可能にするように適合させることもできる。妥当な比率である にもかかわらす配位子と受容体が全く複合体を形成しない場合には、部位１が欠 損しているか、あるいは（受容体が候補物質である場合には）配位子部位１に関 する受容体の結合部位が欠損している。（妥当な量の配位子または受容体が存在 するにもかかわらず）１・１複合体のみが形成される場合には、部位２（または その受容体部位；使用する候補物質による）が受容体に結合する能力を欠いてい る。

同じ分析を適用することによって、野生型タンパク質より強い親和性で部位１ま たは部位２て結合することができる配位子または受容体を同定する。

複合体形成に関する検定 ３要素複合体を検出するための検定法には、複合体の分子量を決定すること、蛍 光の発光または蛍光のクエンチングあるいは受容体上の標識間の他のエネルギー 移動を決定すること、Ｂｉａ−コア分析、ゲル排除クロマトグラフィー、天然ゲ ル電気泳動、等電フォーカシング、沈降および透析が含まれる。他の好適な方法 には受容体−配位子部位に結合する抗体の使用、偏光の旋光度、クロマトグラフ ィーおよび核磁気共鳴が含まれる。クロマトグラフィーの種類にはゲル濾過、イ オン交換および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。いずれの 分析法でも、複合体化していない配位子および／または受容体のバックグラウン ドに対して３要素複合体の形成を決定することが可能であろう。

配位子とそれらの受容体 構造的に分析を行い、適切であれば本明細書に従って突然変異させる配位子の中 には、成長ホルモン、インスリン様成長ホルモン、上皮小体ホルモン、インスリ ン、リラクンン、卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ Ｈ）および黄体形成ホルモン（Ｌ　Ｈ）などの糖タンパク質ホルモン、造血性成 長因子、肝性成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン 、腫瘍壊死因子−アルファ、腫瘍壊死因子−ベータ、ミュラー阻害物質、マウス ・ゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、 インテグリン、トロンボポイエチン、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子、血小板由 来成長因子、ＴＧＦ−アルファやＴＧＦ−ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧ Ｆ）、インスリン様因子成長因子−■、インスリン様成長因子−■、ＥＰＯ１骨 誘導性因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータおよびイ ンターフェロン−ガンマなどのインターフェロン、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ５Ｆお よびＧ−ＣＳ　Ｆなどのコロニー刺激因子（ＣＦＳ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｉ Ｌ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８などのインターロ イキン（ＴＬ）および他のポリペプチド因子が含まれる。好ましい配位子は、Ｇ −Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ｌ　Ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＴＬ−６、ＩＬ− ７、ＥＰＯ，成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチンなどの螺旋状 単量体サイトカイン／ホルモンである。ｈＧＨの場合と同じ方法でこれらの配位 子の受容体を使用し、上述のように拮抗薬または作用薬を選択する。

上述の議論はアミノ酸配列変種に集中した。しかし、標的残基をインビトロ法に よって共有結合的に修飾することによっても同じ目的が達成される。これは、受 容体に結合するという標的位置の残基の側鎖の能力を破壊もしくは改変する何ら かの種類の化学修飾によって達成することができる。共有結合修飾が標的残基に 対して充分に特異的であれば、最終的な効果は例えば置換突然変異と同じである 。特異性は所望の側鎖と優先的に反応する試薬を選択することによって達成され る。さらなる特異性は保護されるべき領域に結合する抗体で他の側鎖を遮断する ことによって達成される。修飾は、結合に直接参加するアミノ酸（構造的残基） の１または複数であり得る。あるいは立体配座の維持に関与している受容体結合 の領域内のアミノ酸またはそれに隣接するアミノ酸をインビトロで共有結合的に 置換する。共有結合的修飾には酸化、還元、アミド化、縮合など、あるいは多糖 やポリエチレングリコールなどの嵩高い基の置換が含まれる。そのような部分（ 例ポリエチレングリコール）をタンパク質に共有結合させる方法はよく知られて いる（例えばＤａν］Ｓら、米国特許第４１７９３３７号を参照のこと）。

７ステイン残基は最も一般的にはクロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα−ハ ロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキンメチルまたは カルホキ／アミドメチル誘導体を得る。またンステイン残基は、プロモトリフル オロアセトン、α−ブロモ〜β−（５−イミドジイル）プロピオン酸、リン酸ク ロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ビリノルンスルフィ ド、メチル２−ピリジル／スルフィド、ｐ−クロロノルクリベンゾエート、２− クロロヌルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニドロベンゾー２− オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基はｐＨ５，５〜７．０におけるジエチルピロカーボネートとの反 応によって誘導体化される。なぜならこの試薬は比較的ヒスチジル側鎖に特異的 だからである。臭化バラ−ブロモフェナシルも有用であり、この反応は好ましく はｐＨ６，０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。

リジニル残基およびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水 物と反応させる。これらの試薬による誘導体化はリジニル残基の電荷が反転する という効果を有する。アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬には 、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリ ドキサール、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン酸、０−メチル イソ尿素、２．４−ペンタンジオン、トランスアミナーゼが触媒するグリオキシ レートとの反応、ポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンアミドエス テル、または他の嵩高い置換基が含まれる。

アルキニル残基は従来の試薬の１または数種との反応によって修飾され、それら にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−クロロヘキサン ジオンおよびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジ ン官能基の高いｐＫ、ゆえに、その反応がアルカリ条件下で行なわれることを必 要とする。さらにこれらの試薬はアルギニンのイプシロンルアミノ基と共にリジ ンの基とも反応し得る。

チロノル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物かテトラニトロメタ ンとの反応によってチロノル残基に光学的な標識を導入するという特別な興味を もって行うことができる。最も一般的にはＮ−アセチルイミジゾールとテトラニ トロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種と３−二トロ誘導体を形 成させる。放射線免疫検定で使用するべく標識されたタンパク質を調製するため に、＋５Ｉまたは１３１１を用いてチロシル残基をヨウ素化する。上述のクロラ ミンＴ法が好適である。

カルボキシル基鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロへキノルー ３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３− （４−アゾニア−４，４−７メチルベンチル）カルボジイミドなどのカルボジイ ミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’（ここにＲとＲ゛は異なるアルキル基を表す）と の反応によって選択的に修飾される。さらにアスパルチル残基とグルタミル残基 はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基とグルタミニル残基 に変換される。

グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されてそれぞれ対 応するグルタミル残基とアスパルチル残基になる。あるいは温和な酸性条件下で これらの残基を脱アミド化する。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲に 包含される。

他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオ ニル残基のヒドロキシル化のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側 鎖のα−アミノ酸のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ　ｒＰｒｏｔｅ ｉｎｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒ ｔｉｅｓＪ　（Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、サンフラッジスコ、７９ 〜８６頁（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化およびＣ−末端カルボキ シル基のアミド化が含まれる。

ｈＧＨｂｐ上の２つの結合部位に関する証拠は抗体結合によって得られる。ｈＧ Ｈｂｐに対するｈＧＨの親和性は、［＋２５７コｈＧＨのｈＧＨｂｐからの置換 と、グリコ／ル化されたウサギＧＨ受容体から作成された抗受容体モノクローナ ル抗体（Ｍ　ａ　ｂ　５　）（Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌｏｇｙ　１１５：１８０５−１８１３（１９８４）　：　Ｂａ窒獅≠窒пA　 Ｒ。

らＢｊｏｃｈｅ＋ｉ、　Ｊ、　２３１　：４５９−４６８（１９８５））でその 複合体を沈殿させることによって測定される。この検定法を用いると、スキャッ チャード分析はｈＧＨとｈＧＨｂｐが１１の複合体を形成することを示す（Ｌｅ ｕｎｇ、　Ｄ、　ｆら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５３７（１９８７）　；　Ｆ ｕｈ、Ｇ　ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　２６５：３１１１−３１１ ５（１９９０）　；　Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒ，ら、Ｅｎｄｏｃ窒奄獅盾撃盾■凵 @１１５：１ ８０５−１８１３（１９８４）　：　Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒら、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｊ、　２３１　：４５９−４６８（１９８５）　：　Tｐｅｎｃｅｒ、　 Ｓ、　Ａ、ら。

］、　Ｂｉｏ１．　Ｃｈｅｖ　、　２６３ニア８６２−７８６７（１９８ｇ）） 。もう１組のＭＡｂ（ＭＡｂ３８７または３Ｄ７）を用いた置換曲線のスキャッ チャード分析（図３）は領５ｈＧＨ対１ｈＧＨｂｐの化学量論をもたらした。こ れらの結果は、ｈＧＨ上の第２の部位に結合するためのｈＧＨｂｐの決定基をＭ ａｂ５が遮断したのだとすれば説明することができる。

各ｈＧＨポリペプチド上の２つの結合部位に関する証拠は、ｈ　Ｇ　Ｈ（Ｃｕｎ ｎｉｎｇｈａｍ、　Ｂ、　Ｃら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４　：　１０８１（ １９８９））とｈＧＨｂｐ（実施例２）の間の結合決定基の走査突然変異分析に おいてモノクローナル抗体を用いることによって開発された。

これらの研究で同定された決定基は１：１複合体の形成を調節するのに重要であ る。このデータに基づいて、我々はこれらの決定基をｈＧＨの非結合性相同体に 装備し、ｈＧＨｂｐに強固に結合する類縁体を作成した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ 、　Ｂ、Ｃ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：１４６１−１４６５（１９９０） ）。ｈＰＲＬ中に８置換を、またｈＰＬ中に５置換を組み込むことによって、我 々はｈＧＨｂｐに結合して１：１複合体を形成する変種を作成した。

我々はゲル濾過を用いてこれらのｈＰＲＬまたはＰＬ変種（図４ＡおよびＢ）が ｈＧＨｂｐの１または２分子に結合することができるかどうかを決定した。ホル モンに対するｈＧＨｂｐの比率が２：１である時に、ｈＰＲＬの両結合変種がｈ ＧＨｂｐとの１１の複合体に対応する２つの対称なピークを示す。

抗体や複合体を分離するためのクロマトグラフィーを使用する必要を伴わずに溶 液中で自由に結合を調べることができるので、我々は化学量論と反応の熱量をさ らに評価するために走査熱量測定法を使用した（図５）。この実験によりｈＧＨ ｂｐに結合したｈＧＨの当量と反応の熱量を決定することが可能になった。

表１に野生型ｈＧＨとｈＧＨおよびｈＰＲＬの変種に関する滴定終点を要約する 。ｈＧＨｂｐのすべてに結合するために必要なｈＧＨの比率は１に対して約０゜ ５である。要するに、これらのデータはｈＰＲＬとｈＰＬ変種がｈＧＨｂｐの三 量化にとって重要な決定基を欠いていることを強く示している。これらの決定基 はｈＧＨの単一アラニン突然変異体中ではほとんど保存されているが、ｈＰＲＬ またはｈＰＬ変種では保存されていない。これはｈＧＨ上にｈＧＨｂｐに関する ２つの結合部位が存在することを示唆している。これらの部位の１つをｈＧＨの アラニン走査突然変異法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｂ、　Ｃ，ら、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２４４：１０８１（１９８９））か、それぞれＭａｂ５またはＭａｂ ２６３免疫沈殿検定法を用いるｈＧＨｂｐによって機能的に詳細に特徴づけた。

ｈ、　Ｇ　ＨとｈＧＨｂｐ上の第２の部位はまだ解明されていなかった。

ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合はその成分に光学的な変化をほとんど引き起こ さない。我々は複合体の形成時の円二色スペクトル（ＣＤ）および蛍光スペクト ルの変化を調べた。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混合した場合、遠ＵＶＣＤスペクトル は基本的にｈ　Ｇ　ＨとｈＧＨｂｐのスペクトルの和と同一である（図６Ａ）。

この結果は複合体の形成時に通常の二次構造に大きな変化がないことを示してい る。近Ｕ〜・’ＣＤスペクトル（図６Ｂ）は芳香族アミノ酸側鎮の非対称な環境 を反映している（Ｂｅｗｌｅｙ、　ＴＡ、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　 ｉｎ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　３５：１５５５（１９７９j　； 　Ｂｅｖｌｅｙ ■＾　ら、＾ｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ■１ｓｔｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃｓ、　２３３：２１９−２２７（１９８４））B１１Ｇ ＨとｈＧＨｂｐのＵ■吸収スペクトルの間には大きな相違があり、これは主とし てｈＧＨと比較してｈＧＨｂｐのトリプトファン含量（それぞれ１対９）が多い ことの結果である。しかしスペクトルの強度の増大を除いて、個々のスペクトル の和は混合後に得られたものと基本的に同一であった。

蛍光スペクトルでは、ｈｃＨｂｐに対するｈ　Ｇ　Ｈの結合時に、３４０ｎｍか ら３３４ｎｍへの前方偏移と蛍光強度のわずかな減少がある（図７）。ヨウ素り エンチングとスターン−ホルマー（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌ鵬ｅｒ）分析は、ホルモ ン受容体複合体中のトリプトファンの暴露の減少があることを示している。これ はｈＧＨを結合した時にｈ　Ｇ　Ｈｂ　ｐ中の１またはそれ以上のＴｒｐ残基が 隠される結果であると思われる。なぜなら蛍光クエンチング研究はｈＧＨ中のト リプトファンが感知し得るほどには溶媒にさらされていないことを示しているか らである（Ｂｅｗｌｅｙ、　Ｔ、＾、　、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　 ｉｎ　Ｒｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　３５：１５５５（１９７９）　； 　Ｂｅｗｌｅｙ、　ＴＡら、＾窒モ■奄魔■刀@。

ｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２３３：２＋ ９−２２７（１９８４））。対照的に、ｈＧＨｂｐの突然変異分析はｈＧＨへの 結合にとってＴｒｐ１０４がとりわけ重要であることを１、している。

−に述のようにｈＧＨの結果は他のポリペプチド配位子（例えばホルモン−受容 体系およびサイトカインー受容体系）に関連している。成長ホルモン受容体とプ ロラクチン受容体は、インターロイキン２．３．４．５．６．７、エリスロポエ チン、マクロファージコロニー刺激因子およびその他（概略については８を参照 のこと）に関するサイトカイン受容体の大きいファミリーに構造的に関連してい ると思われる。これらの受容体の細胞内ドメインが、あったとしてもごくわずか な配列相同性しか共有せず、既知のチロシンキナーゼのいずれとも相同であると は思われないということが注目される。それにもかかわらず、ＧＨ受容体（Ｃａ ｒｔｅｒ−３ｕ、　Ｃ。

ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２６４　：１８６５４−１８６６１ （１９８９）　）、Ｉ　Ｌ−２受容体（＾ｓａｏ、　Ｈ，らA　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　１ｉｅ ｄ、　１７１：６３７−６４４（１９９０））およびＩ　Ｌ−３受容体（Ｉｔｏ ｈ　Ｎ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：２４−３２７（１X９ ０））はホルモン結合のすぐ後にリン酸化型になる。Ｉ　Ｌ−２受容体（Ｓｈａ ｒｏｎ、　Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８７： ４８６９−４８７３（１９９０））とＩ　Ｌ−６受容体（Ｔａｇａ、　Ｔら、Ｃ ｅP１ ５８、５７３−５８１（１９８９））の場合には、補助タンパク質および／また は受容体が信号変換に関与することを示す証拠がある。ｈＧＨとその結合タンパ ク質で得られたこの結果は、ｈＧＨの結合が受容体の細胞外部分の三量化を誘発 し、それが細胞内ドメインを結び合わせることによって、細胞質（または膜結合 ）成分と相互作用し得る活性なドメインが生成するというｈＧＨ受容体の活性化 のモデルを支持するものである。これは複合体化した成分の立体配座の本質的な 変化を伴わずに起こることもあるし、こうした変化を伴わずには起こらないこと もある。

最近２つの他のグループが細胞外結合ドメインと錯化したポリペプチドホルモン を結晶化させている（Ｌａ＋５ｂｅｒｔ、　Ｇら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２６４　：　１２７３０−１２７３６（１９８９）@；　Ｇｕｎ ｔｈｅｒ、　Ｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６５：２２０ｇ２−２２ ０８５（１９９０））。しかしどちらも受容体の三量化に関する決定的な証拠を 報告していない。ヒ１−ＩＬ−２はＩＬ−２受容体のヒトｐ５５成分の可溶性組 換え型と主に１．１の複合体として結晶化した。ただしジスルフィドで連結した 少量のｐ５５二量三員観測された。架橋試験は機能的なＩＬ−２受容体複合体が Ｉ　Ｌ−２、ｐ５５およびｐ７０と呼ばれるもう１つの受容体成分の間で形成さ れるヘテロニ量体であることを示唆している（Ｓａｒａｇｏｒｉ、　Ｈ，ら、Ｊ Ｉ＋＋ｍｕｎｏ１．１３９：１９１ｇ−１９２６（１９８７）　：　Ｏｇｕｒａ 、　Ｔ　ら、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　５：１２Rｌ２３−１３８（ １９８゜ ＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン（ＥＧＦｂｐ）は１分子のＥＧＦとの錯化状態で 結晶化されている（Ｇｕｎｔｈｅｒ、　Ｎら、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｗ、 　２６５：２２０８２−２２０８５（１９９０））。結合研究と沈降分析は溶液 における１・１のＥＧＦ−ＥＧＦｂｐ複合体の形成を示している。これらのデー タはホルモンが誘発する三量化を経るには細胞外ドメインだけでは充分でないこ とを示唆している。しかし、これらの結合研究が複合体を沈殿させるために抗Ｅ ＧＦ受容体ポリクローナル抗体を用いたことに注意すべきである。さらにこれら の結晶化実験と沈降実験では受容体に対して大過剰のホルモンが用いられた。我 々の場合、天然のＧＨ受容体に対して生ぜしめたＭａｂが三量化を遮断しく図３ ）、大過剰のｈＧＨがｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）ｚ複合体を単量体複合体に解離さ せるであろう（図２、参考資料３４）。

この後者の効果は薬学的に重要な意味を含有し得る。ｈＧＨは天然には血清中で ５ｎＭを超えるパルスとして生産され、１ｎＭよりはるかに低いレベルにまで迅 速に低下する（Ｔａｙｌｏｒ、　Ａ、　Ｌら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ、　４８　：２３４９（１９６９）　：　Ｔｈｏｍｐｓ盾氏A　Ｒ，Ｇ。

ら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５１　：３１９３（１９７２）　： 　Ｈｏ、　Ｋ、　Ｙ　ら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄｏｃ窒奄獅盾戟A　１ｌ ｅｔａｂ、　６４　：５１−５ｇ（１９８７））。しかしｈＧＨｂｐは天然には 血清中に約０５〜１ｎＭの一定レベルで存在する（Ｂａｕ＋１ａｎｎ、　Ｇら、 　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６２：１３４− １４１（１９８６j　：　Ｈｅｒｉｎｇ ｔｏｎ、ＡＣら、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７７：　１８１７− １８２３（１９８６））。このようにｈＧＨはｈＧＨｂｐより過剰に律動するの で、細胞受容体と相互作用し得る（さらにはｈＧＨ−ｈＧＨｂｐ−ｈＧＨ膜受膜 受型体型するヘテロニ量化複合体をも生産し得る）遊離のｈ　Ｇ　Ｈと共に、ｈ ＧＨｂｐとの１１の複合体が生産されると予期するであろう。

我々は、ｈＧＨがｈＧＨｂｐと相互作用してｈＧＨ（ｈＧＨｂ　ｐ）２型の複合 体を作ることを決定し、その結果としての細胞外受容体ドメインの三量化がこの ホルモンに関する休園性信号変換を開始すると提唱した。補充されたｈＰＬとｈ ＰＲＬ類縁体（実施例４）はｈＧＨｂｐの三量化を促進しないので、我々はｈＰ ＬとｈＰＲＬ骨格が、受容体認識および結合に必要なものとは異なる必須の三員 化決定基を欠いていると結論することができる。関与するドメインの位置を特定 するために、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ相同体置換を伴う一連のｈＧＨ突然変異体と ２つの欠失類縁体をホルモンが誘発する受容体の三量化の減少についてスクリー ニングした。次に、より詳細なアラニン走査法によって重要な側鎖を同定した。

ｈＧＨｂｐ変種（３２３７Ｃ）を構築し、蛍光的に標識した。ホルモンが誘発す る三量化を監視するために、図８に記載の如く蛍光クエンチングを測定した。こ のクエンチングはｈＧＨとｈＧＨｂｐのモル比が１・２であることを示した（実 施例４）。ｈＬＰおよびｈＰＲＬセグメント置換を伴う一連の相同体走査ｈＧＨ 変種を蛍光検定法で試験した（表２）。これらのうちの４つはホルモンが誘発す るｈＧＨｂｐ二量化に減量化減少を引き起こした（実施例４）。他の２つのｈＧ Ｈ欠失類縁体では、ｈＧＨｂｐ二量化の減量化第２部位ｈＧＨｂｐ結合の破壊に よるものと思われる（表２）。

突然変異ｈＧＨｂｐ（３２３７Ｃ−ＡＦ）を蛍光的に標識した。図８に示すよう に、ホルモンが誘発する三量化を監視するために蛍光信号を用いた。ｌＱｎＭ濃 度に固定した５２３７Ｃ−ＡＦに対してｈＧＨを連続的に希釈し、平衡時に蛍光 クエンチングを測定した。フルオレセイン標識のホモクエンチングはｈＧＨの添 加と共に増大し、ｈＧＨが０．５モル等量の時点で最大になった。しかし極めて 注目すべきことに、より高い濃度のｈＧＨではこのホモクエンチングが反転し、 過剰のｈＧＨの存在下てｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）ｚがｈＧＨ−ｈＧＨｂｐ単量体 複合体に解離することを示した。

ｈＰＬおよびｈＰＲＬセグメント置換を伴う一連の相同体走査ｈＧＨ突然変異体 を８２３７Ｃ−ＡＦに基づく検定法で試験した（表２）。これらのうちの３つ、 即ちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（５４−７４）およびｈＰＲＬ（１１１ −１０９）は有意な減少を引き起こした（１８．６および〉１００倍）。これら の突然変異体に関する一次部位（部位１）中の欠損が、観測されたｈＧＨｂｐ二 量化の減量化ほとんどを説明するものと思われる。さらに、結合親和性を減少さ せる一次部位決定基の突然変異（例：Ｒ６４Ａおよびに１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ） が三量化を減少させることも示され、−次部位に関してｈＧＨｂｐ親和性を増大 させることが明らかになったｈＧＨ突然変異体（Ｅ１７４Ａ）が我々の検定法で の測定によれば三量化をも増進させた。相同体走査突然変異体に加えて、ｈＧＨ 欠失類総体（欠失１〜８）はｈＧ）（ｂｐの三量化を誘発するという能力の劇的 な減少（＞１００倍）を示した（実施例４）。また、ｈＧＨｔｌ二量化のこの欠 如は二次部位ｈＧＨｂｐ結合の破壊によるものと思われた。

二次部位ｈＧＨｂｐ結合に関与する特定のアミノ酸特異的側鎖をアラニン走査に よって詳細に調べた（実施例６）。２６アラニン突然変異体の分析により（表３ ）、２つの突然変異体のみ（ＦＩＡと１４Ａ）がｈＧＨｂｐ二量化の〉１０倍の 破壊をもたらし、他の４つ（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１１９Ａ）が〉２ 倍の破壊をもたらすことが明らかになった。これらの決定基は一次部位結合にと って重要なものとは異なる。固定された濃度の８２３７　Ｃ−ＡＦ（１００ｎＭ ）に連続的なｈＧＨ添加を行う実験と蛍光ホモクエンチングは、ｈＧＨが誘発す る三量化に関する迅速な平衡時間（〈３分）と、引き続いて起こる過剰のｈＧＨ による三量化の反転に関する遅い平衡時間（〉３０分）を示した。このことは三 量化の反転が脱離速度律速であることを示唆している（作用機序については実施 例６）。

ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）ｚ結晶の形成は、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ が記述している方法（アカデミツク・プレス、ロンドン（１９７６））に従って Ｘ線結晶学技術を用いるｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）ｚ複合体の三次元構造の決定を可 能にした。この構造を図１１に記載し、下記実施例７て議論する。図１１の構造 は各ｈＧＨが２つのｈＧＨ受容体またはｈＧＨｂｐに結合することを示している 。各ｈＧＨｂｐｌ′！ｈＧＨの異なる部分と接触しており、第１のｈＧＨｂｐは 表４に記載のアミノ酸と接触し、第２のｈＧＨｂｐと接触しているｈＧＨアミノ 酸を表５に示す。２つのｈＧＨｂｐ間で接触しているアミノ酸を図６に示す。

これらのアミノ酸接触点でｈＧＨの変種を作成し、本発明の検定法によってそれ を検出することができる。ｈＧＨへの結合に関与するアミノ酸内、あるいは２つ のｈ　Ｇ　Ｈｂ　ｐ自体の間のアミノ酸内で同様にｈＧＨｂｐ変種を作成するこ とができる。このようなｈＧＨｂｐ変種は、野生型ｈＧＨとｈＧＨｂｐを用いる 本発明の検定法を用いて検出することができる。

ＨＲＧの医薬組成物と投与 貯蔵のために、所望の純度を有する配位子類縁体タンパク質を随意の生理学的に 許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｊｅｎｃｅｓ、前掲）と混合することによって、凍 結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、配位子類縁体またはＧＨｂｐ抗体の医薬製 剤を調製する。許容される担体、賦形剤または安定化剤は使用される投与量と濃 度で受容者にとって非毒性であり、これらにはリン酸塩、クエン酸塩および他の 有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未 満）のポリペプチド（メトキンド形成を防止するため）、血清アルブミン、ゼラ チンまたは免疫グロブリンなどのタンノくり質、ポリビニルピロリドンなどの親 水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アス（ラギン、アルキニンまたはリシン などのアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、三糖 および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビト ールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオンおよび／またはツウ イーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン 性界面活性剤が含まれる。

インビボ投与に使用される配位子類縁体またはＧＨＧｐ抗体は滅菌状態でなけれ ばならない。これは凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜を通して濾 過することによって容易に達成される。配位子類縁体または配位子類縁体↓二対 する抗体は通常は凍結乾燥した形態か、溶液状態で保存されるであろう。

医薬配位子類縁体または配位子類縁体特異的な抗体組成物は、一般に滅菌注入口 を持つ容器（例えば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で突き刺すことができる 蓋を持つバイアルなど）に入れられる。

配位子類縁体またはＧＨｂｐ抗体を投与する経路は既知の方法（例えば静脈内、 腹腔内、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内または病巣内経路による注射または注入 、あるいは後述の徐放系によるなど）に従う。配位子類縁体を注入によつ連続的 に投与するか、ホーラス注射によって投与する。ＧＨｂｐ抗体は同じ方法で投与 するか、血流またはリンパ液への投与による。

徐放性調製物の好適な例には、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透 過性基盤であって、該基盤が成型品（例：フィルムまたはマイクロカプセル）の 形態にあるものが含まれる。徐放性基盤の例にはポリエステル、ヒドロゲル［例 Ｌａｎｇｅｒら、　Ｊ、　ＢｉｏＩｌｅｄ、　Ｍａｔｅｒ、　Ｒｅｓ、　、　１ ５：１６７−２７７（１９８１）とＬａｎｇｅｒ、　Ｃｈｅ浴A　Ｔｅｃｈ、　 、　１２：９８ −１０５（＋９８２）に記述されているポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリ レート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリラクチド（米国特許第３７７ ３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とＩ、−グルタミン酸ガンマ エチルの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、　２２：５４ ７−５５６（１９８３）、非分解性エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら 、前掲）、Ｌｕｐｒｏｎ　ＤｅｐｏｔＴ″（乳酸−グリコール酸共重合体とロイ プロリドアセテートからなる注射可能な微小球）などの分解性乳酸−グリコール 酸共重合体、ポリ＝Ｄ−（−）−３−ヒドロキシラフ酸（ＥＰ１３３９８８）が 含まれる。エチレンビニルアセテートや乳酸−グリコール酸などのポリマーは１ ００日以上にわたって分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルはよ り短い期間でタンパク質を放出する。封入したタンパク質を体内に長時間残して お（と、３７℃で湿気にさらされた結果としてそれらが変性または凝集して、生 物学的活性の喪失や免疫原性の考え得る変化をもたらすこともあろう。関与する 機構に応じてタンパク質を安定化するために合理的な方法を工夫することができ る。例えば凝集機構がチオ−７スルフイド相互変換による分子間Ｓ−８結合の形 成であることが判明したとすれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から 凍結乾燥し、湿気含量を調節し、適当な添加剤を使用し、特殊なポリマー基盤組 成物を開発することによって安定化を達成することができる。

徐放性の配位子類縁体または抗体組成物には配位子類縁体または抗体をリポソー ムに封入したものも含まれる。配位子類縁体または抗体を含有するリポソームは それ自体は既知の方法によって調製される（ＤＥ３２１８１２１、Ｅｐｓｔｅｉ ｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８２：３６８８ −３６９２（１９８５）、Ｈｖａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Oｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）、ＥＰ５２３２２、ＥＰ３６６７６、Ｅ Ｐ８８０４６、ＥＰ１４３９４９、ＥＰ１４２６４１、日本国特許出願８３−１ １８００８、米国特許第４４８５０４５号、米国特許第４５４４５４５号および ＥＰ１０２３２４）。

通常リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、 その脂質含量は約３０モル％コレステロール以上であるが、その比率の選択は最 適な配位子類縁体治療のために調節される。増大した循環時間を持つリポソーム は米国特許第５０１３５５６号に開示されている。

変種の使用 天然に存在する配位子の作用を拮抗薬として遮断するように作用させるために、 本発明の検定法によって選択される拮抗薬配位子変種を医薬製剤として使用する か、もしくは形質転換動物内て発現させる。形質転換動物は新案物として、ある いは実験モデルとして有用である。他の選択された配位子変種を作用薬として作 用させるための医薬製剤に使用し、これを投与することによって天然に存在する サイトカインによって刺激される応答と類似する応答を強化または促進する。例 えば医薬的に有効な剤形中にｈＧＨ変種を使用する（例えば１９８８年４月１５ 日に出願された米国特許第５０９６８８５号）。配位子変種は、それらが望まし くない副作用を軽減または排除する一方で天然に存在するサイトカインと類似す る活性を有し得るという点で有利であり、糖尿病誘発活性を示さないｈＧＨ変種 はそのような例の１つである。作用薬または拮抗薬として生物学的活性を有さな い配位子変種は少なくとも１つの配位子免疫エピトープを保持しているであろう から、それらは野生型配位子またはそれらの抗体に関する免疫検定法で有用であ る。

モノクローナル抗体と受容体の刺激 状々はいくつかの抗体がｈ　Ｇ　Ｈ受容体を刺激できることを決定した。即ち、 これら抗体は、３要素後合体を形成して受容体を活性化するというｈＧ）Ｔの能 力を模倣する様式で受容体を架橋することができる。そのような作用薬抗体の例 は本発明時Ｉこはすでに知られていたが、ｈＧＨの作用薬として作用するという それらの能力は認められていなかった。好適な抗体はＭＡｂ２６３である（Ｂａ ｒｎａｒｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１５：　１８０５−１８１３ （１９８４）またはＢａｒｎａｒｄら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　、　２３P 　：４５９−４６８（１ ９８５））。他の抗体には後述する方法で作成されるＭＡｂ３Ｄ９および１３Ｅ １がある。随意に、意図する宿主中で親抗体よりも免疫原性の低いキメラ型やＣ ＤＲ移植型を作成するためにこれらの抗体を使用する。これらの抗体は好ましく はヒト受容体に対するものである。ｈＧＨの作用薬は少なくとも二価でなければ ならない。しかし、１受容体分子にしか結合しないＦＡｂ断片などの一価抗体は 拮抗薬として有用である。

いくつかの態様では上記二価抗体が二特異的である。即ち、抗体の１つの腕が１ つの受容体エピトープを指向し、もう１つの腕が受容体上の別のエピトープを指 向する。拮抗薬抗体の態様は受容体（好ましくはその受容体−受容体接触領域） を指向する１つの腕と、ＧＨ受容体以外の抗原を指向するもう１つの腕とを含有 することができる。これらの抗体は従来のハイブリドーマ法によって、あるいは 従来のハイブリトーマ法によって、あるいは各腕をコード化する重鎮および軽鎖 で組換え細胞を形質転換する組換え法によって作成される。組換え法によって二 特異性抗体を作成し、それをアフィニティー精製によって細胞培養から回収する か、もしくは従来の方法で抗体を別個に作成し、それらをインビトロで組み合わ せる。

これらの結果は獣医学の分野ではとりわけ興味深い。なぜなら能動的免疫化によ ってＧＨ作作用薬作成するために成長ホルモン受容体またはその断片に対して動 物を免疫化することによって上述の抗体をインビボで生じさせることが現在では 可能だからである。したがって、受動的に（外因性の抗体の投与によって）抗体 を投与するか、もしくは受容体での免疫化によって能動的に抗体を投与する。

作用薬抗体は成長ホルモンとの比較におけるそれらの親和性に基づ（投与量で投 与される。哺乳動物に関するさらなる投与量は後述のラット成長研究から容易に 外挿される。拮抗薬抗体は、充分量の成長ホルモンと競争してその有効活性を正 常範囲に減じるか、もしくは項生動物が目的物であるならば正常未満に減じるよ うに計算された投与量で投与される。

抗体は上述の配位子類縁体と基本的に同じ様式で投与される。作用薬抗体はこれ までに成長ホルモンが使用されてきたのと同じ目的のために使用される。

以下の実施例は本発明を実施するにあたって現在知られている最善の方法の例示 を意図するものであるが、本発明がこれらの実施例に限定されると見なすべきで はない。

実施例１ ｈＧＨ−受容体複合体の構造 本発明の検定法はｈＧＨ−受容体複合体構造、即ち１つのｈＧＨと２つのｈＧＨ 受容体または結合タンパク質が検出し得る安定な複合体を形成するという発見に 基づいている。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体検定法によってこれらの検定法を 例示する。

ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｌ））２複合体の結晶化ｈＧＨ（２２ｋＤａ）とｈＧＨｂｐ （２８ｋＤａ）の間の複合体の結晶（図１ａ）を気相拡散（＾ＭｃＰｈｅｒｓｏ ｎ　ｒＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　ＣｒｙｓｔａｌｓＪ　iＪｏｈ ｎ　ｆｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　ニューヨーク（１９８２））によって成 長させた。これらの結晶は少な（とも２７人に回折し、ａ＝１４５．８人、ｂ＝ ６８．６人、ｃ＝７６．０人の単位格子変数を伴う空間群（Ｐ２＋２１２）に属 する。これらの結晶の非対称単位の体積はその複合体がｈＧＨ−ｈＧＨｂｐもし くは（ｈＧＨ−ｈＧＨｂｌ））２の形態を取るとは考え難いものである。具体的 には、溶媒含量が単位格子内で１．１複合体については高すぎ（６８％）、２： ２複合体については低すぎる（３２％）必要があろう。結晶の典型的な溶媒含量 は約５０％であるから（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｂ、　？、　、　Ｊ、　１ｌｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、　３３．４９１−４９７（１９６ｇ））、これらの結晶が成分の 非対称な混合物を含有する可能性が最も高かった。

結晶の正確は組成を評価するために、それらを０１％トリフルオロ酢酸中で解離 させ、変性条件下でクロマトクラフィーに付した（図１ｂ）。ペプチド結合の吸 光度に対応する２１４ｎｍて監視したそれぞれのピークの積分によってｈＧＨと ｈＧＨｂｐの量を定量した。４回の独立した決定によると、ｈＧＨｂｐピークに 対するｈＧＨビークのＡ２３．の比率が０４２±０．０２であった。ｈＧＨ・（ ｈＧＨｂｌ））ｚの形態ををする複合体については、積分したピーク面積に関し て予測される比率が各成分内の残基の数（ｈＧＨは１９１残基、ｈＧＨｂｐは２ ３８残基）に基づいて０．４０である。対照実験として、ｈＧＨとｈＧＨｂｐの １．２混合物は図ＩＢのように基本的に同じクロマトグラムを作り、他方、２： １混合物と１　：　ｌｆＬ合物は予期されるように異なるクロマトグラフを作っ た。したがって、図１の結晶はｈＧＨとｈＧｌ−１ｂｐを１２のモル比で含有し た。溶液中で安定な複合体を作るというｈＧＨとｈＧＨｂｐの能力は、複合体形 成が信頼できる検定変数であるということを追認するものである。

溶液におけるｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体の形成サイズ排除クロマトグラフィ ーによって溶液におけるｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）ｚの存在を立証した。ｈＧＨとｂ ＧＨｂｐを１・４．１３．１２．１：１および１０５て比率で混合し、各成分を スーパーロース１２ＦＰＬＣカラムでのゲル濾過によって分離した（図２）。ｈ ＧＨとｈＧＨｂｐの比率が１：４の時（図２Ａ）、それぞれｈＧＨ・（ｈＧＨｂ ｐ）２複合体と遊離のｈＧＨｂｐに対応する見か純粋な試料の吸光度と組成分析 に基づいてｈＧＨｂｐについては２．３５　Ｃｍ−’である。ｈＧＨとｈＧＨｂ ｐの比率が１・３および１２である時（図２Ｂおよび２Ｃ）、複合体ピークの形 と位置には変化がないが、遊離のｈＧＨｂｐｌこ対応するピークは徐々に減少し て０に近づく。したがって１・２の比率では、ｈＧＨとｈＧＨｂｐの基本的にす べてが複合体として結合している。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの比率を１．１に調節し 、最終的に１・０５に調節すると（図２Ｄ、２Ｅ）複合体ピークの位置がより小 さいサイズ（〜５５ｋＤ）に移動し、非対称になり、遊離のｈＧＨが蓄積するの で、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２、ｈＧＨ−ｈＧＨｂｐおよび単量体ｈＧＨに対応 する種の混合物の存在が示唆される。これらのピークの全域て採取したタンパク 質試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって割り当てた組成を確認した。もう１つの対照 実験では、遊離の成分が単量体タンパク質として移動し、三量化がこれらの条件 下てｈＧＨとｈＧＨｂｐの両方の存在を必要とすることを示すことがわかった。

したがって複合体の形成を複数の検定法で検出することができ、ｈＧＨ・（ｈＧ Ｈｂｐ）２複合体の形成は細胞受容体に対するｈＧＨ結合の指標として機能する 。さらにサイトカインーサイトカイン受容体複合体を形成するサイトカイン受容 体を介して作用するサイトカインはいずれも、ｈＧＨ−ｈＧＨ受容体複合体と同 様に、このような検定法で評価できる。

実施例２ ｈＧＨ受容体結合部位 受容体または結合タンパク質についてｈＧＨ結合部位を遮断する抗体を用いて、 ｈＧＨ受容体またはｈＧＨ結合タンパク質に関するｈＧＨ結合部位の性質を特徴 づけた。ｈＧ）ｌｂｐ上の２つの結合部位に関する証拠は下記の通りである。

ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの親和性は典型的にはｈＧＨｂｐからの［＋２Ｓｌコ ｈＧＨの置換と、グリコリル化したウサギＧＨ受容体から作成された抗受容体モ ノクローナル抗体（Ｍａｂ５）による複合体の沈殿によって測定される（Ｂａｒ ｎａｒｄ、　Ｒら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１５　：　１８０５−１ ８１３（１９８４）　；　Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒ，ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、@Ｊ 、　２３１　：４５９−４６８ （１９８５））。この検定法を用いることにより、ｈＧＨとｈＧＨｂｐが１：１ の複合体を形成し得ることがスキャッチャード分析によって立証された（Ｌｅｕ ｎｇ　Ｄ、　ｆ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５３７（１９８７）　：　Ｆｕｈ　Ｇら、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５：３１１１−３１１５（１９９O）　；　Ｂａｒｎ ａｒｄ。

Ｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１５．１８０５−１８１３（１９８４ ）　；　Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　ＪA　２３１　：４５ ９−４ ６８（１９８５）　；　５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｓ、＾、ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　２６３ニア８６２−７８６７（１９８８）　；@５ｐｅｎｃｅｒ、 　Ｓ、　Ａ　ら。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６３ニア８６２−７８６７（１９８ｇ））。

最近になって、大腸菌から精製されたグリコリル化されていないｈＧＨｂｐを用 いる免疫化によってさらなるＭａｂ（複数）が作成された（Ｆｕｈ　Ｇ、ら、　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２６５：３１１１−３１１５（１９９０）） 。複合体を沈殿させるためにこれらの抗ｈＧＨｂｐ　Ｍａｂのうちの２つ（３Ｂ ７および３Ｄ９）を用いる置換曲線のスキャッチャード分析（図３）は、より高 い結合親和性（ＫＤはＭａｂ５の０．４ｎＭに対して０．１　ｎＭ）と１ｈＧＨ ｂｐに対して領５ｈＧＨの化学量論を与える。これらの結果は、ｈＧＨ上の第２ の部位に結合するためのｈＧＨｂｐ上の決定基をＭａＢ５が遮断するとすれば説 明することができる。Ｍａｂ３Ｂ７と３Ｄ９を用いる検定法における協同性の欠 如は１１複合体におけるｈＧＨの親和性（Ｍａｂ５を用いて測定されるもの）が １２複合体に関する値（Ｍａｂ３Ｂ７および３Ｄ９を用いて測定さ才するもの） より約４倍低いに過ぎないという事実を反映しているものと思われる。スキャッ チャードブロソトにおける上方の屈曲によって正の協同性を捕らえるには、はる かに大きく相違する親和性が必要であろう。さらに、Ｍａｂ３Ｂ７と３Ｄ９は１ １複合体と１２複合体の両方を沈殿させ、これが見かけ上の協同性を低下させる に違いない。したがってｈＧＨ第２結合部位の遮断は１，１のｈ　Ｇ　Ｈ−ｈ　 Ｇ　ｆ−（ｂ　ｐモル比をもたらし、一方、第２結合部位を遮断しない抗体は１ ２のモル比をもたらす。

ｈＧＨ上の２つの結合部位に関する証拠は次の通りである。ｈＧＨとｈＧＨｂｐ の間の結合決定基の走査突然変異分析でＭａｂ５を使用した。したがってこれら の研究で同定される決定基は１１複合体の形成を調節する上で重要なものを反映 する。このデータに基づいて我々はｈＧＨの非結合性相同体内にこれらの決定基 を装備し、ｈＧＨｂｐと強固に結合する類縁体を作成した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ ｍ、　Ｂ、　Ｃら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６１−１４６５（１９９０） ）。例えば野生型ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）またはヒト胎盤性ラクトケン（ ｈＰＬ）はｈＧＨより１０５倍または１０３倍以上弱＜ｈＧＨｂｐに結合する。

ｈＰＲＬ中に８つの置換を組み込むことによって（Ｅ６２Ｓ／Ｄ６３Ｎ／Ｑ６６ Ｅ／Ｈ１７１Ｄ／Ｅ１７４Ａ／Ｎ１７５Ｆ／Ｙ１７６Ｆ　／　Ｋ　１７８　Ｒ： 　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｔ　Ｂ、　Ｃ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６１− １４６５（１９９０））、あるい■ ｈＰＬ中に５つの置換を組み込むことによって（Ｖ４１／Ｄ５６Ｅ／Ｍ６４に／ Ｅ１７４Ａ／Ｍ１７９１）、我々はそれぞれｈＧＨよりわずかに６．２倍または １゜４倍だけ弱＜ｈＧＨｂｐに結合する変種を作成した。

これらの変種が１または２分子のｈＧＨｂｐを結合することができるかどうかを 決定するために我々はゲル濾過を用いた（図４）。ｈＧＨｂｐとホルモンの比率 が２・１の時、ｈＰＲＬ（図４Ａ）とｈＰＬ（図４Ｂ）の両結合性変種はｈＧＨ ｂｐとの１：１複合体に対応する２つの対称なピーク（見がけ上の分子量約５５ ｋＤａ）と、化学量論的に過剰なｈＧＨｂｐを表すより低分子量のピーク（３０ ｋＤａ）を示す。同じ条件下で野生型ｈＧＨはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２複合体 に対応する単一のピーク（見かけ上の分子量７７ｋＤａ）をもたらす（図４Ｃ） 。図４０における小さいサテライトピークはわずかに過剰なｈＧＨｂｐに由来す るものである。ピーク組成を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）によって確認した。

化学量論と反応の熱量をさらに評価するために我々は走査熱量測定法を使用した 。なぜなら複合体を分離するために抗体やクロマトグラフィーを使用する必要が なく、溶液中で自由に結合を研究できるがらである。固定した濃度のｈＧＨｂｐ （１５μＭ）を含有する溶液にｈＧＨを一部づつ加え、さらなるエンタルピー変 化がなくなるまで反応の熱量を測定した（図５）。この実験によって我々はｈＧ Ｈｂｐに結合するｈＧＨの当量と反応の熱量を決定することができた。

表１８に野生型ｈＧＨとｈＧＨおよびｈＰＲＬの変種に関する反応の熱量と滴定 終点を要約する。すべてのｈＧＨｂｐを結合するのに必要なｈＧＨの比率は約０ ５対１である。さらに、結合を減少させる（２０倍まで）が、もしくは結合を増 強する（４．５倍）一連の単一アラニン突然変異体は、反応のエンタルピーの変 化を伴いはするが、ｈＧＨｂｐに対して野生型ｈＧＨと同じ結合の化学量論を与 える。対照的にｈＧＨｂｐに対するｈＰＲＬの結合の化学量論は０．８５対１で ある。

表１ａ：ｈＧＨの野生型およびアラニン突然変異体並びにｈＧＨｂｐに強固に結 合するｈＰＲＬの変種に関するｈＧＨｂｐとの反応の熱量と化学量論タンパク質 　Ｋ［１（ｎＭ）’　終点におけるモルｈＧＨ１モルＧＨｂｐｂ ｗｔ　ｈＧＨＯ，３４０，４６±０．０５Ｒ６４Ａ　７．１　０．４７＝！＝０ ．０７に１７２Ａ　４．６　０．４８＋０．１＋５８Ａ　５．６　０．４８ Ｆ１７６Ａ　５．４　０．４６ Ｅ１７４Ａ　Ｏ，０８０，４７ ｈＰＲＬ変！　２．１　０．８５ ’Ｍａｂ５免疫沈殿検定法を用いる］　：　１ｈＧＨｈＧＨｂｐ複合体の形成に ついてＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｂ、　Ｃ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０ ８１（１９８９）から採用した値。熱量計は濃度を結合定数未満に設定する必要 がある成分に関する反応の熱量の変化を正確に決定するほどには感度が高くない ので、熱量測定法はナノモル濃度範囲での三員複合体について結合定数を測定す るには適していない。

５正副一対の平均（±ＳＥ）、他は単一測定である。

これらのデータは総合的にみてｈＰＲＬとｈＰＬ変種がｈＧＨｂｐの三量化にと って重要な決定基を欠いていたことを強く示している。これらの決定基はｈａＨ の単一アラニン突然変異体中ではほとんど保存されているが、ｈＰＲＬまたはｈ ＰＬ変種中では保存さねていない。このことはｈＧＨ上にｈＧＨｂｐにとっての 結合部位が２つあることを示唆している。これらの部位のうちの１つはそれぞれ ＭａＢ５免疫沈殿検定法を用いるｈＧＨｂｐまたはｈＧＨのアラニン走査突然変 異法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｔ　Ｂ、　Ｃ，ら、５ｃｉｅｎｃｔ　２４４：１０８ １（１９８９））によって、機能的に詳細に特徴づけられている。ｈＧＨとｈＧ Ｈｂｐ上の第２の部位は未解明のままであったが、これについて後述する。

実施例３ ｈＧＨ−受容体複合体およびスペクトル変化受容体に対するｈＧＨの結合は各成 分にほとんどスペクトル変化をもたらさない。ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合 が各成分の大きな二次または三次構造の変化をもたらすかどうかを決定するため に、我々は複合体形成時の円二色（ＣＤ）スペクトルと蛍光スペクトルの変化を 調べた。０．０１ＭＴｒｉｓ（＋）Ｈ８，０）およｌＪ２０ＯｍＭ　ＮａＣＩ中 で約１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を透析することによって分光光度測定用のタ ンパク質を調製した。透析後、その溶液を濾過しく０゜２２μ、　Ｍｉｌｌｉｐ ｏｒｅ）、吸光度スペクトルを得た。そのスペクトルを光散乱についいて補正し く５ｈａｕｅｎｓｔｅｉｎ　Ｅ、　、　Ｊ、　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ、　１６ ：４５（１９５５））、２８０ｎｍでの吸光度によってタンパク質濃度を決定し た。純粋な試料の組成分析と吸光度に基づい０．１％ て、ｈＧＨに関する５　２ＭＯは０．８２　ｃｍ−’であり、ｈＧＨｂｐｌ：： −＋いては２．３５ｃｍ”である。ｈＧＨはその４つの螺旋塊構造（＾ｄｂｅｌ −Ｍｅｇｕｉｄ　Ｓ、　Ｓ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１＾ｃａｄ、　Ｓｉｃ、 　ＵＳ＾８４：６４３４（１９８７））に特有の強いα−螺旋ＣＤスペクトルを 示す（Ｂｅｖ］ｅｙ　Ｔ＾ら、＾ｒｃｈ、　ｆｌｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　１３８：３３ｇ−３４６（１９７０））。対照的に、ｈＧＨｂｐのＣＤス ペクトルは、ジスルフィド結合で連結された主としてターンとループ（Ｃ１ｅａ ｒｙ、　Ｓ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：１８８４（１９８９）　： 　Ｈｉｌｄｅｒ、Ｒ，Ｃ，ら、　Ｂｉｏｐｈｙｓ奄モ≠戟@Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒ）’　３１：４５（１９８８））からなるタンパク質に特有であり、ｈＧ Ｈｂｐは３つの隣接して連結したジスルフィド結合を含有する（Ｆｕｈ　Ｇ、ら 、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｔ　２６５：３１１３−３１１５（１９９０））。

凍結細胞ペーストを低浸透圧緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５（ｐＨ８，０）、 １　ｍＭ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で融解した 。その懸濁液をホモジナイズし、４℃で１時間撹拌した後、１１００００ｘで２ ０分間遠心分離した。

その上清に固体硫酸アンモニウムを２６０ｇ／Ｌの濃度で加え、溶解するまで撹 拌した。タンパク質沈殿物を１１００００ｘで３０分間の遠心分離によって集め た。そのペレットを１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５（ｐＨ８，０）、１ｍＭＰＭＳＦに 再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。透析液を１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５（ｐ Ｈ８，０）中のＱセファ０−スカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に添加し、０．０ から０．５ＭＮａＣ１への直線的勾配で溶出させた。ｈｃＨｂｐを含有するピー ク分画をｈＧＨアフィニティーカラムに直接充填した。洗浄の後、４ＭＭｇＣ１ ｔ、１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ（ｐＨ７５）を用いてこのカラムを溶出させた。ピ ーク分画を合わせ、ｌＱｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，５）で透析し、Ｍｏｎｏ　Ｑカ ラムに添加し、洗浄し、ｌＱｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，５）中０，０から０．２Ｍ 　ＮａＣ］　へ（Ｄ直線的勾配で溶出サセタ。

ｈＧＨ，！：ｈＧＨｂｐを混合する場合、遠ＵＶＣＤスペクトルはｈＧＨとｈＧ Ｈｂｐに関するスペクトルの和と基本的に同一である（図６Ａ）。この結果は複 合体化した時に通常の二次構造に大きな変化がないことを示している。近ＵＶＣ Ｄスペクトル（図６Ｂ）は芳香族アミノ酸側鎖の非対称な環境を反映する（Ｂｅ ｗｌｅｙ、　Ｔ、　Ａ、　。

Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ■ｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３ ５：１５５５（１９７９）　；　Ｂｅｗｌｅｙ　Ｔ、＾、らA　Ａｒｃｈｉｖｅ ｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　２３３ ：２１９−２２７（１９８４））。ｈＧＨとｈＧＨｂｐのＵＶ吸収スペクトルの 間には大きな相違があり、これは主としてｈＧＨと比較してｈＧＨｂｐのトリプ トファン含量が高い（それぞれ１対９）結果である。しかしスペクトルの強度の 増大を除いて、個々のスペクトルの和は基本的に混合後に得られるものと同一で ある。

蛍光スペクトルでは、ｈＧＨがｈＧＨｂｐに結合した時に、３４０ナノメートル から３３４ナノメートルへの前方偏移と蛍光強度のわずかな減少がある（図７） 。

ヨウ素りエンチングとンユターン・フォルマー分析はホルモン受容体複合体中の トリプトファンの暴露に減少があることを示している。蛍光クエンチノブ研究は ｈＧＨ中のトリプトファンが感知し得るほどには溶媒にさらされていないことを 示しティるのＴ（Ｂｅｗｌｅｙ、　Ｔ、＾、、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ 　ｉｎ　Ｉｌｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３５：ｌ５T５（１ ９７９）　：　Ｂｅｗｌｅｙ　Ｔ＾ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　２３３：２P９−２２７（１ ９８４））、これはおそら＜ｈＧＨを結合した時にｈＧＨｂｐ中の１またはそれ 以上のＴｒｐ残基が隠される結果であると思われる。対照的に、ｈＧＨｂｐの突 然変異分析はＴｒｐ１０４がｈＧＨへの結合にとりわけ重要であることを示して いる。

これらの分光学的研究はｈＧＨｂｐに対するｈＧ）ｌの結合時にほとんど立体配 座変化を示さないが、これらの方法は通常の二次構造の構造的変化（遠［ＪＶＣ Ｄ）および芳香族基の位置の変化（近ＵＶＣＤと蛍光クエンチノブ）に偏してい る。したがって複合体化した成分と遊離の成分の高解像構造は立体配座的変化を さらに明らかにするであろう。

実施例４ 検定法と修飾されたｈＧＨ 修飾したポリペプチドホルモンを本検定法で評価した。−組のｈＧＨ残基（Ｆｌ ｏ、Ｒ５４、Ｋ５６．１５８、Ｒ６４、Ｑ６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｋ１７４ 、Ｋ１７６、Ｒ１７８およびＫ１８５を含む）はｈＧＨｂｐ中化学量論的結合を 付与する上で重要であることが知られている（ＷＯ９０１０４７８８）。ｈＧＨ ｂｐに強固に結合するヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）類縁体とヒトプロラクチ ン（ｈＰＲＬ）類縁体（それぞれＫｄ＝１．ｎＭおよび６ｎＭ）を同定するべく 、これらの決定基をｈＧＨｂｐ結合非競争的ｈＧＨ相同体であるｈＰＬとｈＰＲ Ｌに装備した。既に議論したようにｈＧＨはｈＧＨｂｐと相互作用してｈ　Ｇ　 Ｈ（ｈ　Ｇ　Ｈｂ　ｐ　）　２型の複合体を作る。採用したｈＰＬおよびｈＰＲ Ｌ類縁体はｈＧＨｂｐの二重化を促進しないので、我々はｈＰＬ骨格とｈＰＲＬ 骨格が最初の受容体認識と結合に必要なものとは異なる必須の三員化決定基を欠 いていると結論することができる。ｈＧＨ（ｈＧＨｂ　ｐ）２の形成に関与する ドメインの位置を特定するために、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ相同体置換を伴う一連 のｈＧＨ突然変異体と２つの欠失類縁体を、ホルモンが誘発する受容体三量化の 減少についてスクリーニングした。次に重要な側鎖をより詳細なアラニン走査法 によって同定した。

ホルモンが誘発するｈＧＨｂｐの二重化を定量するために、我々はフルオレセイ ンで標識されたｈＧＨｂｐのホモクエンチノブを測定する高感度な検定法を使用 した。突然変異ｈＧＨｂｐ　５２３７Ｃを構築し、精製し、５−ヨードアセタミ ドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）と反応させることによって蛍光的に標識された ｈＧＨｂｐ（５２３７Ｃ−ＡＦ）を得た。ここに得られた３２３７Ｃ−ＡＦ試薬 は１ｈＧＨｂｐ分子につき１つの標識を保持しており、競争結合検定で完全な結 合活性を保っている。フルレセインは重複する励起スペクトルと放射スペクトル を有するので、この蛍光プローブはこれらの分子が互いに接近した時にホモクエ ンチノブを起こす。この信号を用いてホルモンが誘発する５２３７Ｃ−ＡＦの二 重化を図８に示すように監視した。

図８には、ｈＧＨの連続的添加による１０ｎＭ　５２３７Ｃ−ＡＦのホモクエン チノブを示す。５２３７Ｃ−ＡＦを結合緩衝液（２０ｍＭ　ｔ　ｒ　ｉ　５−Ｈ ＣＩ（ｐＨ７５）、０１％Ｂ５Ａ１０．０２％ＮａＮ５）で１．０ｎＭ濃度に希 釈し、１．Ｏｍｌづつ１２Ｘ７５ｍｍポリプロピレン検定チューブに分注した。

別個に、１２０ｍＭから０．００２ｍＭまでにわたるｈＧＨの希釈液を作成した 。次にｈＧＨ希釈液の一部（１０ｍｌ）または緩衝液のみを５２３７Ｃ−ＡＦチ ューブに加え、平衡化するために暗所で２５℃で５時間その混合物をインキュベ ートした。インキュベーション後、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＲＦ　５０００　Ｕ分光 蛍光計を用いて４９０ｎｍの励起Ｉと５１２ｎｍの放射■（バンド幅はそれぞれ ３ｎｍと１０ｎｍ）で蛍光測定を行った。３つの読み取り値からＦ／Ｆ０値を計 算し、ｈＧＨ濃度に対してプロットした。５２３７Ｃ−ＡＦの調製は次の通りで ある。既に記述したように突然変異体５２３７ＣｈＧＨｂｐを構築し、精製した 。１ｍｇ／ｍｌ　８２３７Ｃの溶液を２５ｍＭンステイ：／ＨＣＩ、２５ｍＭ　 ＮａＨＣＯｓにし、位置２３７のンステインを脱遮断するために４℃で２時間イ ンキュベートした。５０ｍＭｔｒｉｓ・ＨＣＩ（ｐＨ８）で平衡化したＰ　Ｄ　 １０　（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ）ミ二カラムを用いてコノタンパク質を脱塩し、 直ちに５００　ｍＭ　５−　Ｉ　Ａ　Ｆ　（ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ ｓ）と暗所で４℃で１６時間反応させた。５−ＪＡＦ添加前の脱遮断された５２ ３７ＣのＤＴＮＢ分析は５２３７ＣＩ分子につき１遊離チオール基の平均値を示 した（２２μＭ遊離ＳＨ対１７μＭ　５２３７Ｃ）。２０ｍＭ　ｔｒｉｓ−Ｈｃ ］（ｐＨ７，５）で平衡化したもう１つのＰＤ１０ミ二カラムを用いて、遊離の 発蛍光団から５−ＩＡＦと反応した８２３７Ｃを精製した。精製した５２３７Ｃ −ＡＦの一部を一８０℃で保存し、使用する直前に融解した。５２３７Ｃ−ＡＦ の吸着スペクトル分析は、７１３００（４９４ｎｍ）と６４８００（２８０ｎｍ ）のモル吸光係数を用い、２８ＱｎＭにおける５−ＩＡＦ吸光度の妨害について 補正することにより、１．０ｍＭ５２３７Ｃにつき０．８４ｍＭのフルオレセイ ン結合を示した。

ここで１０ｎＭ濃度に固定した８２３７Ｃ−ＡＦに対してｈＧＨを連続的に希釈 し、平衡時に蛍光ホモクエンチノブを測定した。ホモクエンチノブはｈＧＨの添 加と共に増大し、ｈＧＨが０．５モル当量（５ｎＭ）の時に最大（ΔＦ／ＦＯ＝ １１％）になる。しかし極めて注目すべきは、このホモクエンチノブがより高い ｈＧＨ濃度で反転することであり、これは過剰のｈＨＧ（即ちｈＧＨ／ｈＧＨｂ ｐ＞０．５）の存在下ではｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２がｈＧＨ−ｈＧＨｂｐ単量 複合体に解離することを示している。ドナー（Ｓ２３７Ｃ−ＡＥＤＡＮＳ、ｒｅ ｆ、）蛍光クエンチノブとアクセプター（５２３７Ｃ−ＡＦ）蛍光増大の両方を 測定するために同一でないドナー／アクセプタ一対を用いる実験で示されるよう に、測定される蛍光ホモクエンチノブは純粋なフォルスターエネルギー転移を反 映する。大過剰のｈＧＨ（＞７０ｎＭ）の存在下で起こる蛍光測定値のＦ／Ｆｏ ＞１への増大は、結合したｈＧＨ−５２３７Ｃ−ＡＦ複合体に対して遊離の３２ ３７Ｃ−ＡＦのより高い非特異的結合によるものと思われる。この現象は我々の 検定法で得られるＩＣ３゜値をわずかにゆがめるかもしれないが（図９）、我々 の分析の基礎である相対的ＩＣ，。値は影響を受けないはずである。

図９ではｈＧＨが誘発する５２３７Ｃ−ＡＦの二重化に関するＩＣ５゜値を決定 した。結合緩衝液（２０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、０．１％ＢＳ Ａ、０゜０２％ＮａＮ５）中の３２３７Ｃ−ＡＦ（図８について説明したように 調製したもの）の連続的希釈液（３倍）を６０ｎＭから０．０８ｎＭの範囲にわ たって調製し、ｌ。

Ｑｍｌづつを検定チューブに分注した。同様に、ｈＧＨを連続的に３μＭから０ ００４μＭの範囲にわたって希釈した。ｈＧＨ希釈液の一部（１０μＩ）（１： ２のｈＧＨと５２３７Ｃ−ＡＦのモル比を与える）と緩衝液のみを８２３７Ｃ− ＡＦの入った検定チューブに加え（３つ一組）、混合し、インキュベートするこ とによって暗所で２５℃で５時間平衡化した。平衡後、既に記述したように（図 ８）蛍光を測定したが、ただし励起バンド幅を１０ｎＭとした。半最大ΔＦ／Ｆ ０値を与えるｈＧＨの濃度としてＩＣ，。値を計算した。

表２にｈＧＨの様々な相同体置換体および欠失突然変異体によって誘発される５ ２３７Ｃ−ＡＦの三量化に関するＩＣ，。値を示す。ｈＧＨ突然変異体の同定は △、欠失体、ｈＰＬ、ヒト胎盤性ラクトゲンによる置換体、ｈＰＲＬ、ヒトプロ ラクチンによる置換体として表す。欠失または置換の領域を括弧内に指定する。

ＩＣｓ。値は図２について記述したように決定した。標準偏差は一般に報告する 値の＋／−５０％未満である。

表２ ｗｔ　ｈＧＨＯ，５４−−− △（１−８）ｈＧＨ＞　１００ ｈＰＲＬ（１２４９）　１０　１９ ｈＰＲＬ（２２−２３）　０．６６　１．２Δ（３２−４６）　０．４２　０． ８ ｈＰＬ（４６−５２）　０．９４　１．７ｈＰＲＬ（５４−７４）　２．５　４ ．７ｈＰＲＬ（８８−９５）　０．７２　１．３ｈＰＲＬ（９７−１０４）　１ ．６　２．９ｈＰＬ（１０９４１２）　３．０　５．５ｈＰＲＬ（１１１１２９ ）　＞１００ ｈＰＲＬ（１２６−１３６）　１．２　２．２ｈＰＲＬ（１３７−１４５）　０ ．６９　１．３ｈＰＲＬ（１４６−１５２）　０．５１　０．９最初に、ｈＰＬ およびｈＰＲＬセグメントａ換を用いて一連の相同体走査ｈＧＨ突然変異体を５ ２３７Ｃ−ＡＦに基づく検定法で試験した（表２）。これらのうちの３つ、即ち ｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（５４−７４）およびｈＰＲＬ（１１１−１ ，２９）はホルモンが誘発するｈＧＨｂｐの三量化にわずかな減少（それぞれＪ ８．６および＞　１００倍）を引き起こした。しかしｈ　ＰＲＬ　１２−１９と ｈＰＲＬ　５−１−７４は一次部位結合にとって非常に重要な残基を破壊し、こ の部位に関するｈＧＨｂｐの親和性を本質的に減少させることがわかった。これ らの突然変異体に関する一次部位結合の喪失は観測されたｈＧＨｂｐ二量化の減 量化主たる原因であると思われる。実際に、野生型ｈＧＨによる５２３７Ｃ−Ａ Ｆホモクエンチングについて観測された５００ｐＭというＩＣｓ。は−次部位ｈ ＧＨｂｐ親和性について報告された値（Ｋｄ＝４００ｐＭ）とほぼ同一である。

さらに、結合親和性を減じる一次部位決定基の突然変異（例：Ｒ６４Ａおよびに １７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）が三量化をも減じることが示され、−次部位についてｈ ＧＨｂｐの親和性を増進することが示されたｈＧＨ突然変異体（Ｒ１７４Ａ）は 我々の検定法で測定したときに三量化をも増進する。他の相同体突然変異体ｈ　 ＰＲＬ（１１１，−１２９）は−次部位結合には影響を与えないが、サイズ排除 クロマトグラフィーによって分析した場合に、９０％はｈＧＨ−ｈＧＨｂｐ複合 体のみを形成するが、残りの１０％はｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２を形成するとい う不均質性の証拠を示す。

比較的無傷な二次部位結合を伴うこの突然変異体の副分画の存在は、この突然変 異体の効果の原因をタンパク質折り畳みの失敗または翻訳後修飾に帰することが できることを示唆している。

相同体走査突然変異体に加えて、２つのｈＧＨ欠失類縁体（１つはＮ−末端から ８残基を除去したもの［△（１−８）］であり、もう１つのは残基３２〜４６が 欠失した天然の変種（２０Ｋ　ｈＧＨ，米国特許第４４４６２３５号）である） を試験した（表２）。△（１−８）突然変異体はｈＧＨｂｐの三量化を誘発する という能力の劇的な減少（＞１００倍）を示した。この突然変異体は一次部位結 合に対してわずかな効果しか持たないので（Ｋｄ、、、、／Ｋｄ、、＝４）、ｈ ＧＨｂｐ二量化の減量化二次部位ｈＧＨｂｐ結合の破壌によるものと思われる。

実施例５ ｈＧＨ変種のアラニン走査 二次部位ｈＧＨｂｐ結合に関与する特定の側鎖を解明するために、△（１−８） 、ｈＰＲＬ（１１−１９）およびｈＰＲＬ（１１１−１２９）突然変異体で同定 されたドメインをアラニン走査によって詳細に調べた。ブタ成長ホルモンのＸ線 結晶構造によれば相同体置換によって同定された２つのドメインは螺旋であり、 かつ、高度に両親媒性であるので、われわれはスクリーニングする突然変異体を 、残基が溶媒にさらされていると思われるこれらの螺旋の親水性表面に位置する ものに集中させた。これらのドメインに加えて、Ｃ−末端付近の３突然変異体（ Ｅｌ、８６Ａ。

５１８８ＡおよびＲ１９１Ａ）をもスクリーニングした。なぜならこの領域にお ける適当な相同体置換類縁体がなかったからである。

２６種の一組のアラニン突然変異体（表３）から、ｈＧＨｂｐの三量化に大きな 破壊をもたらす２つの突然変異体ＦＩＡと１４Ａ（それぞれ３３倍と５６倍）と 、≧２倍の減少を引き起こす他の４種（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｒ１１９ Ａ）を見つけた、アラニン走査はＮ−末端ドメイン中のＦＩＡと１４Ａに隣接す る残基が螺旋ＡとＣのＣ−末端ドメイン中の残基と共に、二次部位ｈＧＨｂｐ結 合に有意な寄与をしないことを示している。Ｎ−末端ドメインからＦｌとＲ２を 削除したｈＧＨＱ縁体［△（１，２）］から得られる追加のデータは、△（１， ２）がＦＩＡのみの場合以上には三量化を破壊しないことを明らかにし、このこ とはＮ−末端アミンまたはカルボニル基ではな（フェニルアラニン側鎖が重要で あることを示している。アラニン走査分析は、二次部位ｈＧＨｂｐ結合と受容体 の三量化に最も寄与するｈＧＨ決定基がＦｌおよび１４の疎水性側鎖であること を明らかにしている。これらの決定基は、主として親水性を示す（Ｂｏｕｔｉｎ 　Ｊ、Ｍ、ら、Ｃｅ１ｌ　６９：（１９８ｇ））多くの残基（Ｍａｔｔｈｅｖｓ 、　Ｂ、　１．　、　Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、　３３：４９１−４９７（ １９６８））から■驕|次部 位結合にとって必須なものとは著しく異なる。

表３に、アラニン置換したｈＧＨ突然変異体によって誘発される５２３７Ｃ−Ａ Ｆの三量化に関するＩＣ，。値を示す。突然変異体は野生型残基とアミノ酸配列 中での位置及びそれに続く突然変異体残基（この場合にはアラニン）で命名され ている。−文字コードによって指定されるアミノ酸はＡ、Ａｌ　ａ　：Ｃ，Ｃｙ ｓ　；Ｄ。

Ａｓｐ；Ｅ、Ｇｌｕ；Ｆ、Ｐｈｅ：Ｇ、Ｇｌｙ：Ｈ，Ｈｉｓ　：　Ｉ、Ｉ　ｌｅ ：Ｋ。

Ｌｙｓ　：Ｌ、Ｌｅｕ　：Ｍ、　Ｍｅｔ　；Ｎ、Ａｓｎ　；Ｐ、Ｐｒｏ　：Ｑ、 　Ｇｉｎ　；Ｒ。

Ａｒｇ：Ｓ、Ｓｅｒ：Ｔ、Ｔｈｒ；Ｖ、Ｖａｌ；児　Ｔｒｐ；Ｙ、Ｔｙｒである 。

発現されない突然変異体をＮＥと指定する。ＩＣ５ｏ数は図２に記述の如く計算 する。標準偏差は一般に報告する値の＋／−５０％未満または表示の通りである 。

表３ Ｗｌ　ｈＧＨ０，５４− ＦＩＡ　７ｊ　１４ Ｐ２Ａ　５］　１．Ｉ Ｔ３Ａ、′７２１：３ ＋４Ａ　３０　５５ Ｐ５Ａ　３２　１１ Ｌ６Ａ　１．４　２５ ′Ｓ７Ａ　、３７　０．７ Ｒ８Ａ　ＩＪ３　３．４ Ｆ１０Ａ　、７７　１．４　ＤｌｌＡ に Ｎ１２Ａ　５１　１．１ Ｌ１５Ａ　、３６　０ｊ 日１６Ａ　、６３　１２ Ｈ１８Ａ　５５　１Ｄ Ｒ１９Ａ　、９２　１．７ Ｈ２ｊＡ　３１　１０ Ｄ１０７Ａ　３８　０．７ Ｎ１０９Ａ　、３５　０：！ Ｙ１１１Ａ　ＩＤＩ！ Ｄ１１２Ａ　、５３　１Ｄ Ｋ１１５Ａ　、８４　１β Ｄ１１６Ａ　３．１　ａ７　ε１１ａＡ　ｆｆ１Ｂ Ｒ１１９Ａ　１．１　２０ ０１２２Ａ　、４　０．７ ＴＩ２３Ａ　ＥＳ１２ Ｒ１２７Ａ　ＥＤ１５ Ｅｉ２９Ａ　、７０　１３ Ｄ１３０Ａ　、４２　Ｑｆｉ Ｅ１８６Ａ　！　１．１ ８１８８Ａ　、４９　Ｂ １９１Ａ 実施例６ 蛍光のホモクエンチング 固定した濃度の８２３７Ｃ−Ａ、Ｆ（１００ｎＭ）に対してｈＧＨの逐次的な添 加を行うと、実時間で監視した蛍光ホモクエンチング（実施例４）は、ｈＧＨが 誘発する二重化に関する速い平衡時間（〈３分）と、引き続いて起こる過剰のｈ ＧＨ（即ちｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ＞０．５）による二重化の反転に関する遅い平衡 時間（〉３０分）を示す。このことは、二重化の反転が、ＨＲ＋Ｒ，−４−ＨＲ Ｘ＋Ｒ−＞十過剰Ｈ−２ＨＲ（ここでは化学量論的な結合がｈＧＨ過剰の条件下 て二重化と競争する）という機序に従う脱離速度律速であることを示唆している （Ｈ＝ｈＧＨ，Ｒ＝遊離のｈＧＨｂｐ、Ｒ＋＝−次部位ｈＧＨｂｐ、Ｒ，＝二次 部位ｈＧＨｂｐ）。我々は一次部位の化学量論的結合が起こり、それゆえにこれ がｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体の形成と競争するに違いないことを知っている 。化学量論的二次部位結合が起こり得るかどうかを決定するために、−次部位を 除去するように工作した類縁体を、二重化に関して競争する能力について試験し た。ｈＧＨｂｐ親和性を５００倍減少させる一次部位の中央部の突然変異を伴う 二重突然変異体に１７２Ａ／Ｆ１７６Ａは二次部位を保持している。図１０はｈ ＧＨｂｐの二重化が１６０倍過剰（８００ｎＭ）の存在下でさえ過剰のに１７２ Ａ／Ｆ１７６Ａによって反転し得ないことを示している。対照的に、工作された 一次部位を含有し、二次部位決定基を欠く既知のｈＰＬ変種は２０ｎＭ（４倍過 剰）のＩＣ，。で効率よく二重化を遮断する。このデータは化学量論的な二次部 位結合が起こらないということと、二重化が、 という逐次的な結合機序によって進行しなければならないということを立証して いる。

二次部位ｈＧＨｂｐ結合は化学量論的な一次部位複合体の形成を必要とするので 、この結合事象はｈＧＨのみではな（ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）中に存在する決定 基に依存しなければならない。したがってこれらの決定基は一次部位ｈＧＨｂｐ および／または最初のｈＧＨｂｐ結合事象によって引き起こされる立体配座変化 から導入されなければならない。

実施例７ Ｘ線結晶学に基づ＜ｈＧＨ−ｈＧＨｂｐアミノ酸相互作用ｈ　Ｇ　Ｈ（ｈ　Ｇ　 Ｈｂ　ｐ　）　２結晶の形成は、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ａｃ ａｄｅ＋＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　１９７６）に記述されている方法に従ってＸ線結晶学的技術を 用いてｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体の三次元構造を決定することを可能にする 。反復種晶添加と静置滴における蒸気拡散の組み合わせを用いてこの複合体の結 晶を成長させた。わずかに２．１モル過剰になるようにｍｅ　ｔ−ｈＧＨにｈＧ Ｈｂｐを添加することによって結晶貯蔵液を調製し、これを４℃で２４時間イン キュベートした。次に複合体を濃縮し、１２０ｍＭＮａＣ］、２０ｍＭ酢酸ナト リウム（ｐＨ５，５）、１ｍＭＰＭＳＦを用いて平衡化したサイズ排除カラム（ Ｇ　７５−１２０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｓｉｇｍａ））に充填した。次に複合体 を含有する分画を貯蔵し、濃縮し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）、１ ｍＭ　ＰＭＳＦに脱塩した。得られた貯蔵溶液中の複合体の濃度は４ｍｇ／ｍ］ （Ｅｚｓｏ（０，１％）＝１．６７　ｃｍ−’）であった。０．ＩＭ　Ｂ　１ｓ −ｔ　ｒ　ｉ　５（ｐＨ６，５）を用いて複合体の貯蔵液を１．７ｍｇ／ｍｌに 希釈し、これに飽和硫酸アンモニウム（超純粋（Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｍａｎｎ）　 ）を加えて１０％飽和溶液を調製した。Ｍ　Ｐ　Ｄ　（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え て最終濃度１％にした。次にピペットを用いてこの混合物の５０μｌをＰｙｒｅ ｘガラススポットプレートに移し、１５０ｍｍＸ２５ｍｍプラスチック培養皿中 で４０％飽和硫酸アンモニウムに対して室温で２日間平衡化させた後、種結晶を 導入した。４５ｋＶ、１１０ｍＡで作動する回転アノード発生器上で２７人に回 折する１ｍｍｘ０．５ｍｍｘ０．１ｍｍの大きさの結晶が２週間以内に得られた 。

ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）ｚ結晶構造の三次元ポリペプチド構造を図１１に示す。太 い線で描かれた中央上部の領域はｈＧＨ分子を表し、アルファ螺旋を明確に見る ことができる。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子（１つは左側にあり、も う１つは右側にある）に結合している。これらのｈＧＨｂｐ分子のそれぞれは単 一鎖によって連結された２つのドメインを有する。上部ドメインはｈＧＨ分子と 同じ高さにあり、もう１つのドメインは垂直方向を向いており、この図の底部に 向かって突き出している。ｈＧＨｂｐの後者の２つのドメインは図１１の最底部 で互いに接触している。底部におけるこの接触は２つのｈＧＨｂｐ分子の間で唯 一の接触領域を構成しており、この接触点について後述する。この構造に基づい て、相互作用する３つのポリペプチドのアミノ酸の分析を行った。これらは次の ３つのカテゴリーに分類される　１）表４に列挙するｈＧＨとｈＧＨｂｐｌ（最 初に結合するｈＧＨｂｐ）の間の相互作用；２）表５に列挙するｈＧＨとｈＧＨ ｂｐ２（２番目に結合するｈＧＨｂｐ）の間の相互作用；および３）表６に列挙 する複合体中の２つのｈＧＨｂｐ間の相互作用。表４と表５は表示する唯一のｈ ＧＨｂｐアミノ酸に結合している唯一の個々のｈＧＨアミノ酸を開示している。

結合している特定の部分と化学的相互作用の性質をも列挙しである。命名法は標 準的な一文字標記に従い、アミノ酸の番号は天然のｈＧＨまたはｈＧＨｂｐのア ミノ末端から番号を付与したものである。表４．５および６中の残りの用語は次 の通りに定義される：ＭＣ＝生鎖、ＳＣ＝側鎖、ＳＳ＝ＳニジスルフィドＢ＝水 素結合、ＳＢ＝塩橋、ＶＷ＝ファン・デル・ワールス。これらの表は部位１およ び部位２が作用するすべての残基を網羅したものではない。

表４ 部位１相互作用 ｈＧＨ部分　ｈＧＨｂｐｌ　部分　相互作用表５ 部位２相互作用 ｈＧＨ部分　ｈＧＨｂｐ２　部分　相互作用表６ 結合タンパク質相互作用 ｈＧＨｂｐｌ　部分　ｈＧＨｂｐ２　部分　相互作用実施例８ ｈＧＨ受容体を刺激するためのモノクローナル抗体の使用本発明の検定法を用い て成長ホルモン受容体に対するモノクローナル抗体をスクリーニングすることが できる。次いで得られたモノクローナル抗体を、成長を促進する相対的能力につ いてインビボで評価することができる。グリコジル化されたラットおよびウサギ 受容体を免疫原として用いてモノクローナル抗体ＭＡｂ２６３（＾ｇｅｎ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ、オーストラリア、クィーンズランド）を作成した。下垂体 切除ラットに、ラット中１５５μｇ／ＫｇのｈＧＨ投与量に対してモル基準で等 価な投与量でＭＡｂ２６３を毎日皮下注射したところ、図１２に示すように有意 な体重増加があった。

それぞれ８匹のラットからなる２つの群に、ＭＡｂ２６３（１，０５ｍｇ／ｋｇ ）と共に、あるいはＭＡｂ２６３なしで、賦形剤緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　 ５（ｐＨ８）、０１％牛血清アルブミン）を与えた。要求に応じて水と食物をラ ットに与えた。毎日の体重を図１２に示す。第６日の終了時にう・ソトの体重を 測定し、その結果を次の表７に示す。

表７ モノクローナル抗体が誘発する体重増加群　体重増加／ラット　体重増加率 ＭＡｂ２６３　６．０７５ｇ÷／−１．９７　ｇ　６．４７＋／−１，９７％し たがって体重増加を得るために成長ホルモン受容体に対するモノクローナル抗体 を投与することがてきる。

実施例９ 作用薬または拮抗薬活性に関する細胞検定法細胞に基づく新規な生物活性検定系 を本明細書に記載する。これはホルモンまたはサイトカイン受容体（例えばＥＰ Ｏ，アルファーインターフェロン、ベーターイシターフェロン、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、 Ｃ−Ｃ３Ｆ、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、インターロイキン２．３．４． ６または７の受容体など）にそのＣ−末端で解放されたＧ　Ｈ受容体の細胞外Ｇ Ｈ結合ドメインからなるハイブリツド受容体（米国特許第４８５９６０９号）形 質転換細胞系に基づき、該細胞系は通常はホルモンまたはサイトカインに対して 応答性であり、また通常はホルモンまたはサイトカインの受容体を含有する。通 常、そのＮ−末端でＧＨ受容体断片に融合されたホルモンまたはサイトカイン受 容体の貫層および内部原形質部分のみを使用する。該細胞の応答特性は、例えば 分析物の放出（例・脱顆粒）、有糸分裂性、増殖、膜特徴の変化などの測定可能 な特徴である。

ｈＧＨ受容体は血液形成起源の受容体の大きなファミリー（７）に属し、このフ ァミリーにはインターロイキン−３（ＩＬ−３）および顆粒球コロニー刺激因子 （Ｇ−Ｃ８Ｆ）受容体が含まれる。Ｎａｇａｔａとその共同研究者ら（８）は、 全長ネズミＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションされたＩ　Ｌ−３依存性骨 髄性白血病細胞系（ＦＤＣ−Ｐｉ）がＩＬ−３を伴わないＧ−ＣＳ　Ｆの添加に よって増殖することを明らかにした。あるハイブリッド受容体（米国特許第４８ ５９８０９号および５０３０５７６号）は大阪バイオサイエンス研究所のＥｔｓ ｋｏ　ｌ５ｈｉｚａｋａ−１ｋｅｄａおよびＳｈｉｇｅｋａｚｕＮａｇａｔａ博 士によって構築されたものであり、これはＧ−ＣＳ　Ｆ結合ドメインを欠くが３ つの細胞外フィブロネクチン反復、貫層ドメインおよび細胞内ドメインを含有す る型のｍＧ−Ｃ５Ｆ受容体に連結したｈＧＨｂｐを含有する。フィブロネクチン ドメインはＧ−ＣＳ　Ｆの結合に関与しないが、ｍＧ−Ｃ３Ｆ受容体の良好な発 現には必要である（８）。

ｍＧ−Ｃ８Ｆ受容体のエクソン７から１５（これは３つのフィブロネクチンドメ インと貫層および細胞内ドメインの全体をコード化する）に連結したｈＧＨ受容 体のエクソン１から５まで（これは分泌シグナルと細胞外ｈＧＨ結合ドメインを コード化する）を含有するｃＤＮＡからハイブリッド受容体を構築した。ｈＧＨ 受容体に由来する配列（Ｌｅｕｎｇ　Ｄら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５３７（ １９８７））をＰＣＲによってベクターｐＢＯ８−１６２（８）中にクローン化 し、これによってＦＤＣ−ＰＬ細胞における該ハイブリッド受容体の発現を可能 にした。２つの受容体断片の連結部にひとつのシスティンを作った。安定なＦＤ Ｃ−ＰＩ細胞系のトランスフェクションと培養は後述の通りである。

１細胞あたりのおよその受容体数と親和性を立証するために、全細胞上のハイブ リッド受容体からの［＋”ｌ］ｈＧＨの競争的置換を用いた。Ｉ　Ｌ−３で成長 させた細胞を検定の前にリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）＋１０％ＦＢＳで洗浄し た。２０ｐＭ［”’ＩコｈＧＨ（Ｙ１０３Ａ）の存在下でｈＧＨの連続的希釈液 と共に細胞を４℃で１８時間インキュベートした（１．２Ｘ１０’／ｍｌ）。次 に過剰の標識を除去するために細胞をＰＢＳで２回洗浄した。第２ｈＧＨｂｐの 結合を部分的に遮断し得るＹ２Ｏ２のヨウ素化を防止するためにＹ１０３Ａを用 いた（９）。

数回の独立した結合実験において、ｈＧＨに関する見かけ上のに、値は０．１± ０．０３ｎＭであり、１細胞につき１０００±３００個の受容体があった。この 親和性は可溶性ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨ結合より約３倍強く、細胞上の受容体 に対するｈＧＨの結合に関する親和力効果の反映であり得る。トランスフェクシ ョンされなかった細胞はｈＧＨに関する特異的結合部位を欠いた（９）。図１３ は細胞増殖を誘発するというｈＧＨの能力に対する増大するｈＧＨ濃度の効果を 示している。低濃度においてｈＧＨはこの検定法で強力な作用薬として作用し、 そのＥＣ，。は〜２０ｐＭで、この値は全細胞上の見かけ上のに、（〜１０１０ ０ｐよりい（らか低い。これは最大細胞増殖が１００％の受容体占有未満で起こ り得ることの反映であり得る。

突然変異分析（３，４）と構造研究（５）は各ｈＧＨ分子がｈＧＨｂｐを結合す るための２つの別個の部位を含有する点で二価であることを示している。対照的 にｈＧＨｂｐは、ｈＧＨ上の部位１または部位２に結合するために基本的に同じ 決定基を使用するので、実際上−価である。過剰なｈＧＨはｈＧＨ・（ｈＧＨｂ ｐ）ｚ複合体を解離させて、ｈＧＨが専ら部位１を介してｈＧＨｂｐに結合して いるｈＧＨ−ｈＧＨｂｐ複合体を形成させるであろう。したがって我々は過剰な ｈＧＨが拮抗信号であるに違いないと推定した（図１）。実際に極めて高いｈＧ Ｈ濃度では増殖活性が失われる（ＩＣ６゜０２ＲＭ）。Ｉ　Ｌ−３が誘発する細 胞増殖は高いｈＧＨ濃度（８μＭ）の存在下でも変化せず、ｈＧＨが細胞増殖に とって毒性でないことを示している。作用薬変曲点または拮抗薬変曲点はいずれ も細胞密度に依存せず（図１３）、この効果が細胞間の架橋受容体または他の細 胞−細胞相互作用を伴わないことを示している。さらに全長ｍＧ−Ｃ８Ｆ受容体 を含有するＦ　Ｄ　Ｃ−Ｐ１細胞はｈＧＨに応答しないし、ハイブリッド受容体 を含有する細胞もＧ−Ｃ５Ｆに応答しない。

実施例１０ ハイブリッド受容体細胞増殖検定を信号化するためのｈＧＨｂｐの三量化にとっ ての必要条件をさらに調べるために、我々はｈＧＨｂｐに対する二価モノクロー ナル抗体（ＭＡｂ）とそれらに由来する一価断片（ＦＡｂ）を使用した。低濃度 の４つの異なる抗受容体ＭＡｂのうち３つの増大する濃度の添加が、細胞増殖の 誘発に関してｈＧＨと同じぐらい強力であった（表８）。

タンパク質　Ｋｇ（ｎＭ）＊　ＥＣ５ｏ↑　相対最大応答　自己拮抗性：ＦＡｂ ２６３　ＮＤ　＞１．５重Ｍ　Ｎ０ＦＡｂ３Ｄ９　ＮＤ　＞３μＭ　Ｎ０ ＦＡｂ３Ｄ９　ＮＤ　＞０．１　＃１Ｍ　ＮＤＦＡｂ５　ＮＤ　＞１μＭ　ＮＤ ０１２０日　０．３　Ｎｏｎｅ　− Ｈ２１Ａ／日６４に／Ｅ１７４Ａ０．０１　２０ＲＭ　６０ＲＭＭＡｂ５および ２６３は＾ｇｅｎ、Ｉｎｃ、（＝ニー７＋−ンー）から得たものであり、Ｗａｔ ｅｒｓとその共同研究者らによって記述されている（Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒら、 　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１５：１８０５−１８１３（１９８４）　；　 Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３１　：４５９−４６ ８（１９８T））。ＭＡｂ １３Ｅ１と３Ｄ９はＧｅｎｅｎｔｅｃｈのハイブリドーマグループから得たもの であり、その性質は他の文献に記述されている（３）。簡単に述べると、プロテ ィンＡ−セファロースに対する結合と０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ３，０）による溶出 によってマウスの腹水からＭＡｂを精製した。ジチオスレイトールで活性化した ＰＢＳ中のパパイン＋１０ｍＭシスティンでＭＡｂを１時間処理（５０：１重量 ＭＡｂ／重量パパイン）することにより、ＦＡｂ断片を調製した。０，１Ｍヨー ドアセタミドの添加によって消化を停止させた。Ｆｃと残存ＭＡｂをプロティン Ａ−セファロースに２回吸着させ、次いでスーパーロース１２　（Ｐｈａｒｉａ ｃｉａ）でのゲル濾過によって除去した。

各ＭＡｂに関するＥＣ５゜値（０，３ないし１重Ｍ）は通常、ＥＬＩＳＡによっ て決定したに、よりいくらか低い値であった（表８）。ｈＧＨの場合と同様に、 これは全細胞に対する親和性効果および／または最大信号化が１００％受容体占 有未滴で達成されることの反映であろう。はるかに高い濃度（２０ｎＭないし〉 １０ＲＭ）では３つのＭＡｂのうち２つが活性を失った。これはおそらく過剰の ＭＡｂがｈＧＨｂｐへの一価結合ゆえに受容体の架橋を遮断するからであろう。

対応する一価ＦＡｂ断片は基本的に不活性であり（表８）、信号化活性にとって 二価性が必要であることをさらに示している。

これらのＭＡｂに関する用量応答曲線の相違は、それらがｈＧＨｂｐに結合する 方法の相違によって説明することができる。ＭＡｂ５は、おそらく両受容体が互 いに接触する領域に結合することによって（１１）、ｈＧＨ−ｈＧＨｂｐ複合体 に対する第２ｈＧＨｂｐの結合を防止する。ＭＡｂ５が最も効率が低いという事 実は最大信号化にとって受容体が互いに密接に接近する必要があることを示して いるのであろう。ＭＡｂ１３Ｅ１はｈＧＨ結合（１１）を遮断し、ｈＧＨの効果 を模倣する。このＭＡｂは広い平坦部を示し、拮抗検相を示さない。これはおそ らく我々が観測し得るほどに高いＭＡｂ濃度に達し得なかったためであろう。我 々はこの中和ＭＡｂがｈＧＨと同様に結合して極めて安定な受容体二量体を形成 するのであろうと考える。対照的に、ＭＡｂ２６３と３Ｄ９はホルモン−受容体 境界から離れたところに結合し、類似する作用薬相と拮抗薬相を示す。これら２ つの相はｈＧＨはどには広く離れていない。これはおそら（二量体が最適な受容 体−受容体接触を伴わないからであろう。ＭＡｂ２６３と３Ｄ９が作用薬である という事実は、活性な二量体を形成するための構造上の必要条件がかなりルーズ であることを示唆している。

Ｍ、Ａｂ１３Ｅ１またはＭＡｂ５に由来するＦＡｂ断片はｈＧＨが誘発する細胞 増殖に拮抗するが、ＭＡ　ｂ　２６３と３Ｄ９に由来するものは拮抗しない（表 ９）。

これらの研究はＭＡｂ１３Ｅ１とＭＡｂ５に関するエピトープがホルモン−受容 体または受容体−受容体境界を遮断するという事実と合致している。

表９ ハイブリッドｈＧＨ−ｍＧ−Ｃ５Ｆ受容体を含有するＦＤＣ−ＰＩ細胞のｈＧＨ が誘発する細胞増殖を遮断するＦＡｂおよびｈＧＨ類縁体の拮抗効果の要約。１ 重Ｍ　ｈＧＨ十増大する濃度のＦＡｂまたはｈＧＨ類縁体と共に細胞をインキュ ベートした。半最大阻害濃度とはｈＧＨの細胞増殖活性の５０％を遮断するのに 必要な濃度をいう。「なし」は１０ＲＭまでのＦＡｂまたはｈＧＨ類縁体で阻害 がＦＡｂ２６３　なし ＦＡｂ１３Ｅ１　０．８μＭ ＦＡｂ５　０．２μＭ ＦＡｂ３Ｄ９　なし ｈＧＨ２μＭ Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ　なし Ｇ１２０Ｒ２０ＲＭ Ｈ２１Ａ／Ｒ６４に／Ｅ１７４Ａ　６０ｎＭ実施例１に 量化のためのｂＧＨ上の構造的な必要条件をさらに決定するために（図１１）、 我々は部位１または部位２に対する受容体の結合を減じるように設計したｈＧＨ の突然変異体を試験した。部位２決定基は保存しているが部位１中の重要な側層 （１２）が変化している二重突然変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）は細胞増殖 を促進するが、ＥＣ，。は野生型ｈＧＨ（表８）より約１０３倍高い濃度に移動 する。このことはインビトロで測定した部位１結合に関するに６の５００倍の減 少と合致する（１２）。我々はに１７２Ａ／Ｆ１７６Ａでの滴定において不活性 相を観測し得るほど高い濃度には達し得なかった。単−ｈＧＨ突然変異体（Ｇ１ ２０Ｒ）は機能的な部位１を保持しているが、部位２を立体的に遮断する。この 突然変異体は基本的にいずれの濃度でも不活性である。したがって、細胞増殖を 促進するには部位１または部位２のいずれかに対する結合が必要であるが、それ だけでは十分でない。

逐次的な信号化機序は、部位２結合が遮断されている（しかし部位１結合は遮断 されていない）突然変異体がｈＧＨの誘発する細胞増殖に拮抗するはずであるこ とを予測させる。このことを調べるために、我々は最大細胞増殖の９０％を支持 するに足るｈＧＨ（１ｎＭ）十増大する濃度の野生型ｈＧＨまたは部位１（Ｋ１ ７２、Ａ、／Ｆ１７６、Ａ）もしくは部位２（Ｇ１２ＯＲ）の突然変異体と共に 細胞を培養した。我々の予期した通り、部位２突然変異体はｈＧＨに拮抗するが 、部位１突然変異体は全く効果がない。実際に、部位２突然変異体は拮抗薬とし て野生型ｈＧＨより１００倍近く強力である（ＩＣ，０はＧ１２０Ｒについて２ ０ｎＭであり、ｈＧＨについて２μＭである９表９）。これは我々にとっては意 外なことではない。なぜならいったんＧ１２ＯＲが結合すれば、受容体を二量体 し、作動させることができないからである。したがってＧ１２ＯＲとｈＧＨの間 の競争は部位１を介する遊離のホルモン分子結合にさらに制限される。対照的に 、ｈＧＨが拮抗性遊離ホルモンであるためには結合したｈＧＨ中間体が反応する 前に占有されていない受容体と反応する必要がある。これは高濃度のｈＧＨを必 要とする。

Ｇ１２ＯＲはｈＧＨよりはるかに良好な拮抗薬であるが、５０％の拮抗性に必要 な突然変異体の濃度はこの検定法ではｂＧＨより約２０倍高い（表９）。これは 、単量体Ｇ１２ＯＲ・受容体複合体におけるＧ１２０ＲよりもｈＧＨが二量体ｈ ＧＨ・（受容体）２複合体に強固に結合するという事実の反映であろう。あるい は最大の信号化が１００％の受容体占有を必要としないのかもしれない。いずれ の場合にもＧ１２ＯＲ突然変異体における部位１の親和性を改善すれば、より強 力な拮抗薬になるであろう。

部位１を介してｈＧＨｂｐにより強固に結合するｈＧＨ変種が突然変異法によっ て作成されている（４．１３）。これらの変異の組み合わせ（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４ に／Ｅ１７４Ａ）はｈＧＨｂｐに３０倍強固に結合する。この変種はｈＧＨと同 等のＥＣｓ。を持っていたが、自己拮抗性に関するＩＣａ＊はｈＧ）Ｉより約３ ０倍低かった。このことは、結合したホルモン−受容体中間体上の部位２と可溶 性ホルモン上の遊離の部位１の間の競争によって自己拮抗性がもたらされるとい う概念と合致する。部位１結合の改善がこのホルモンを作用薬として改善しなか ったという事実は、受容体の二量体が律速であること、および、それゆえに部位 １と部位２の両方に作用薬突然変異を導入することが望ましいことの反映であり 得る。我々はこの変種がＧ１２０Ｒを含有するようにさらに突然変異させた。こ の４突然変異体変種はｈＧＨ拮抗薬としてＧ１２ＯＲより１０倍強力であった（ 図１４、表９）。これは拮抗性にとって部位１結合親和性が重要であることのさ らなる証拠である。

我々の研究は、ｈＧＨ，ＭＡｂおよびそれらの誘導体によってもたらされる拮抗 性または自己拮抗性が受容体二量体の遮断の結果であって、受容体の下方調節の 結果ではないことを示している。第１に、ｈＧＨの代わりにＴＬ−３で増殖させ た細胞は、より高いｈＧＨ応答またはｈＧＨ受容体数を示さない。受容体の下方 調節は通常、受容体の活性化と強固に共役している。この場合、ｈＧＨに関する 用量応答曲線の拮抗性部分が（１μＭではなく）生理学的に関連のあるｈＧＨ濃 度で始まることを予期することができる。さらに、ＭＡｂとｈＧＨのそれぞれに 関するＩＣ，ｏに対するＥＣ，。の比率は広範に変化し、受容体の活性化が単に 結合特性を変化させるだけで阻害から容易に脱共役し得ることを示している。最 後に、Ｇ１２ＯＲ突然変異体は不活性であるがｈＧＨより強力な拮抗薬であり、 Ｇ１２ＯＲによる細胞の予備処理はその拮抗性効果を増進させない。したがって ０１２ＯＲの拮抗性効果は単純な受容体下方ｔＪＲ節とは合致しないのである。

高濃度で自己拮抗性を発揮する他の配位子が受容体二量体の遮断に関与し、これ が本発明の実施に有用な配位子を同定するための追加の基礎として働くことが考 えられる。

引用交献 １　、１１ｐ１ｍｅｄ、　Ｓ、　、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３ ２２：９６６−９７７（１９９０）　；　Ｆｒｏｈａ＋ａｎA　Ｌ、＾、　、　 Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏ。

Ｍｅｔａｂ、　７２：１１７５−１１８１（１９９］）２、　Ｗｅｌｌｓ、ＪＡ ら、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇ、　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓ、　５２（印刷中０１ ９９２）３　Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ、　Ｂ、　Ｃら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５４＋８ ２１−８２５（１９９２）４、ｒｕｎｉｎｇｈａｍ、Ｂ、（’　ら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４４：１０８１−１０８５（１９８９）５、ｄｅ　Ｖｏｓ、Ａ、Ｍ　ら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２５５：３０６−３１２（１９９２）６、Ｙａｒｄｅｎ　Ｉ 　ら、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５７：４４３（１９８８）　 ；　Ｕｌｌｒｉｃｈ＾、ら、Ｃｅ１ｌ@６１：２０３（１ ７　、Ｂａｚｅｎ、　Ｊ、　Ｆ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、＾、８７：６９３４（１９９０）　：　bｏｓｍａｎ　Ｄ、 ら、　Ｔｒｅｎｄ ｓ　Ｂｉｎｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１５：２６５（１９９０）　：　Ｐａｔｔｈ ｙ、　Ｌ、Ｃｅ１１６１：１３（１９９０）８、Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｒら、ＥＭ ＢＯＪ、１０：２８５５−２８６５（１９９１）９、Ｂａ５ｓ、Ｓ、Ｈら、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ＾８８：４４９ｇ−４ ５０２（１９９１）１０、Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ、Ｂ、Ｃら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８８：３４０７−３４１１（１ X９１） １１　、Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ、Ｂ、Ｃ，ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１４ ６］−１４６５（１９９０）］２．　Ｅｌｂｅｒｇら、　ＪＢＣ，２６５：１４ ７７０（１９９０）１３、Ｎ、　Ｉｔｏｈら、Ｓｃ】ｅｎｃｅ　２４７：３２４ （１９９０）時間（分） ｊＧｌｂ 溶出体積　（ｍｌ） ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　６Ａ 波長（ｎｍ） 波長（ｎｍ） ＦＩＧ、７ モル当量　ｈＧＨ ＦＩＧ、　８ １ｏｇ　ｈＧＨ濃度（Ｍ） ＩＧｌｊ ＦＩＧ、ｊ２ ｌｏｇ　［ｈＧＨ］　ｎＭ ＦＩＧ、　１５０ Ｋｌ”５６ ＦＩＧ、　＋５ｂ に＋＋５ｓ ＦＩＧ、Ｉ５Ｃ フロントページの続き

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．ある候補物質が配位子拮抗薬または配位子作用薬であるかどうかを決定する ための方法であって、 （ａ）該候補物質を作用または結抗されるべき配位子の受容体と接触させ、（ｂ ）１配位子分子と２受容体分子からなる３要素複合体の形成について検定する、 ことからなる方法。
2. ２．複合体を蛍光エネルギー転移、熱量測定法、沈降平衡、ゲル濾過または電気 泳動によって検出する請求項１の方法。
3. ３．候補物質が配位子のアミノ酸配列変種である請求項１の方法。
4. ４．配位子がＥＰＯ、成長ホルモン、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、アルフ ァインターフェロン、ベータインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、イ ンターロイキン２、３、４、６または７である請求項３の方法。
5. ５．段階（ａ）において候補物質を天然の配位子の存在下で受容体と接触させる 請求項１の方法。
6. ６．天然の配位子が１：１のホルモン：受容体複合体を形成するが、１：２のホ ルモン：受容体複合体を実質上形成することができない場合に、候補物質が拮抗 薬であることを決定する段階をさらに含む請求項５の方法。
7. ７．候補物質型が天然の配位子を１：２の複合体から置換させる場合に、その候 補物質が作用薬であることを決定する段階をさらに含む請求項５の方法。
8. ８．受容体が配位子受容体の細胞外ドメインである請求項１の方法。
9. ９．受容体が蛍光標識によって標識されており、その標識のホモクエンチングに よって複合体の形成を検出する請求項１の方法。
10. １０．まず第１配位子部位を介して受容体ポリペプチドに結合し、次いで第１部 位とは異なる第２配位子部位を介して第２受容体ポリペプチドに逐次的に結合し 、それによって１分子の配位子と２分子の受容体を含有する複合体を形成するポ リペプチド配位子に関する作用薬または拮抗薬を同定する方法であって、第２配 位子部位を同定し、第２配位子部位に突然変異を導入し、第２配位子部位におい て受容体に結合するという突然変異させた配位子の能力を決定することからなる 方法。
11. １１．配位子が通常は第１に第１配位子部位を介して受容体ポリペプチドに結合 した後、第２に第１部位とは異なる第２配位子部位を介して受容体ポリペプチド に逐次的に結合することによって１分子の配位子と２分子の受容体を含有する複 合体を形成するポリペプチド配位子に関する作用薬を同定する方法であって、（ ａ）作用薬候補物質を作成するために配位子に突然変異を導入し、（ｂ）候補物 質が第１配位子部位を介して受容体に結合する親和性を決定し、（ｃ）候補物質 が第２配位子部位を介して受容体に結合する親和性を決定し、（ｄ）候補物質が 配位子より高度に第１および第２配位子部位の１または両方を介して受容体に結 合し、かつ、第１および第２配位子部位の両方を介して受容体に結合する場合に 作用薬としてその候補物質を選択する、ことからなる方法。
12. １２．天然の配位子がまず第１配位子部位を介して受容体ポリペプチドに結合し た後、第２に第１部位とは異なる第２配位子部位を介して受容体ポリペプチドに 逐次的に結合することによって１分子の配位子と２分子の受容体を含有する複合 体を形成する場合のポリペプチド配位子に関する拮抗薬を同定する方法であって 、 （ａ）配位子に突然変異を導入することによって拮抗薬候補物質を作成し、（ｂ ）第１配位子部位における受容体に対する候補物質の親和性を決定し、（ｃ）第 ２配位子部位における受容体に対する候補物質の親和性を決定し、（ｄ）第１配 位子部位で受容体に結合するが、第２配位子部位では受容体に対して減少した結 合親和性を示す場合に、拮抗薬としてその候補物質を選択すること、からなる方 法。
13. １３．４つの両親媒性アルファ螺旋を天然の立体配座で含有し、かつ、２つの部 位を介してまず部位１で、次いで部位２で逐次的にその受容体に結合する単量体 ポリペプチド配位子の変種であって、部位１または部位２に導入された突然変異 を含む変種（ただし、配位子が成長ホルモンである場合には、（ａ）少なくとも ２残基が突然変異しており、それらがそれぞれ天然のホルモンのＮ−末端約１５ 残基内と螺旋Ｃ内にあるか、（ｂ）部位１におけるその受容体に関する配位子の 親和性を増大させるように部位１が突然変異されるものとする）。
14. １４．請求項１３の変種であって、部位２がこの部位におけるその受容体に関す るその変種の親和性を天然の配位子と比較して少なくとも約２倍減少させるよう に突然変異されている変種。
15. １５．請求項１３の変種であって、部位１が突然変異されていることによってこ の部位におけるその受容体に関するその変種の親和性が天然の配位子と比較して 少なくとも約２倍増大している変種。
16. １６．部位２突然変異が天然の残基の電荷、嵩高さまたは疎水性を本質的に変化 させるアミノ酸配列置換である請求項１３の変種。
17. １７．配位子に関する拮抗薬である請求項１３の変種。
18. １８．配位子に関する作用薬である請求項１３の変種。
19. １９．部位１突然変異が、（ａ）螺旋Ａの中央約４０％中、（ｂ）螺旋ＡとＢを 連結するループのＣ−末端２／３または（ｃ）螺旋ＤのＣ−末端１／２に導入さ れる請求項１３の変種。
20. ２０．部位２突然変異が、（ａ）Ｎ−末端残基から螺旋Ａのほぼ最初の４ターン までの配列内に含有される配位子の部分内、もしくは（ｂ）螺旋Ｃの中央の５タ ーン内に導入される請求項１３の変種。
21. ２１．配位子が二量体ホルモン、アルファインターフェロン、ベータインターフ ェロン、ＩＬ−２、−３、−４、−６、または−７、成長ホルモン、胎盤性ラク トゲン、プロラクチン、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦである請求項１３の変種 。
22. ２２．残基Ｆ１、Ｉ４、Ｌ６、Ｒ８，Ｄ１１６、Ｇ１２０、Ｄ１１９またはＴ１ ２３におけるアミノ酸配列変異と、残基Ｅ１７４における１つのアミノ酸配列変 異を伴い、それによって受容体に対する部位１の親和性が増大し、受容体に対す る部位２の親和性が減少しているヒト成長ホルモンである請求項１４の変種。
23. ２３．残基Ｆ１、Ｉ４、Ｌ６またはＲ８におけるアミノ酸配列変異を伴うヒト成 長ホルモンであって、そのホルモンの最初の約１０残基内にある他の残基が削除 または改変されていない請求項１３の変種。
24. ２４．医薬的に許容され得る剤形にある請求項１３の変種。
25. ２５．配位子がＥＰＯであり、部位２が残基６〜１６および１０１〜１０９内に 位置し、部位１残基が残基１４５〜１５９内に位置する請求項１３の変種。
26. ２６．配位子がＩＬ−２であり、部位２が配列１３〜２０および９０〜９５内に 位置し、部位１残基が残基１２１〜１３３内に位置する請求項１３の変種。
27. ２７．配位子がＧ−ＣＳＦであって、部位２残基が配列１２〜２２および１１６ 〜１２３内に位置し、部位１残基が残基１５７〜１７５内に位置する請求項１３ の変種。
28. ２８．配位子がＩＬ−３であり、部位２残基が配列１９〜２３と７５〜７９内に 位置し、部位１残基が残基１１０〜１１９内に位置する請求項１３の変種。
29. ２９．配位子がＩＬ−４であり、部位２残基が配列６〜１１と８１〜８７内に位 置し、部位１残基が残基１１５〜１２４内に位置する請求項１３の変種。
30. ３０．配位子がＩＬ−６であり、部位２残基が配列２０〜３０と１２１〜１３０ 内に位置し、部位１残基が残基１６３〜１８３内に位置する請求項１３の変種。
31. ３１．アルファ螺旋内に位置する親水性残基に変異を導入する請求項１３の変種 。
32. ３２．アルファ螺旋内に位置する疎水性残基に変異を導入する請求項１３の変種 。
33. ３３．請求項１３の変種をコード化する核酸。
34. ３４．請求項３３のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。
35. ３５．請求項３４の宿主細胞を培養し、その培養から変種を回収することからな る方法。
36. ３６．請求項３３のＤＮＡで形質転換された形質転換動物。
37. ３７．成長ホルモン特異的応答を促進するために哺乳動物を処置する方法であっ て、哺乳動物成長ホルモン受容体に特異的なモノクローナル作用薬抗体の治療量 を投与することからなる方法。
38. ３８．該哺乳動物がヒトであり、該モノクローナル抗体がＭＡｂ２６３である請 求項３７の方法。