DE69926624T2

DE69926624T2 - Verfahren zum screenen einer die oligomerisierung von rezeptorproteinmolekülen fördernden substanz

Info

Publication number: DE69926624T2
Application number: DE69926624T
Authority: DE
Inventors: M. Higuchi; Y. Shimonaka; Keiko Esaki
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2019-04-14
Also published as: WO1999053313A1; ES2247790T3; EP1079230B1; US20070238128A9; ATE301833T1; EP1079230A1; JP4397122B2; US20060183153A1; AU3169599A; DE69926624D1; EP1079230A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen von Substanzen, die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen fördern. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Screenen von physiologisch aktiven Substanzen, das die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen als einen Indikator verwendet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Physiologisch aktive Substanzen, wie z.B. Erythropoietin und Wachstumshormon, tragen durch ihre Bindung an spezifische Rezeptoren, die an der Target-Zellmembran exprimiert werden, zur Transduktion von differenzierenden und proliferativen Signalen bei. Im Jahr 1990 berichteten Yoshimura et al., dass ein EPO-Rezeptor, der eine Mutation von Arg zu Cys an Position 129 in seiner extrazellulären Domäne trägt, Transduktion eines proliferativen Signals induziert, und dies sogar in Abwesenheit von EPO, was darauf schließen lässt, dass es für Signaltransduktion wichtig ist, die extrazellulären Domänen von EPO-Rezeptoren über Disulfidbindungen zu multimerisieren (Nature 348, 647–649 (1990)). Weiters zeigte Röntgen-Strukturanalyse der Wachstumshormon-Wachstumshormonrezeptor-Bindung, dass sich zwei Wachstumshormonrezeptoren an ein Wachstumshormonmolekül binden (Journal of Molecular Biology 222(4), 865–868 (1991)). Die Rezeptormultimerisierung trägt somit wahrscheinlicher zum ersten Schritt des Signaltransduktionsweges bei, der durch physiologisch aktive Substanzen induziert wird.
Im Jahr 1996 wurde von einem EPO-Rezeptor-Bindungspeptid, das eine Kernstruktur von 14 Aminosäuren YXCXXGPXTWXCXP (X kann jede beliebige Aminosäure sein) aufweist, berichtet, das es möglicherweise EPO-Aktivität nachahmt (Science 273, 458–463 (1996)). Kristallstrukturanalyse von diesem Peptid und dem EPO-Rezeptorkomplex zeigten, dass das Peptiddimer EPO-Rezeptor-Dimerisation fördert (Science 273, 464–471 (1996)).
Weiters wurde für einen Antikörper gegen eine extrazelluläre Domäne des EPO-Rezeptors erkannt, dass sie möglicherweise EPO-Aktivität nachahmt. Einwertige (Fab-) Fragmente dieses Antikörpers können sich an den EPO-Rezeptor binden, jedoch nicht Signaltransduktion induzieren, was darauf schließen lässt, dass EPO-Rezeptordimerisation durch Bindung von zweiwertigem Antikörper für seine Funktion erforderlich ist (J. Biol. Chem. 271(40), 24691–24697 (1996)).
Solch ein Signaltransduktionsweg, ausgelöst durch Rezeptormultimerisation, wird nicht nur in EPO und Wachstumshormon beobachtet, sondern auch in anderen physiologisch aktiven Substanzen einschließlich Interferonen und Granulozytenkoloniestimulierender Faktor (G-CSF). In Bezug auf Thrombopoietin wurde auch ein Peptid identifiziert, das Thrombopoietinaktivität durch Rezeptormultimerisation nachahmen kann (Science 276, 1696–1699 (1997)).
Cunningham et al. zeigen ein Verfahren zur Selektion von Agonisten und Antagonisten durch Nachweisen von Ternärkomplexbildung von Wachstumshormonrezeptoren und seinen Liganden (Japanische Patentanmeldung Nr. 5–500070). Dieses Verfahren detektiert jedoch Homolöschung von fluoreszierenden Sonden unter Verwendung eines Spektralfluorimeters und ist daher nicht für großtechnisches Screenen von Testsubstanzen geeignet.
Ziel der Erfindung ist, ein Screening-Verfahren von Ersatzstoffen für physiologisch aktive Substanzen bereitzustellen, das Rezeptormultimerisation als einen Indikator verwendet.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder entwickelten ein Screening-System, das eine praktische Bestimmung ermöglicht, ob Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon durch Kontakt mit einer Testsubstanz oligomerisiert werden oder nicht, was ihre Erfindung darstellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen von Substanzen bereit, die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon fördern, wobei das Verfahren das Bestimmen umfasst, ob die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon oligomerisiert werden, wenn sie mit Testsubstanzen kontaktiert werden. Die Testsubstanz kann mit den Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon in einer zellfreien Umgebung kontaktiert werden.
Im obigen Verfahren ist es möglich, Signale zu messen, die durch die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon erzeugt werden, um zu bestimmen, ob die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon oligomerisiert werden. Die Signale können aus der aus Szintillations-, Chemolumineszenz-, Fluoreszenz-, Absorptions-, ionisierenden Strahlungs-, magnetischen Kernresonanz- und Oberflächenplasmonresonanz-Signalen bestehenden Gruppe ausgewählt werden. Solche Signale können durch SPA-Verfahren, RIA-Verfahren, Oberflächenplasmonresonanz, magnetische Kernresonanz, enzym-gekoppelten Immunadsorptionstest, Gelfiltrations-Chromatographie und dergleichen gemessen werden. Zumindest eines der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon kann markiert sein. Die Markierung kann aus der aus Radioisotop, Fluorophor, Enzym, Biotin, Avidin, Szintillationssubstanz und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt werden. Um die Gegenwart von oligomerisierten Molekülen oder Fragmenten unter Verwendung von SPA-Verfahren zu bestimmen, kann beispielsweise zumindest eines der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon mit Radioisotop markiert werden, während zumindest eines der anderen an die Oberfläche von Szintillationssubstanz-enthaltenden Perlen gebunden werden kann. In diesem Fall kann eine Testsubstanz zu einer wässrigen Lösung zugesetzt werden, die die radioaktiv markierten Rezeptoren oder Peptidfragmente davon sowie die Rezeptoren oder Peptidfragmente davon, die an die Oberfläche von Szintillationssubstanz-enthaltenden Perlen gebunden sind, umfassen, und dann können die gebildeten Szintillationssignale gemessen werden, um zu bestimmen, ob die Rezeptoren oder Peptidfragmente davon oligomerisiert werden. Fachleuten wird es möglich sein, das Mischungsverhältnis zwischen den Szintillationssubstanz-enthaltenden Perlen (SPA-Perlen) und den Re zeptoren, die an die Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers anzubinden sind, richtig festzulegen.
Die Oligomere der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon können in einer Lösung oder an einer festen Oberfläche gebildet werden. Um die Gegenwart der Oligomere unter Verwendung von magnetischer Kernresonanz oder von Gelfiltrations-Chromatographie zu bestimmen, werden die Oligomere im Allgemeinen vorzugsweise in einer Lösung gebildet. Um die Gegenwart der Oligomere unter Verwendung von SPA-Verfahren, RIA-Verfahren, Oberflächenplasmonresonanz oder enzymgekoppeltem Adsorptionstest zu bestimmen, werden die Oligomere im Allgemeinen vorzugsweise an einer festen Oberfläche gebildet.
Der Rezeptor kann ein Cytokinrezeptor aus der aus Blutbildungsfaktor-Rezeptor, Lymphokinrezeptor, Wachstumsfaktor-Rezeptor und Differenziationshemmfaktor-Rezeptor bestehenden Gruppe sein. Insbesondere kann er aus der aus Erythropoietin- (EPO-) Rezeptor, Thrombopoietin- (TPO-) Rezeptor, Granulozytenkoloniestimulierendem Faktor- (G-CSF-) Rezeptor, Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor- (M-CSF-) Rezeptor, Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor- (GM-CSF-) Rezeptor, Tumornekrosefaktor- (TNF-) Rezeptor, Interleukin-1- (IL-1-) Rezeptor, Interleukin-2- (IL-2-) Rezeptor, Interleukin-3- (IL-3-) Rezeptor, Interleukin-4- (IL-4-) Rezeptor, Interleukin-5- (IL-5-) Rezeptor, Interleukin-6- (IL-6-) Rezeptor, Interleukin-7- (IL-7-) Rezeptor, Interleukin-9- (IL-9-) Rezeptor, Interleukin-10- (IL-10-) Rezeptor, Interleukin-11- (IL-11-) Rezeptor, Interleukin-12- (IL-12-) Rezeptor, Interleukin-13- (IL-13-) Rezeptor, Interleukin-15- (IL-15-) Rezeptor, Interferon-α- (IFN-α-) Rezeptor, Interferon-β- (IFN-β-) Rezeptor, Interferon-γ- (IFN-γ-) Rezeptor, Wachstumshormon- (GH-) Rezeptor, Insulinrezeptor, Stammzellenfaktor- (SCF-) Rezeptor, Gefäßendothelwachstumsfaktor- (VEGF-) Rezeptor, Epidermiswachstumsfaktor- (EGF-) Rezeptor, Nervenwachstumsfaktor- (NGF-) Rezeptor, Fibroblastenwachstumsfaktor- (FGF-) Rezeptor, Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor- (PDGF-) Rezeptor, transformierendem Wachstumsfaktor-β- (TGF-β-) Rezeptor, Leukämiehemmfaktor- (LIF-) Rezeptor, ziliarneurotrophischem Faktor- (CNTF-) Rezeptor, On costatin-M- (OSM-) Rezeptor und kerbenähnlichem Rezeptor bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Das Rezeptorproteinmolekül kann eine Cytokinrezeptor-Untereinheit sein. Beispielsweise besteht jeder der Rezeptoren IL-3-Rezeptor, IL-5-Rezeptor und GM-CSF-Rezeptor aus α- und β-Einheiten. Diese Rezeptoren sind dafür bekannt, eine gemeinsame β-Untereinheit aufzuweisen. Jeder der Rezeptoren IL-6-Rezeptor, LIF-Rezeptor und IL-11-Rezeptor besteht aus einer α-Untereinheit und gp130-Untereinheiten. Diese Rezeptoren sind dafür bekannt, eine gemeinsame gp130-Untereinheit aufzuweisen. Sowohl CNTF-Rezeptor als auch OSM-Rezeptor ist ein Trimer aus α-Untereinheit, LIF-Rezeptor-α-Untereinheit und gp130-Untereinheit. So besteht auch jeder der Rezeptoren IL-2-Rezeptor, IL-4-Rezeptor, IL-7-Rezeptor, IL-9-Rezeptor und IL-15-Rezeptor aus α-, β- und γ-Untereinheiten. Für diese Rezeptoren ist bekannt, dass sie eine gemeinsame γ-Untereinheit aufweisen.
Das Peptidfragment des Rezeptorproteinmoleküls umfasst vorzugsweise zumindest eine Liganden-Bindungsstelle des Rezeptors. Das Rezeptorproteinmolekül weist eine Liganden-Bindungsstelle in seiner extrazellulären Region oder löslichen Region auf.
Das Oligomer, das aus den Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon gebildet werden kann, kann jedes beliebige Homooligomer oder Heterooligomer einschließlich Dimer, Trimer und Tetramer sein. Erythropoietin-Rezeptor, Thrombopoietin-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, SCF-Rezeptor und EGF-Rezeptor beispielsweise sind bekannt dafür, Homodimere zu bilden; IL-6-Rezeptor, LIF-Rezeptor und IL-11-Rezeptor sind bekannt dafür, Heterodimere zu bilden; und IL-2-Rezeptor, CNTF-Rezeptor und OSM-Rezeptor sind dafür bekannt, Heterotrimere zu bilden.
Eine zu screenende Substanz kann ein neuer Ersatz für eine bekannte, physiologisch aktive Substanz sein. Die bekannte, physiologisch aktive Substanz umfasst Erythropoietin, Interferon, G-CSF, Wachstumshormon, Thrombopoietin, GM-CSF und M-CSF.
In einer Ausführungsform des obigen Verfahrens können Substanzen, die Dimerisation von Erythropoietin-Rezeptor-Proteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon fördern, durch Zusatz einer Testsubstanz zu einer wässrigen Lösung, die ¹²⁵I-markierte Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon sowie Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon, die an die Oberfläche von Szintillationssubstanz-enthaltendem Yttriumsilicat- oder Polyvinyltoluol-Perlen gebunden sind, umfasst; und durch anschließendes Messen von erzeugten Szintillationssignalen zur Bestimmung, ob die Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon dimerisiert sind, gescreent werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screenen von Substanzen bereit, die die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon hemmen, umfassend das Bestimmen, ob die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon in Gegenwart einer Oligomerisations-fördernden Substanz gehemmt wird, wenn sie mit einer Testsubstanz kontaktiert werden. Die Oligomerisations-fördernde Substanz kann eine physiologische Aktivität aufweisen. Die Substanz, die die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon hemmt, kann die Fähigkeit besitzen, die physiologische Aktivität der Oligomerisations-fördernden Substanz zu hemmen. Beispielsweise kann die Oligomerisations-fördernde Substanz Erythropoietin sein, und der Rezeptor kann ein Erythropoietin-Rezeptor sein.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Testset zum Screenen von Substanzen bereit, die die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon hemmt, umfassend eine Oligomerisations-fördernde Substanz, die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon und einen Puffer. Die Oligomerisations-fördernde Substanz kann beispielsweise Erythropoietin sein; das Rezeptorproteinmolekül oder Peptidfragment davon kann ein Erythropoietin-Rezeptorproteinmolekül oder Peptidfragment davon sein; und der Puffer kann phosphatgepufferte Salzlösung sein.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters die Verwendung von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon bereit, um zu bestimmen, ob eine Testsubstanz Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon fördert.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend näher beschrieben.
Die Erfinder stellen zuerst Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon her. Das Rezeptorproteinmolekül oder Peptidfragment davon kann in Form einer Membranfraktion vorliegen, die die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon enthält, kann vorzugsweise aus Zeilen isoliert und gereinigt sein und noch bevorzugter rekombinant hergestellt seom. Das Rezeptorproteinmolekül oder Peptidfragment davon kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
Wird eine Membranfraktion verwendet, so können Zellen, die die Rezeptorproteinmoleküle von Interesse exprimieren, in einer Pufferlösung, die ein Tensid wie beispielsweise Triton X-100 enthält, löslich gemacht und dann unter Verwendung einer Affinitätssäule, an der Liganden oder Anti-Rezeptor-Antikörper immobilisiert sind, chromatographiert werden, um die Rezeptorproteinmoleküle zu reinigen.
Weist das Rezeptorproteinmolekül eine identifizierte Liganden-Bindungsstelle auf, so kann ein Peptidfragment, das dieser Stelle entspricht, synthetisiert und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Um das Rezeptorproteinmolekül oder Peptidfragment davon rekombinant herzustellen, kann cDNA, die für das Rezeptorproteinmolekül voller Länge oder seine extrazelluläre Region, die eine Liganden-Bindungsstelle enthält, kodiert, unter Verwendung von PCR-Verfahren und cDNA-Bibliothek kloniert und dann in einen geeigneten Expressionsvektor integriert werden, um das Gen von Interesse in einer Wirtszelle wie z.B. E.-coli- oder CHO-Zelle zu exprimieren. Um einfache Reinigung zu ermöglichen, kann ein Gen, das für eine Markierung wie z.B. MBP, GST oder FLAG kodiert, stromauf oder stromab des Gens, das für das Protein von Interesse kodiert; ligiert werden.
Um das Oligomer der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon durch RIA-Verfahren oder enzymgekoppelten Immunadsorptionstest nachzuweisen, werden die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon im Vorfeld markiert.
Um als Nächstes zu bestimmen, ob die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon oligomerisiert sind, können die Moleküle oder Fragmente mit einer Testsubstanz wie folgt kontaktiert werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Erfinder die Bindung zwischen Rezeptoren durch Szintillationsverfahren messen. Das Szintillationsverfahren kann Photonenemission, die aus Kollisionen zwischen radioaktiver Strahlung aus manchen Rezeptoren, die mit Radioisotopen markiert sind, und Emissionssubstanzen (d.h. Szintillationssubstanzen), die an die anderen Rezeptoren im Oligomerkomplex gebunden sind, resultieren, nachweisen. Die resultierende Photonenemission kann mittels eines Photomultipliers oder einer Photodiode als ein Spannungsimpuls gemessen werden. Die bevorzugte Emissionssubstanz umfasst Kristalle oder Pulver von NaI, CsI und ZnS oder Kristalle von Anthracen und Naphthalin. Alternativ dazu kann das Szintillationsnähetest- (SPA-) Verfahren, entwickelt von Amersham International (N. Bothworth und P. Towers, Nature 341, 167–168 (1989)), für diesen Zweck verwendet werden. Das SPA-Verfahren setzt Strahlungsenergie aus einem Radioisotop durch Absorption mittels Szintillationssubstanz-enthaltenden Yttriumsilicat- oder Polyvinyltoluol-Perlen (SPA-Perlen) in Licht um, wenn sich das Radioisotop an SPA-Perlen bindet oder sich in großer Nähe zu diesen Perlen befindet. Manche Rezeptoren sind beispielsweise an SPA-Perlen gebunden, während andere Rezeptoren radioaktiv markiert sind. In einem nächsten Schritt kann eine Testsubstanz zu einer Lösung, die die radioaktiv markierten Rezeptoren sowie die an SPA-Perlen gebundene Rezeptoren umfasst, zugesetzt werden, um so das Licht nachzuweisen, das aus der durch die Testsubstanz vermittelten Rezeptoroligomerisation resultiert. Avidin und Biotin können verwendet werden, um die Rezeptoren an SPA-Perlen zu binden. Das zu verwendende Radioisotop umfasst ³H, ¹⁴C, ³²P, ⁴⁵Ca und ¹²⁵I. Alternativ dazu kann eine Mikrotiterplatte verwendet werden, die anstelle von SPA-Perlen Szintillationssubstanz an der Oberfläche ihres Bodens enthält. Nicht markierte Rezeptoren werden beispielsweise an der Oberfläche des Plattenbodens immobilisiert, und radioaktiv markierte Rezeptoren und Testsubstanzen werden hierzu zugesetzt.
Bei der Bildung des Rezeptoroligomers, die durch die Testsubstanz vermittelt wird, sammeln sich die radioaktiv markierten Rezeptoren an der Oberfläche des Plattenbodens, und die in der Bodenoberfläche enthaltene Szintillationssubstanz absorbiert Strahlungsenergie aus dem Radioisotop, wodurch Photonenemission ausgelöst wird. Gesteigerte Photonenemission resultiert in der Detektion der Rezeptoroligomerisation. Das SPA-Perlen verwendende Verfahren ist praktisch und für großtechnisches Screenen von Testsubstanzen auf ihre Aktivität geeignet, da es keinen Bedarf gibt, ungebundene Rezeptoren von gebundenen Rezeptoren vor der Detektion zu trennen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann Oberflächenplasmonresonanz-Sensor, genannt BIACORE (entwickelt von und im Handel erhältlich bei Pharmacia Biotech) verwendet werden, um Rezeptoroligomerisation nachzuweisen. BIACORE weist eine grundlegende Struktur auf, die eine Lichtquelle, ein Prisma, einen Detektor und einen Mikrokanal einbindet. Manche Rezeptoren wurden an einem Sensorchip vom Kassetten-Typ immobilisiert, und die anderen Rezeptoren werden dann auf den Sensorchip injiziert. Die injizierten Rezeptoren werden zum Sensorchip bei einer konstanten Durchflussgeschwindigkeit zugeführt und dann auf die immobilisierten Rezeptoren verteilt. Bei der Bildung des Oligomers durch Bindung der immobilisierten Rezeptoren mit den injizierten Rezeptoren sammeln sich die injizierten Rezeptoren am Sensorchip an, was zu gesteigertem Proteinvolumen am Chip führt. Dieses gesteigerte Volumen kann optisch als en Plasmonresonanzsignal nachgewiesen werden. Eine Testsubstanz kann beispielsweise gleichzeitig mit den Rezeptoren injiziert werden, um eine gesteigerte Intensität von Plasmonresonanzsignal nachzuweisen, was die Detektion der Testsubstanzaktivität auf Grundlage eines gesteigerten Plasmonresonanzsignals, induziert durch die Gegenwart der Testsubstanz, ermöglicht.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein magnetisches Kernresonanz- (NMR-) Verfahren verwendet werden, um Rezeptoroligomerisation nachzuweisen. Das NMR-Verfahren verwendet eine niederenergetische elektromagnetische Welle und wird aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, sogar geringe Energieveränderungen nachzuweisen, bevorzugt. Beispielsweise werden zwei Rezeptortypen in einem Lösungsmittel bei rund 1 mM aufgelöst, woraufhin Messung von magnetischer Kernresonanzsignale folgt. Daraufhin wird eine Testsubstanz zur Lösung zugesetzt. Magnetische Kernresonanzsignale können wiederum gemessen werden, um die Rezeptoroligomerisation in Form einer Signalverschiebung nachzuweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA) verwendet werden. Beispielsweise werden gewisse Rezeptoren an jedem Well einer 96-Well-Platte immobilisiert und dann in einem geeigneten Medium mit einer Testsubstanz umgesetzt, und die anderen Rezeptoren werden mit einem Enzym wie z.B. Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase markiert. Nach dem Waschen wird ein Färbungsmittel zur Platte zugesetzt, und Absorption wird für jede einzelne Platte gemessen. Die Rezeptoroligomerisation kann durch steigende Absorption nachgewiesen werden. Rezeptoroligomerisation kann auch unter Verwendung von Chemolumineszenz durch Markieren der Rezeptoren mit Luciferase als ein Enzym und Entwickeln der Platte durch ein Färbungsmittel nachgewiesen werden. Alternativ dazu können radioaktiv markierte oder mit einer fluoreszierenden Substanz markierte Rezeptoren anstelle der Enzym-markierten Rezeptoren verwendet werden, um Rezeptoroligomerisation nachzuweisen. In diesem Fall kann die Detektion durch die Messung der verbleibenden ionisierenden Strahlungsdosis oder der Fluoreszenzintensität erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Gelfiltrationschromatographie-Verfahren verwendet werden. Zwei Arten von Rezeptoren und eine Testsubstanz werden unter geeigneten Bedingungen miteinander umgesetzt und werden dann Gelfiltrationschromatographie unterzogen. Die Rezeptoroligomeri sation kann durch eine Verschiebung der Retentionszeit für Höchstabsorption nachgewiesen werden.
Eine Substanz, die die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon hemmt, kann wie folgt gescreent werden.
Eine Oligomerisation-hemmende Substanz kann durch Nachweisen einer Veränderung der Signalintensität in Gegenwart einer Testsubstanz, zusammen mit einer Substanz, die die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon fördert, gescreent werden.
Die Oligomerisation-hemmende Substanz kann beispielsweise durch Zusatz einer Oligomerisations-fördernden Substanz und einer Testsubstanz zu einer wässrigen Lösung, die ¹²⁵I-markierte Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon sowie Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon, die an die Oberfläche von Szintillationssubstanz-enthaltenden Yttriumsilicat- oder Polyvinyltoluol-Perlen gebunden sind, umfasst; und durch anschließendes Messen der erzeugten Szintillationssignale nachgewiesen werden.
In einer Ausführungsform des Testsets gemäß der vorliegenden Erfindung können Elemente, aus denen das Set besteht, in (einen) Behälter wie z.B. Phiole(n) oder Röhrchen, getrennt voneinander oder in Kombination oder als einzelne Einheit verpackt werden. Der/Die Behälter können weiters als eine einzelne Einheit in eine Haltevorrichtung mit mehreren Kompartimenten verpackt werden. In diesem Testset können sowohl die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon als auch die Oligomerisations-fördernde Substanz in lyophilisierter Form vorliegen. Diese Elemente können mit einem Puffer wieder hergestellt werden, wenn das Testset für den Screeningtest verwendet wird.
Diese Beschreibung umfasst einen Teil des oder den gesamten Inhalt, wie er in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der Japanischen Patentanmeldung Nr. 10– 102325 offenbart ist, die ein Prioritätsdokument für die vorliegende Anmeldung darstellt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Resultate von EPO-Rezeptordimerdetektion unter Verwendung von SPA-Perlen. Die horizontale Achse steht für eine molare Konzentration von EMP1-Dimer und die vertikale Achse für Emissions-Counts.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben, die zu Veranschaulichungszwecken bereitgestellt werden und nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung beabsichtigt sind.
Beispiel 1: Klonieren von EPO-Rezeptorgen

1) Zwei Paare von PCR-Primern (d.h. 4 Primer insgesamt) wurden auf Grundlage von EPO-Rezeptor-cDNA-Sequenz entworfen. Es wurden also die folgenden 5'-Primer ERO-1 und 3'-Primer ERO-2 für die erste PCR-Amplifikation hergestellt: ERO-1 (5'-GCAGCTGCTGACCCAGCTGT-3') (Seq.-ID Nr. 1) ERO-2 (5'-AAGTCTTGAGTCTGCACTGG-3') (Seq.-ID Nr. 2)

Um die Exaktheit des Klonierens zu verbessern, wurden die folgenden 5'-Primer ERI-1 und 3'-Primer ERI-2, die intern mit ERO-1 bzw. ERO-2 benachbart sind, für die zweite PCR-Amplifikation hergestellt:
ERI-1 (5'-TTTGAATTCTGTATCATGGACCACCTCGG-3') (Seq.-ID Nr. 3)
ERI-2 (5'-TTTAAGCTTGATCCCTGATCATCTGCAGC-3') (Seq.-ID Nr. 4)
Die Primer ERI-1 und ERI-2 umfassen eine EcoRI-Stelle bzw. eine Hindlll-Stelle, um nachfolgendes Subklonieren zu vereinfachen.

2) AS-E2-Zelllinie, die stark EPO-Rezeptoren exprimiert, (etwa 1 × 10⁸ Zellen) wurde verwendet, um Gesamt-RNA (1,23 mg) gemäß einem modifizierten AGPC-Verfahren mit Phenolbehandlung und Chloroformbehandlung zu extrahieren. Oligo-dT-Latex-Perlen wurden verwendet, um Poly(A) + RNA (7,8 μg) aus der ganzen Gesamt-RNA zu reinigen. Nach Bestätigung der mRNA-Reinheit durch Elektrophorese wurde 1 μg Poly(A) + RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthesesets von Amersham Umkehrtranskriptionsreaktion unterzogen. 2 μl des resultierenden Reaktionsgemisches (20 μl insgesamt) wurden PCR unter Verwendung von LA Taq (Takara LA PCR kit ver2) unterzogen. ERO-1 & ERO-2 und ERI-1 & ERI-2 wurden als PCR-Primerpaare verwendet. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 2 min bei 94 °C (20 s bei 98 °C/90 s bei 60 °C/3 min bei 72 °C) × 30 Zyklen und 10 min bei 72 °C. Ein Teil dieses RT-PCR-Reaktionsgemisches wurde Elektrophorese unterzogen, um die amplifizierte Fragmentgröße zu bestätigen.
3) Die Erststrang-cDNA, die aus AS-E2-Zell-mRNA synthetisiert wurde, wurde als eine Matrize verwendet und sechs getrennten PCR-Reaktionen unter Verwendung von LA Taq (Takara) wie zuvor beschrieben unterzogen. ERI-1 und ERI-2 wurden in diesen PCR-Reaktionen als Primer verwendet. Jedes der amplifizierten PCR-Fragmente wurde in ein pBluescript II SK(+) subkloniert. Ein Klon wurde für jedes PCR-Fragment ausgewählt, um ein Plasmid herzustellen. Die resultierenden sechs Klonplasmide und PCR-Fragmente (direktes Sequenzieren) wurden analysiert.
4) cDNA-Insert wurde mit BamH I und Hind III aus einem EPO-R-cDNA-Plasmid, das zwei Basensubstitutionen aufwies, geschnitten und dann in eine BamH-I/Hind-III-Stelle von pUC-119-Vektor insertiert. Dieses Plasmid wurde mit BssH II und Bal I verdaut, um ein Fragment einschließlich des Vektors zu erhalten (Fragment 1). Währenddessen wurde eine Region zwischen einer BssH-II-Stelle und einer Bal-I-Stelle aus einem normalen Klon ohne jegliche Mutation in dieser Region geschnitten (Fragment 2), wobei dieser Klon aus den sechs EPO-R-cDNA-Klonen, die in 3) zuvor hergestellt worden waren, ausgewählt worden war. Die Fragmente 1 und 2 wurden aneinander ligiert. Die resultierenden Klone wurden durch Sequenzieren analysiert, um einen Klon zu isolieren, in den Fragment 2 korrekt insertiert worden war (pUC 119-EPOR-L2). cDNA-Insert wurde aus pUC 119-EPOR-L2 unter Verwendung von BamH I und Hind III geschnitten und in eine BamH-I/Hind-III-Stelle von pBLSII SK(+)-Vektor insertiert, wodurch ein Klon (pEPOR-L2/SK) erhalten wurde.

Beispiel 2: Konstruktion von Expressionssystem für lösliche EPO-Rezeptoren

1) Um ein menschliches lösliches EPO-Rezeptorgen zu konstruieren, wurde PCR unter Verwendung von pEPOR-SK als eine Matrize und den folgenden Primern 1 und 2 durchgeführt: Primer 1: 5'-TTTTAAGAATTCCACCATGGACCACCTCGGGGCGT-3' (Seq.-ID Nr. 5) Primer 2: 5'-GGGATCCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTAGG CGTCAGCAGCGACA-3' (Seq.-ID Nr. 6) Primer 3: 5'-TGAATTCAGTGTGTGCTGAGCAACCT-3' (Seq.-ID Nr. 7) Primer 4: 5'-GGGATCCGCTTTGCTCTCGAACTT-3' (Seq.-ID Nr. 8)

Ein Reaktionsgemisch (50 μl), das 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 U Ex. Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,25 mM dNTP, 0,2 μM Primer 1 und 2 und 180 ng pEPOR-SK enthielt, wurde mit 15 μl Chill Out 14 (MJ Research Inc.) überschichtet. PCR-Amplifikation wurde in einem Temperaturwechselgerät vom Modell 480 (Perkin-Elmer) 30 Zyklen lang unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 min bei 96 °C, 1 min bei 60 °C und 2 min bei 72 °C, und die Amplifikation endete mit einer zusätzlichen Phase von 10 min, während der die Reaktion auf 72 °C gehalten wurde. Die resultierenden PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines PCR-Reinigungssets (Qiagen) gereinigt, in Ethanol gefällt und in 8 μl TE gelöst. Nach Zusatz von 1 μl 10 × Puffer H (Takaro Shuzo Co., Ltd.) wurden die gereinigten PCR-Produkte mit EcoR I und BamH I (0,5 μl, 10 U jeweils) bei 37 °C 2 Stunden lang verdaut. Die verdauten Produkte wurden an 1%igem Agarosegel Elektrophorese unterzogen, um eine Bande von etwa 700 bp auszuschneiden. Diese Bande wurde ex trahiert und unter Verwendung eines Gelextraktionssets (Qiagen) gereinigt, in Ethanol gefällt und in 5 μl TE gelöst. Demähnlich wurde 1 μg pUC 19 (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit EcoR I und BamH I verdaut, in Ethanol ausgefällt und in 10 μl TE aufgelöst. Die so erhaltenen Bande (2 μl) und pUC 19 (1 μl) wurden vermischt und mit 1 μl T4-DNA-Ligase (Life Technologies Oriental Inc.) in 4 μl destilliertem Wasser und 2 μl 5 × T4-DNA-Ligasepuffer bei 16 °C 2 Stunden lang umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in für den E.-coli-Stamm JM109 kompetente Zellen (Takaro Shuzo Co., Ltd.) transformiert, die auf Eis geschmolzen worden waren, und 30 min lang auf Eis inkubiert. Nach zusätzlicher einminütiger Inkubation bei 42 °C und dann 2,5 min lang auf Eis wurden die Zellen weiter bei 37 °C in 500 μl SOC-Medium (Life Technologies Oriental Inc.), das hierzu zugesetzt wurde, gehalten. Die transformierten Zellen (200 μl) wurden auf LBA-Amp-Platten inokuliert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Sechs Kolonien wurden aus den resultierenden Kolonien ausgewählt, wovon jede in 3 ml LB-Amp-Medium inokuliert und auf eine LBA-Amp-Platte ausgestrichen wurde, woraufhin Kultivieren bei 37 °C folgte. Daraufhin wurden Zellen, die in jeder Zellkultur gewachsen waren, in destilliertem Wasser suspendiert und Kolonie-PCR unter den zuvor beschriebenen Bedingungen unterzogen. Die resultierenden PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert, die bestätigte, dass jeder Klon das insertierte EPO-Rezeptorgen in sich trug. E.-coli-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 2.000 U/min 15 min lang (Hitachi 05PR22) aus jeder LB-Amp-Zellkultur gesammelt. Ein QIAprep-Zentrifugen-Plasmid-Set (Qiagen) wurde verwendet, um die Plasmide in 100 μl TE zu sammeln. Jede Plasmidlösung wurde durch Zyklussequenzieren in einem DNA-Sequenziergerät vom Modell ABI373A (Perkin-Elmer) unter Verwendung eines Zyklussequenzierungssets (Perkin-Elmer), Primer 1, 2, 3, und 4 und Primer M13(–21) (Perkin-Elmer) oder M13RV (Takaro Shuzo Co., Ltd.) analysiert. Die aus einem Klon mit der Targetsequenz, die für den löslichen EPO-Rezeptor kodiert, hergestellte Plasmidlösung wurde mit EcoR I und BamH I unter den zuvor beschriebenen Bedingungen verdaut, woraufhin Extraktion und Reinigung folgten. Das verdaute Plasmid wurde an pCHO1 ligiert, das ähnlich verdaut und gereinigt worden war, und in für E.-coli-Stamm JM109 kompetente Zellen unter den zuvor beschriebenen Bedingungen transformiert. Demähnlich wurde eine Plasmidlösung hergestellt und mit EcoR I und BamH I verdaut und dann durch Agarosegel- Elektrophorese analysiert, wodurch ein Expressionsplasmid pCHO/EpoR2 für den menschlichen löslichen EPO-Rezeptor gewonnen wurde, der das insertierte lösliche Target-EPO-Rezeptorgen trägt.

2) Als Nächstes wurde eine CHO-Zelllinie, die die menschlichen löslichen EPO-Rezeptoren exprimiert, hergestellt.

Eine Lösung von pCHO/EpoR2-Plasmid (30 μl) wurde mit 4 μl 10 × Puffer K (Takara Shuzo Co., Ltd.), 4 μl 1 % BSA-Lösung und 2 μl Pvu I vermischt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach Zusatz von 50 μl TE und 100 μl TE-gesättigtem Phenol wurde die Lösung bei 14.000 U/min 1 min lang zentrifugiert (MRX-150, Tomy Seiko Co., Ltd.), um eine wässrige Phase zu gewinnen. Diese wässrige Phase wurde mit 100 μl Chloroform, das hierzu zugesetzt wurde, vermischt und bei 14.000 U/min 1 min lang zentrifugiert (MRX-150, Tomy Seiko Co., Ltd.), um eine wässrige Phase zu gewinnen, woraufhin Fällung in Ethanol erfolgte. Die Präzipitate wurden in 20 μl sterilem TE aufgelöst, um ihre Absorptionsfähigkeit bei 260 nm zur Berechnung ihrer Konzentration zu messen. 10 μl von Lipofect AMINE (Life Technologies Oriental Inc.) und 3 μg Pvu-I-verdaute Plasmidlösung wurden in 0,3 ml α-MEM-Medium suspendiert, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Nach Waschen mit α-MEM wurden CHO-Zellen, die bis zu 70 % Konfluenz in 25T-Kolben (Becton Dickinson & Co.) gezüchtet worden waren, in 2,4 ml α-MEM in Gegenwart des Lipofect-AMINE-Plasmidgemisches bei 37 °C unter 5 % CO₂ 8 Stunden lang kultiviert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden über Nacht in 5 ml α-MEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), gehalten. Der Überstand wurde wiederum verworfen, und eine Zellkultur wurde in 5 ml α-MEM, ergänzt mit 10 % FCS (frei von Nucleinsäure, selektives Medium) gestartet. Das selektive Medium wurde alle 2–4 Tage gewechselt. Nach einmaligem Subkultivieren in 75T-Kolben wurden die Zellen Grenzverdünnung in fünf 96-½-Well-Platten (Corning) unterzogen, sodass die Zellen zu 0,1 Zellen pro Well verdünnt waren. Zwei Wochen später wurde jeder Well durch ein Umkehrmikroskop beobachtet, um Proliferation von 89 Klonen zu bestätigen. Nach Waschen mit Dulbecco's PBS wurden die Zellen durch Behandlung mit einer Trypsin-EDTA-Lösung gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden weiter in 24-Well-Platten bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellkultur wurde 4 Tage lang nach Wechseln des Mediums fortlaufen gelassen, um den Kulturüberstand zu gewinnen. Die löslichen EPO-Rezeptoren wurden durch Western-Blot-Verfahren unter Verwendung von Anti-FLAB-M2-Antikörpern als primäre Antikörper nachgewiesen, wodurch ein Klon c165, der die löslichen EPO-Rezeptoren exprimierte, gewonnen wurde. Der Klon c165 wurde in einem selektiven Medium, das 20 nM MTX enthielt, kultiviert, woraufhin Grenzverdünnung erfolgte, wodurch 36 Klone erhalten wurden. Die löslichen EPO-Rezeptoren im Kulturüberstand wurden durch Western-Blot-Verfahren unter Verwendung von Anti-FLAG-M2-Antikörpern oder Anti-EPO-Rezeptor-Antikörpern (R&D-Systeme) als primäre Antikörper nachgewiesen, wodurch eine CHO-Zelllinie EpoR/CHO c165-19, die die löslichen EPO-Rezeptoren exprimierte, gewonnen wurde.
Beispiel 3: Reinigung von löslichen EPO-Rezeptoren
Der Kulturüberstand von sEpoR-exprimierenden CHO-Zellen wurde filtriert (Porengröße: 5 μm, Fuji Photo Film Co., Ltd.) und dann durch SARTOPURE-PP-Filter (Sartorius) und SARTOBRAN-P-Filter (Porengröße: 0,45 ± 0,2 μm, Sartorius) durchgeführt, um Zelltrümmer zu entfernen.
Bis-Tris-HCl-Puffer wurde zum resultierenden Filtrat auf 20 mM zugesetzt, wobei dieser Puffer durch Auflösen von Bis-Tris in Wasser und Einstellen des pH auf 6,0 mit HCl hergestellt worden war. Dieses Filtrat wurde dann bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min auf eine Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Bettvolumen: 500 ml) aufgetragen, die mit 20 mM Bis-Tris-HCl-Puffer (pH 6,0) äquilibriert war. Diese Säule wurde mit 20 mM Bis-Tris-HCl-Puffer (pH 6,0) gewaschen, um nicht-adsorbiertes Protein zu entfernen, gefolgt von Elution mit 20 mM Bis-Tris-HCl-Puffer (pH 6,0), der 0,5 M NaCl enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5–6 ml/min. Tris-HCl-Puffer wurde zur resultierenden Fraktion auf 50 mM zugesetzt, wobei dieser Puffer durch Auflösen von Tris in Wasser und Einstellen des pH auf 7,3 mit HCl hergestellt worden war. Diese Fraktion wurde dann bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min auf eine Anti-FLAG-M2-Affinitätssäule (Bettvolumen: 10 ml, Eastman Kodak Co.), äquilibriert mit TBS-Lösung (Takara Shuzo Co., Ltd.), aufgebracht.
Proteine, die an die Anti-FLAG-M2-Affinitätssäule adsorbiert waren, wurden mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer (pH 3,5) eluiert und durch Zusatz von etwa 1/10 Volumen von 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) auf einen neutralen pH eingestellt, woraufhin Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac-Protein-C4-Säule (Vydac) erfolgte. Das heißt, dass die Proteine an eine Vydac-Protein-C4-Säule, äquilibriert mit einer 0,1%igen Trifluoressigsäurelösung, die 20 % Acetonitril enthielt, adsorbiert und dann mit einem linearen Acetonitrilgradienten bis zu 80 % 60 Minuten lang eluiert wurden. Die Elution unter Verwendung dieses HPLC-Verfahrens resultierte in einem einzelnen Elutionspeak, wodurch gereinigtes sEpoR erhalten wurde.
Beispiel 4: Biotinylierung von löslichen EPO-Rezeptoren
Der gereinigte sEpoR aus Beispiel 3 wurde Lösungsmittelersetzung mit 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6) unterzogen. sEpoR wurde also nach Trocknen in einem Zentrifugenkonzentrator unter reduziertem Druck in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6) aufgelöst oder wurde auf eine Fast-Desalting-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6), aufgebracht.
Ein Biotinylierungsmittel (Amersham) wurde zu den zu markierenden Proteinen in einer Menge von 40 μl pro mg Protein zugesetzt und wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang unter Rühren umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Bio-Gel-P-6-Säule (Bio-Rad Laboratories), äquilibriert mit PBS-Lösung, die 0,02 % Tween 20 enthielt, aufgebracht, um nicht umgesetzte Reagenzien zu entfernen und hierdurch eine Proteinfraktion zu gewinnen, die biotinylierten sEpoR enthielt.
Beispiel 5: Markieren von löslichen EPO-Rezeptoren mit ¹²⁵I
Der gereinigte sEpoR aus Beispiel 3 wurde Lösungsmittelersetzung mit 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6) unterzogen. sEpoR wurde also nach Trocknen in einem Zentrifugenkonzentrator unter reduziertem Druck in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6) aufgelöst oder wurde auf eine Fast-Desalting-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6), aufgebracht.
Eine Phiole, die ¹²⁵I-Bolton-&-Hunter-Reagens (Amersham) enthielt, wurde einem Stickstoffgasstrom ausgesetzt, um das darin enthaltene Lösungsmittel abzudampfen. 15 μl sEpoR-Lösung (ca. 1 mg/ml) wurden dieser Phiole zugesetzt und mit dem Reagens auf Eis 30 Minuten lang unter Rühren (alle 5 Minuten) umgesetzt. Die Reaktion wurde weitere 5 Minuten auf Eis nach Zusatz von 500 μl 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,6), der 0,2 M Glycin enthielt, fortgesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex-G-25-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2), der 0,25 % Gelatine enthielt, aufgebracht, um nicht umgesetzte Reagenzien zu entfernen und hierdurch eine Proteinfraktion, die ¹²⁵I-markierten sEpoR enthielt, zu erhalten.
Beispiel 6: Detektion von EPO-Rezeptordimerisation unter Verwendung von SPA-Perlen
50 μg von an Streptavidin gebundene SPA-Perlen (Amersham), biotinylierter sEpoR und etwa 150.000 cpm ¹²⁵I-markierter sEpoR wurden in 100 μl Testpuffer (Dulbecco's PBS(–), die 0,1 % BSA und 5 mM EDTA enthielt) aufgelöst, um eine Testlösung herzustellen. Währenddessen wurden EPO-Rezeptorbindungs-Peptiddimere hergestellt, indem das Peptide Institute, Inc., gebeten wurde, sie wie in Science 273, 458–463 (1996); Blood 88(10), 542a (1996); Science 276, 1696–1699 (1997), beschrieben zu synthetisieren. Die EPO-Rezeptorbindungs-Peptiddimere wurden vermischt und mit der Testlösung bei Raumtemperatur 12 Stunden lang umgesetzt, woraufhin Detektion unter Verwendung von Microbeta (Pharmacia) erfolgte.
Struktur von EPO-Rezeptorbindungs-Peptiddimer
Signale, deren Intensität von der Konzentration des EMP1-Dimers abhängen, wurden aus den SPA-Perlen erzeugt, was zur Detektion von EPO-Rezeptordimerisation führte (1)
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen von Ersatzstoffen für physiologisch aktive Substanzen bereit, das Rezeptormultimerisation als Indikator verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Screenen auf Substanzen, welche die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon fördern, umfassend das Bestimmen, ob die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon oligomerisiert werden, wenn sie mit einer Testsubstanz in Kontakt kommen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon mit der Testsubstanz in einer zellfreien Umgebung kontaktiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Messen von Signalen, die durch die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon erzeugt werden, um zu bestimmen, ob die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon oligomerisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Signal aus der aus Szintillations-, Chemolumineszenz-, Fluoreszenz-, Absorptions-, ionisierenden Strahlungs-, magnetischen Kernresonanz- und Oberflächenplasmonresonanz-Signalen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin zumindest eines der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Markierung aus der aus Radioisotop, Fluorophor, Enzym, Biotin, Avidin, Szintillationssubstanz und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin zumindest eines der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon radioaktiv markiert wird, während zumindest eines der anderen an die Oberfläche von Szintillationssubstanz-enthaltenden Perlen gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 7, umfassend: das Zusetzen der Testsubstanz zu einer wässrigen Lösung, welche die radioaktiv markierten Rezeptoren oder Peptidfragmente davon sowie die an Szintillationssubstanz-hältige Perlen gebundenen Rezeptoren oder Peptidfragmente davon umfasst; und das Messen von erzeugten Szintillationssignalen, um zu bestimmen, ob die Rezeptoren oder Peptidfragmente davon oligomerisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Oligomer der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon in einer Lösung gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Oligomer der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon an einer festen Oberfläche gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der Rezeptor ein Cytokinrezeptor ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Cytokinrezeptor aus der aus Blutbildungsfaktorrezeptor, Lymphokinrezeptor, Wachstumsfaktorrezeptor und Differenzierungshemmfaktor-Rezeptor bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Cytokinrezeptor aus der aus Erythropoietin- (EPO-) Rezeptor, Thrombopoietin- (TPO-) Rezeptor, Granulozytenkoloniestimulierendem Faktor- (G-CSF-) Rezeptor, Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor- (M-CSF-) Rezeptor, Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor- (GM-CSF-) Rezeptor, Tumornekrosefaktor- (TNF-) Rezeptor, Interleukin-1- (IL-1-) Rezeptor, Interleukin-2- (IL-2-) Rezeptor, Interleukin-3- (IL-3-) Rezeptor, Interleukin-4- (IL-4-) Rezeptor, Interleukin-5- (IL-5-) Rezeptor, Interleukin-6- (IL-6-) Rezeptor, Interleukin-7- (IL-7-) Rezeptor, Interleukin-9- (IL-9-) Rezeptor, Interleukin-10- (IL-10-) Rezeptor, Interleukin-11- (IL-11-) Rezeptor, Interleukin-12- (IL-12-) Rezeptor, Interleukin-13- (IL-13-) Rezeptor, Interleukin-15- (IL-15-) Rezeptor, Interferon-α- (IFN-α-) Rezeptor, Interferon-β- (IFN-β-) Rezeptor, Interferon-γ- (IFN-γ-) Rezeptor, Wachs tumshormon- (GH-) Rezeptor, Insulinrezeptor, Stammzellenfaktor- (SCF-) Rezeptor, Gefäßendothelwachstumsfaktor- (VEGF-) Rezeptor, Epidermiswachstumsfaktor- (EGF-) Rezeptor, Nervenwachstumsfaktor- (NGF-) Rezeptor, Fibroblastenwachstumsfaktor- (FGF-) Rezeptor, Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor- (PDGF-) Rezeptor, transformierendem Wachstumsfaktor-β- (TGF-β-) Rezeptor, Leukämiehemmfaktor- (LIF-) Rezeptor, ziliarneurotrophischem Faktor- (CNTF-) Rezeptor, Oncostatin-M- (OSM-) Rezeptor und kerbenähnlichem Rezeptor bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Rezeptorproteinmolekül eine Cytokinrezeptor-Untereinheit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das Peptidfragment des Rezeptorproteinmoleküls eine lösliche Region des Rezeptors umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, worin das Peptidfragment des Rezeptorproteinmoleküls eine extrazelluläre Region des Rezeptors umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, worin das Peptidfragment des Rezeptorproteinmoleküls zumindest eine Ligandenbindungsstelle des Rezeptors umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Oligomer ein Homooligomer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Oligomer ein Heterooligomer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin das Oligomer ein Dimer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die zu screenende Substanz ein neuer Ersatzstoff für eine bekannte physiologisch aktive Substanz ist.
Verfahren zum Screenen auf Substanzen, welche die Dimerisation von Erythropoietin-Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon fördern, umfassend: das Zusetzen einer Testsubstanz zu einer wässrigen Lösung, die ¹²⁵I-markierte Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon sowie an die Oberfläche von Szintillationssubstanz-hältigen Yttriumsilicat- oder Polyvinyltoluol-Perlen gebundene Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon umfasst; und das Messen erzeugter Szintillationssignale, um zu bestimmen, ob die Erythropoietin-Rezeptoren oder Peptidfragmente davon dimerisiert werden.
Verfahren zum Screenen auf Substanzen, welche die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon hemmen, umfassend das Bestimmen, ob Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon in Gegenwart einer die Oligomerisation fördernden Substanz durch Kontakt mit einer Testsubstanz gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die die Oligomerisation fördernde Substanz physiologische Aktivität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24, worin die Substanz, welche die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon hemmt, die Fähigkeit besitzt, die physiologische Aktivität der die Oligomerisation fördernden Substanz zu hemmen.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die die Oligomerisation fördernde Substanz Erythropoietin ist und der Rezeptor ein Erythropoietin-Rezeptor ist.
Testset zum Screenen auf Substanzen, welche die Oligomerisation von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon hemmen, umfassend eine die Oligomerisation fördernde Substanz, die Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon und einen Puffer.
Testset nach Anspruch 27, worin die die Oligomerisation fördernde Substanz Erythropoietin, das Rezeptorproteinmolekül oder das Peptidfragment davon ein Erythropoietin-Rezeptorproteinmolekül oder ein Peptidfragment davon und der Puffer phosphatgepufferte Salzlösung ist.
Verwendung von Rezeptorproteinmolekülen oder Peptidfragmenten davon zur Bestimmung, ob eine Testsubstanz die Oligomerisation der Rezeptorproteinmoleküle oder Peptidfragmente davon fördert.