WO1999053313A1 - Procede de recherche d'une substance favorisant l'oligomerisation de molecules de proteines receptrices - Google Patents

Procede de recherche d'une substance favorisant l'oligomerisation de molecules de proteines receptrices Download PDF

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WO1999053313A1
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peptide fragment
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protein molecule
receptor protein
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Masato Higuchi
Yasushi Shimonaka
Keiko Esaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a substance that promotes the oligomerization of a receptor protein molecule, and more particularly, to a method for screening a physiologically active substance using the formation of an oligomer of a receptor protein molecule as an index.
  • Bioactive factors such as erythropoietin and growth hormone bind to specific receptors expressed on the cell membrane on the target cell side and transmit signals such as differentiation and proliferation.
  • Yoshimura et al. Reported that replacing Arg (129) in the extracellular domain of the EPO receptor with Cys transmitted a growth signal even in the absence of EPO. It was suggested that multimerization of DNA by disulfide bond is important for signal transduction (Nature, 348: 647-649, (1990)).
  • G-CSF monostimulatory factor
  • Cunningham et al. Have shown a method for selecting an agonist and an antagonist of a ligand for detecting the formation of a three-element complex of a growth hormone receptor and a ligand (Japanese Patent Application No. 5-500070). However, this method measures the amount of homoquenching by fluorescent probe labeling using a spectrofluorometer, and was not suitable for screening large amounts of test substances.
  • An object of the present invention is to provide a method for screening for a bioactive agent substitute using receptor multimer formation as an index. Disclosure of the invention
  • the present inventors have established a screening system capable of easily examining whether or not a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof forms an oligomer upon contact with a test substance, and completed the present invention. It led to.
  • the present invention examines whether or not a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof forms an oligomer by contacting with a test substance, thereby obtaining an oligomer of the receptor protein molecule or a peptide fragment thereof. It provides a method for screening for substances that promote chemical transformation.
  • the contact between the receptor protein molecule or the peptide fragment thereof and the test substance is preferably performed in a cell-free environment.
  • the receptor protein molecule or its peptide fragment has formed an oligomer is determined by measuring a signal induced by the oligomer formation of the receptor protein molecule or its peptide fragment.
  • the signals are: scintillation signal, chemiluminescence signal, fluorescence signal, absorption signal It can be selected from the group consisting of Danal, ionizing signal, nuclear magnetic resonance signal and surface plasmon resonance signal. Examples of a method for measuring such a signal include the SPA method, the RIA method, surface plasmon resonance, nuclear magnetic resonance, enzyme immunoprecipitation measurement, and gel filtration chromatography. At least one of the receptor protein molecules or peptide fragments thereof may be labeled.
  • the label can be selected from the group consisting of radioisotopes, phosphors, enzymes, piotin, avidin, scintillants, and combinations thereof.
  • the receptor protein molecule or its peptide fragment is labeled with a radioisotope, and at least one of the other is labeled with a scintillant-containing bead. It is good that it is put.
  • the test substance is added to an aqueous solution containing a receptor or a peptide fragment thereof labeled with a radioisotope and a receptor or a peptide fragment thereof coated on the surface of beads containing scintillant.
  • the mixing ratio between the receptor coated on the bead surface and the beads containing scintillant (SPA beads) may be determined appropriately according to the instruction manual.
  • the oligomer of the receptor protein molecule or its peptide fragment may be formed in solution or on a solid surface.
  • the oligomer is usually preferably formed in a solution.
  • the oligomer is usually preferably formed on a solid phase surface.
  • the receptor may be a cytoforce receptor, which may be selected from the group consisting of a hematopoietic factor receptor, a lymphokine receptor, a growth factor receptor and a differentiation inhibitory factor, More specifically, erythropoietin (EPO) receptor, thrombopoietin (TP ⁇ ) receptor, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) receptor, macrophage colony stimulating factor ( ⁇ -CSF) receptor, granulocyte matrix Clofadicolone stimulating factor (GM-CSF) receptor, tumor necrosis factor (TNF) receptor, interleukin-1 (IL-1) receptor, interleukin-1 2
  • EPO erythropoietin
  • TP ⁇ thrombopoietin
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • ⁇ -CSF macrophage colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte matrix Clofadicolone stimulating factor
  • TNF interleukin-1
  • IL-1 2 receptor interleukin-2 receptor
  • interleukin-3 (IL-3) receptor interleukin-4 (IL-14) receptor
  • interleukin-5 (IL-5) receptor interleukin- 5 receptor
  • interleukin- 6 (IL-6) receptor interleukin-6 receptor
  • interleukin-7 (IL-7) receptor interleukin-1 9 (IL-9) receptor
  • interleukin-10 (IL-10) receptor interleukin-1 Leukin-11 (IL-11) receptor
  • interleukin-12 interleukin-2 receptor
  • interleukin-3 (IL-3) receptor interleukin-4 (IL-14) receptor
  • interleukin-7 (IL-7) receptor interleukin-1 9 (IL-9) receptor
  • interleukin-10 (IL-10) receptor interleukin-1 Leukin-11 (IL-11) receptor
  • IL-12 interleukin-13 (IL-13) receptor, interleukin-15 (IL-15) receptor, interferon-a (IFN- ⁇ ) receptor, interleukin Feron- ⁇ (IFN- ⁇ ) receptor, interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) receptor, growth hormone (GH) receptor, insulin receptor, blood stem cell growth factor (SCF) receptor, vascular epidermal growth factor (VEGF) receptor, epidermal growth factor (EGF) receptor, nerve growth factor (NGF) receptor, fibroblast growth factor (FGF) receptor, platelet-derived growth factor (PDGF) receptor, transforming Proliferation —) 3 (TGF- / 3) receptor, leukocyte migration inhibitory factor (LIF) receptor, ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor, oncostatin ⁇ (0 SM) receptor and Notch family receptor Can be selected from the group consisting of:
  • the receptor protein molecule may be a cytokine receptor subunit.
  • the IL-13 receptor, IL-5 receptor, and GM-CSF receptor are composed of an ⁇ -subunit and a 3-subunit, and the / 3 subunit is known to be common.
  • the IL-6 receptor, LIF receptor, and IL-11 receptor are composed of a small subunit and a gpl30 subunit, and it is known that the gpl30 subunit is common.
  • the CNTF receptor and OSM receptor are composed of a trimer of ⁇ -subunit, LIF receptor ⁇ -subunit, and g ⁇ 130 subunit.
  • the IL-12 receptor, IL-14 receptor, IL-17 receptor, IL-9 receptor, and IL-15 receptor are composed of ⁇ subunit, 3 subunits, ⁇ subunit, and ⁇ Subunits are known to be common.
  • Peptide fragments of a receptor protein molecule will at least bind to the ligand of that receptor. It is preferable to include a joint site.
  • the ligand binding site of the receptor protein molecule is located in the extracellular or soluble region.
  • the oligomer that can be formed by the receptor protein molecule or its peptide fragment may be a homo-oligomer, a hetero-oligomer, or any oligomer such as a dimer, trimer, or tetramer.
  • erythropoietin receptor, thrombopoietin receptor, G-CSF receptor, SCF receptor, EGF receptor, etc. form homodimers
  • IL-16 receptor LIF receptor, IL-11 receptor It is known that a heterodimer is formed, and IL-2 receptor, CNTF receptor, and ⁇ SM receptor form a heterotrimer.
  • the substances to be screened may be new alternatives to known bioactive substances.
  • Known physiologically active substances include erythropoietin, interferon, G-CSF, growth hormone, thrombopoietin, GM-CSF, M-CSF, and the like.
  • the method is coated in 1 25 and Ellis port Poechi emissions receptor or base peptide fragment thereof that is labeled with I, I Tsu tri ⁇ insect RIQUET one Toby or the surface of polyvinyl toluene beads containing cinch land
  • the test substance is added to an aqueous solution containing the erythropoietin receptor or its peptide fragment, and the induced scintillation signal is measured. It is possible to screen for a substance that promotes the dimerization of an erythropoietin receptor protein molecule or a peptide fragment thereof by checking whether or not it has formed.
  • the present invention also provides a substance that promotes the oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof found by the above method.
  • This oligomerization promoting substance can be a novel substitute for a known bioactive substance, and may be a cytokinin receptor agonist, particularly an erythropoietin receptor agonist, and has an action of stimulating erythropoiesis. May have.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a substance that promotes the oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof found by the above method. That state Examples include agents for treating renal anemia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a suitable diluent, preservative, solubilizer, emulsifier, carrier and the like, together with a therapeutically effective amount of the oligomerization promoting substance.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to an amount that produces a therapeutic effect under specified conditions and administration methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of a liquid, powder, or a form coated with a protective coating, and is administered by various administration routes including parenteral, oral, pulmonary, nasal, and the like. sell.
  • the administration schedule such as administration route, dosage, administration time, and administration interval, should be determined as appropriate, taking into account the characteristics of the above-mentioned oligomerization-promoting substance, which is the active ingredient, its dosage form, the age and condition of the patient, etc. Can be.
  • the present invention relates to a method for determining whether oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof by a substance that promotes oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof is inhibited by contact with a test substance.
  • the present invention provides a method for screening for a substance that inhibits oligomerization of the receptor protein molecule or its peptide fragment by checking whether or not the receptor protein molecule or the peptide fragment thereof is oligomerized.
  • the oligomerization promoting substance may have biological activity.
  • the substance that inhibits the oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof may have an effect of suppressing the physiological activity of the oligomerization promoting substance.
  • the oligomerization promoting substance may be erythropoietin
  • the receptor may be an erythropoietin receptor.
  • the present invention also provides a substance that inhibits oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof found by the above method.
  • This oligomerization inhibitor can be an inhibitor of a known physiologically active substance, and may be a site force-in receptor antagonist, in particular, an erythropoietin receptor antagonist, and may inhibit the erythropoiesis-stimulating effect of erythropoietin. It may be able to inhibit it.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits the oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof found by the above method.
  • the mode include a therapeutic agent for a disease caused by an increase in the amount of EPO.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a therapeutically effective amount of the above oligomerization inhibitor.
  • they may contain suitable diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, carriers and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of a liquid, a powder, or a form coated with a protective coating, and may be administered by various administration routes including parenteral, oral, pulmonary, nasal, and the like. You.
  • the administration schedule such as administration route, dosage, administration time, and administration interval, can be appropriately determined in consideration of the above-mentioned oligomerization inhibitor, which is an active ingredient, the characteristics of its dosage form, the age and medical condition of the patient, and the like. .
  • the present invention provides a test kit for screening for a substance that promotes oligomerization of the receptor protein molecule or its peptide fragment, including the receptor protein molecule or its peptide fragment, and a buffer solution.
  • the receptor protein molecule or peptide fragment thereof may be an erythropoietin receptor protein molecule or a peptide fragment thereof
  • the buffer may be phosphate buffered saline.
  • the present invention relates to a receptor protein molecule or a peptide thereof, comprising a substance that promotes the oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof, a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof, and a buffer.
  • a test kit for screening for a substance that inhibits fragment oligomerization for example, a substance that promotes the oligomerization of a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof is erythropoietin, the receptor protein molecule or a peptide fragment thereof is an erythropoietin receptor protein molecule or a peptide fragment thereof, and a buffer solution. May be phosphate buffered saline.
  • a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof is prepared.
  • the receptor protein molecule or its peptide fragment may be a membrane fraction containing the receptor protein molecule or its peptide fragment, but is preferably isolated and purified from cells. It is more preferable that they are produced by a recombinant method or the like.
  • One example of a method for obtaining a receptor protein molecule or a peptide fragment thereof is as follows.
  • the receptor protein molecule may be purified by solubilizing it with a buffer containing a surfactant such as iton X-100 and immobilizing a ligand or an anti-receptor antibody on affinity chromatography.
  • a peptide fragment of that portion can be synthesized and used.
  • cDNA or a cDNA library encoding the extracellular region containing the full-length or ligand-binding site of the receptor protein molecule using a PCR method or a cDNA library is used. May be cloned and inserted into an appropriate expression vector, and then expressed using a host such as E.coli or CHO cells.
  • a gene encoding a tag such as MBP, GST, FLAG can be linked upstream or downstream of the gene encoding the protein of interest.
  • the receptor protein molecule or a peptide fragment thereof is labeled in advance.
  • receptor binding can be measured by scintillation.
  • radiation emitted from an isotope-labeled receptor collides with a luminescent substance (scintilant) bound to the other receptor that has formed a complex to generate light that is emitted by a photomultiplier tube or the like. It can be measured by changing to a voltage pulse with a photodiode.
  • a crystal such as Nal, Csl, ZnS or the like, or a powder
  • a crystal such as anthracene or naphthalene
  • a scintillation proximity assay (SPA) developed by Amer sham (Bothworth N, and Towers P. (1989) Nature, 341, 167-168) can be used.
  • SPA beads scintillation proximity assay
  • SPA beads are bound to one receptor, and the other receptor to which the radioisotope is bound is coexistent in the solution. It is possible to add a test substance here and detect light induced by the formation of a complex caused by the interposition of the test substance. Avidin and biotin can be used to bind SPA beads to the receptor. Radioisotopes may be used 3 H, 14 C, 32 P , 4 5 Ca, 1 25 1.
  • a microtiter plate containing a scintillant on the bottom of the plate can also be used. For example, one unlabeled receptor is immobilized on the bottom of the plate, and the radiolabeled receptor and the test substance are added thereto.
  • the receptor complex When the receptor complex is formed via the test substance, the receptor labeled with a radioisotope remains on the bottom of the plate, and the scintillant contained on the bottom of the plate absorbs the energy of the radioisotope and emits light. Is issued.
  • the complex can be detected by increasing the amount of light.
  • the method using SPA beads is particularly suitable for screening in which the activity of a large amount of a test substance is measured, since it requires no separation operation for binding or non-binding and is a simple method.
  • receptor complex formation can be detected by a surface plasmon resonance sensor called BIAC0RE (developed and commercialized by Pharmacia Biotech).
  • IAC0RE a surface plasmon resonance sensor
  • B The basic structure of IAC0RE consists of a light source, a prism, a detector, and a microchannel.
  • One receptor is immobilized on a cassette-type sensor chip, and the other receptor is injected on the sensor chip.
  • the injected receptor is supplied on the sensor chip at a constant flow rate and diffuses into the immobilized receptor. If the immobilized receptor and the injected receptor combine to form a complex, the injected receptor will remain on the sensor chip, increasing the volume of protein on the sensor chip I do.
  • This increase in volume can be optically detected as a plasmon resonance signal. For example, detecting an increase in plasmon resonance signal when a test substance and a receptor are simultaneously injected, and detecting the activity of the test substance by increasing the plasmon resonance signal induced by the coexistence of the test substance be
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • e can be used to detect complex formation.
  • NMR is a method using electromagnetic waves with small energy, and is preferable because even a small change in energy can be detected with high sensitivity.
  • two types of receptors are dissolved in a solvent at a concentration of about IraM, and a nuclear magnetic resonance signal is measured.
  • the complex can be detected by adding the test substance, measuring the nuclear magnetic resonance signal again, and measuring the signal transfer.
  • an enzyme immunoprecipitation assay (ELISA: Enzyme-like immunosorbent assay) can be used.
  • ELISA Enzyme-like immunosorbent assay
  • one receptor is immobilized on a 96-well plate, and the other substance to which an enzyme such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase is bound in an appropriate solvent and the test substance are added. To react. After washing, a color reagent is added and the absorbance at a suitable wavelength is measured. Complex formation can be detected by an increase in absorbance. It is also possible to bind luciferase as an enzyme and detect the amount of chemiluminescence with a luminescent reagent. It is also possible to detect the remaining ionizing dose or the amount of fluorescence by using a receptor labeled with a radioisotope or a fluorescent substance instead of an enzyme-bound receptor.
  • gel filtration chromatography can be used.
  • the two receptors and the test substance reacted under appropriate conditions are applied to gel filtration.
  • Complex formation can be detected by shifting the absorbance peak retention time.
  • Risk reduction can be achieved by detecting a change in signal in the presence of a test substance and a substance that promotes the oligomerization of the receptor protein or its peptide fragment.
  • 1 25 and erythropoietin receptor or base peptide fragment thereof that is labeled with I, Ellis port Poechin receptor or its being coated on I Tsu thorium silicate beads or the surface of Poribiniruto Ruenbizu containing scintillant A substance that promotes the oligomerization of the receptor protein or its peptide fragment and a test substance are added to an aqueous solution containing the peptide fragment of Example 1 and a test substance is detected, and the inhibitory substance is detected by measuring the induced scintillation signal. be able to.
  • the components constituting the kit may be contained individually or in combination or collectively in containers such as vials, tubes, and the like. May be housed in compartmented carrier means for mass storage.
  • the receptor protein molecule or its peptide fragment and the substance that promotes oligomerization thereof are preferably in a lyophilized state. These components should be added to the buffer and used for the test when using the test kit.
  • FIG. 1 shows the results of detection of EPO receptor dimer by SPA beads.
  • the horizontal axis indicates the molar concentration of the EMP1 dimer, and the vertical axis indicates the count of the luminescence.
  • ER0-1 (5'-GCAGCTGCTGACCCAGCT GT-3 ') (SEQ ID NO: 1) and ER0-2 (5'-AAGTCTTGAGTCTGCACTGG-3') No. 2) was prepared.
  • ERI-1 (5'-TTTGAATTCTGTATCATGGACCACCTCGG-3 ') (SEQ ID NO: 3) on the 5' side of ER0-1 and ER0-2 for the second PCR to improve the accuracy of ERl-2 (5'-TTTAAGCTTGATCCCTGATCATCTGCAGC-3 ') (SEQ ID NO: 4) was prepared on the 3' side. Easily subcloned later for ERI-1 and ERI-2 To this end, £ 0 ( ⁇ 1 and 11111 (1111 sites were assigned, respectively).
  • RNA (1.23 mg) was extracted from about 1 ⁇ 10 8 EP0 receptor high expression cell lines (AS-E2) by a modification of the AGPC method (addition of phenol treatment and black mouth form treatment).
  • Poly (+ RNA (7.8 ug) was purified from the total RNA using oligo dT-latex beads.
  • Amersham cDNA was synthesized from lug poly (A) + RNA.
  • a reverse transcription reaction was performed using the kit.2 ⁇ l of this reaction solution (20 ⁇ l) was subjected to PCR using LA Taq (Takara LA PCR kit ver2) .
  • the PCR primers were ER0-1, ER0-2.
  • ERI-1 and ERI-2 PCR cycle was 94t :, 2min-(98 ° C, 20sec / 60 ° C, 90sec / 72 ° C, 3min) x 30cycle-72 ° C
  • a portion of this RT-PCR reaction solution was subjected to electrophoresis to confirm the size of the amplified fragment.
  • PCR was independently performed for 6 reactions using LA Taq (Takara) according to the method described above.
  • ERI-1 and ERI-2 were used as primers. Transfer each amplified PCR fragment to pBluscriptll
  • the cDNA insert was excised from the EPO-R cDNA plasmid containing two base substitutions with BamHI and Hindlll, and inserted into the BamHlZHindl 11 site of the pUC119 vector. After digesting this plasmid with BssHII and Ball, a fragment containing the vector was obtained (fragment 1).
  • fragment 2 From the clones obtained by ligating Fragment 1 and Fragment 2, the nucleotide sequence was analyzed and a clone (pUCl19-EP0R-L2) in which Fragment 2 was correctly inserted was isolated.
  • Primer 1 5'-TTTTAAGAATTCCACCATGGACCACCTCGGGGCGT-3 'SEQ ID NO:
  • Primer 2 5'-GGGATCCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTAGGCGTCAGCAGCG
  • Primer 3 5 '-TGAATTCAGTGTGTGCTGAGCAACCT-3' (SEQ ID NO: ⁇ )
  • Primer 1 5'-GGGATCCGCTTTGCTCTCGAACTT-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • the 50 ⁇ 1 reaction solution contains 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KC1, 1.5 mM MgC12, 2.5 U Ex.Taq (Takara Shuzo), 0.25 mM dNTP, 0.2 ⁇ primers 1 and 2, Includes 180 ng of pEPOR-SK, 15 ⁇ l of Chill0utl4 (MJ Research Inc.) in heavy phase, 1 minute at 96 ° C and 1 minute at 60 ° C in a Model 480 thermal cycler (Perkin-Elmer) After 30 cycles of a 2 minute cycle at 72 ° C., the mixture was kept at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was purified using a PCR purification kit (Qiagen), precipitated with ethanol, and dissolved in 8 ⁇ 1 TE. After adding ⁇ of Buffer Buffer ( ⁇ 10, Takara Shuzo), EcoRI and BamHI were added in 0.5 ⁇ 1 (10U), respectively, and digested at 37 ° C for 2 hours. The digest was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to cut out a band of about 700 bp, extracted and purified using a gel extraction kit (Qiagen), ethanol-precipitated, and dissolved in 5 ⁇ l of TE.
  • a PCR purification kit Qiagen
  • pUC19 (1 g, Takara Shuzo) digested with EcoRI and BamHI was dissolved in 10 TE after ethanol precipitation.
  • the cells were mixed with E. coli JM109 strain competent cells (Takara Shuzo) thawed on ice, allowed to stand on ice for 30 minutes, kept at 42 ° C for 1 minute, and allowed to stand on ice for 2 minutes 30 seconds, followed by 500 zl.
  • S0C medium (Lifetech Oriental) was added and the mixture was kept at 37 ° C. Of these, 2001 was inoculated on an LBA-Arap plate and allowed to stand at 37 ° C, and 6 of the formed colonies were streaked on 3 ml of LB-Amp and LBA-Amp plates and incubated at 37 ° C. Culture and further The cells were suspended in distilled water and subjected to colony PCR under the above conditions. The PCR product was analyzed by agarose gel electrophoresis, and the introduction of the EP0 receptor gene was confirmed in all clones.
  • Escherichia coli was recovered from the culture solution cultured in LB-Amp by centrifugation at 2000 rpm for 15 minutes (Hitachi, 05PR22), and the plasmid was recovered in 100 IX 1 TE using QIAprep-spinplasmid kit (Qiagen).
  • ABI373A DNA sequencing was performed using a cycling sequencing kit (Perkin Elmer), primers 1, 2, 3, 4, M13 (-21) (Perkin Elmer) or M13RV (Takara Shuzo). (PerkinElmer) was used to determine the nucleotide sequence by the cycle sequence method. Desired soluble type
  • the plasmid solution of the clone having the EP0 receptor sequence was digested with EcoRI and BamHI under the above conditions, extracted and purified, ligated with similarly digested, extracted and purified pCHOl, and transformed into E. coli JM109 competent cells under the above conditions. Conversion, similarly prepare a plasmid solution,
  • the mixture was centrifuged for 1 minute (Tomi Issei, MRX-150), the aqueous phase was collected, and ethanol precipitation was performed. It was dissolved in 20 M 1 of sterile TE, and the concentration was calculated by measuring the absorbance at 260 nm. 10 ⁇ 1 Lipofect AMINE (Lifetech Oriental) and 3 g of Pvul digested plasmid solution were each suspended in 0.3 ml of a-MEM, mixed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the cells were subcultured once in a 75T flask, diluted to 0.1 cells per we11, and diluted to 5 96-1 / 2 well plates (cold). The limiting dilution was performed on the first day. Two weeks later, each well was observed under an inverted microscope to confirm the growth of 89 clones. After washing with Dulbecco's PBS, the cells were collected with a Tribcine-EDTA solution, cultured in a 24-well plate, cultured to confluence, and the medium was changed for 4 days to obtain a culture supernatant.
  • the soluble EP0 receptor was confirmed by Western blotting using an anti-FLAB M2 antibody as a primary antibody, and a soluble EP0 receptor expression clone cl65 was obtained.
  • cl65 was cultured in a selective medium containing 20 nM MTX and subjected to limiting dilution to obtain 36 clones.
  • the CH0 cell line EpoR / CHO c 165-19 was obtained.
  • the culture supernatant of sEpoR-expressing CH0 cells is filtered through a filter (pore size: 5 m, Fujifilm), and then passed through a SARTOPURE PP filter (Sartorius) and a SARTOBRAN P filter (pore size: 0.45 + 0.2 ⁇ , Sartorius). Cell debris was removed.
  • Q Sepharose Fast buffer was added to the filtrate with pistris hydrochloride buffer (solution prepared by dissolving Bis-Tris in water and adjusted to pH 6.0 with HC1) to a concentration of 20 and equilibrated with 20 mM pistris hydrochloride buffer pH 6.0.
  • the column was adsorbed to a Flow (bed volume 500 ml) column at a flow rate of 4 to 5 ml / min.
  • the column was washed with 20mM pistris hydrochloride buffer pH 6.0 to remove unadsorbed proteins, and eluted with 20mM pistris hydrochloride buffer pH 6.0 containing 0.5M NaCl (flow rate 5-6mlZ min).
  • Tris-HCl buffer solution prepared by dissolving Tris in water and adjusted to pH 7.3 with HC1 was added to the fraction to 50 mM, and the anti-FLAG M2 buffer equilibrated with TBS (Takara Shuzo) solution.
  • Nichii bed volume 10 ml, manufactured by Bisman Kodak was adsorbed to a column (flow rate lnilZ).
  • the protein adsorbed on the anti-FLAG M2 affinity column is eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer pH 3.5, and the pH is adjusted to about neutral by adding about 1/10 volume of 1 M Tris hydrochloride buffer pH 8.0.
  • the purified sEpoR obtained in Example 3 was solvent-substituted with a 0.1 M sodium bicarbonate buffer solution, pH 8.6. That is, after drying with a vacuum centrifugal concentrator, dissolve in 0.1M sodium bicarbonate buffer pH8.6 or use a Fast Desalting column (Pharmacia) equilibrated with 0.1M sodium bicarbonate buffer pH8.6. To replace the solvent. A biotinylation reagent (Amersham) was added at 40 ⁇ 1 per 1 mg of the protein to be labeled, and labeling was performed for 1 hour at room temperature with stirring.
  • the purified sEpoR obtained in Example 3 was solvent-substituted with a 0.1 M sodium bicarbonate buffer solution, pH 8.6. That is, after drying with a vacuum centrifugal concentrator, dissolve in 0.1M sodium bicarbonate buffer pH8.6 or use a Fast Desalting column (Pharmacia) equilibrated with 0.1M sodium bicarbonate buffer pH8.6. To replace the solvent.
  • a 0.1 M sodium bicarbonate buffer solution pH 8.6. That is, after drying with a vacuum centrifugal concentrator, dissolve in 0.1M sodium bicarbonate buffer pH8.6 or use a Fast Desalting column (Pharmacia) equilibrated with 0.1M sodium bicarbonate buffer pH8.6. To replace the solvent.
  • Nitrogen gas was sprayed onto the vial containing 125 I Bolton and Hunter reagent (Amersham) to evaporate the solvent, and 151 of sEpoR solution (about lmg / ml) was added to the vial. After performing the reaction in ice for 30 minutes while stirring every 5 minutes, 500 l of a 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 8.6) containing 0.2 M glycine was added, and the reaction was further performed in ice for 5 minutes.
  • a 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer pH 8.6 containing 0.2 M glycine
  • 100M 1 measurement buffer Composition: Dulbecco's containing 0.1% BSA, 5mM EDTA PBS (-)) 50 g of streptavidin-conjugated SPA beads in (Amersham), Piochin of SEpoR, to prepare a solution that contains 125 1-labeled SEpoR about 150000Cpm.
  • a dimer of an EP0 receptor binding peptide having the structure shown below (SCIENCE, 273: 458-463, (1996), BLOOD, 88 (10): 542a, (1996), SCIENCE, 276: 1696 -1699, (1997), and the reaction was carried out at room temperature for 12 hours, followed by measurement with a microbeta (Pharmacia).

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Description

明 細 書 受容体タンパク質分子のオリゴマ一化を促進する物質のスクリーニング方法
技術分野
本発明は、 受容体タンパク質分子のオリゴマー化を促進する物質のスクリー ニング方法、 より詳細には、 受容体タンパク質分子のオリゴマー形成を指標とし た生理活性物質のスクリーニング方法に関する。 背景技術
エリス口ポェチンや成長ホルモンといつた生理活性因子は、 標的細胞側の細胞 膜に発現している特異的受容体に結合して、 分化 ·増殖等のシグナルを伝えてい る。 1990年、 吉村らは E PO受容体の細胞外ドメインに存在する Arg(129)を Cys に置換すると、 E PO非存在下でも増殖シグナルが伝わることを報告し、 E PO 受容体の細胞外ドメインがジスルフィ ド結合により多量体化することがシグナル 伝達に重要であることを示唆した （Nature, 348:647-649, (1990)) 。 更に、 成長 ホルモンと成長ホルモン受容体の結合様式を X線構造解析で検討した結果、 1分 子の成長ホルモンに 2分子の受容体が結合していることが明らかとなり（Journal of Molecular Biology, 222(4) :865-868, (1991)) 、 生理活性因子からのシグナ ル伝達経路のファーストステツプは受容体の多量体形成である可能性が高まった。
1996年に YXCXXGPXTWXCXP (Xはどの様なアミノ酸でも良い） の 14アミノ酸をコ ァ構造とする E P 0受容体結合べプチドが E P O機能を代替しうることが報告さ れ （Science, 273:458-463, (1996)), このペプチドと E P 0受容体の結晶構造解 析から、 ぺプチドのニ量体が E PO受容体の二量体化を促していることが明らか となった (Science, 273:464- 471，（1996))。
さらに、 E P 0受容体細胞外ドメインに対する抗体が E P 0機能を代替するこ とも明らかとなり、 この抗体を一価 （Fab)にすると E PO受容体への結合能を保 持しつつもシグナル伝達能を失うことから、 二価の結合による E PO受容体の二 量体形成が必要と考えられている (J. B i o l . Chem.， 271 (40) : 24691-24697, ( 199 6) ) 。
この様な受容体の多量体形成を引き金とするシグナル伝達経路は、 E P 0や成 長ホルモンに限った現象ではなく、 ィンターフェロンや顆粒球コ口；一刺激因子 ( G-CSF)などの生理活性因子でも共通に認められる現象である。 トロンボポェチ ンに関しても受容体の多量体化を介して機能を代替しうるペプチドが発見されて いる (Sc i ence, 276 : 1696- 1699, ( 1997) )。
カニングハムらは、 成長ホルモン受容体とリガンドの三要素複合体形成を検出 するリガンドの作用薬及び拮抗薬の選択方法を示している （特願平 5- 500070号）。 しかしながら、 本法は蛍光プローブ標識によるホモクェンチング量を分光蛍光計 を用いて測定しており、 大量の被検物質を測定するスクリ一ニングには適してい なかった。
本発明の目的は、 受容体多量体形成を指標とした生理活性因子代替物スクリ一 ニング方法を提供することである。 発明の開示
本発明者らは、 被検物質との接触により、 受容体タンパク質分子またはそのべ プチド断片がォリゴマーを形成するか否かを簡便に調べることができるスクリー ニング系を確立して、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 被検物質と接触させることにより、 受容体タンパク質分 子またはそのべプチド断片がオリゴマ一を形成するか否かを調べることによって、 その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物 質をスクリーニングする方法を提供す.る。 受容体タンパク質分子またはそのぺプ チド断片と被検物質との接触は無細胞環境下で行うとよい。
上記の方法においては、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリ ゴマー形成により誘起される信号を測定することにより、 該受容体タンパク質分 子またはそのぺプチド断片がオリゴマ一を形成したか否かを調べることができる。 信号は、 シンチレーシヨンシグナル、 化学発光シグナル、 蛍光シグナル、 吸光シ ダナル、 電離線シグナル、 核磁気共鳴シグナルおよび表面プラズモン共鳴シグナ ルからなる群よリ選択することができる。 このような信号を測定する方法として は、 S P A法、 R I A法、 表面プラズモン共鳴、 核磁気共鳴、 酵素免疫沈降測定 法、 ゲル濾過クロマトグラフィーなどを挙げることができる。 受容体タンパク質 分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつは標識化されているとよい。 標 識は、 放射性同位元素、 蛍光体、 酵素、 ピオチン、 アビジン、 シンチラントおよ びそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。 例えば、 S P A法 でオリゴマー形成の有無を調べるためには、 受容体タンパク質分子またはそのべ プチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、 他の少なくとも ひとつがシンチラントを含むビーズの表面にコ一ティングされているとよい。 こ の場合、 放射性同位元素で標識化されている受容体またはそのべプチド断片と、 シンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている受容体またはそのべ プチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、 誘起されるシンチレ一シヨンシ グナルを測定することにより、 該受容体またはそのべプチド断片がオリゴマーを 形成したか否かを調べることができる。 ビーズ表面にコ一ティングする受容体と シンチラントを含むビーズ （S P Aビーズ） の混合比は、 取扱説明書に従い適当 に決めればよい。
受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一は溶液中に形成さ れてもよいし、 固相表面上に形成されてもよい。 核磁気共鳴またはゲル濾過クロ マトグラフィ一を利用して、 オリゴマー形成の有無を調べる場合には、 通常、 ォ リゴマーは溶液中に形成されるとよい。 S P A法、 R I A法、 表面プラズモン共 鳴または酵素免疫沈降測定法を利用して、 オリゴマー形成の有無を調べる場合に は、 通常、 オリゴマーは固相表面上に形成されるとよい。
受容体はサイト力イン受容体であるとよく、 サイト力イン受容体は、 造血因子 受容体、 リンホカイン受容体、 増殖因子受容体および分化抑制因子受容体からな る群より選択することができ、 より具体的には、 エリスロポエチン （E P O ) 受 容体、 トロンボポェチン （T P〇） 受容体、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— C S F ) 受容体、 マクロファージコロニー刺激因子 （Μ— C S F ) 受容体、 顆粒球マ クロファ一ジコロニ一刺激因子 （GM— C S F) 受容体、 腫瘍壊死因子 （TN F ) 受容体、 インターロイキン一 1 ( I L— 1 ) 受容体、 インタ一ロイキン一 2
( I L一 2) 受容体、 インターロイキン— 3 ( I L- 3) 受容体、 インターロイ キン— 4 ( I L一 4) 受容体、 インタ一ロイキン— 5 ( I L - 5 ) 受容体、 イン ターロイキン— 6 ( I L— 6) 受容体、 インタ一ロイキン— 7 ( I L- 7) 受容 体、 インタ一ロイキン一 9 ( I L - 9 ) 受容体、 インターロイキン一 10 ( I L - 10) 受容体、 インタ一ロイキン— 11 ( I L-11) 受容体、 インタ一ロイキン—12
( I L -12) 受容体、 インタ一ロイキン— 13 ( I L -13) 受容体、 インタ一ロイ キン— 15 ( I L -15) 受容体、 インターフェロン—a ( I FN- α) 受容体、 ィ ンタ一フエロン一 β ( I FN- ^ ) 受容体、 インターフェロン一 γ ( I FN- γ) 受容体、 成長ホルモン （GH) 受容体、 インスリン受容体、 血液幹細胞増殖 因子 （SCF) 受容体、 血管上皮増殖因子 （VEGF) 受容体、 上皮細胞増殖因 子 （EGF) 受容体、 神経成長因子 （NGF) 受容体、 線維芽細胞増殖因子 （F GF) 受容体、 血小板由来増殖因子 （PDGF) 受容体、 トランスフォーミング 増殖— )3 (TGF-/3) 受容体、 白血球遊走阻止因子 （L I F) 受容体、 毛様体 神経栄養因子 （CNTF) 受容体、 オンコスタチン Μ (0 SM) 受容体および No tch フアミリー受容体からなる群より選択することができる。
受容体タンパク質分子は、 サイ トカイン受容体サブュニットであってもよい。 例えば、 I L一 3受容体、 I L— 5受容体、 GM— C S F受容体は αサブュニッ トと) 3サブュニットから構成され、 /3サブュニットは共通であることが知られて いる。 また、 I L— 6受容体、 L I F受容体、 I L— 1 1受容体は、 なサブュニ ットと g p l 30サブュニットから構成され、 g p 1 30サブュニットが共通で あることが知られている。 また、 CNTF受容体、 O SM受容体では、 αサブュ ニット、 L I F受容体 αサブュニットと g ρ 1 30サブュニットの 3量体から構 成されている。 また、 I L一 2受容体、 I L一 4受容体、 I L一 7受容体、 I L — 9受容体、 I L— 1 5受容体は、 αサブユニット、 3サブユニット、 γサブュ ニットから構成され、 γサブュニットは共通であることが知られている。
受容体タンパク質分子のぺプチド断片は、 少なくともその受容体のリガンド結 合部位を含むものであるとよい。 受容体タンパク質分子のリガンド結合部位は細 胞外領域あるいは可溶性領域に存在する。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が形成しうるオリゴマーは、 ホ モオリゴマーであっても、 ヘテロオリゴマーであってもよいし、 ダイマー、 トリ マ一、 テトラマ一、 などのいずれのオリゴマーであってもよい。 例えば、 エリス ロポェチン受容体、 トロンボポェチン受容体、 G— C S F受容体、 S C F受容体、 E G F受容体などは、 ホモダイマ一を形成し、 I L一 6受容体、 L I F受容体、 I L— 1 1受容体はへテロダイマ一を形成し、 I L— 2受容体、 C N T F受容体、 〇 S M受容体はへテロトリマ一を形成することが知られている。
スクリーニングされる物質は、 既知の生理活性物質の新規な代替物であっても よい。 既知の生理活性物質としては、 エリスロポエチン、 インターフェロン、 G — C S F、 成長ホルモン、 トロンボポェチン、 G M— C S F、 M— C S F、 など を挙げることができる。
上記方法のひとつの態様においては、 1 25 Iで標識されているエリス口ポェチ ン受容体またはそのべプチド断片と、 シンチランドを含むィットリゥムシリケ一 トビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているェリ スロポェチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、 誘起されるシンチレ一シヨンシグナルを測定することにより、 該エリス口ポェチ ン受容体またはそのペプチド断片がダイマ一を形成したか否かを調べて、 エリス ロポェチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の二量体化を促進する 物質をスクリ一ニングすることができる。
本発明は、 上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのべ プチド断片のオリゴマー化を促進する物質も提供する。 このオリゴマ一化促進物 質は、 既知の生理活性物質の新規な代替物となりうるものであり、 サイト力イン 受容体ァゴニスト、 特に、 エリスロポエチン受容体ァゴニストであってもよく、 赤血球形成を刺激する作用を有するかもしれない。
本発明は、 上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのべ プチド断片のオリゴマー化を促進する物質を含む医薬組成物も提供する。 その態 様として、 腎性貧血治療剤などが挙げられる。 本発明の医薬組成物は、 治療上有 効量の上記オリゴマー化促進物質とともに、 適当な希釈剤、 防腐剤、 可溶化剤、 乳化剤、 担体などを含有してもよい。 ここで、 「治療上有効量」 という用語は、 指定の条件および投与法に対して治療効果を奏する量をいうものとする。 本発明 の医薬組成物は、 液体、 粉体、 保護被膜で被覆された形態のいずれであってもよ く、 非経口、 経口、 経肺、 経鼻などを含めた種々の投与経路で投与されうる。 投 与経路、 投与量、 投与時間、 投与間隔などの投与計画は、 有効成分である上記ォ リゴマー化促進物質とその剤型の特性、 患者の年齢と病状などを考慮して、 適宜 決定することができる。
また、 本発明は、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー 化を促進する物質による受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴ マ一形成が、 被検物質との接触により、 阻害されるか否かを調べることによって、 その受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一化を阻害する物 質をスクリーニングする方法を提供する。 オリゴマ一化促進物質は生理活性を有 するものであってもよい。 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリ ゴマー化を阻害する物質は、 前記オリゴマー化促進物質の生理活性を抑制する作 用を有するものであってもよい。 例えば、 オリゴマー化促進物質がエリスロポェ チンであリ、 受容体がエリスロポエチン受容体であるとよい。
本発明は、 また、 上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子または そのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質も提供する。 このオリゴマ一化 阻害物質は、 既知の生理活性物質のインヒビターとなりうるものであり、 サイ ト 力イン受容体アンタゴニスト、 特に、 エリスロポエチン受容体アンタゴニストで あってもよく、 エリス口ポェチンの赤血球形成刺激作用を阻害できるかもしれな い。
本発明は、 上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのべ プチド断片のオリゴマー化を阻害する物質を含む医薬組成物も提供する。 その態 様として、 E P O量が増加することによって生じる疾患の治療剤を挙げることが できる。 本発明の医薬組成物は、 治療上有効量の上記オリゴマー化阻害物質とと もに、 適当な希釈剤、 防腐剤、 可溶化剤、 乳化剤、 担体などを含有してもよい。 本発明の医薬組成物は、 液体、 粉体、 保護被膜で被覆された形態のいずれであつ てもよく、 非経口、 経口、 経肺、 経鼻などを含めた種々の投与経路で投与されう る。 投与経路、 投与量、 投与時間、 投与間隔などの投与計画は、 有効成分である 上記オリゴマー化阻害物質とその剤型の特性、 患者の年齢と病状などを考慮して、 適宜決定することができる。
さらに、 本発明は、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、 および緩 衝液を含む、 その受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一化 を促進する物質をスクリーニングするための検査キットを提供する。 例えば、 受 容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク 質分子またはそのべプチド断片であり、 緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水であつて もよい。
さらにまた、 本発明は、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリ ゴマー化を促進する物質、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、 およ び緩衝液を含む、 その受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ —化を阻害する物質をスクリーニングするための検査キットを提供する。 例えば、 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一化を促進する物質が エリスロポエチンであり、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がェリ スロポェチン受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片であり、 緩衝液がリ ン酸緩衝生理食塩水であつてもよい。
以下、 本発明を詳細に説明する。
まず、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を用意する。 受容体タン パク質分子またはそのペプチド断片は、 受容体タンパク質分子またはそのべプチ ド断片を含む膜画分であってもよいが、 好ましくは、 細胞から単離 ·精製された ものであるとよく、 より好ましくは、 組換え法などにより作製されたものである とよい。 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片を得る方法の一例を以下 に sc す o。
膜画分を用いる場合、 目的とする受容体蛋白質分子を発現している細胞を T r i t o n X— 1 00等の界面活性剤を含む緩衝液で可溶化し、 リガンドまたは 抗受容体抗体を固相化したァフィ二ティ一クロマトダラフィ一等で受容体蛋白質 分子を精製すればよい。
受容体蛋白質分子のリガンド結合部位の構造が明らかな場合には その部分の ぺプチド断片を合成して使用することができる。
遺伝子組換え法により受容体蛋白質分子またはそのペプチド断片を得るには、 PCR法や c DNAライブラリーを用いて受容体蛋白質分子の全長またはリガン ド結合部位を含む細胞外領域をコードする c DN Aをクローニングし、 適当な発 現ベクターに組み込んだ後、 E. c 0 1 iや CHO細胞等の宿主を用いて発現さ せればよい。 精製を容易にする目的で目的とする蛋白質をコードする遺伝子の上 流または下流に MB P， GST, F LAG等のタグをコードする遺伝子を連結す ることもできる。
受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一を R I A法、 酵素 免疫沈降測定法などで検出するためには、 予め、 受容体タンパク質分子またはそ のぺプチド断片を標識化しておく。
次いで、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を被検物質と接触させ て、 オリゴマー形成の有無を調べる。 その具体的方法は以下のとおりである。 本発明の一態様では、 受容体の結合をシンチレーシヨンによって測定すること ができる。 シンチレ一シヨンは同位体元素で標識された受容体から発せられる放 射線が、 複合体を形成したもう一方の受容体に結合した発光物質 （シンチラン ト） に衝突して発する光を光電子倍増管やフォトダイオードなどで電圧パルスに 変えて測定することかできる。 発光物質としては Nal， Csl, ZnS などの結晶また は粉末、 アントラセン、 ナフタリンなどの結晶が好適に用いられる。 また、 Amer sham社によって開発された （Bothworth N, and Towers P. (1989) Nature, 341, 167- 168)シンチレーシヨン近接アツセィ技術 (scintillation proximity Assay (SPA) を用いることができる。 シンチレーシヨン近接アツセィでは、 シンチラン トを含むィットリゥムシリケ一トまたはポリビニルトルエンビーズ （S P Aビ一 ズ） に同位体元素が結合または近接すると、 放射同位体のエネルギーが S P Aビ ーズに吸収され光に変換される。 例えば、 S P Aビーズを一方の受容体に結合さ せ、 さらに放射性同位体を結合させたもう一方の受容体を溶液中に共存させる。 ここに被検物質を加え、 被検物質の介在によって生じる複合体の形成により誘起 される光を検出することが可能である。 S P Aビーズと受容体との結合にはアビ ジン、 ピオチンをもちいることができる。 放射性同位体としては3 H , 14C， 32P, 45Ca， 1 251 をもちいることができる。 また、 S P Aビーズの他にシンチラン トをプレートの底面に含むマイクロタイタープレートを用いることもできる。 例 えば、 標識をしていない一方の受容体をプレートの底面に固定し、 ここへ放射性 同位体で標識された受容体と被検物質を加える。 被検物質を介して受容体の複合 体が形成されると、 プレート底面に放射性同位体で標識された受容体が留まり、 プレート底面に含有されたシンチラントに放射性同位体のエネルギーが吸収され て光が発せられる。 光量の増加により複合体の検出が可能である。 S P Aビーズ を用いる方法は、 結合、 非結合の分離操作を必要とせず、 簡便な方法である点で、 大量の被検物質の活性を測定するスクリーニングに特に好適である。
本発明の別の態様では、 BIAC0RE と呼ばれる表面プラズモン共鳴センサー （フ エルマシアバイオテク社により開発、 実用化された） により受容体の複合体形成 を検出することができる。 B IAC0RE の基本構造は、 光源とプリズム、 ディテクタ —とマイクロ流路からなる。 カセット式のセンサ一チップ上に一方の受容体を固 定化し、 もう一方の受容体をセンサ一チップ上にインジェクションする。 インジ ェクトされた受容体は一定の流速でセンサーチップ上に供給され、 固定化された 受容体中に拡散する。 固定化された受容体とインジェクトされた受容体が結合し て複合体を形成すれば、 ィンジェクシヨンされた受容体がセンサーチップ上に留 まり、 センサ一チップ上の蛋白質で構成される体積が増加する。 この体積の増加 を光学的にプラズモン共鳴シグナルとして検出することができる。 例えば、 被検 物質と受容体を同時にィンジェクシヨンした際のプラズモン共鳴シグナルの増加 を検出し、 被検物質を共存させることによって誘起されたブラズモン共鳴シダナ ルの増加により、 被検物質の活性を検出することができる。
本発明のさらに別の態様では、 核磁気共鳴 （NMR: Nuc l ear magnet i c resonanc e) を用いて複合体の形成を検出することが可能である。 N M Rはエネルギーの 小さな電磁波を用いる方法であり、 わずかなエネルギー変化でも感度よく検出す ることができる点で好ましい。 例えば、 2種の受容体を I raM程度の濃度で溶媒に 溶かし、 核磁気共鳴シグナルを測定する。 ついで、 '被検物質を加え、再度核磁気 共鳴シグナルを測定し、 シグナルの移動を測定することで複合体を検出すること ができる。
本発明のさらなる別の態様では、 酵素免疫沈降測定法 （EL I SA: Enzyme- l iked i mmunosorbent assay) を用いることができる。 例えば、 96穴プレートに一方の受 容体を固定し、 適当な溶媒下、 ホースラディッシュペルォキシダーゼ、 またはァ ルカリフォスファタ一ゼ等の酵素を結合させたもう一方の受容体と被検物質を加 え反応させる。 洗浄後、 発色試薬を加え、 好適な波長における吸光度を測定する。 吸光度の増大により複合体の形成を検出することができる。 酵素としてルシフエ ラ一ゼを結合させ、 発光試薬により化学発光量により検出することも可能である。 また、 放射性同位元素または蛍光物質で標識した受容体を、 酵素を結合した受容 体の代わりに用いて、 残存する電離線量または蛍光量を測定することにより検出 することも可能である。
本発明のまた別の態様では、 ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることができ る。 適当な条件で反応した 2種の受容体と被検物質をゲル濾過ク口マトグラフィ にふす。 複合体の形成は、 吸光度ピーク保持時間の移動により検出することがで きる。
受容体タンパク質またばそのべプチド断片のオリゴマ一化を阻害する物質をス クリ一二ングするには、 以下のようにすればよい。
受容体タンパク質またはそのべプチド断片のオリゴマー化を促進する物質と、 被検物質とを共存させてシグナルの変化を検出することによリスクリ一二ングす ることができる。
例えば、 1 25 Iで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのべプチド 断片と、 シンチラントを含むィットリウムシリケートビーズまたはポリビニルト ルェンビーズの表面にコーティングされているエリス口ポェチン受容体またはそ のペプチド断片とを含む水溶液に、 受容体タンパク質またはそのぺブチド断片の オリゴマ一化を促進する物質と被検物質を添加し、 誘起されるシンチレーシヨン シグナルを測定することにより阻害する物質を検出することができる。
本発明の検査キットの一態様においては、 キットを構成する要素が、 各々ある いは組み合わせてあるいはひとまとめにして、 バイアル， チューブなどのような 容器に包含されていてもよく、 さらに、 それらの容器はひとまとめにして納める ための区画化された担持手段に納められていてもよい。 このキットにおいては、 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片、 およびそのオリゴマー化を促進 する物質が凍結乾燥された状態であるとよい。 これらの要素は、 検査キットの使 用時に、 緩衝液に添加されて、 検査に供されるとよい。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願平 10 - 102325号の 明細書および図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 S P Aビーズによる E P 0レセプターニ量体の検出結果を示す。 横軸 は E M P 1二量体のモル濃度、 縦軸は発光量のカウントを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 これらの実施例は説明のた めのものであリ、 本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例 1〕 E P Oレセプタ一遺伝子のクローニング
1 ) EP0レセプタ一 cDNA配列をもとに PCRのための 2組計 4個のプライマーを設 計した。 即ち、 第 1回目の PCR用として、 5'側に ER0- 1 (5' - GCAGCTGCTGACCCAGCT GT-3' ) (配列番号 1 ) および 3，側 ER0- 2 (5' - AAGTCTTGAGTCTGCACTGG- 3' ) (配列番 号 2 ) を作製した。 クロ一ニングの正確性を高めるための第 2回目の PCR用とし て ER0-1 , ER0-2 の内側の 5'側に ERI- 1 (5' -TTTGAATTCTGTATCATGGACCACCTCGG-3 ' ) (配列番号 3 ) および 3'側に ERl -2 (5' -TTTAAGCTTGATCCCTGATCATCTGCAGC-3' ) (配列番号 4 ) を作製した。 ERI - 1， ERI -2 には後にサブクローニングを容易 にするため、 £0(^1と11111(1111サィ トをそれぞれ付与した。
2) EP0レセプター高発現細胞株 （AS-E2)約 1 X108個より、 AGPC法の改変法 (フエノール処理とクロ口ホルム処理を追加） にて total RNA (1.23mg)を抽出し た。 total RNA の全量から、 oligo dT- latex beadsを使って poly ( +RNA (7.8 ug) を精製した。 mRNAの純度を電気泳動で確認した後、 lugの poly(A) + RNA か ら Amersham cDNA 合成キットを用いて逆転写反応を行った。 この反応液 （20ul) のうち 2ulを、 LA Taq (Takara LA PCR kit ver2) を用いた PCRを行った。 PCR プライマーは、 ER0- 1， ER0- 2および ERI- 1, ERI- 2を用いた。 PCRサイクルは、 9 4t：、 2min -― (98°C、 20sec/60°C、 90sec/72°C、 3 min) x 30cycle—- 72°C、 10m in で行った。 この RT- PCR反応液の一部を、 電気泳動にて増幅フラグメントのサ ィズの確認を行った。
3) AS- E2細胞 mRNAより合成した 1 st strand cDNAを錡型として、 上記の方法に て LA Taq (Takara) を用いて独立に 6反応の PCRを行った。 この PCRにはプライ マ一として ERI- 1， ERI- 2を用いた。 増幅した各 PCRフラグメントを pBluscriptll
SK(+)にサブクローニングした後、 それぞれより 1個ずつのクローンを選択し、 プラスミ ドを調製した。 それぞれの 6クローンのプラスミ ド、 および PCRフラグ メント （Direct sequencing)につレヽて角军析を行った。
4) 2箇所の塩基置換を含む EPO- R cDNAプラスミ ドより BamHIと Hindlll により cDNAインサートを切り出したのち、 pUC119ベクタ一の BamHlZHindl 11 サイ トに 揷入した。 このプラスミ ドを BssHIIおよび Ballにて消化後、 ベクタ一を含むフラ グメントを得た （フラグメント 1) 。 一方、 3) で作製した 6つの EPO- R cDNAの BssHII部位よリ Ball部位までの領域が変異を含まない正常塩基配列を確認したク ローンより BssHII部位より Ball部位までの領域を切り出した （フラグメント 2) 。 フラグメント 1とフラグメント 2をライゲ一ションして得たクローンのなかで、 塩基配列を解析しフラグメント 2が正しく挿入されたクロ一ン （pUCl 19- EP0R-L 2) を単離した。 PUC119 - EP0R - L2より、 BamHIと Hindi 11 により cDNAインサート を切り出したのち、 pBLSII SK(+)ベクタ一の BamHI/Hindlll サイ トに揷入したク ローンを得た （pEPOR- L2/SK)。 〔実施例 2〕 可溶性 E P Oレセプターの発現系構築
1 ) 可溶型ヒト EP0受容体遺伝子を構築するため、 pEPOR- SKを錡型に用いて以下 に示すプライマ一 1および 2により PCRを行った。
プライマー 1 : 5' -TTTTAAGAATTCCACCATGGACCACCTCGGGGCGT-3' 配列番号
5)
プライマ一 2 ： 5'-GGGATCCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTAGGCGTCAGCAGCG
ACA-3' (配列番号 6 )
プライマー 3 : 5' - TGAATTCAGTGTGTGCTGAGCAACCT- 3' (配列番号 Ί )
プライマ一 4 ： 5' -GGGATCCGCTTTGCTCTCGAACTT-3' (配列番号 8 )
50 ^ 1 の反応溶液には 10mMの Tris-HCl pH8.3、 50mMの KC1 、 1.5mMの MgC12 、 2.5Uの Ex. Taq (宝酒造） 、 0.25mMの dNTP、 0.2μΜ のプライマ一 1及び 2、 180 ngの pEPOR- SKを含み、 15 μ 1 の Chill0utl4 (MJ Research Inc. ) を重相し、 480 型サーマルサイクラ一 （Perkin- Elmer) にて 96°Cで 1分、 60°Cで 1分、 72°Cで 2 分のサイクルを 30サイクル反応させた後、 72度で 10分間保温した。 得られた PCR 産物を PCR 精製キット （Qiagen) にて精製し、 エタノール沈澱後、 8 ^ 1 の TEに 溶解した。 Ι μ ΐ の Buffer Η (χ10、 宝酒造） を添加後 EcoRI および BamHI をそ れぞれ 0.5^ 1 (10U) 添加して 37°Cで 2時間消化した。 消化物を 1 %ァガロース ゲル電気泳動を行って、 約 700bp のバンドを切りだし、 ゲルェクストラクシヨン キット （Qiagen) により抽出精製し、 エタノール沈澱後、 5 μ 1 の TEに溶解した。 同様に EcoRI および BamHI で消化した pUC19( 1 g 、 宝酒造） をエタノール沈澱 後、 10 の TEに溶解した。 切り出したバンドおよび pUC19 それぞれ 2および 1 1 に、 蒸留水 4 1 および 2 μ 1 の χ5 Τ4 DNA ligase Buffer, 1 μ 1 の T4 DNA ligase (ライフテックオリエンタル） を混合し、 16°C、 2時間反応させた後、 氷上で融解した大腸菌 JM109 株コンビテントセル （宝酒造） に混和して氷上 30分 間静置し、 42°Cで 1分間保温した後氷上に 2分 30秒静置し、 500 z l の S0C培地 (ライフテックオリエンタル） を添加して 37°Cで保温した。 このうち 200 1 を LBA-Arap プレートに播種して 37°Cで一晚静置し、 形成されたコロニーのうち 6個 を 3mlの LB- Ampおよび LBA- Ampプレートにストリークして 37°Cで培養し、 さらに 蒸留水に懸濁して上記条件でコロニー PCR を行った。 PCR産物をァガロースゲル 電気泳動にて解析し、 すべてのクローンで EP0受容体遺伝子の揷入を確認した。
LB-Amp にて培養した培養液から 2000rpm 、 15分間の遠心 （日立、 05PR22) によ リ大腸菌を回収し、 QIAprep- spinplasmid kit(Qiagen) によりプラスミ ドを 100 IX 1 の TEに回収した。 プラスミ ド溶液をサイクルシークェンシングキット （パー キンエルマ一） 、 プライマー 1、 2、 3、 4、 M13(-21) (パーキンエルマ一） ま たは M13RV (宝酒造） を用いて、 ABI373A 型 DNAシークェンサ一 （パーキンエル マ一） にてサイクルシークェンス法にて塩基配列を決定した。 目的とする可溶型
EP0受容体の配列をもつクローンのプラスミ ド溶液を上記条件で EcoRI および Ba mHI 消化して抽出精製し、 同様に消化、 抽出精製した pCHOl と連結し、 大腸菌 JM 109 コンビテントセルを上記条件で形質転換し、 同様にプラスミ ド溶液を調製し、
EcoRIおよび BamHI にて消化してァガロースゲル電気泳動により解析し、 それぞ れ目的の可溶型 EP0受容体遺伝子の揷入された可溶型ヒト EP0受容体発現プラス ミ ド pCH0/EpoR2を得た。
2) 次に可溶型ヒト EP0受容体を発現する CH0細胞株の調製を行った。
30μ 1 の pCH0/EpoR2 プラスミ ド溶液と 4 μ 1 の Buffer Κ (χ10、 宝酒造） 、 4 1 の 1 % BSA溶液、 2 1 の Pvulを混和して 37°Cでー晚静置し、 50 の TE および 100 の TE飽和フエノールを混和後 14000rpmで 1分間 （トミ一精ェ、 MR X- 150)遠心し水相を回収し、 100μ 1 のクロ口ホルムを添加混合後、 14000rpmで
1分間 （トミ一精ェ、 MRX-150)遠心し水相を回収し、 エタノール沈澱を行った。 20M 1 の滅菌 TEに溶解し、 260nm の吸光度を測定して濃度を計算した。 10^ 1 の Lipofect AMINE (ライフテックオリエンタル） および 3 g の Pvul消化プラスミ ド溶液をそれぞれ 0.3ml の a- MEMに懸濁した後混和し、 室温で 30分間静置した。 25T フラスコ （べクトンディッキンソン） に 70%コンフルェントに培養した CH0 細胞を a -MEMにて洗浄後、 2.4mlの α- MEMを添加し、 Lipofect AMINE- プラスミ ド混合液を添加して 37°C、 5 %C02下で 8時間培養した。 上清を捨て、 5mlの 1 0%牛胎児血清 （FCS)を含む α- MEMにて一晚培養した後、 上清を捨て 5 mlの 10%F CS を含む a- MEM (核酸不含、 選択培地） にて培養を開始した。 2から 4日間隔 で選択培地を交換し、 増殖細胞を 75T フラスコにて 1度継代培養を行った後、 we 11あたり 0. 1個となるように希釈して 5枚の 96- 1/2穴プレート （コ一二ング） に 限界希釈を行った。 2週間後に倒立顕微鏡下で各 wellを観察して 89個のクローン の増殖を確認した。 ダルベッコ PBS にて洗浄後、 トリブシン- EDTA 溶液にて細胞 を回収し、 24穴プレートにて培養を行い、 コンフルェントに培養し、 培地を交換 して 4日間培養して培養上清を得た。 可溶型 EP0受容体を抗 FLAB M2 抗体を一次 抗体に用いたウェスタンプロット法にて確認し、 可溶型 EP0受容体発現クローン cl65を得た。 cl65を 20nM MTXを含む選択培地で培養し、 限界希釈を行って、 36ク ローンを得た。 培養上清を調製して可溶型 EP0受容体を抗 FLAG M2 抗体または抗 EP0 受容体抗体 （R&D systems)を一次抗体に用いたウェスタンプロット法にて確 認し、 可溶型 EP0受容体発現 CH0細胞株 EpoR/CHO c 165- 19を得た。
〔実施例 3〕 可溶性 E POレセプターの精製
sEpoR発現 CH0細胞の培養上清をフィルター （ポアサイズ 5 m フジフィルム 社製） で濾過し、 更に SARTOPURE PPフィルター（Sartorius社製） 、 SARTOBRAN P フィルタ一 （ポアサイズ 0.45 + 0. 2 μιη 、 Sartor ius)を通して細胞片等を除去し た。
濾液にピストリス塩酸緩衝液 （Bis-Trisを水に溶解し、 HC1で pH6.0 に調製し た溶液） を 20 になるよう添加し、 20mMピストリス塩酸緩衝液 pH6.0 で平衡化し た Q Sepharose Fast Flow (ベットボリューム 500ml) カラムに流速 4〜 5ml/ 分で吸着させた。 同カラムを 20mMピストリス塩酸緩衝液 pH6.0 で洗浄して非吸着 蛋白質を除去した後、 0.5M NaCl を含む 20mMピストリス塩酸緩衝液 pH6.0 で溶出 し （流速 5〜6mlZ分） 、 得られた画分にトリス塩酸緩衝液 （Trisを水に溶解し、 HC1 で pH7.3 に調製した溶液） を 50mMになるように添加して、 TBS (宝酒造社 製） 溶液で平衡化した抗 FLAG M2 ァフィ二ティ一 （ベットボリューム 10ml、 ィー ストマンコダック社製） カラムに吸着させた （流速 lnilZ分） 。
抗 FLAG M2 ァフィ二ティ一カラムへの吸着蛋白質を 0.1Mのグリシン塩酸緩衝液 PH3.5 で溶出し、 1 M トリス塩酸緩衝液 pH8.0 を約 1/10量添加して pHを中性付近 に戻して、 Vydac Protein C4 (Vydac 社製） による逆相系高速液体クロマトダラ フィ一に供した。 すなわち、 20%ァセトニトリルを含む 0. 1 %トリフルォロ酢酸 溶液で平衡化した Vydac Protein C4カラムに吸着させ、 60分間でァセトニトリル 濃度を 80%まで直線的に増加させて溶出した。 当該高速液体ク口マトグラフィー による溶出結果は単一ピークを呈したことから、 当該標品を精製 sEpoR とした。 〔実施例 4〕 可溶性 E POレセプターのピオチン標識
実施例 3で得られた精製 sEpoR を 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 pH8.6 に溶媒 置換した。 すなわち、 真空遠心濃縮機で乾燥後に 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 PH8.6 に溶解するか、 あるいは、 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 pH8.6 で平衡化 した Fast Desaltingカラム （フアルマシア社製） を用いて溶媒置換を行った。 ピオチン化試薬 （アマシャム社製） を標識対象の蛋白質 lmg当たり 40^ 1 添加 し、 攪拌しながら室温で 1時間標識を行った。 反応液中の未反応試薬を、 0.02% Tween 20を含む PBS溶液で平衡化したバイオゲル P- 6 カラム （バイオラッド社 製） で除去し、 得られた蛋白質画分をピオチン標識 sEpoR とした。
〔実施例 5〕 可溶性 E POレセプターの1251標識
実施例 3で得られた精製 sEpoR を 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 pH8.6 に溶媒 置換した。 すなわち、 真空遠心濃縮機で乾燥後に 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 PH8.6 に溶解するか、 あるいは、 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 pH8.6 で平衡化 した Fast Desaltingカラム （フアルマシア社製） を用いて溶媒置換を行った。
125I Bolton and Hunter 試薬 （アマシャム社製） の入ったバイアルに窒素ガ スを吹き付けて溶媒を蒸発させ、 同バイアルに sEpoR溶液 （約 lmg/ml)を 15 1 添加した。 5分毎に攪拌しながら氷中で 30分間反応を行った後、 0.2Mグリシンを 含む 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液 pH8.6 を 500 l 加えて更に 5分間氷中で反 応を行った。
反応液中の未反応試薬を、 0.25%ゼラチンを含む 0.1Mリン酸緩衝液 pH7.2 で平 衡化したセフアデックス G- 25カラム （フアルマシア社製） で除去し、 得られた蛋 白質画分を1251 標識 sEpoRとした。
〔実施例 6〕 S P Aビーズによる E P 0レセプタ一二量体形成の検出
100M 1 の測定用緩衝液 （組成： 0. 1 % BSA、 5mM EDTA を含む Dulbecco's PBS(-)) 中に 50 g のストレプトアビジン結合 SPAビーズ （アマシャム社製） 、 ピオチン化 sEpoR、 約 150000cpm の1251 標識 sEpoR が含まれる溶液を調製した。 この溶液中に以下に示す構造の EP0レセプター結合性べプチドのニ量体（SCIENCE, 273:458-463, (1996) 、 BLOOD, 88(10) :542a, (1996) 、 SCIENCE, 276:1696-1699, (1997) を参考に株式会社ペプチド研究所に依頼して合成） を添加して室温で 12 時間反応を行った後、 マイクロベータ （フアルマシア社製） で測定した。
E POレセプター結合性べプチドのニ量体の構造
CGTYSCHFGPLTWVCKPQGGn
GGTYSCHFGPLT VC PQGGXK (Xは β-AW
その結果、 EMP1 二量体の濃度に依存した SPAビーズからのシグナルが得られ、 E P〇レセプターの二量体化が検出された （図 1 ) 。 産業上の利用可能性
受容体多量体形成を指標とした生理活性因子代替物スクリーニング方法が提供 された。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 被検物質と接触させることにより、 受容体タンパク質分子またはそのぺプ チド断片がオリゴマーを形成するか否かを調べることによって、 その受容体タン パク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一化を促進する物質をスクリ一二 ングする方法。 ，
2 . 無細胞環境下で、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を被検物 質と接触させる請求項 1記載の方法。
3 . 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマー形成により誘 起される信号を測定することにより、 該受容体タンパク質分子またはそのべプチ ド断片がオリゴマ一を形成したか否かを調べる請求項 1または 2に記載の方法。
4 . 信号が、 シンチレ一シヨンシグナル、 化学発光シグナル、 蛍光シグナル、 吸光シグナル、 電離線シグナル、 核磁気共鳴シグナルおよび表面プラズモン共鳴 シグナルからなる群よリ選択される請求項 3記載の方法。
5 . 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片の少なくともひとつが標識 化されている請求項 3記載の方法。
6 . 標識が、 放射性同位元素、 蛍光体、 酵素、 ピオチン、 アビジン、 シンチラ ントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項 5記載の方法。
7 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射 性同位元素で標識化され、 他の少なくともひとつがシンチラントを含むビーズの 表面にコーティングされている請求項 6記載の方法。
8 . 放射性同位元素で標識化されている受容体またはそのペプチド断片と、 シ ンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている受容体またはそのぺプ チド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、 誘起されるシンチレーシヨンシグ ナルを測定することにより、 該受容体またはそのべプチド断片がォリゴマ一を形 成したか否かを調べる請求項 7記載の方法。
9 . 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマーが溶液中に形 成される請求項 1記載の方法。
1 0 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーが固相表面 上に形成される請求項 1記載の方法。
1 1. 受容体がサイ ト力イン受容体である請求項 1〜 1 0のいずれかに記載の 方法。
1 2. サイ ト力イン受容体が、 造 !fiL因子受容体、 リンホカイン受容体、 増殖因 子受容体および分化抑制因子受容体からなる群よリ選択される請求項 1 1記載の 方法。
1 3. サイ ト力イン受容体が、 エリスロポエチン （E P 0) 受容体、 トロンボ ポェチン （TPO) 受容体、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— C S F) 受容体、 マ クロファージコロニー刺激因子 （M— C S F) 受容体、 顆粒球マクロファージコ ロニー刺激因子 （GM— C S F) 受容体、 腫瘍壊死因子 （TNF) 受容体、 イン タ一ロイキン— 1 ( I L— 1 ) 受容体、 インターロイキン— 2 ( I L— 2) 受容 体、 インタ一ロイキン一 3 ( I L - 3 ) 受容体、 インタ一ロイキン一 4 ( I L- 4 ) 受容体、 インタ一ロイキン— 5 ( I L - 5 ) 受容体、 インターロイキン— 6
( I L— 6) 受容体、 インタ一ロイキン— 7 ( I L- 7) 受容体、 インタ一ロイ キン— 9 ( I L— 9) 受容体、 インタ一ロイキン一 10 ( I L-10) 受容体、 イン タ一ロイキン— 11 ( I L -11) 受容体、 インタ一ロイキン一 12 ( I L-12) 受容 体、 インターロイキン— 13 ( I L— 13) 受容体、 インタ一ロイキン一 15 ( I L- 15) 受容体、 インターフェロン一 α ( I FN- α) 受容体、 インタ一フエロン一 β ( I FN- 3 ) 受容体、 インタ一フエロン一 γ ( I FN-y ) 受容体、 成長ホ ルモン （GH) 受容体、 インスリン受容体、 血液幹細胞増殖因子 （SCF) 受容 体、 血管上皮増殖因子 （VEGF) 受容体、 上皮細胞増殖因子 （EGF) 受容体、 神経成長因子 （NGF) 受容体、 線維芽細胞増殖因子 （FGF) 受容体、 血小板 由来増殖因子 （PDGF) 受容体、 トランスフォーミング増殖— /3 (TGF- β ) 受容体、 白血球遊走阻止因子 （L I F) 受容体、 毛様体神経栄養因子 （CN TF) 受容体、 オンコスタチン Μ (0 SM) 受容体および Notch ファミリー受容 体からなる群より選択される請求項 1 1記載の方法。
14. 受容体タンパク質分子がサイ トカイン受容体サブュニットである請求項 1 1記載の方法。
1 5 . 受容体タンパク質分子のぺプチド断片がその受容体の可溶性領域を含む ものである請求項 1〜 1 4のいずれかに記載の方法。
1 6 . 受容体タンパク質分子のペプチド断片がその受容体の細胞外領域を含む ものである請求項 1 5記載の方法。 ―
1 7 . 受容体タンパク質分子のペプチド断片が少なくともその受容体のリガン ド結合部位を含むものである請求項 1 5記載の方法。
1 8 . オリゴマーがホモオリゴマーである請求項 1〜 1 7のいずれかに記載の 方法。
1 9 . オリゴマーがヘテロオリゴマーである請求項 1〜 1 7のいずれかに記載 の方法。
2 0 . オリゴマーがダイマ一である請求項 1〜 1 9のいずれかに記載の方法。
2 1 . スクリーニングされる物質が、 既知の生理活性物質の新規な代替物であ る請求項 1〜2 0のいずれかに記載の方法。
2 2 . 125 Iで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断 片と、 シンチラントを含むィットリゥムシリゲートビーズまたはポリビニルトル ェンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはその ぺプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、 誘起されるシンチレーシヨン シグナルを測定することにより、 該エリスロポエチン受容体またはそのべプチド 断片がダイマーを形成したか否かを調べる、 エリスロポエチン受容体タンパク質 分子またはそのペプチド断片の二量体化を促進する物質をスクリーニングする方 法。
2 3 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマ一化を促進す る物質による受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一形成が、 被検物質との接触により、 阻害されるか否かを調べることによって、 その受容体 タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリ 一二ングする方法。
2 4 . オリゴマー化促進物質が生理活性を有するものである請求項 2 3記載の 方法。
2 5 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害す る物質が、 前記オリゴマー化促進物質の生理活性を抑制する作用を有するもので ある請求項 2 4記載の方法。
2 6 . オリゴマ一化促進物質がェリス口ポェチンであリ、 受容体 ェリス口ポ ェチン受容体である請求項 2 3記載の方法。
2 7 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、 および緩衝液を含む、 その受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマー化を促進する物 質をスクリ一ニングするための検査キット。
2 8 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容 体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、 緩衝液がリン酸緩衝生理食塩 水である請求項 2 7記載の検査キット。
2 9 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進す る物質、 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、 および緩衝液を含む、 その受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマー化を阻害する物 質をスクリ一二ングするための検査キット。
3 0 . 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマ一化を促進す る物質がエリスロポエチンであり、 受容体タンパク質分子またはそのべプチド断 片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのべプチド断片であり、 緩 衝液がリン酸緩衝生理食塩水である請求項 2 9記載の検査キット。
3 1 . 請求項 1〜2 2のいずれかに記載の方法にょリ見いだされた受容体タン パク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマー化を促進する物質。
3 2 . 既知の生理活性物質の新規な代替物である請求項 3 1記載の物質。
3 3 . サイトカイン受容体ァゴニストである請求項 3 1記載の物質。
3 . エリスロポエチン受容体ァゴニストである請求項 3 3記載の物質。
3 5 . 赤血球形成を刺激する作用を有する請求項 3 4記載の物質。
3 6 . 請求項 2 3〜 2 6のいずれかに記載の方法により見いだされた受容体タ ンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマ一化を阻害する物質。
3 7 . 既知の生理活性物質のインヒビタ一である請求項 3 6記載の物質。
3 8 . サイ トカイン受容体アンタゴニストである請求項 3 6記載の物質。
3 9 . エリスロポエチン受容体アンタゴニストである請求項 3 8記載の物質。
4 0 . エリスロポエチンの赤血球形成刺激作用を阻害する請求項 3 9記載の物 質。 .
4 1 . 請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の方法により見いだされた受容体タン パク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマー化を促進する物質を含む医薬組 成物。
4 2 . 請求項 2 3〜 2 6のいずれかに記載の方法により見いだされた受容体タ ンパク質分子またはそのべプチド断片のオリゴマ一化を阻害する物質を含む医薬 組成物。
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