JP4397122B2 - 受容体タンパク質分子のオリゴマー化を促進する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、受容体タンパク質分子のオリゴマー化を促進する物質のスクリーニング方法、より詳細には、受容体タンパク質分子のオリゴマー形成を指標とした生理活性物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
エリスロポエチンや成長ホルモンといった生理活性因子は、標的細胞側の細胞膜に発現している特異的受容体に結合して、分化・増殖等のシグナルを伝えている。1990年、吉村らはEPO受容体の細胞外ドメインに存在するArg(129)をCysに置換すると、EPO非存在下でも増殖シグナルが伝わることを報告し、EPO受容体の細胞外ドメインがジスルフィド結合により多量体化することがシグナル伝達に重要であることを示唆した(Nature,348:647−649,(1990))。更に、成長ホルモンと成長ホルモン受容体の結合様式をX線構造解析で検討した結果、I分子の成長ホルモンに2分子の受容体が結合していることが明らかとなり(Journal of Molecular Biology,222(4):865−868,(1991))、生理活性因子からのシグナル伝達経路のファーストステップは受容体の多量体形成である可能性が高まった。
1996年にYXCXXGPXTWXCXP(Xはどの様なアミノ酸でも良い)の14アミノ酸をコア構造とするEPO受容体結合ペプチドがEPO機能を代替しうることが報告され(Science,273:458−463,(1996))、このペプチドとEPO受容体の結晶構造解析から、ペプチドの二量体がEPO受容体の二量体化を促していることが明らかとなった(Science,273:464−471,(1996))。
さらに、EPO受容体細胞外ドメインに対する抗体がEPO機能を代替することも明らかとなり、この抗体を一価(Fab)にするとEPO受容体への結合能を保持しつつもシグナル伝達能を失うことから、二価の結合によるEPO受容体の二量体形成が必要と考えられている(J.Biol.Chem.,271(40):24691−24697,(1996))。
この様な受容体の多量体形成を引き金とするシグナル伝達経路は、EPOや成長ホルモンに限った現象ではなく、インターフェロンや顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)などの生理活性因子でも共通に認められる現象である。トロンボポエチンに関しても受容体の多量体化を介して機能を代替しうるペプチドが発見されている(Science,276:1696−1699,(1997))。
カニングハムらは、成長ホルモン受容体とリガンドの三要素複合体形成を検出するリガンドの作用薬及び拮抗薬の選択方法を示している(特願平5−500070号)。しかしながら、本法は蛍光プローブ標識によるホモクエンチング量を分光蛍光計を用いて測定しており、大量の被検物質を測定するスクリーニングには適していなかった。
本発明の目的は、受容体多量体形成を指標とした生理活性因子代替物スクリーニング方法を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、被検物質との接触により、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成するか否かを簡便に調べることができるスクリーニング系を確立して、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、被検物質と接触させることにより、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成するか否かを調べることによって、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質なスクリーニングする方法を提供する。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片と被検物質との接触は無細胞環境下で行うとよい。
上記の方法においては、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー形成により誘起される信号を測定することにより、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成したか否かを調べることができる。信号は、シンチレーションシグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、吸光シグナル、電離線シグナル、核磁気共鳴シグナルおよび表面プラズモン共鴫シグナルからなる群より選択することができる。このような信号を測定する方法としては、SPA法、RIA法、表面プラズモン共鳴、核磁気共鳴、酵素免疫沈降測定法、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを挙げることができる。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつは標識化されているとよい。標識は、放射性同位元素、蛍光体、酵素、ビオチン、アビジン、シンチラントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。例えば、SPA法でオリゴマー形成の有無を調べるためには、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、他の少なくともひとつがシンチラントを含むビーズの表面にコーティングされているとよい。この場合、放射性同位元素で標識化されている受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該受容体またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成したか否かを調べることができる。ビーズ表面にコーティングする受容体とシンチラントを含むビーズ(SPAビーズ)の混合比は、取扱説明書に従い適当に決めればよい。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーは溶液中に形成されてもよいし、固相表面上に形成されてもよい。核磁気共鳴またはゲル濾過クロマトグラフィーを利用して、オリゴマー形成の有無を調べる場合には、通常、オリゴマーは溶液中に形成されるとよい。SPA法、RIA法、表面プラズモン共鳴または酵素免疫沈降測定法を利用して、オリゴマー形成の有無を調べる場合には、通常、オリゴマーは固相表面上に形成されるとよい。
受容体はサイトカイン受容体であるとよく、サイトカイン受容体は、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体および分化抑制因子受容体からなる群より選択することができ、より具体的には、エリスロポエチン(EPO)受容体、トロンボポエチン(TPO)受容体、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)受容体、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)受容体、腫瘍壊死因子(TNF)受容体、インターロイキン−1(IL−1)受容体、インターロイキン−2(IL−2)受容体、インターロイキン−3(IL−3)受容体、インターロイキン−4(IL−4)受容体、インターロイキン−5(IL−5)受容体、インターロイキン−6(IL−6)受容体、インターロイキン−7(IL−7)受容体、インターロイキン−9(IL−9)受容体、インターロイキン−10(IL−10)受容体、インターロイキン−11(IL−11)受容体、インターロイキン−12(IL−12)受容体、インターロイキン−13(IL−13)受容体、インターロイキン−15(IL−15)受容体、インターフェロン−α(IFN−α)受容体、インターフェロン−β(IFN−β)受容体、インターフェロン−γ(IFN−γ)受容体、成長ホルモン(GH)受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子(SCF)受容体、血管上皮増殖因子(VEGF)受容体、上皮細胞増殖因子(EGF)受容体、神経成長因子(NGF)受容体、線維芽細胞増殖因子(FGF)受容体、血小板由来増殖因子(PDGF)受容体、トランスフォーミング増殖−β(TGF−β)受容体、白血球遊走阻止因子(LIF)受容体、毛様体神経栄養因子(CNTF)受容体、オンコスタチンM(OSM)受容体およびNotchファミリー受容体からなる群より選択することができる。
受容体タンパク質分子は、サイトカイン受容体サブユニットであってもよい。例えば、IL−3受容体、IL−5受容体、GM−CSF受容体はαサブユニットとβサブユニットから構成され、βサブユニットは共通であることが知られている。また、IL−6受容体、LIF受容体、IL−11受容体は、αサブユニットとgp130サブユニットから構成され、gp130サブユニットが共通であることが知られている。また、CNTF受容体、OSM受容体では、αサブユニット、LIF受容体αサブユニットとgp130サブユニットの3量体から構成されている。また、IL−2受容体、IL−4受容体、IL−7受容体、IL−9受容体、IL−15受容体は、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニットから構成され、γサブユニットは共通であることが知られている。
受容体タンパク質分子のペプチド断片は、少なくともその受容体のリガンド結合部位を含むものであるとよい。受容体タンパク質分子のリガンド結合部位は細胞外領域あるいは可溶性領域に存在する。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が形成しうるオリゴマーは、ホモオリゴマーであっても、ヘテロオリゴマーであってもよいし、ダイマー、トリマー、テトラマー、などのいずれのオリゴマーであってもよい。例えば、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、G−CSF受容体、SCF受容体、EGF受容体などは、ホモダイマーを形成し、IL−6受容体、LIF受容体、IL−11受容体はヘテロダイマーを形成し、IL−2受容体、CNTF受容体、OSM受容体はヘテロトリマーを形成することが知られている。
スクリーニングされる物質は、既知の生理活性物質の新規な代替物であってもよい。既知の生理活性物質としては、エリスロポエチン、インターフェロン、G−CSF、成長ホルモン、トロンボポエチン、GM−CSF、M−CSF、などを挙げることができる。
上記方法のひとつの態様においては、125Iで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むイットリウムシリケートビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該エリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片がダイマーを形成したか否かを調べて、エリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の二量体化を促進する物質をスクリーニングすることができる。
本発明は、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質も提供する。このオリゴマー化促進物質は、既知の生理活性物質の新規な代替物となりうるものであり、サイトカイン受容体アゴニスト、特に、エリスロポエチン受容体アゴニストであってもよく、赤血球形成を刺激する作用を有するかもしれない。
本発明は、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質を含む医薬組成物も提供する。その態様として、腎性貧血治療剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、治療上有効量の上記オリゴマー化促進物質とともに、適当な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、担体などを含有してもよい。ここで、「治療上有効量」という用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を奏する量をいうものとする。本発明の医薬組成物は、液体、粉体、保護被膜で被覆された形態のいずれであってもよく、非経口、経口、経肺、経鼻などを含めた種々の投与経路で投与されうる。投与経路、投与量、投与時間、投与間隔などの投与計画は、有効成分である上記オリゴマー化促進物質とその剤型の特性、患者の年齢と病状などを考慮して、適宜決定することができる。
また、本発明は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質による受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー形成が、被検物質との接触により、阻害されるか否かを調べることによって、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。オリゴマー化促進物質は生理活性を有するものであってもよい。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質は、前記オリゴマー化促進物質の生理活性を抑制する作用を有するものであってもよい。例えば、オリゴマー化促進物質がエリスロポエチンであり、受容体がエリスロポエチン受容体であるとよい。
本発明は、また、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質も提供する。このオリゴマー化阻害物質は、既知の生理活性物質のインヒビターとなりうるものであり、サイトカイン受容体アンタゴニスト、特に、エリスロポエチン受容体アンタゴニストであってもよく、エリスロポエチンの赤血球形成刺激作用を阻害できるかもしれない。
本発明は、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質を含む医薬組成物も提供する。その態様として、EPO量が増加することによって生じる疾患の治療剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、治療上有効量の上記オリゴマー化阻害物質とともに、適当な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、担体などを含有してもよい。本発明の医薬組成物は、液体、粉体、保護被膜で被覆された形態のいずれであってもよく、非経口、経口、経肺、経鼻などを含めた種々の投与経路で投与されうる。投与経路、投与量、投与時間、投与間隔などの投与計画は、有効成分である上記オリゴマー化阻害物質とその剤型の特性、患者の年齢と病状などを考慮して、適宜決定することができる。
さらに、本発明は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質をスクリーニングするための検査キットを提供する。例えば、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
さらにまた、本発明は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングするための検査キットを提供する。例えば、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質がエリスロポエチンであり、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を用意する。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を含む膜画分であってもよいが、好ましくは、細胞から単離・精製されたものであるとよく、より好ましくは、組換え法などにより作製されたものであるとよい。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を得る方法の一例を以下に記載する。
膜画分を用いる場合、目的とする受容体蛋白質分子を発現している細胞をTriton X−100等の界面活性剤を含む緩衝液で可溶化し、リガンドまたは抗受容体抗体を固相化したアフィニティークロマトグラフィー等で受容体蛋白質分子を精製すればよい。
受容体蛋白質分子のリガンド結合部位の構造が明らかな場合には、その部分のペプチド断片を合成して使用することができる。
遺伝子組換え法により受容体蛋白質分子またはそのペプチド断片を得るには、PCR法やcDNAライブラリーを用いて受容体蛋白質分子の全長またはリガンド結合部位を含む細胞外領域をコードするcDNAをクローニングし、適当な発現ベクターに組み込んだ後、E.coliやCHO細胞等の宿主を用いて発現させればよい。精製を容易にする目的で目的とする蛋白質をコードする遺伝子の上流または下流にMBP,GST,FLAG等のタグをコードする遺伝子を連結することもできる。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーをRIA法、酵素免疫沈降測定法などで検出するためには、予め、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を標識化しておく。
次いで、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を被検物質と接触させて、オリゴマー形成の有無を調べる。その具体的方法は以下のとおりである。
本発明の一態様では、受容体の結合をシンチレーションによって測定することができる。シンチレーションは同位体元素で標識された受容体から発せられる放射線が、複合体を形成したもう一方の受容体に結合した発光物質(シンチラント)に衝突して発する光を光電子倍増管やフォトダイオードなどで電圧パルスに変えて測定することかできる。発光物質としてはNaI,CsI,ZnSなどの結晶または粉末、アントラセン、ナフタリンなどの結晶が好適に用いられる。また、Amersham社によって開発された(Bothworth N,and Towers P.(1989)Nature,341,167−168)シンチレーション近接アッセイ技術(scintillation proximity Assay(SPA)を用いることができる。シンチレーション近接アッセイでは、シンチラントを含むイットリウムシリケートまたはポリビニルトルエンビーズ(SPAビーズ)に同位体元素が結合または近接すると、放射同位体のエネルギーがSPAビーズに吸収され光に変換される。例えば、SPAビーズを一方の受容体に結合させ、さらに放射性同位体を結合させたもう一方の受容体を溶液中に共存させる。ここに被検物質を加え、被検物質の介在によって生じる複合体の形成により誘起される光を検出することが可能である。SPAビーズと受容体との結合にはアビジン、ビオチンをもちいることができる。放射性同位体としては3H,14C,32P,45Ca,125Iをもちいることができる。また、SPAビーズの他にシンチラントをプレートの底面に含むマイクロタイタープレートを用いることもできる。例えば、標識をしていない一方の受容体をプレートの底面に固定し、ここへ放射性同位体で標識された受容体と被検物質を加える。被検物質を介して受容体の複合体が形成されると、プレート底面に放射性同位体で標識された受容体が留まり、プレート底面に含有されたシンチラントに放射性同位体のエネルギーが吸収されて光が発せられる。光量の増加により複合体の検出が可能である。SPAビーズを用いる方法は、結合、非結合の分離操作を必要とせず、簡便な方法である点で、大量の被検物質の活性を測定するスクリーニングに特に好適である。
本発明の別の態様では、BIACOREと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサー(フェルマシアバイオテク社により開発、実用化された)により受容体の複合体形成を検出することができる。BIACOREの基本構造は、光源とプリズム、ディテクターとマイクロ流路からなる。カセット式のセンサーチップ上に一方の受容体を固定化し、もう一方の受容体をセンサーチップ上にインジェクションする。インジェクトされた受容体は一定の流速でセンサーチップ上に供給され、固定化された受容体中に拡散する。固定化された受容体とインジェクトされた受容体が結合して複合体を形成すれば、インジェクションされた受容体がセンサーチップ上に留まり、センサーチップ上の蛋白質で構成される体積が増加する。この体積の増加を光学的にプラズモン共鳴シグナルとして検出することができる。例えば、被検物質と受容体を同時にインジェクションした際のプラズモン共鳴シグナルの増加を検出し、被検物質を共存させることによって誘起されたプラズモン共鳴シグナルの増加により、被検物質の活性を検出することができる。
本発明のさらに別の態様では、核磁気共鳴(NMR:Nuclear magnetic resonance)を用いて複合体の形成を検出することが可能である。NMRはエネルギーの小さな電磁波を用いる方法であり、わずかなエネルギー変化でも感度よく検出することができる点で好ましい。例えば、2種の受容体を1mM程度の濃度で溶媒に溶かし、核磁気共鳴シグナルを測定する。ついで、被検物質を加え、再度核磁気共鳴シグナルを測定し、シグナルの移動を測定することで複合体を検出することができる。
本発明のさらなる別の態様では、酵素免疫沈降測定法(ELISA:Enzyme−liked immunosorbent assay)を用いることができる。例えば、96穴プレートに一方の受容体を固定し、適当な溶媒下、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはアルカリフォスファターゼ等の酵素を結合させたもう一方の受容体と被検物質を加え反応させる。洗浄後、発色試薬を加え、好適な波長における吸光度を測定する。吸光度の増大により複合体の形成を検出することができる。酵素としてルシフェラーゼを結合させ、発光試薬により化学発光量により検出することも可能である。また、放射性同位元素または蛍光物質で標識した受容体を、酵素を結合した受容体の代わりに用いて、残存する電離線量または蛍光量を測定することにより検出することも可能である。
本発明のまた別の態様では、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることができる。適当な条件で反応した2種の受容体と被検物質をゲル濾過クロマトグラフィにふす。複合体の形成は、吸光度ピーク保持時間の移動により検出することができる。
受容体タンパク質またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングするには、以下のようにすればよい。
受容体タンパク質またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質と、被検物質とを共存させてシグナルの変化を検出することによりスクリーニングすることができる。
例えば、125Iで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むイットリウムシリケートビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に、受容体タンパク質またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質と被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより阻害する物質を検出することができる。
本発明の検査キットの一態様においては、キットを構成する要素が、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまとめにして、バイアル,チューブなどのような容器に包含されていてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめにして納めるための区画化された担持手段に納められていてもよい。このキットにおいては、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、およびそのオリゴマー化を促進する物質が凍結乾燥された状態であるとよい。これらの要素は、検査キットの使用時に、緩衝液に添加されて、検査に供されるとよい。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願平10−102325号の明細書および図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例1〕EPOレセプター遺伝子のクローニング
1)EPOレセプターcDNA配列をもとにPCRのための2組計4個のプライマーを設計した。即ち、第1回目のPCR用として、5’側にERO−1(5’−GCAGCTGCTGACCCAGCTGT−3’)(配列番号1)および3’側ERO−2(5’−AAGTCTTGAGTCTGCACTGG−3’)(配列番号2)を作製した。クローニングの正確性を高めるための第2回目のPCR用としてERO−1,ERO−2の内側の5’側にERI−1(5’−TTTGAATTCTGTATCATGGACCACCTCGG−3’)(配列番号3)および3’側にERI−2(5’−TTTAAGCTTGATCCCTGATCATCTGCAGC−3’)(配列番号4)を作製した。ERI−1,ERI−2には後にサブクローニングを容易にするため、EcoRIとHindIIIサイトをそれぞれ付与した。
2)EPOレセプター高発現細胞株(AS−E2)約1×108個より、AGPC法の改変法(フェノール処理とクロロホルム処理を追加)にてtotal RNA(1.23mg)を抽出した。total RNAの全量から、oligo dT−latex beadsを使ってpoly(A)+RNA(7.8ug)を精製した。mRNAの純度を電気泳動で確認した後、1ugのpoly(A)+RNAからAmersham cDNA合成キットを用いて逆転写反応を行った。この反応液(20ul)のうち2ulを、LA Taq(Takara LA PCR kit ver2)を用いたPCRを行った。PCRプライマーは、ERO−1,ERO−2およびERI−1,ERI−2を用いた。PCRサイクルは、94℃、2min−−−(98℃、20sec/60℃、90sec/72℃、3min)×30cycle−−−72℃、10minで行った。このRT−PCR反応液の一部を、電気泳動にて増幅フラグメントのサイズの確認を行った。
3)AS−E2細胞mRNAより合成した1st strand cDNAを鋳型として、上記の方法にてLA Taq(Takara)を用いて独立に6反応のPCRを行った。このPCRにはプライマーとしてERI−1,ERI−2を用いた。増幅した各PCRフラグメントをpBluscriptII SK(+)にサブクローニングした後、それぞれより1個ずつのクローンを選択し、プラスミドを調製した。それぞれの6クローンのプラスミド、およびPCRフラグメント(Direct sequencing)について解析を行った。
4)2箇所の塩基置換を含むEPO−R cDNAプラスミドよりBamHIとHindIIIによりcDNAインサートを切り出したのち、pUC119ベクターのBamHI/HindIIIサイトに挿入した。このプラスミドをBssHIIおよびBalIにて消化後、ベクターを含むフラグメントを得た(フラグメント1)。一方、3)で作製した6つのEPO−R cDNAのBssHII部位よりBalI部位までの領域が変異を含まない正常塩基配列を確認したクローンよりBssHII部位よりBalI部位までの領域を切り出した(フラグメント2)。フラグメント1とフラグメント2をライゲーションして得たクローンのなかで、塩基配列を解析しフラグメント2が正しく挿入されたクローン(pUC119−EPOR−L2)を単離した。pUC119−EPOR−L2より、BamHIとHindIIIによりcDNAインサートを切り出したのち、pBLSII SK(+)ベクターのBamHI/HindIIIサイトに挿入したクローンを得た(pEPOR−L2/SK)。
〔実施例2〕可溶性EPOレセプターの発現系構築
1)可溶型ヒトEPO受容体遺伝子を構築するため、pEPOR−SKを鋳型に用いて以下に示すプライマー1および2によりPCRを行った。
プライマー1:5’−TTTTAAGAATTCCACCATGGACCACCTCGGGGCGT−3’(配列番号5)
プライマー2:5’−GGGATCCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTAGGCGTCAGCAGCGACA−3’(配列番号6)
プライマー3:5’−TGAATTCAGTGTGTGCTGAGCAACCT−3’(配列番号7)
プライマー4:5’−GGGATCCGCTTTGCTCTCGAACTT−3’(配列番号8)
50μlの反応溶液には10mMのTris−HCl pH8.3、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、2.5UのEx.Taq(宝酒造)、0.25mMのdNTP、0.2μMのプライマー1及び2、180ngのpEPOR−SKを含み、15μlのChillOut14(MJ Research Inc.)を重相し、480型サーマルサイクラー(Perkin−Elmer)にて96℃で1分、60℃で1分、72℃で2分のサイクルを30サイクル反応させた後、72度で10分間保温した。得られたPCR産物をPCR精製キット(Qiagen)にて精製し、エタノール沈澱後、8μlのTEに溶解した。1μlのBuffer H(x10、宝酒造)を添加後EcoRIおよびBamHIをそれぞれ0.5μl(10U)添加して37℃で2時間消化した。消化物を1%アガロースゲル電気泳動を行って、約700bpのバンドを切りだし、ゲルエクストラクションキット(Qiagen)により抽出精製し、エタノール沈澱後、5μlのTEに溶解した。同様にEcoRIおよびBamHIで消化したpUC19(1μg、宝酒造)をエタノール沈澱後、10μlのTEに溶解した。切り出したバンドおよびpUC19それぞれ2および1μlに、蒸留水4μlおよび2μlのx5 T4 DNA ligase Buffer、1μlのT4DNA ligase(ライフテックオリエンタル)を混合し、16℃、2時間反応させた後、氷上で融解した大腸菌JM109株コンピテントセル(宝酒造)に混和して氷上30分間静置し、42℃で1分間保温した後氷上に2分30秒静置し、500μlのSOC培地(ライフテックオリエンタル)を添加して37℃で保温した。このうち200μlをLBA−Ampプレートに播種して37℃で一晩静置し、形成されたコロニーのうち6個を3mlのLB−AmpおよびLBA−Ampプレートにストリークして37℃で培養し、さらに蒸留水に懸濁して上記条件でコロニーPCRを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて解析し、すべてのクローンでEPO受容体遺伝子の挿入を確認した。LB−Ampにて培養した培養液から2000rpm、15分間の遠心(日立、05PR22)により大腸菌を回収し、QIAprep−spinplasmid kit(Qiagen)によりプラスミドを100μlのTEに回収した。プラスミド溶液をサイクルシークエンシングキット(パーキンエルマー)、プライマー1、2、3、4、M13(−21)(パーキンエルマー)またはM13RV(宝酒造)を用いて、ABI373A型DNAシークエンサー(パーキンエルマー)にてサイクルシークエンス法にて塩基配列を決定した。目的とする可溶型EPO受容体の配列をもつクローンのプラスミド溶液を上記条件でEcoRIおよびBamHI消化して抽出精製し、同様に消化、抽出精製したpCHO1と連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを上記条件で形質転換し、同様にプラスミド溶液を調製し、EcoRIおよびBamHIにて消化してアガロースゲル電気泳動により解析し、それぞれ目的の可溶型EPO受容体遺伝子の挿入された可溶型ヒトEPO受容体発現プラスミドpCHO/EpoR2を得た。
2)次に可溶型ヒトEPO受容体を発現するCHO細胞株の調製を行った。
30μlのpCHO/EpoR2プラスミド溶液と4μlのBuffer K(x10、宝酒造)、4μlの1%BSA溶液、2μlのPvuIを混和して37℃で一晩静置し、50μlのTEおよび100μlのTE飽和フェノールを混和後14000rpmで1分間(トミー精工、MRX−150)遠心し水相を回収し、100μlのクロロホルムを添加混合後、14000rpmで1分間(トミー精工、MRX−150)遠心し水相を回収し、エタノール沈澱を行った。20μlの滅菌TEに溶解し、260nmの吸光度を測定して濃度を計算した。10μlのLipofect AMINE(ライフテックオリエンタル)および3μgのPvuI消化プラスミド溶液をそれぞれ0.3mlのα−MEMに懸濁した後混和し、室温で30分間静置した。25Tフラスコ(ベクトンディッキンソン)に70%コンフルエントに培養したCHO細胞をα−MEMにて洗浄後、2.4mlのα−MEMを添加し、Lipofect AMINE−プラスミド混合液を添加して37℃、5%CO2下で8時間培養した。上清を捨て、5mlの10%牛胎児血清(FCS)を含むα−MEMにて一晩培養した後、上清を捨て5mlの10%FCSを含むα−MEM(核酸不合、選択培地)にて培養を開始した。2から4日間隔で選択培地を交換し、増殖細胞を75Tフラスコにて1度継代培養を行った後、wellあたり0.1個となるように希釈して5枚の96−1/2穴プレート(コーニング)に限界希釈を行った。2週間後に倒立顕微鏡下で各wellを観察して89個のクローンの増殖を確認した。ダルベッコPBSにて洗浄後、トリプシン−EDTA溶液にて細胞を回収し、24穴プレートにて培養を行い、コンフルエントに培養し、培地を交換して4日間培養して培養上清を得た。可溶型EPO受容体を抗FLAB M2抗体を一次抗体に用いたウエスタンブロット法にて確認し、可溶型EPO受容体発現クローンc165を得た。c165を20nM MTXを含む選択培地で培養し、限界希釈を行って、36クローンを得た。培養上清を調製して可溶型EPO受容体を抗FLAG M2抗体または抗EPO受容体抗体(R&D systems)を一次抗体に用いたウエスタンブロット法にて確認し、可溶型EPO受容体発現CHO細胞株EpoR/CHO c165−19を得た。
〔実施例3〕可溶性EPOレセプターの精製
sEpoR発現CHO細胞の培養上清をフィルター(ポアサイズ5μmフジフィルム社製)で濾過し、更にSARTOPURE PPフィルター(Sartorius社製)、SARTOBRAN Pフィルター(ポアサイズ0.45+0.2μm、Sartorius)を通して細胞片等を除去した。
濾液にビストリス塩酸緩衝液(Bis−Trisを水に溶解し、HClでpH6.0に調製した溶液)を20mMになるよう添加し、20mMビストリス塩酸緩衝液pH6.0で平衡化したQ Sepharose Fast Flow(ベットボリューム500ml)カラムに流速4〜5ml/分で吸着させた。同カラムを20mMビストリス塩酸緩衝液pH6.0で洗浄して非吸着蛋白質を除去した後、0.5M NaClを含む20mMビストリス塩酸緩衝液pH6.0で溶出し(流速5〜6ml/分)、得られた画分にトリス塩酸緩衝液(Trisを水に溶解し、HClでpH7.3に調製した溶液)を50mMになるように添加して、TBS(宝酒造社製)溶液で平衡化した抗FLAG M2アフィニティー(ベットボリューム10ml、イーストマンコダック社製)カラムに吸着させた(流速1ml/分)。
抗FLAG M2アフィニティーカラムへの吸着蛋白質を0.1Mのグリシン塩酸緩衝液pH3.5で溶出し、1Mトリス塩酸緩衝液pH8.0を約1/10量添加してpHを中性付近に戻して、Vydac Protein C4(Vydac社製)による逆相系高速液体クロマトグラフィーに供した。すなわち、20%アセトニトリルを含む0.1%トリフルオロ酢酸溶液で平衡化したVydac Protein C4カラムに吸着させ、60分間でアセトニトリル濃度を80%まで直線的に増加させて溶出した。当該高速液体クロマトグラフィーによる溶出結果は単一ピークを呈したことから、当該標品を精製sEpoRとした。
〔実施例4〕可溶性EPOレセプターのビオチン標識
実施例3で得られた精製sEpoRを0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6に溶媒置換した。すなわち、真空遠心濃縮機で乾燥後に0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6に溶解するか、あるいは、0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6で平衡化したFast Desaltingカラム(ファルマシア社製)を用いて溶媒置換を行った。
ビオチン化試薬(アマシャム社製)を標識対象の蛋白質1mg当たり40μl添加し、攪拌しながら室温で1時間標識を行った。反応液中の未反応試薬を、0.02%Tween20を含むPBS溶液で平衡化したバイオゲルP−6カラム(バイオラッド社製)で除去し、得られた蛋白質画分をビオチン標識sEpoRとした。
〔実施例5〕可溶性EPOレセプターの125I標識
実施例3で得られた精製sEpoRを0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6に溶媒置換した。すなわち、真空遠心濃縮機で乾燥後に0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6に溶解するか、あるいは、0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6で平衡化したFast Desaltingカラム(ファルマシア社製)を用いて溶媒置換を行った。
125I Bolton and Hunter試薬(アマシャム社製)の入ったバイアルに窒素ガスを吹き付けて溶媒を蒸発させ、同バイアルにsEpoR溶液(約1mg/ml)を15μl添加した。5分毎に攪拌しながら氷中で30分間反応を行った後、0.2Mグリシンを含む0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液pH8.6を500μl加えて更に5分間氷中で反応を行った。
反応液中の未反応試薬を、0.25%ゼラチンを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.2で平衡化したセファデックスG−25カラム(ファルマシア社製)で除去し、得られた蛋白質画分を125I標識sEpoRとした。
〔実施例6〕SPAビーズによるEPOレセプター二量体形成の検出
100μlの測定用緩衝液(組成:0.1%BSA、5mM EDTAを含むDulbecco’s PBS(−))中に50μgのストレプトアビジン結合SPAビーズ(アマシャム社製)、ビオチン化sEpoR、約150000cpmの125I標識sEpoRが含まれる溶液を調製した。この溶液中に以下に示す構造のEPOレセプター結合性ペプチドの二量体(SCIENCE,273:458−463,(1996)、BLOOD,88(10):542a,(1996)、SCIENCE,276:1696−1699,(1997)を参考に株式会社ペプチド研究所に依頼して合成)を添加して室温で12時間反応を行った後、マイクロベータ(ファルマシア社製)で測定した。
EPOレセプター結合性ペプチドの二量体の構造
その結果、EMP1二量体の濃度に依存したSPAビーズからのシグナルが得られ、EPOレセプターの二量体化が検出された(図1)。
産業上の利用可能性
受容体多量体形成を指標とした生理活性因子代替物スクリーニング方法が提供された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、SPAビーズによるEPOレセプター二量体の検出結果を示す。横軸はEMP1二量体のモル濃度、縦軸は発光量のカウントを示す。
Claims (25)
- 被検物質と接触させることにより、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成するか否かを調べることによって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質をスクリーニングする方法であって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、他の少なくともひとつがシンチラントを含む固相に結合されており、ならびに、該オリゴマー形成により誘起されるシンチレーションシグナルを測定することを含む、前記方法。
- 無細胞環境下で、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を被検物質と接触させる請求項1記載の方法。
- シンチラントを含む固相に結合されている受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がシンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている請求項1又は2記載の方法。
- 放射性同位元素で標識化されている受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該受容体またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成したか否かを調べる請求項3記載の方法。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーが固相表面上に形成される請求項1記載の方法。
- 受容体がサイトカイン受容体である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- サイトカイン受容体が、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体および分化抑制因子受容体からなる群より選択される請求項6記載の方法。
- サイトカイン受容体が、エリスロポエチン(EPO)受容体、トロンボポエチン(TPO)受容体、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)受容体、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)受容体、腫瘍壊死因子(TNF)受容体、インターロイキン−1(IL−1)受容体、インターロイキン−2(IL−2)受容体、インターロイキン−3(IL−3)受容体、インターロイキン−4(IL−4)受容体、インターロイキン−5(IL−5)受容体、インターロイキン−6(IL−6)受容体、インターロイキン−7(IL−7)受容体、インターロイキン−9(IL−9)受容体、インターロイキン−10(IL−10)受容体、インターロイキン−11(IL−11)受容体、インターロイキン−12(IL−12)受容体、インターロイキン−13(IL−13)受容体、インターロイキン−15(IL−15)受容体、インターフェロン−α(IFN−α)受容体、インターフェロン−β(IFN−β)受容体、インターフェロン−γ(IFN−γ)受容体、成長ホルモン(GH)受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子(SCF)受容体、血管上皮増殖因子(VEGF)受容体、上皮細胞増殖因子(EGF)受容体、神経成長因子(NGF)受容体、線維芽細胞増殖因子(FGF)受容体、血小板由来増殖因子(PDGF)受容体、トランスフォーミング増殖−β(TGF−β)受容体、白血球遊走阻止因子(LIF)受容体、毛様体神経栄養因子(CNTF)受容体、オンコスタチンM(OSM)受容体およびNotchファミリー受容体からなる群より選択される請求項6記載の方法。
- 受容体タンパク質分子がサイトカイン受容体サブユニットである請求項6記載の方法。
- 受容体タンパク質分子のペプチド断片がその受容体の可溶性領域を含むものである請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 受容体タンパク質分子のペプチド断片がその受容体の細胞外領域を含むものである請求項10記載の方法。
- 受容体タンパク質分子のペプチド断片が少なくともその受容体のリガンド結合部位を含むものである請求項10記載の方法。
- オリゴマーがホモオリゴマーである請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- オリゴマーがヘテロオリゴマーである請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- オリゴマーがダイマーである請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- スクリーニングされる物質が、既知の生理活性物質の新規な代替物である請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 125Iで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むイットリウムシリケートビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該エリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片がダイマーを形成したか否かを調べることを含む、エリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の二量体化を促進する物質をスクリーニングする方法。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質による受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー形成が、被検物質との接触により、阻害されるか否かを調べることによって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、他の少なくともひとつがシンチラントを含む固相に結合されており、ならびに、該オリゴマー形成により誘起されるシンチレーションシグナルを測定することを含む、前記方法。
- オリゴマー化促進物質が生理活性を有するものである請求項18記載の方法。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質が、前記オリゴマー化促進物質の生理活性を抑制する作用を有するものである請求項19記載の方法。
- オリゴマー化促進物質がエリスロポエチンであり、受容体がエリスロポエチン受容体である請求項18記載の方法。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質をスクリーニングするための検査キットであって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が放射性同位元素で標識化されたものと、シンチラントを含む固相に結合されたものとからなる、前記検査キット。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である請求項22記載の検査キット。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングするための検査キットであって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が放射性同位元素で標識化されたものと、シンチラントを含む固相に結合されたものとからなる、前記検査キット。
- 受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質がエリスロポエチンであり、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である請求項24記載の検査キット。
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