SK278576B6 - Expression vectors for increased production polypeptides, plasmides containing these vectors, host cells containing these plasmides, gained products, connecting methods and use - Google Patents
Expression vectors for increased production polypeptides, plasmides containing these vectors, host cells containing these plasmides, gained products, connecting methods and use Download PDFInfo
- Publication number
- SK278576B6 SK278576B6 SK5246-84A SK524684A SK278576B6 SK 278576 B6 SK278576 B6 SK 278576B6 SK 524684 A SK524684 A SK 524684A SK 278576 B6 SK278576 B6 SK 278576B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- vector
- bgh
- host
- gene
- met
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 108
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 24
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 21
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 14
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 14
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 13
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 11
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 11
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 10
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 10
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 3
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 claims description 3
- JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N Met-Asp-Gln Chemical group CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 2
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 2
- DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N Met-Asp-Pro Chemical group CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N 0.000 claims 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 19
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- IUYCGMNKIZDRQI-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IUYCGMNKIZDRQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- -1 methionine amino acid Chemical class 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- DGLQWAFPIXDKRL-UBHSHLNASA-N Ala-Met-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N DGLQWAFPIXDKRL-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 101000651036 Arabidopsis thaliana Galactolipid galactosyltransferase SFR2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 102100039554 Galectin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000887168 Gallus gallus Gallinacin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100412102 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) rec2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 241000893859 Matelea Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- XOMXAVJBLRROMC-IHRRRGAJSA-N Met-Asp-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XOMXAVJBLRROMC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RNAGAJXCSPDPRK-KKUMJFAQSA-N Met-Glu-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 RNAGAJXCSPDPRK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- DGNZGCQSVGGYJS-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DGNZGCQSVGGYJS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JOYFULUKJRJCSX-IUCAKERBSA-N Met-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O JOYFULUKJRJCSX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VQILILSLEFDECU-GUBZILKMSA-N Met-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VQILILSLEFDECU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N Met-Thr-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000010916 pituitary tumor Diseases 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940088174 thiamine 1 mg Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Vynález sa týka zlepšených expresných vektorov na produkciu polypeptidov, plazmidov obsahujúcich tieto vektory, hostiteľov obsahujúcich tieto plazmidy, získaných produktov, súvisiacich spôsobov a použitia.
Doterajší stav techniky
Jedna z oblastí genetického inžinierstva sa zaoberá zavádzaním cudzích sekvencií DNA, odvodených z eukaryotických zdrojov, do Escherichia coli alebo iných mikroorganizmov. Nadväzujúcou oblasťou genetického inžinierstva je produkcia polypeptidov kódovaných cudzou DNA, pomocou takto získaných mikroorganizmov. Produkciu polypeptidov je možné považovať za dvojstupňový proces, v ktorom každý stupeň zahrnuje mnohé ďalšie kroky. Uvedené dva stupne sú transkripcia a translácia. Aby bolo možné polypeptidy produkovať účinne a vo veľkom množstve, musia byť účinné obidva stupne procesu. Transkripcia je produkcia mRNA z génu (DNA). Translácia je produkcia polypeptidu z mRNA.
Kritickým krokom transkripčného procesu je iniciácia, t. j. väzba RNA-polymerázy v oblasti promótor-operátor. Sekvencia deoxyribonukleotidových báz, ktoré tvoria oblasť promótora, sa môže meniť, a tak ovplyvňovať relatívnu účinnosť promótora. Účinnosť závisí od afinity RNA-polymerázy k promótoru.
Účinnosť translácie je ovplyvňovaná stabilitou mRNA. Zvýšená stabilita mRNA umožňuje lepšiu transláciu. Aj keď exaktné determinanty stability mRNA nie sú presne známe, je známe, že určitú úlohu z hľadiska stability hrá sekundárna štruktúra mRNA, určovaná sekvenciou báz.
Prvý krok translácie spočíva vo väzbe ribozómu k sekvencií mRNA označovanej ako Shineova-Delgamova sekvencia alebo miesto väzby ribozómov (RBS). Syntéza polypeptidov začína tak, že ribozóm migruje pozdĺž mRNA k štartovaciemu kodónu AUG, kde dochádza k translácii. Tento kodón sa obvykle nachádza blízko pri bázach za Shineovou-Dalgamovou sekvenciou. Medzi faktory ktoré zvyšujú účinnosť translácie patria tie, ktoré podporujú väzbu ribozómu k Shineovej-Dalgamovej sekvencii. Zistilo sa, že rozhodujúcu úlohu pri stanovení translácie hrá tak sekundárna štruktúra mRNA v oblasti Shineovej-Dalgamovej sekvencie a kodónu AUG, ako aj vzdialenosť medzi Shineovou-Dalgamovou sekvenciou a kodónom AUG. Ďalším faktorom, ktorý ovplyvňuje účinnosť translácie, je predčasná terminácia a zoslabenie. Účinnosť translácie sa dá zlepšiť odstránením zoslabovacích miest.
Prekážka, na ktorú narážajú pokusy výroby veľkých množstiev eukaryotických polypeptidov v bakteriálnych bunkách, spočíva v neschopnosti buniek, produkujúcich veľké množstvo mRNA, účinne rásť. Tento problém sa dá odstrániť tak, že sa zabráni transkripcii pomocou nazývaného represia. Pri represii sa gény blokujú pôsobením inhibičného proteínu (represora), ktorý zabraňuje transkripcii tak, že sa viaže na operátor. Po tom, čo mikroorganizmy dorastú na požadovanú hustotu buniek, blokované gény sa aktivujú deštrukciou represora alebo prídavkom molekúl nazývaných induktory, ktoré rušia efekt represorov.
V literatúre je možné nájsť mnohé práce zaoberajúce sa klonovaním eukaryotických génov v plazmidoch obsahujúcich promótor PL z bakteriofágov lambda (Bernard, H. V. a ď., Gene (1979) 5, 59, Derom, C. a ď., Gene (1982) 17, 45, Gheysen, D. a ď, Gene (1982) 17, 55, Hedgpeth, J. a ď., Mol. Gen. Genet. (1978) 163, 197, 5 Remaut, E. a d., Gene (1981) 15, 81 a Derynck, R., a ď.,
Náture (1980) 287, 193). Európska patentová prihláška č. 041.767, zverejnená 16. 12. 1981, opisuje expresné vektory obsahujúce promótor PL z bakteriofágu lambda. Žiadna z uvedených publikácií však neopisuje použitie 10 miesta väzby ribozómov Cn.
Bolo opísané použitie vektora obsahujúceho promótor PL z bakteriofágu lambda a miesta väzby ribozómov Cn (Oppenheim, A. B. a ď., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327 a Shimatake, H. a Rosenberg, M., Náture 15 (1981) 292, 128). Tieto publikácie opisujú produkciu zvýšeného množstva proteínu CIt ale nezaoberajú sa produkciou eukaryotických proteínov.
Shatzman a Rosenberg predviedli v r. 1982 na 14. Zimnom sympóziu v Miami panel (Shatzman, A. R a 20 Rosenberg, M., 14 Miami Winter Symposium, anotácia str. 98 (1982)). Táto anotácia obsahuje neinštruktívny opis použitia vektora obsahujúceho PL z bakteriofágu lambda, Nut a miesta väzby ribozómov Cn na syntézu „eukaryotického“ polypeptidu (antigén SV40t nie je v 25 skutočnosti eukaryotický polypeptid, ale vírusový proteín) v množstve väčšom ako 5 % bunkového proteínu v nemenovanom bakteriálnom hostiteľovi, Použitý operátor nie je definovaný. Takisto nie je identifikovaný pôvod replikácie ani gén pre selektívny fenotyp. Tento 30 systém, používajúci vektor, je opisovaný ako systém obsahujúci určité hostiteľské lyzogény, do ktoiých je možné vektor stabilne transformovať. Jedna z realizácii nášho vynálezu, a to pMGlOO, môže byť v určitých črtách tomuto vektoru podobná. Netransformuje sa však do 35 hostiteľského lyzogénu, ale skôr do vhodných hostiteľských kmeňov E. coli, ktoré obsahujú termolabilný represor CI a gén N, ale z ktorých bol odstránený zvyšok lyzogénu. Okrem toho bol použitý na produkciu analógov hovädzieho (hGH) rastového hormónu v množ40 stvách prevyšujúcich 20 % celkového bunkového proteínu.
V ďalších realizáciách nášho vynálezu sa okrem toho používajú miesta väzby ribozómov, ktoré sa líšia od Cn- Ďalej boli odstránené nepodstatné sekvencie, pokiaľ 45 ide o vektor pND5 a jeho deriváty, za vzniku vektora umožňujúceho produkciu polypeptidov v množstve viac ako o 10 % vyššom, ako pokiaľ ide o pMGlOO.
Nedávno sa prihlasovateľ dozvedel o existencii patentovej prihlášky USA na meno M. Rosenberg, podanej 50 pod. č. 457 352 National Institutes of Health, Dept. of Health and Human Services, USA. Časti tejto prihlášky boli získané z Národnej technickej informačnej služby (Dept. of Commerce, USA), ale nie sú dostupné a sú udržiavané v tajnosti. Dostupné časti boli zhodnotené a 55 bolo zistené, že sú neištruktívne. Uvádzajú, že hostiteľ je dôležitý (str. 8, r. 17), ale neuvádzajú žiadneho vhodného hostiteľa. . Závisí ďalej od použitia mutanty lambda, ktorá nie je špecifikovaná (str. 4. r, 20). Uvádzajú, že hostiteľ obsahuje lyzogény (str. 8, r. 18) na rozdiel od 60 nášho vynálezu, kde hostiteľ nie je lyzogénny. Zmieňujú sa o klonovaní a expresii eukaryotického génu, opičieho metalotioneínového génu (str. 7, r. 18), ale neuvádzajú podrobnosti. Uvádzajú, že ani sekvencia, ani poloha žiadneho nukleotidu v oblasti väzby ribozómov Cu 65 nebola zmienená (str. 3, r. 27). Pokiaľ ide o náš vynález, je takáto alterácia možná.
SK 278576 Β6
Známy stav techniky nezahrnuje: úspešnú expresiu hovädzieho alebo ľudského rastového hormónu vektorovým systémom obsahujúcim PfCn, produkciu biologicky účinných analógov bGH alebo hGH, kompozície obsahujúce takéto analógy alebo ich použitie, indukčné metódy na dosiahnutie produkcie polypeptidov v množstve väčšom ako 20 % celkovej produkcie proteínu hostiteľom.
Jediná známa práca týkajúca sa produkcie analógov bGH hostiteľmi transformovanými vektormi metódou genetického inžinierstva, sa zaoberá použitím promótora Trp na produkciu analógu bGH, ktorý má na N-konci fenylalanínovej formy prírodného bGH aminokyselinu Met (Seeburg, P. H. a d., DNA (1983) 2, 37).
Jediná známa práca, týkajúca sa produkcie analógov hGH hostiteľmi transformovanými vektormi metódou genetického inžinierstva sa zaoberá použitím promótorov Lac a Trp na produkciu analógu hGH, ktorý má na N-konci prírodného hDH aminokyselinu Met (Goedell, D. V. a d., Náture (1979) 281, 544).
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je zlepšený expresný vektor, ktorý po zavedení do bunky vhodného bakteriálneho hostiteľa, predovšetkým Escherichia coli, obsahujúceho termolabilný represor CI, umožňuje, aby hostiteľská bunka po zvýšení teploty na teplotu deštrukcie represora, t. j. 42 °C, uskutočnila expresiu požadovaného génu vloženého do vektora a produkciu polypeptidu, kódovaného génom, obsahujúci, dvojvláknovú molekulu DNA, ktorá v smere 5 '-> 3' obsahuje:
promótor a operátor PLOL z bakteriofágu lambda, miesto využitia N naviazanie antiterminátorového N proteínu, produkovaného hostiteľskou bunkou, sekvenciu DNA, obsahujúcu miesto väzby ribozómov, ktoré umožňuje mRNA požadovaného génu, aby sa naviazala na ribozómy hostiteľskej bunky, kde miesto väzby ribozómu je:
(i) mutačné ribozómové väzbové miesto Cn z bakteriofágu lambda so sekvenciou
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA alebo (ii) syntetický oligonukleotid so sekvenciou
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA alebo (iii) z prevažujúceho hlavného proteínového génu bakteriofágu lambda a má sekvenciu
ITTTTTTACGGGATrTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC, iniciačný kodón a oblasť reštrikčných enzýmov na vloženie požadovaného génu do vektora vo fáze s iniciačným kodónom ATG a ďalej zahrnuje sekvenciu DNA, obsahujúcu pôvod replikácie z hostiteľskej bunke a sekvenciu DNA, obsahujúcu gén, spojený so selektačným alebo identifikovateľným fenotypickým znakom, ktorý je, manifestovaný, ak je vektor prítomný v hostiteľskej bunke. Výhodnými vektormi sú pMGlOO a pND5.
Gény, t. j. cDNA, ktoré kódujú požadované polypeptidy, ako sú rastové hormóny, napríklad hovädzí, prasačí, kurací alebo ľudský rastový hormón, superoxid-dismutáza, apoproteín E, vírusový proteín 1 vírusu slintačky a krívačky, proteín A. z S. aureus, interleukín II, enzým alebo jeho analógy, môžu byť vložené do oblasti reštrikčných enzýmov vektora, kde sa vytvoria plazmidy. Plazmidy potom môžu byť zavedené do vhodných hostiteľov, kde môžu byť exprimované gény a produkované polypeptidy. Výhodné plazmidy pre gGH ja pRec 2/3 a pROll, pre hGH to j c pTV 18(1) a pTV 104(2). Výhodnými hostiteľmi sú Escherichia coli A1637, A1645, A2606 a A1563, v súčasnosti sa dáva prednosť A1637.
Získaný systém hostiteľ-vektor môže byť použitý na produkciu polypeptidov. Hostiteľské bunky, obsahujúce plazmidy sa pestujú pri vhodných podmienkach umožňujúcich produkciu polypeptidu a vzniknutý polypeptid sa izoluje. V súčasnosti sa považuje za výhodné kultivovať bunky 10 až 30, predovšetkým 15 minút pri asi 42 °, a potom asi 37 až 39 °C tak dlhý čas, aby celkový čas kultivácie bol asi 60 až 90 minút. Výhodné je kultivovať asi 75 minút pri 38 až 39 °C. Za výhodné rastové médium sa v súčasnosti považuje hydrolyzát lektalbumínu s prídavkom glukózy alebo infúzie mozgovej drene.
Pri použití systémov hostiteľ-vektor boli pripravené analógy bGH a hGH. Tieto analógy môžu byť upravené do veterinárnych, resp. farmaceutických kompozícií. Príslušné analógy môžu byť použité priamo alebo v uvedených kompozíciách na stimuláciu produkcie mlieka alebo mäsa hovädzieho dobytka alebo na liečenie nedostatku ľudského rastového hormónu.
Na bližšiu ilustráciu vynálezu slúžia pripojené výkresy, ktorých význam je takýto:
Obr. 1. Konštrukcia expresného vektora pMGlOO. Tento plazmid sa buduje zavedením fragmentu DNA z fágu lambda, nachádzajúceho sa medzi reštrikčnými miestami HaelII (poloha 38150) a Sau3a (poloha 38362), do DNA plazmidu pKC30, kde bolo štiepenie pomocou Hpal a BamHl. Fragment HaeIII-Sau3a nesie nutR, tRb cy’ a miesto väzby ribozómov proteínu Cn (Cn-RBS). Subklonovaním DNA, obsahujúcej CU-RBS, do pHC30 sa vytvorí pMGlOO obsahujúci jediné reštrikčné miesto BamHl priamo za iniciačným kodónom ATG Cn-RBS a jedno reštrikčné miesto Ndel v triplete ATG (spodné zavedenie). Čísla v zátvorkách označujú polohu reštrikčných miest v DNA fágu lambda.
Obr. 2. Konštrukcia plazmidu pRec 2/3. Plazmid D4, obsahujúci cDNA a bGH, sa digeruje Haell. Získaný fragment s 1 600 pármi báza (1 600 bp) sa čistí a podrobí sa digrécii počas 5 minút pri 37 °C s 5 jednotkami SI exonukleázy. Ligáciou sa pripojí syntetický linker EcoRl so sekvenciou
GGAATTCC CCTTAAGG
Produkt sa štiepi pomocou EcoRl a zavedie sa do pBR322, ktorý bol štiepený pomocou EcoRl. Izoluje sa kloň pALRl, ktorý štiepením pomocou EcoRl uvoľní fragment 1 200 bp so sekvenciou
AATTCCCA.... GGGT....
na 5' konci. Vznik tejto sekvencie potvrdzuje, že pALRl obsahuje reštrikčné miesto EcoRl, ktoré nesie kodón TTC na zvyšok č. 1 (fenylalanín) autentického bGH. pALRl sa podrobí čiastočnému štiepeniu pomocou Pstl. K výluhu sa pripojí ligáciou HindlII a štiepi sa pomocou EcoRl a HindlII. Fragment obsahujúci cDNA z bGH sa izoluje a subklonuje do pBR322 medzi reštrikčnými miestami EcoRl a HindlII za vzniku pAL500. Subklonovaný fragment bGH cDNA sa potom pomocou EcoRl a HindlII vyreže z pAL500, „naplní“ fragmentom DNA
SK 278576 Β6 polymerázy „Klenow“ a zavedie do expresného vektora pMGlOO (obr. 1), otvoreného v mieste BamHl a takisto rovnako „naplneného“. Získaný vektor pREC 2/2 vyjadruje modifikovaný bGH, ktorý je na aminokonci pozmenený takto:
MetAspGlnPhe'Pro2......bGH
Plazmid pRCE 2/2 sa digeruje Pstl a izoluje sa fragment obsahujúci na 5’ konci génu bGH promótor PL (označuje sa ako fragment A). Tento fragment sa ligáciou pripojí k fragmentu Pstl z pAL500 (označovanému ako fragment B). Takto získaný vektor pRec 2/3 vyjadruje modifikovaný bGH, ktorý je na aminokonci pozmenený takto: MetAspGlnPhe'Pro2......bGH
Obr. 3. Konštrukcia expresných vektorov pND5, pND55 a pROll. Plazmid pOG7 (Oppenheim, A., Gottesman, S. a Gottesman, M., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327) sa štiepi pomocou Ndel. Konce veľkého fragmentu, nesúce promótor PLnutL, tR a Cn-RBS, sa spoja za vzniku expresného vektora pND5. DNA tohto vektora sa otvorí pomocou Ndel. Zavedením tohto fragmentu z pRec 2/3 (obr. 2), ktorý obsahuje bGH cDNA, vznikne plazmid pROll, ktorý sa zdá byť lepší expresor modifikovaného bGH, opisovaného na obr. 2, ako pRec 2/3. Zavedením syntetických linkerov so sekvenciou
TATGAGCTCA ACTCGAGTAT do pOG7, štiepeného Ndel, vznikne expresný vektor pND55, ktorý obsahuje jediné reštrikčné miesto Sací pred ATG. Ak sa štiepi pND55 pomocou Sací a podrobí pôsobeniu fragmentu „Klenow“ DNA polymerázy, vznikne iniciačný kodón ATG, ktorý nasleduje po promótore PL a Cn-RBS. Tento vektor je vhodný na vyjadrenie rôznych eukaryotických génov bez iniciačného kodónu ATG.
Obr. 4. Konštrukcia pTV 18(1) a pTV 104(2). Plazmid pVTHGH sa pripraví klonovaním cDNA obsahujúcej kód hGH do pBR 322 v mieste HindlII štandardným spôsobom (Meth. Enzymol. (1979) 68, 75). Vzniknutý plazmid sa digeruje HindlII. Získaný fragment s 800 pármi báz sa čistí a ďalej digeruje FnuDII a „naplní“ fragmentom „Klenow“ DNA polymerázy. Toto spracovanie odstraňuje kodóny pre prvých 16 aminokyselín hGH. Získaný fragment DNA sa spojí so syntetickým linkerom, ktorý obsahuje kodóny na sekvenciu hGH od Met14 a regeneruje reštrikčné miesto Ndel pred kodónom ATG pre Met14. Po spracovaní Ndel sa táto semisyntetická DNA zavedie do vektora pND5, otvoreného pomocou Ndel. Získaný plazmid pTV 18(1) vyjadruje hGH pod kontrolou promótora PL. Je to analóg hGH, ktorému chýba prvých 13 zvyškov aminokyselín a majúci na N-konci Met14.
Plazmid pTV 18(1) sa čiastočne digeruje Ndel a spojí sa syntetickým linkerom, ktorý obsahuje kodóny na aminokyseliny hGH č. 1 až 13:
TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT
Tento linker je takisto komplementárny na miesto Ndel v pTV 18(1) a umiesťuje kompletný gén hGH do fázy s iniciačným kodónom ATG expresného vektora pND5 (obr. 3). Získaný plazmid pTV 104(2) tak vyjadruje natívny hGH s metioninom, navyše na N-konci.
Obr. 5 zobrazuje vektor pAL Trp 46, ktorý obsahuje promótor Trp a prvých 7 aminokyselín génu Trp E transkripčne prevedených od génu beta-galaktozidázy.
Obr. 6, 7 a 8 ukazujú rad expresných vektorov (Tac) obsahujúcich časť promótora Trp a operátora Lac, nasle40 dovanú reštrikčnými miestami na zavedenie požadovaného génu expresiu bGH pod kontrolou promótora Tac.
Obr. 9 a 10 ukazujú expresné vektory obsahujúce bGH cDNA pod kontrolou histidinového promótora.
Obr. 11 ukazuje zavedenie génu bGH do expresného vektora pod kontrolou promótora Lac.
Obr. 12 predstavuje expresiu génu bGH pod kontrolou promótora Omp F.
Obr. 13. Konštrukcia Met4-bGH-analógu pAL401 a expresných vektorov pND6 a pNDll s pozmenenými reštrikčnými miestami. pAL401, ktorý vyjadruje modifikovanú formu bGH, v ktorej chýbajú na aminokonci bGH prvé tri aminokyseliny (Met4 bGH), sa konštruuje trojitou ligáciou:
a) fragment DNA bGH s 623 pármi báz s PvuII a HindlII vyrezaným z pAL500
b) linkera, vzniknutého syntézou dvoch vláken DNA, ktoré sa po vyčistení ustália vo forme CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCT
GCGACACGAGGCCCAGTCGTGGACGTGGTCGACG „naplneného“ fragmentom „Klenow“ DNA polymerázy, a potom štiepeného Ndel a PvuII za vzniku fragmentu s 58 pármi báz, ktorý sa izoluje a čistí
c) pNDll, ktorý sa pripraví takto: Expresný vektor pOG7 sa alteruje elimináciou HindlII a jedného z miest Ndel (vzdialeného od iniciačného kodónu ATG) za vzniku pND6. Potom sa linkery HindlII zavedú do miesta SA11 za vzniku pNDl 1.
Obr. 14. Konštrukcia autentického bGH, modifikovaného na aminokonci metioninom a rôznych analógov bGH.
a) Plazmid pAL401 sa podrobí pôsobeniu Ndel. V mieste Ndel sa ligáciou pripojí syntetický DNA linker, obsahujúci iniciačný signál ATG a kód na prvé tri aminokyseliny na aminokonci natívneho bGH. Získaný vektor pAL601 vedie k expresii natívneho bGH obsahujúceho na aminokonci navyše metionín.
b) Postupom podľa a), ale modifikáciou štruktúry oligodeoxyribonukleotidového linkera, sa konštruuje skupina vektorov kódujúcich rad modifikovaných hovädzích rastových hormónov. Modifikované rastové hormóny začínajú na N-konci metioninom, v polohách 1 a 2 majú ktorékoľvek z dvadsiatich v prírode sa vyskytujúcich aminokyselín a v polohe 3 ktorúkoľvek z dvadsiatich prírodných aminokyselín okrem Glu, Gin, Lys, Met alebo Trp. Od polohy 4 do karboxylového konca je sekvencia identická s natívnym bGH.
Obr. 15. Tibiálny test. Obrázok ukazuje porovnanie vplyvu analógu bGH pRec 2/3 a autentického bGH na rast kostnej doštičky hypofýzektomizovaných potkanov.
Vektor podľa vynálezu umožňuje dosiahnutie vyšších hodnôt expresie génov a polypeptidov. Ide o dvojvláknovú molekulu DNA. Pri zavedení do bunky vhodného bakteriálneho hostiteľa, s obsahom termolabilného represora CI, a zvýšení teploty hostiteľa na teplotu deštrukcie, umožňuje vektor v hostiteľskej bunke uskutočniť expresiu požadovaného génu vneseného do vektora a produkciu polypeptidu kódovaného génom.
Vektor obsahuje v smere 5'->3’:
sekvenciu DNA obsahujúcu promótor a operátor PLOL z bakteriofágu lambda, miesto využitia N na zaviazanie antiterminátorového N proteínu, produkovaného hostiteľskou bunkou, sekvenciu DNA s obsahom miesta väzby ribozómov, ktoré umožňuje mRNA požadovaného génu, aby sa naviazala na ribozómy hostiteľskej bunky, iniciačný kodón ATG alebo sekvenciu DNA, ktorá sa zavedením požadovaného génu do vektora mení na iniciačný kodón ATG a miesto reštrikčných enzýmov na nastavenie požadovaného génu do vektora vo fáze s iniciačným kodónom ATG.
Vektor ďalej obsahuje sekvenciu DNA, ktorá obsahuje pôvodné replikácie z bakteriálneho plazmidu, schopného autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke a sekvenciu DNA, ktorá obsahuje gén spojený so selektabilnou alebo identifikovateľnou fenotypickou črtou, s tým že dochádza k manifestácii, ak je vektor prítomný v hostiteľskej bunke.
Hostiteľom, používaným na vektor podľa vynálezu, je Escherichia coli. V súčasnosti sa dáva prednosť kmeňom A1637, A1645, A2602 a A1563. Najvýhodnejší je v súčasnosti A1637. Bol získaný z C6000 zavedením transpozónu obsahujúceho rezistentný gén tetracyklínu v oblasti galaktozového operónu a systém lambda na lambda expresiu, ktorý je blízky galaktozovému operónu. Bol uložený v Američan Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA, kde sú uložené mnohé plazmidy. Všetky podobné zbierky sú vybudované v súlade s Budapeštianskou dohodou o medzinárodnom uznávaní ukladania mikroorganizmov.
Kmeň A1645 bol získaný z A163 7 selekciou na Gel+ (schopnosť fermentovať galaktózu) a stratu tetracyklínovej rezistencie. Obsahuje ďalej expresný systém lambda, ale časť transpozónu bola selekciou odstránená. Jeho fenotyp je C600 rm+ gal+ thr' leu' lac Z (lambda c 1857 delta Hl delta BAM N+).
Kmene A2602 a A1563 sú odvodené od SA500. Ich fenotypy sú SA500 his* ilu* gal+ delta 8 (lambda C1857 delta Hl delta BAM N+) a SA500 his' ílu’ gal+ delta 8 lac ZxA21 (lambda C1859 int2 xisl nutL3 delta Hl).
Vektor má výhodne formu kovalentne uzatvorenej dvoj vláknovej molekuly. Nie je však nevyhnutné, aby bol vektor kovalentne uzatvorený.
Vektor dosahuje zvýšené hodnoty expresie po tom, ako je hostiteľská bunka zahriata na teplotu, pri ktorej sa CI represor deštruuje. Na tento cieľ je účinná teplota nad asi 42 °C a keďže je žiaduce zabrániť zbytočnému tepelnému poškodeniu hostiteľských buniek v najširšom možnom rozmere, je obvykle žiaduce, aby teplota nikdy neprekročila 42 °C o viac ako niekoľko stupňov.
Jedným z dôležitých komponentov vektora je miesto väzby ribozómov (RBS). Vhodné sú oblasti Cu z bakteriofágu lambda so sekvenciou
TAAGGAAATACTTACAT ATTCCTTTATGAATGTA syntetický oligonukleotid so sekvenciou
TAAGGAAGRACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA a gén prevládajúceho proteínu bakteriofágu lambda so sekvenciou
TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC.
Ďalším komponentom vektora je miesto reštrikčných enzýmov na vnesenie požadovaného génu do vektora vo fáze s iniciačným kodónom ATG. Je možné používať rôzne takéto miesta. V súčasnosti sa dáva prednosť miestam BamHl, Sací aNdcl.
Vektor takisto obsahuje pôvod replikácie z bakteriálneho plazmidu, schopného autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke. Pôvody replikácie môžu byť získané z rôznych zdrojov. V súčasnosti sú ako zdroje preferované pBR322 alebo pRl.
Sekvencia DNA, ktorá obsahuje gén spojený so selekčnou alebo identifikovateľnou fenotypickou črtou s tým, že dochádza k manifestácii, ak je vektor prítomný v hostiteľskej bunke, je takisto komponentom vektora. Medzi vhodné gény patria gény spojene s teplotnou citlivosťou alebo rezistenciou proti liečivám, napríklad rezistenciu proti ampicilínu, chlóramfenikolu alebo tetracyklínu.
Podobne ako vektory, opísané predtým vo vedeckej literatúre, môžu byť vektory podľa vynálezu použité na dosiahnutie zvýšenej expresie veľkého množstva génov, kódujúcich požadované polypeptidické produkty. Medzi vhodné gény patria tie, ktoré kódujú rastové hormóny, napríklad hovädzí, prasačí, kurací alebo ľudský hormón, superoxid-dismutázu, apoproteín E. Vírusový proteín 1 vírusu slintačky a krívačky, proteín A z S. aureus, interleukín III, enzýmy alebo analógy uvedených látok. Analógom sa rozumie polypeptid s rovnakou aktivitou ako prírodné sa vyskytujúci polypeptid, ale s jednou alebo viacerými odlišnými aminokyselinami na N-konci polypeptidu.
Vektor môže byť vytvorený pomocou spôsobov, ktoré sú odborníkom v oblasti, ktorej sa vynález týka, známe. Takéto postupy sú podrobnejšie opísané v rôznych tu uvedených publikáciách, ktoré dopĺňajú opis známeho stavu techniky.
Jeden z vektorov, preferovaných v súčasnej dobe, je pMGlOO, ktorého reštrikčná mapa je znázornená na obr.
1. V tomto vektore bola na reštrikčné miesto BamHl zavedená cDNA, kódujúca hovädzí rastový hormón. Výsledný plazmid sa označuje pRec 2/3 bGH. Jeho reštrikčná mapa je zobrazená na obr. 2. Plazmid pRec 2/3 bGH bol zavedený do kmeňa A163 7 Escherichia coli bežnou transformačnou metódou. Získaný systém hostiteľ-vektor bol uložený v zbierke pod číslom ATCC 39385.
Druhý vektor, preferovaný v súčasnosti, je pND5, ktorého reštrikčná mapa je znázornená na obr. 3. Do jeho reštrikčného miesta Ndel bola zavedená cDNA hovädzieho rastového hormónu. Výsledný plazmid sa označuje pROl 1, bol transformáciou zavedený do kmeňa A1637 Escherichia coli. Získaný systém hostiteľ-vektor bol uložený pod číslom ATCC 39390.
Vektor pND5 bol takisto použitý na klonovanie ľudského hormónu. Zavedením hGH cDNA do reštrikčných miest Ndel bol vytvorený plazmid označený pTV 18(1) a plazmid označený pTV 104(2). pTV 18(1) je znázornený na obr. 4. Bol zavedený transformáciou do kmeňa A1637 Escherichia coli. Získaný systém hostiteľ-vektor bol uložený pod číslom ATCC 39386. pTV 104(2) je znázornený na obr. 4. Bol takisto zavedený do kmeňa A1637 Escherichia coli. Získaný systém hostiteľ-vektor bol uložený pod číslom ATCC 39384.
Rovnakým spôsobom je možné pripraviť iné plazmidy zavedením génu kódujúceho požadovaný polypeptid do enzýmového reštrikčného miesta vektora podľa vynálezu.
Uvedené konkrétne systémy hostiteľ-vektor obsahujú kmeň Escherichia coli č. A1637. Ako bolo uvedené, boli použité aj iné kmene zahrnujúce A1645, Λ2606 a A1563. Tieto systémy hostiteľ-vektor je možné použiť na výrobu polypeptidov, ako je hovädzí a ľudský rastový hormón. S týmto cieľom sa systém hostiteľ-vektor pestuje za vhodných podmienok, umožňujúcich produkciu polypeptidu, ktorý sa potom získava.
I I I
SK 278576 Β6
Vhodné podmienky zahrnujú kultiváciu systému hostiteľ-vektor, príslušný čas pri asi 42 °C, a potom ďalšiu kultiváciu pri asi 37 až 39 “C opäť určitý čas, pričom sa kultivácia uskutočňuje vo vhodnom médiu.
Začiatočný čas kultivácie je asi 10 až 30 min pri 42 °C, a potom sa kultivuje pri 37 až 39 °C tak dlhý čas, aby celkový čas kultivácie bol asi 60 až 90 min. Výhodne sa kultivuje asi 15 min pri 42 °C, a potom si 75 min pri 38 až 39 °C. Medzi vhodné média patrí hydrolyzát laktalbumínu s prídavkom glukózy a vývar z mozgu a srdca. S cieľom stabilného uchovania vektora v hostiteľovi je rozhodujúce, aby bol hostiteľ udržiavaný pod selektívnym tlakom, napríklad prídavkom antibiotika.
Pomocou opísanej metódy bolo pripravené množstvo analógov bGH a hGH, ktoré majú alebo môžu mať aktivitu hormónov, vyskytujúcich sa v prírode.
Analógy bGH majú aktivitu prírodného bGH a identickú sekvenciu aminokyselín okrem obmien na N-konci až do 5. aminokyseliny. Ako príklady je možné uviesť:
1. aminokyselina metionín pridaná na N-koniec fenylalanínovej formy bGH
2. aminokyselina metionín pridaná na N-koniec alanínovej formy bGH
3. sekvencia aminokyselín Met-Asp-Gln pridaná na N-koniec fenylalanínovej formy bGH
4. sekvencia aminokyselín Ala-Gly pridaná na N-koniec alanínovej formy bGH
5. sekvencia aminokyselín Met-Gly pridaná na N-koniec alanínovej formy bGH
6. sekvencia aminokyselín Met-Asp-Pro-Met-Gly pridaná na N-koniec alanínovej formy bGH
7. sekvencia aminokyselín Met-Asp-Pro pridaná na N-koniec fenylalanínovej formy bGH
8. sekvencia aminokyselín Met-Thr-Arg pridaná na N-koniec fenylalanínovej formy bGH
9. aminokyseliny až po metionín (4. poloha) odstránené z N-konca fenylalanínovej formy bGH
Analóg bGH so sekvenciou aminokyselín
Met- (X)„ -Y-Met..., kde Met je N-koniec, X je ktorákoľvek z dvadsiatich prírodných aminokyselín, Y je ktorákoľvek z dvadsiatich prírodných aminokyselín okre Glu, Gin, Lys, Met alebo Trp, n je celé číslo od 0 do 6 a Met...je sekvencia prírodného bGH od polohy 4 do COOH-konca (poloha 191).
Analógy hGH majú aktivitu prírodného hGH a identickú sekvenciu aminokyselín, okrem obmien na N-konci. Ako príklady je možné uviesť:
1. aminokyselina metionín pridaná na N-koniec prírodného hGH
2. aminokyseliny až po metionín (poloha 14) odstránené z N-konca hGH
Analóg hGH so sekvenciou aminokyselín
Met-(X)„-Y-Met..„ kde Met je N-koniec, X je ktorákoľvek z dvadsiatich prírodných aminokyselín, Y je ktorákoľvek z dvadsiatich prírodných aminokyselín okrem Glu, Gin, Lys, Met alebo Trp, n je celé číslo od 0 do 13 a Met... je sekvencia prírodného hGH od polohy 14 do COOH-konca (poloha 191).
Je možné pripravovať veterinárne kompozície, ktoré obsahujú účinné množstvo jedného alebo viacerých analógov bGH a vhodný nosič. Tieto nosiče sú odborníkom známe. Analógy je možné podávať hovädziemu dobytku priamo alebo vo forme kompozície s cieľom zvýšenia produkcie mlieka alebo mäsa.
Je možné pripravovať farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú účinné množstvo jedného alebo viacerých analógov hGH a vhodný nosič. Tieto nosiče sú odborníkom známe. Analógy je možné podávať ľudskému 5 subjektu priamo alebo vo forme kompozície, napríklad pokiaľ ide o jedincov postihnutých trpaslíctvom, na liečenie nedostatkov produkcie hGH subjektom.
Nasledujúce príklady realizácie, ktoré majú pomôcť pochopiť vynález, nemajú v žiadnom prípade obmedzo10 vať jeho rozsah. Príklady neobsahujú podrobný opis bežných metód používaných pri konštrukcii vektorov, včleňovaní génov, kódujúcich požadované polypeptidy, do týchto vektorov alebo zavádzaní získaných plazmidov do bakteriálnych hostiteľov. Tieto metódy sú od15 bomíkom známe a sú opísané v mnohých publikáciách, napríklad
Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2. vydanie, vyd. R. W. Old a S. B. Primrose, Univ. of Calif. Press (1981),
Met. Enzymol., diel 68, Recombinant DNA, vyd.
Ray WU,
Met. Enzymol., diel 65, Nucleic Acids (časť 1), vyd. Lowrrence Grossman a Kivie Moldave,
T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook, Molecular 25 Cloning, A Laboratory Manula, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982),
H. V. Bernard a ď., Gene (1979) 5, 59,
A. B. Oppenheim a ď., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327,
E. Remautaď., Gene(1981) 15, 81.
Príklad 1
Expresné vektory
Termín expresný vektor sa tu vzťahuje na skupinu 35 plazmidov používaných na expresiu požadovaných génov v baktériách, predovšetkým v Escherichia coli. Požadovaný gén môže byť vložený do expresného vektora alebo môžu byť vyrezané promótory na expresnom vektore a umiestené pred požadovaný gén.
1. Expresné vektory PL
A. pMGlOO pMG 100, ako je znázornené na obr. 1, je zložený z lambda DNA, vloženej do násobne kopírovacieho plazmidu pBR322. Význačnou črtou DNA je, že obsahuje 45 promótor lambda PL, utilizačné miesta L a R pre N (nutL a nutR), terminačné miesto R1 (tR1), miesto väzby ribozómov C[t a iniciačný kodón ATG. Ostatné črty sú znázornené na obr. 1.
pMG 100 sa pripraví z pKC30. pKC30 sa pripraví 50 subklonovaním promótora lambda PL pomocou nasledujúceho spôsobu. DNA fága lambda sa digeruje s reštrikčnými endonukleázami Xhol a Smal a jednotlivý fragment, obsahujúci 6393 párov báz, sa vyčistí a potom digeruje s reštrikčnými endonukleázami HindlII a 55 BamHl. Získaný fragment, tvorený 2397 pármi báz a obsahujúci promótor PL sa čistí a liguje do veľkého fragmentu pBR322 DNA, izolovaného z HindlII a digerátu BamHl. Subklon bol identifikovaný kolóniovou hybridizáciou, izolovaný a plazmid DNA bol izolovaný 60 (Oppenheim, A- a ď., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327).
Tento plazmid a jeho deriváty, s obsahom eukaryotických génov, môže byť uchovávaný vo vhodných hostiteľoch Escherichia coli. Najdôležitejším znakom hostiteľa je, že poskytuje termosenzitívny represor CI857 a 65 antiterminačný N proteín (Gottesman, M. E. a ď., J.
Mol. Biol. (1978) 140, 197).
Tento vektor má proti predtým opísaným expresným vektorom mnohé výhody, medzi ktoré patrí:
1. Extrémne vysoká úroveň expresie. Tento vektor je schopný riadiť expresiu cudzích proteínov v Escherichia coli v úrovni 15 až 25 % celkového bunkového proteínu.
2. Termoindukovateľná regulácia expresie. Promótor PL je inaktívny, ak je k nemu viazaný represor CI. Represor CI857 je termosenzitívny, tzn. že sa pri 30 °C viaže na promótor, ale pri 42 °C je inaktivovaný. Zvýšením teploty fermentácie na 42 °C sú hostiteľské baktérie povzbudené na produkciu požadovaného proteínu.
Medzi výhody tohto systému patrí:
a) ak to je žiaduce, je možné produkovať cudzí proteín, ktorý je toxický voči Escherichia col, a tak zabrániť odumretiu buniek v začiatku fermentačného procesu,
b) nadprodukciou proteínu je ho možné stabilizovať a zabrániť proteolytickej degradácii (Chang, Y. E. a d’., Gene (1981) 14, 121). „Okamžitá“ nadprodukcia pri použití pevne regulovateľného promótora, napríklad PL, môže teda byť výhodná na kontinuálnu produkciu s nízkou úrovňou.
3. Vysoký počet kópií. Promótor PL v pMG 100 sa nachádza na plazmide s vysokým počtom kópií proti samému lambda, ktorý je prítomný v Escherichia coli v nízkom počte kópií. To zvyšuje úroveň expresie.
4. Miesto väzby ribozómov a iniciačný kodón. Tento expresný vektor obsahuje silné prokaryotícké miesto väzby ribozómov (RBS), rovnako ako translačný kodón (ATG). Je teda možné klonovať akýkoľvek eukaryotický gén bez nutnosti pridávania iniciačného kodónu. Účinné RBS ďalej zvyšuje úroveň expresie.
5. Vhodné reštrikčné miesto. Expresný vektor má miesto BamHl, umiestené priamo za iniciačným kodónom ATG, ktoré umožňuje vhodné polohovanie požadovaného génu s cieľom dosiahnutia optimálnej expresie.
6. Miesto Nut. N protein, ktorý je poskytovaný hostiteľom, sa viaže na miesto Nut na expresnom vektore, a tak zabraňuje ukončeniu transkripcie na mieste tR1.
B. pND5
Ako je znázornené na obr. 3, pND5 obsahuje promótor PL a ostatné dôležité komponenty expresných vektorov podľa vynálezu. Zahrnuje jednotlivé miesto Ndel bezprostredne za miestom väzby ribozómov. Miesto väzby ribozómov sa líši od normálneho miesta Cn. Má sekvenciu
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA
Môže byť odvodené od niektorej mutanty alebo môže byť syntetizované chemicky. Ako je podrobne opísané v objasnení významu obrázkov, bol pND5 odvodený od pOG7 (Oppenheim, A. a ď., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327). Tento vektor neobsahuje translačný iniciačný kodón. Vyskytuje sa, aby poskytoval vyššiu expresiu modifikovaného bGH a hGH, predovšetkým zvýšený výťažok, vztiahnuté na pMG 100 s obsahom analógu bGH.
C. pND55 pND55 je derivát pND5, ktoiý obsahuje vhodné reštrikčné miesto Sací pred Cn-RBS a iniciačným kodónom ATG. Rozštiepenie plazmidu v tomto mieste s nasledujúcim pôsobením fragmentu Klenow DNA polymerázy umožňuje získať iniciačný kodón ATG, ku ktorému môže byť ligovaný ktorýkoľvek požadovaný gén (obr. 3).
II. Expresné vektory Trp
A. pAL Trp 46 pAL Trp 46 obsahuje promótor Trp a prvých sedem aminokyselín génu Trp E v členených do beta-galaktozi dazového génu (obr. 5). Požadovaný gén môže byť zavedený do miesta BamHl, ktoré nasleduje za siedmimi aminokyselinami trp E.
B. pAL Trp 47, Trp 46 zbavený atenuátora
Ide o x konštrukciu založenú na Trp 46, v ktorom bola vypustená zoslabovacia oblasť promótora Trp.
C. Spájanie Trp-Lac
Konštrukcia tohto promótora, nachádzajúceho sa na plazmide p3754, je ilustrovaná na obr. 6 a 7. Na obr. 8 je znázornená jej obmena.
III. Expresné vektory s histidínovým promótorom
Konštrukcia tohto expresného vektora je ilustrovaná na obr. 9 a 10.
IV. Iné používané promótory
A. Lac
Tento promótor bol použitý pri konštrukcii pYL 301, ako je znázornené na obr. 11.
B. Omp F
Ide o promótorový systém, ktorý vyjadruje protein pripojený k signálnej sekvencii. Signálna sekvencia sa odstráni pri premiesteni proteínu cez membránu (obr. 12).
Príklad 2 Hovädzí rastový hormón
Východiskovým bodom pre cDNA modifikácie bGH je plazmid D4, ktorý už bol opísaný (Keshet E. a ď., Nucleic Acids Research (1981) 9, 19). Plazmid D4 je takisto opísaný v súvisiacej patentovej prihláške USA č. 245 943, podanej 20.03.1981 s požadovanou prioritou z izraelskej patentovej prihlášky č. 56 690, podanej 24.03.1980. Bol dopredu uložený v americkej zbierke typových kultúr v hostiteľovi Escherichia coli pod č. ATCC31826.
I. pRec 2/3 bGH
Konštrukcia pRec 2/3 je znázornená na obr. 2. bGH cDNA t D4 bola pred včlenením do PMG100 podrobená manipulácii s cieľom získania správneho čítacieho rámca.
pRec 2/3 bol zavedený do rôznych kmeňov Escherichia coli vrátane A1637 transformáciou pomocou známych metód. Kmeň A1637, obsahujúci pRec 2/3, bol uložený pod č. ATCC 39385. Tento kmeň produkuje počas rastu a indukcie analóg bGH so sekvenciou aminokyselín Met-Asp-Gln, pridanou na N-koniec fenylalanínovej formy prírodného bGH. Množstvo analógu bGH, produkované pRec 2/3, je asi 23 % celkového proteínu produkovaného baktériami, vypočítané z merania na farbenom polyakrylamidovom géle SDS Coomasie.
II. pROll
Konštrukcia pROll je znázornená na obr. 3. DNA vektora pND5 sa podrobí reštrikcii Ndel. Zavedením fragmentu Ndel z pRec 2/3 (obr. 2), ktorý obsahuje bGH cDNA, sa získa plazmid pROl 1.
pROl 1 bol zavedený do kmeňa Escherichia coli A1637 transformáciou. Získaný systém hostiteľ-vektor bol uložený pod č. ATCC 39390. Tento kmeň počas rastu a indukcie produkuje rovnaký analóg ako pRec 2/3. Predbežné výsledky ukazujú, že pROll produkuje až o 20 % viac analógu bGH ako pRec 2/3. Na pestovanie kmeňa, izoláciu získaného analógu bGH a jeho čistenie sa používajú rovnaké metódy ako v príklade 4 pre pRec 2/3.
III. pAL401
Konštrukcia pAL401 je znázornená na obr. 13. bGH
SK 278576 Β6 cDNA z D4 pAL-500 (obr. 2) bola vložená do pNDl 1, ako je znázornené na obr. 13.
pAL401 môže byť transformáciou zavedený do kmeňa Escherichia coli A1637. Získaný kmeň produkuje analóg bGH, v ktorom je na N-konci Met4 prírodného bGH a aminokyseliny pred Met4 sú vynechané.
IV.pAL601
Konštrukcia pAL601 je znázornená na obr. 14. Ide o derivát pAL401 (obr. 13).
pAL601 je možné transformáciou zaviesť do Escherichia coli A1637. Získaný kmeň produkuje analóg bGH, v ktorom je na N-koniec fenylalanínovej formy bGH pridaný Met.
Príklad 3
Ľudský rastový hormón
Východiskovým bodom pre hGH cDNA je klonovania cDNA z mRNA čistenej z hypofyzámeho tumoru akromegalických pacientov do miesta Hindlll v pBR322.
I. pTV 18(1)
Konštrukcia pTV 18(1) je znázornená na obr. 4. Pred vložením do pND5 bola hGH cDNA podrobená manipulácii s cieľom získania správneho čítacieho rámca.
pTV 18(1) bol transformáciou zavedený do Escherichia coli A1637. Získané baktérie boli uložené pod číslom ATCC 39386. Tento kmeň produkuje pestovaním a indukciou analóg hGH so sekvenciou prírodného hGH začínajúc Met14 a bez aminokyselín 1 až 13. Množstvo analógu hGH, produkovaného pTV 18(1), je asi 8 % celkového proteínu produkovaného baktériami.
II. pTV 104(2)
Konštrukcia pTV 104(2) je znázornená na obr. 4. Pred vložením do pND5 bola hGH cDNA podrobená manipulácii s cieľom správneho čítacieho rámca.
pTV 104(2) bol transformáciou zavedený od Escherichia coli A 1637. Získané baktérie boli uložené pod č. ATCC 39384. Tento kmeň produkuje rastom a indukciou analóg hGH so sekvenciou prírodného hGH, pred ktorou je na N-konci Met. Množstvo analógu hGH, produkovaného pTV 104(2), je cez 25% celkového proteínu produkovaného baktériami.
Príklad 4
Pestovanie pRec 2/3
Zásobné kultúry: Zásobné kultúry pRec 2/3 v A1637 sa pestujú na médiu BHI (pozri inokulá), potom sa dvojnásobne zriedi 87 % glycerolom obsahujúcim fosfátocitrátový pufer a skladujú sa pri -70 °C.
Inokulum: Inokulum sa propaguje v médiu BGH (infúzia mozgovej drene 37 g/1, DIFCO). Sterilné médium v trepacej banke sa inokuluje zo zásobnej kultúry a inkubuje sa 15 h pri 30 °C na trepačke s rýchlosťou 200 min’1. Ďalšie štádia propagácie inokula sa uskutočňujú v miešaných prevzdušňovaných fermentoroch. Sterilné médium sa inokuluje vždy 0,2 ml kultúry z banky a inkubuje sa 15 h pri 30 °C a pH 7+0,5 pri miešaní a prevzdušňovaní s cieľom udržania hladiny rozpusteného kyslíka nad 20 % nasýtenia vzduchom.
Produkcia: Produkčné médium obsahuje:
| hydrolyzát laktalbumínu (enzymatický) | 20 g/1 |
| kvasnicový extrakt | 10 g/1 |
| k2hpo+ | 2,5 g/1 |
| NaCl | 10 g/1 |
| ampicilín | 0,1 g/1 |
| biotín | 0,1 mg/1 |
| tiamín | 1 mg/1 |
| roztok stopových prvkov | 3 ml/l |
Ampicilín, biotín a tiamín v roztoku sa oddelene filtračné sterilizujú a pridávajú sa k sterilnému produkčnému médiu pred inokuláciou. Sterilný roztok glukózy sa najprv pridáva do 10 g/1 a počas indukcie a procesu expresie tak, aby sa udržoval obsah glukózy nad 10 g/1.
Roztok stopových prvkov obsahuje:
| MgSO4.7H2O | 170 | g/1 |
| FeCl, | 16 | g/1 |
| ZnCl2.4H2O | 2 | g/1 |
| CoC12.6H2O | 2 | g/1 |
| Na2MoO4.2H2O | 2 | g/1 |
| CaCl2.2H2O | 1 | g/1 |
| CuCl2 | 1 | g/1 |
| H3BO3 | 0,5 | g/1 |
| kone. HC1 | 100 | ml/l |
Médium sa inokuluje 5 až 10 % kultúrou inokula a inkubuje sa pri 30 °C. Rýchlosť miešania a prevzdušňovania sa nastavuje tak, aby hladina rozpusteného kyslíka bola na 20 % nasýtenia vzduchu. pH sa udržiava pomocou NH3 na 7+0,2. Ak sa dosiahne koncentrácia buniek asi 3 g/1 (OD660=10), začína sa indukcia.
Teplota sa zvýši na 42 °C. Tá sa udržuje 15 min, potom sa zníži na 38 °C. Po 1 až 1 1/2 trvajúcej inkubácii pri 38 °C sa kultúra ochladí, bunky sa oddelia odstredením a podrobia sa čisteniu hormónu.
Získavanie bGH kg bakteriálnych buniek sa v mixéri Warring suspenduje v 10 objemoch roztoku obsahujúceho 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA a 25 % sacharózy, pričom sa kontroluje rýchlosť mixéra s cieľom maximálneho zamedzenia penenia. Homogénna suspenzia sa nechá kontinuálne prechádzať rozrušovačom buniek Dynomill (Willy A. Bachofen, Bazilej) a homogénna suspenzia rozrušených buniek sa vyčerí najprv odstredením v odstredivke Sharpless, a potom sa kontinuálne odstreďuje rýchlosťou 20 000 min1 v odstredivke Sorval.. Precipitát z obidvoch odstrediviek sa zhromaždí, premyje 50 mM Tris-Cl (pH 7,4) a opäť suspenduje v 500 ml rovnakého pufŕa. Pridá sa lyzozým do konečnej koncentrácie 2 mg/ml a suspenzia sa inkubuje 1 h pri 37 °C. Potom sa pridá Triton X-100 do konečnej koncentrácie 1 %, suspenzia sa ochladí na 4 °C a odstreďuje 20 min rýchlosťou 20 000 min’1 v odstredivke Sorvall SS34. Precipitát sa zhromaždí, premyje dvakrát 50 mM TrisCl, opäť suspenduje v 500 ml 50 mM Tris-Cl (pH 7,4) m 5 mM MgCl2 a pridá sa deoxyribonukleáza do konečnej koncentrácie 20 mikrogramov/ml. Po inkubácii, trvajúcej 30 min pri teplote miestnosti, sa precipitát zhromaždí tak, ako je opísané, premyje dvakrát 500 ml 20 mM Tris-Cl (pH 7,4), 100 mM NaCl a 10 mM EDTA a potom dvakrát 500 ml destilovanej vody. Precipitát sa zhromaždi odstredením a môže sa skladovať pri 20 °C neobmedzený čas. V tomto štádiu je čistota bGH 80 %, súdiac podľa elektroforézy na nátriumdodecylsulfátovom géle. Výťažok je približne 15 g bGH. Čistenie bGH
100 g precipitátu sa suspenduje v 40 ml destilovanej vody a solubilizuje titráciou s 0,5 M NaOH, pH 11,8. Roztok sa potom 2 min podrobí pôsobeniu zvuku a vyčerí odstreďovaním rýchlosťou 20 000 min'1 počas minút v odstredivke Sorvall SS34. Roztok sa potom uvedie na stĺpec Sepharosy CL-6B ( 5 x 100 cm), ekvilibrovaný 6,5 mM borátového pufra, pH 11,8. Stĺpec sa vyvíja rýchlosťou 100 ml/h a zbierajú sa frakcie po 12 ml. Prvé maximum mimo stĺpca sa zlikviduje. Nasledujúce dve ma
SK 278576 Β6 ximá sa oddelia a zhromaždia. Prvý predstavuje agregovaný bGH s nízkou aktivitou; druhý bGH s vysokou aktivitou.
Stĺpec DEAE-Sephacelu (25 g/100 g ekv. ppt) sa ekvilibruje 6,5 mM borátovým pufrom, pH 9,0. Druhý pík bGH sa upraví na pH 9,0 pomocou HC1 dodávanej na stĺpec DEAE-Sephacelu rýchlosťou 250 ml/h. Stĺpec sa premyje 7,5 ml 6,5 mM borátového pufra, pH 9,0, elúuje 6,5 mM borátovým pufrom, pH 9,0, s obsahom 75 mM NaCl. Frakcie s OD280 nad 0,3 sa zhromaždia, dialyzujú proti H2O v dialýznom Millipore Pellicon a potom lyofllizujú.
Príklad 5
Aktivita analógu bGH, produkovaného pRec 2/3
1. Rádioimunotestové (RIA) porovnanie analógu bGH s prírodným bGH
Roztok obsahujúci 100 ng/ml analógu bGH sa pripraví vo fyziologickom roztoku tlmenom fosfátovým pufrom (1 % BSA). Tento roztok sa postupne riedi na koncentráciu 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 a 0,78 ng/1. Zdvojené 0,1 ml alikvótne podiely týchto roztokov sa podrobia RIA postupom dvojitej protilátky. Zrieďovacia krivka je porovnateľná s prírodným bGH.
2. Test väzby rádioreceptorov
Test väzby rádioreceptorov sa uskutočňuje s membránami z králičej pečene, ako je opísané v T. Tushima a H. G. Freisen (Y. Chin., Endocr. Metab. (1973) 37, 334), pri použití l25I-hGH ako značnej látky a autentických roztokov bGH po konštrukcii kalibračných kriviek. Vzorky sa inkubujú strojene počas 2 hodín pri teplote miestnosti v 0,3 ml skúšobného pufra (50 mM Tris, 15 mM CaCl2 a 5 mg/ml hovädzieho sérového albumínu, pH 7,6).
Skúmavky obsahujú 125I-hGH (20 000 cpm prípravy 30 až 60 /pci//pg), 150 až 250 mikrogramov proteínu membrány pečene a buď prírodný bGH (1 až 100 ng) alebo extrakty bakteriálneho bGH. Výsledok ukazuje, že aktivita analógu bGH je porovnateľná s prírodným bGH.
3. Tibiálny test
Bioaktivita pRec 2/3-analógu bGH získaného inžinierstvom z bakteriálnych buniek podľa príkladu 4 sa hodnotí tibiálnym testom (Parlow A. F. a ď., Endocrinology (1965) 77, 1126).
Potkany sa hypofyzektomizujú vo veku 28 až 30 dní, potom sa ponechajú 10 až 14 dní bez terapie. Hovädzí hormón odvodený z hovädzej hypofýzy alebo z rekombinantnej Escherichia coli sa rozpustí v 0,15 M NaCl + + 0,1 M borátu, pH 10,0. Potkany (skupiny po 4 až 7) dostávajú denne subkutánne injekcie roztokov bGH (5 až 125 mikrogram/deň po 0,2 ml) počas 5 dní, pričom dostávajú bežnú stravu (Purina Rat-Chow a vodu ad libidum). Zvieratá sa 6 deň usmrtia, odoberú sa holenné kosti ich predných nôh, pozdĺžne sa rozrežú, fixujú acetónom a zafarbia 2% AgNO3. Šírka epifyzámych doštičiek sa meria pozorovaním rozkladným binokulárom (Nikon). Stredné hodnoty (40 čítaní na potkana) sa použijú na konštrukciu logaritmických kriviek dávka-odpoveď. Výsledky sú uvedené na obr. 15.
Príklad 6
Analógy bGH
Tabuľka I uvádza sériu plazmidov, ktoré boli konštruované a analógy, ktoré z nich boli produkované.
Tabuľka I plazmid amino-koniec analógov bGH
Rec 2/3 Met Asp Gin Phe1 pH i Met Asp Pro Met Gly Ala Phe1 pM 4 Met Asp Pro Phe1 pM 1 Met Ala1 Phe1 pM 2 Met Ala1 Phe2 pAL 401 Met* pYL 301 Met Gly Ala1 Phe2 pAL 302 11 AK + Ala1 Phe2 pHis 129 Met Thr Arg Phe1 pAL 312 Met Gly Ala1 Phe2 pAL 322 Met Gly Ala1 Phe2 pAL 601R Met Gly Ala1 Phe2 p 18 Met Gly Ala1 Phe2
PBTG-800 Met Glu Phe1 pORF 2-12 Ala Gly Ala1 Phe2
Príklad 7
Účinok pRec 2/3-analógu bGH na laktogenézu dojníc
Laktogénny účinok bGH je dobre dokumentovaný vo vedeckej literatúre v prácach Bines J. a ď., Brit. J. Nutrí. (1980) 43,179 a Peel C. a ď., J. Nutr. (1981) 1111, 1662. Bauman D. a ď., J. Dairy Sci., diel dod. 1, abstrakt 86 (1982) zaznamenáva, že produkcia mlieka sa zvýši pomocou rDNA bGH. Bol uskutočnený pokus s cieľom stanovenia účinku pRec 2/3-bGH na laktogenézu v porovnaní s prírodným bGH. 18 holštýnskych kráv v štádiu 141 až 154 dní po pôrode bolo náhodne vybraných na terapiu a zostavených do skupín podľa dojivosti podľa schémy predbežná terapia terapia injekcia OH denne kontrola 5 dní fyziologický roztok prírodný bGH 5 dní 25 mg/deft počas 10 dní pRec 2/3-bGH 5 dní 25 mg/deft počas 10 dní
Tesne pred každodennou injekciou boli vzorky' bGH prevedené do roztoku pomocou 0,1 M NaHCO3 vodného pufra (pH 8,2) s koncentráciou 1 mg/ml. Kravám bolo denne počas 10 dni injikované placebo alebo roztok bGH subkutánne v oblasti krku. Počas päťdennej terapie neboli dávané žiadne injekcie.
Kravy boli dojené dvakrát denne približne o 6.00 a 17.00. Hmotnosti mlieka boli zaznamenávané systémom Boumatic a zanášané do systému mliekárenských dát.
Priemerné hodnoty dojivosti počas predbežnej terapie a terapie bGH sú uvedené v tabuľke II. Úroveň dojivosti kontrolných kráv sa nezmenila, zatiaľ čo v obidvoch skupinách ošetrovaných bGH objem mlieka vzrástol podobne. Prírodný bGH spôsobil nárast mlieka počas 10 dní o 11,9 % a analóg bGH o 10,2 %. Údaje neboli analyzované z hľadiska štatistického významu vzhľadom na malý počet zvierat, ale veľkosť nárastu je podobná údajom z literatúry.
Bol urobený záver, že pRec 2/3-bGH stimuluje laktogenézu dojníc podobne ako prírodný bGH.
Tabuľka II
Účinok hovädzieho rastového hormónu na laktogenézu priemerná cenná qqjxvomc
| ekupina | počet predb. ter&p. podávanie | V nárastu oproti predb. terapii | ||
| 5 dni | GH, io dní | |||
| kontrolná | 6 | 25,96 | 25,97 | - |
| prírodný bGH | ||||
| 25 mg/deň | 5 | 26,55 | 29,71 | 11,9 |
| pRec 2/3-bGH | ||||
| 25 tng/deň | 6 | 26,07 | 28,73 | 10,2 |
I I I
SK 278576 Β6
Každej krave bolo 10 x denne počas 10 dní subkutánne injikované buď placebo alebo roztok bGH.
Claims (58)
1. Expresný vektor, ktorý po zavedení do bunky vhodného bakteriálneho hostiteľa, predovšetkým Escherichia coli, obsahujúceho termolabilný represor CI, umožňuje, aby hostiteľská bunka po zvýšení teploty hostiteľskej bunky na 42 °C, kedy je represor inaktivovaný, uskutočnila expresiu požadovaného génu vloženého do vektora a produkciu polypeptidu, kódovaného génom, obsahujúci dvoj vláknovú molekulu DNA, ktorá v smere 5'->3' obsahuje:
promótor a operátor PLOL z bakteriofágu lambda, miesto využitia N na naviazanie antiterminátorového N proteínu, produkovaného hostiteľskou bunkou, sekvenciu DNA, obsahujúcu miesto väzby ribozómov, ktoré umožňuje mRNA požadovaného génu, aby sa naviazala na ribozómy hostiteľskej bunky, kde miesto väzby ribozómu je:
(i) mutačné ribozómové väzbové miesto Cn z bakteriofágu lambda so sekvenciou
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA alebo (ii) syntetický oligonukleotid so sekvenciou
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA alebo (iii) z prevažujúceho hlavného proteínového génu bakteriofágu lambda a má sekvenciu
TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC, iniciačný kodón a oblasť reštrikčných enzýmov na vloženie požadovaného génu do vektora vo fáze s iniciačným kodónom ATG, a ďalej zahrnuje sekvenciu DNA, obsahujúcu pôvod replikácie z bakteriálneho plazmidu pBR322, schopného autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke a sekvenciu DNA, obsahujúcu gén, spojený so selekčným alebo identifikovateľným fenotypickým znakom, ktorý je manifeste vaný, ak je vektor prítomný v hostiteľskej bunke.
2. Vektor podľa nároku 1, kde vhodnou hostiteľskou bunkou je Escherichia coli.
3. Vektor podľa nároku 2, kde je použitý kmeň Escherichia coli A1637, A1645, A2602 alebo A1563.
4. Vektor podľa nároku 1, kde dvoj vláknová molekula DNA je kruhová.
5. Vektor podľa nároku 1, kde oblasť reštrikčných enzýmov je BamHl, Sací alebo Ndel.
6. Vektor podľa nároku 1, kde fenotypickým znakom je rezistencia proti liečivám alebo citlivosť proti teplote.
7. Vektor podľa nároku 6, kde rezistencia proti liečivám je rezistencia proti ampicilínu, chloramfenikolu alebo tetracyklínu.
8. Vektor podľa nároku 1, kde požadovaný gén kóduje rastový hormón, superoxid dismutázu, apoliproteín E, vírusový proteín 1 vírusu slintačky a krívačky , proteín A z S. aureus, interleukín III, enzým alebo jeho analógy.
9. Vektor podľa nároku 1, kde požadovaný gén kóduje hovädzí rastový hormón alebo jeho analógy.
10. Vektor podľa nároku 1, kde požadovaný gén kó- duje ľudský rastový hormón alebo jeho analógy.
11. Vektor podľa nároku 1, kde požadovaný gén kóduje prasačí rastový hormón alebo jeho analógy.
12. Vektor podľa nároku 1, kde požadovaný gén kóduje kurací rastový hormón alebo jeho analógy.
13. Vektor pMGlOO, majúci reštrikčnú mapu znázornenú na obr. 1 a uložený pod číslom zbierky ATCC 39385 s bGH cDNA klonovanou do reštrikčného miesta BamHl, ako je znázornené na obr. 2.
10
14. Vektor pND5 majúci reštrikčnú mapu znázornenú na obr. 3 a uloženú pod číslom zbierky ATCC 39384 a 39386 s hGH cDNA klonovanou do restričkných miest Ndel, ako je znázornené na obr. 4.
15. Plazmid na produkciu polypeptidu, obsahujúci
15 vektor podľa nároku 1 a gén kódujúci polypeptid alebo jeho analóg, vložený do oblasti reštrikčných enzýmov.
16. Plazmid na produkciu hovädzieho rastového hormónu, obsahujúci vektor podľa nároku 1 a gén, kódujúci hovädzí rastový hormón, alebo jeho analóg, vlo-
20 žený do oblasti restričkných enzýmov.
17. Plazmid podľa nároku 16 s označením pRec 2/3 bGH, majúci reštrikčnú mapu znázornenú na obr. 2 a uložený pod číslom zbierky' ATCC 39385.
18. Plazmid podľa nároku 16 s označením pROll,
25 majúci reštrikčnú mapu znázornenú na obr. 3 a uloženú pod číslom zbierky ATCC 39390.
19. Plazmid na produkciu ľudského rastového hormónu, obsahujúci vektor podľa nároku 1 a gén, kódujúci ľudský rastový hormón, alebo jeho analóg, vložený do
30 oblasti restričkných enzýmov.
20. Plazmid podľa nároku 19 s označením pTV 18(1) majúci reštrikčnú mapu znázornenú na obr. 4 a uloženú pod číslom zbierky ATCC 39386.
21. Plazmid podľa nároku 19 s označením
35 pTV 104(2) majúci reštrikčnú mapu znázornenú na obr. 4 a uložený pod číslom zbierky ATCC 39384.
22. Systém hostiteľ-vektor na produkciu polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje plazmid podľa nároku 15 v hostiteľskej bunke E. coli.
40
23. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že je použitý kmeň E. coli A1637, A1645, A2602 alebo A1563.
24. Systém hostiteľ-vektor na produkciu hovädzieho rastového hormónu, vyznačujúci sa
45 t ý m , že obsahuje plazmid podľa nároku 16 v hostiteľskej bunke E. coli.
25. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že je použitý kmeň E. coli. Λ1637, A1645, A2602 a A1563.
50
26. Systém hostiteľ-vektor na produkciu hovädzieho rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje plazmid podľa nároku 17 v hostiteľskej bunke E. coli.
27. Systém hostiteľ-vektor na produkciu hovädzieho
55 rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje plazmid podľa nároku 18 v hostiteľskej bunke E. coli.
28. Systém hostiteľ-vektor na produkciu ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje plazmid podľa nároku 19 v hostiteľskej bunke E. coli.
29. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, ž.e je použitý kmeň E. coli A1637, A1645, A2602 alebo A1563.
65
30. Systém hostiteľ-vektor na produkciu ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje plazmid podľa nároku 20 v hostiteľskej bunke E. coli.
31. Systém hostiteľ-vektor na produkciu ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje plazmid podľa nároku 21 v hostiteľskej bunke E. coli.
32. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že sa systém hostiteľ-vektor podľa nároku 22 kultivuje 10 až 30 min pri 42 °C a potom kontinuálne pri 37 až 39 °C, pričom celkový čas kultivácie je 60 až 90 min, a potom sa izoluje výsledný polypeptid.
33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa uskutočňuje 15 min pri 42 °C a kontinuálne 75 min pri 38 až 39 °C.
34. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa t ý m , že médium je hydrolyzát laktalbumínu s prídavkom glukózy alebo mozgového a srdcového vývaru.
35. Spôsob produkcie hovädzieho rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že sa systém hostiteľ-vektor podľa nároku 26 kultivuje pri podmienkach uvedených v nároku 32 a izoluje sa výsledný bGH.
36. Spôsob produkcie hovädzieho rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že sa systém hostiteľ-vektor podľa nároku 27 kultivuje pri podmienkach uvedených v nároku 32 a izoluje sa výsledný bGH.
37. Spôsob produkcie ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že sa systém hostiteľ-vektor podľa nároku 30 kultivuje pri podmienkach uvedených v nároku 32 a izoluje sa výsledný hGH.
38. Spôsob produkcie ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že sa systém hostiteľ-vektor podľa nároku 31 kultivuje pri podmienkach uvedených v nároku 32 a izoluje sa výsledný hGH.
39. Analóg bGH, exprimovaný vektorom podľa nároku 1, s aktivitou prírodné sa vyskytujúcich aminokyselín, ktorá sa od sekvencie prírodného bGH odlišuje až 5 aminokyselinami naN-konci.
40. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci fenylalanínovej formy bGH aminokyselinu metionín.
41. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci alanínovej formy bGH aminokyselinu metionín.
42. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci fenylalanínovej formy bGH sekvenciu aminokyselín Met-Asp-Gln.
43. Analóg podľa nároku 39, majúci naN-konci alanínovej formy bGH sekvenciu aminokyselín Ala-Gly.
44. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci alaninovej formy bGH sekvenciu aminokyselín Met-Gly.
45. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci alanínovej formy bGH sekvenciu aminokyselín Met-Asp-Pro-Met-Gly.
46. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci fenylalanínovej formy bGH sekvenciu aminokyselín Met-Asp-pro.
47. Analóg bGH, exprimovaný vektorom podľa nároku 1, majúci sekvenciu aminokyselín Met-(X)„-Y-Met..., kde Met je N-koniec, X je ktorákoľvek z dvadsiatich prírodné sa vyskytujúcich aminokyselín, Y je ktorákoľvek z dvadsiatich aminokyselín okrem Glu, Gin, Lys, Met alebo Trp, n je celé číslo 0 až 6 a Met.... je sekvencia prírodného bGH od polohy 4 do COOH-konca (poloha 191).
48. Analóg podľa nároku 39, majúci sekvenciu aminokyselín fenylalanínovej formy bGH po odstránení ami nokyselín až po metionín (poloha 4) na N-konci.
49. Analóg podľa nároku 39, majúci na N-konci fenylalanínovej formy bGH sekvenciu aminokyselín Met-Thr-Arg.
50. Analóg hGH, exprimovaný vektorom podľa nároku 1, s aktivitou prírodné sa vyskytujúceho hGH, majúci podobnú sekvenciu aminokyselín odlišnú od sekvencie prírodného hGH.
51. Analóg podľa nároku 50, majúci sekvenciu aminokyselín hGH po odstránení aminokyselín až po metionín (poloha 14) na N-konci.
52. Analóg podľa nároku 50, majúci na N-konci prírodného hGH aminokyselinu metionín.
53. Analóg hGH, exprimovaný vektorom podľa nároku 1, majúci sekvenciu aminokyselín Met-(X)n-Y-Met...., kde Met je N-koniec, X je ktorákoľvek z dvadsiatich prírodné sa vyskytujúcich aminokyselín, Y je ktorákoľvek z dvadsiatich aminokyselín okrem Glu, Gin, Lys, Met alebo Trp, n je celé číslo 0 až 13 a Met.... je sekvencia prírodného hGH od polohy 14 do COOHkonca (poloha 191)
54. Veterinárny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo analógu bGH podľa nároku 39 a vhodný nosič.
55. Veterinárny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo analógu bGH podľa nároku 42 a vhodnú nosič.
56. Veterinárny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo analógu hGH podľa nároku 50 a vhodný nosič.
57. Použitie analógu bGH podľa nároku 39 pri spôsobe stimulácie produkcie mlieka alebo mäsa u hovädzieho dobytka.
58. Použitie analógu bGH podľa nároku 42 pri spôsobe stimulácie produkcie mlieka alebo mäsa u hovädzieho dobytka.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51418883A | 1983-07-15 | 1983-07-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK524684A3 SK524684A3 (en) | 1997-10-08 |
| SK278576B6 true SK278576B6 (en) | 1997-10-08 |
Family
ID=24046152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK5246-84A SK278576B6 (en) | 1983-07-15 | 1984-07-05 | Expression vectors for increased production polypeptides, plasmides containing these vectors, host cells containing these plasmides, gained products, connecting methods and use |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4871835A (sk) |
| EP (3) | EP0691406A1 (sk) |
| JP (3) | JPH0687780B2 (sk) |
| AT (2) | ATE136934T1 (sk) |
| AU (2) | AU577298B2 (sk) |
| BG (2) | BG49718A3 (sk) |
| BR (1) | BR8403523A (sk) |
| CA (1) | CA1254527A (sk) |
| CZ (1) | CZ282867B6 (sk) |
| DD (2) | DD240217A5 (sk) |
| DE (2) | DE3486425T2 (sk) |
| DK (1) | DK347184A (sk) |
| ES (2) | ES8602947A1 (sk) |
| FI (1) | FI90564C (sk) |
| HK (1) | HK128095A (sk) |
| HU (1) | HU209878B (sk) |
| IE (2) | IE64174B1 (sk) |
| IL (8) | IL72396A (sk) |
| NZ (2) | NZ208897A (sk) |
| RO (1) | RO91332B (sk) |
| SK (1) | SK278576B6 (sk) |
| ZA (1) | ZA845345B (sk) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US5236828A (en) * | 1983-07-06 | 1993-08-17 | Papas Takis S | Plasmid pJL6 |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US5670371A (en) * | 1983-07-15 | 1997-09-23 | Bio-Technology General Corp. | Bacterial expression of superoxide dismutase |
| US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
| DE3585170D1 (de) * | 1984-03-06 | 1992-02-27 | Lilly Co Eli | Expressionsvektoren fuer rinderwachstumshormonderivate. |
| US5162217A (en) * | 1984-08-27 | 1992-11-10 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda PL promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
| US6030611A (en) * | 1984-08-27 | 2000-02-29 | Bio-Technology General Corp. | Therapeutic SOD compositions and uses thereof |
| US5143836A (en) * | 1984-08-27 | 1992-09-01 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda pl promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
| US5759816A (en) * | 1984-08-27 | 1998-06-02 | Bio-Technology General Corp. | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |
| CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
| CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
| US5112744A (en) * | 1984-08-27 | 1992-05-12 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase |
| US4743546A (en) * | 1985-02-13 | 1988-05-10 | Biotechnica International, Inc. | Controlled gene excision |
| US4861868A (en) | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| FR2579223B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
| EP0229110B1 (en) | 1985-06-26 | 1992-05-20 | The Upjohn Company | Solubilization and oxidation of somatotropin from transformed microorganisms |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
| JPS63500941A (ja) * | 1985-09-18 | 1988-04-07 | ジ・アップジョン・カンパニ− | 選択的脱アミノ化による哺乳動物ソマトトロピンの生物学的活性の増強 |
| US5631227A (en) * | 1985-09-18 | 1997-05-20 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
| JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
| US6610520B1 (en) | 1985-11-22 | 2003-08-26 | Bio-Technology General Corp. | Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby |
| IE59498B1 (en) * | 1985-11-22 | 1994-03-09 | Bio Technology General Corp | Human manganese superoxide dismutase analog, plasmid for its expression and method of recovering it in enzymatically active form |
| ES2019874B3 (es) * | 1986-10-08 | 1991-07-16 | Upjohn Co | Bioactividad mejorada de somatotropina de mamiferos mediante desamidacion selectiva. |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5240837A (en) * | 1987-02-19 | 1993-08-31 | The Upjohn Company | CDNAS encoding somatotropin, expression vectors and hosts |
| WO1988006186A2 (en) * | 1987-02-19 | 1988-08-25 | The Upjohn Company | cDNAs ENCODING SOMATOTROPIN, EXPRESSION VECTORS AND HOSTS |
| US5104796A (en) * | 1987-04-06 | 1992-04-14 | International Minerals & Chemical Corp. | High titer production of human somatomedin c |
| US5047504A (en) * | 1987-04-28 | 1991-09-10 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US4966841A (en) * | 1987-05-22 | 1990-10-30 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Enhanced vector production and expression of recombinant DNA products |
| US5030563A (en) * | 1987-07-07 | 1991-07-09 | Genetics Institute, Inc. | Bacterial hypersecretion using mutant repressor sequence |
| US5079345A (en) * | 1988-08-19 | 1992-01-07 | Eli Lilly And Company | Proteins having growth hormone anabolic properties with reduced effect on carbohydrate metabolism |
| DE68919647T2 (de) * | 1988-10-26 | 1995-05-11 | American Cyanamid Co | Verfahren zur Verringerung des Aggregatinhaltes in Wachstumshormonen gleichenden Stoffen. |
| US6780613B1 (en) * | 1988-10-28 | 2004-08-24 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants |
| EP0397834B1 (en) | 1988-10-28 | 2000-02-02 | Genentech, Inc. | Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants |
| EP0441889A1 (fr) * | 1988-11-07 | 1991-08-21 | Commission des Communautés Européennes | Hormone de croissance humaine modifiee |
| US4975529A (en) * | 1989-08-18 | 1990-12-04 | Monsanto Company | Method of folding somatotropins |
| US5958879A (en) * | 1989-10-12 | 1999-09-28 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Growth hormone receptor antagonists and methods of reducing growth hormone activity in a mammal |
| US6583115B1 (en) | 1989-10-12 | 2003-06-24 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods for treating acromegaly and giantism with growth hormone antagonists |
| IE912345A1 (en) * | 1990-08-03 | 1992-02-12 | Pharmacia Ab | Treatment of human lactation failure |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5844097A (en) * | 1990-11-30 | 1998-12-01 | Monoclonetics International, Inc. | Methods for the diagnosis of peripheral nerve damage |
| DE69115926T2 (de) * | 1990-11-30 | 1996-05-30 | Monoclonetics Int | Verfahren zur diagnose chronischer niedriger rückenschmerzen und nackenschmerzen |
| US5231178A (en) * | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
| EP0586549B1 (en) * | 1991-05-10 | 2000-09-20 | Genentech, Inc. | Selecting ligand agonists and antagonists |
| US5395761A (en) * | 1991-11-27 | 1995-03-07 | Eli Lilly And Company | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith |
| ZA94169B (en) * | 1993-01-26 | 1994-09-07 | Lilly Co Eli | Non-denaturing potency assay for bovine somatotropin |
| AU693478B2 (en) * | 1994-11-10 | 1998-07-02 | Metabolic Pharmaceuticals Limited | Treatment of obesity |
| US6335319B1 (en) | 1994-11-15 | 2002-01-01 | Metabolic Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of obesity |
| US20020142965A1 (en) * | 1994-11-15 | 2002-10-03 | Metabolic Pharmaceuticals, Ltd. | Treatment of obesity |
| AU5881996A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods of treatment using growth hormone antagonists |
| KR970006498A (ko) * | 1995-07-31 | 1997-02-21 | 유충식 | 활성형 인성장호르몬의 정제 방법 |
| DE69638117D1 (de) * | 1995-09-21 | 2010-03-04 | Genentech Inc | Varianten des menschlichen Wachstumshormons |
| US5849293A (en) * | 1996-01-11 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of human transferrin in controlling insulin levels |
| CA2197408A1 (en) * | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Kazuo Chihara | Mutant human growth hormones and their uses |
| US6737407B1 (en) * | 1997-09-08 | 2004-05-18 | Metabolic Pharmaceuticals, Ltd. | Treatment of obesity |
| DE19951765A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Thomas Schweder | Wirts-Vektor-Systeme zur Überproduktion von thermolabilen Enzymen psychrophiler Organismen |
| KR100400638B1 (ko) * | 2000-12-06 | 2003-10-08 | 주식회사 엘지생명과학 | 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법 |
| MXPA03008022A (es) | 2001-03-09 | 2003-12-04 | Genentech Inc | Proceso para la produccion de polipeptidos. |
| ES2343518T3 (es) * | 2002-09-09 | 2010-08-03 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Polipeptidos interferon alfa modificados resistentes a proteasas. |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| US20070154992A1 (en) | 2005-04-08 | 2007-07-05 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR68404B (sk) * | 1979-06-01 | 1981-12-29 | Univ California | |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US4426323A (en) * | 1980-01-10 | 1984-01-17 | Ionics, Incorporated | Selected recovery of proteins from fermentation broths |
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| DK171301B1 (da) * | 1980-06-06 | 1996-08-26 | Biogen Inc | Plasmid-vektorer, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid |
| US4352443A (en) * | 1980-06-24 | 1982-10-05 | U.S. Cap & Closure, Inc. | Dispenser having a trigger-bulb pump |
| JPS6045848B2 (ja) * | 1980-07-31 | 1985-10-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト成長ホルモンの製造方法 |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| DE3231658A1 (sk) | 1981-01-21 | 1983-11-17 | ||
| EP0061250A3 (en) * | 1981-03-23 | 1983-09-28 | Biogen N.V. | Improved process for recovering products produced by host organisms |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| US4436815A (en) * | 1981-11-27 | 1984-03-13 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells |
| US4665160A (en) * | 1982-03-22 | 1987-05-12 | Genentech, Inc. | Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome |
| AU553017B2 (en) * | 1982-06-07 | 1986-06-26 | Chr. Hansen A/S | A process for the preparation of chymosin |
| CA1224432A (en) * | 1982-08-17 | 1987-07-21 | Gary N. Buell | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| JPS60500358A (ja) * | 1982-12-23 | 1985-03-22 | アメリカ合衆国 | マウスの細胞内で組み換えｄｎａによって生産されたヒト成長ホルモン |
| US4728609A (en) * | 1983-01-10 | 1988-03-01 | Hoffmann-La-Roche Inc. | Recombinant growth hormone releasing factor |
| JPS59145876A (ja) * | 1983-02-09 | 1984-08-21 | 株式会社リコー | 開閉体用のヒンジ |
| DK162130C (da) * | 1983-03-07 | 1992-03-02 | Hoffmann La Roche | Grf-analoge peptider, fremgangsmaade til fremstilling deraf, grf-analoge peptider som terapeutiske midler, anvendelse af grf-analoge peptider, fremgangsmaade til fremstilling af farmaceutiske praeparater indeholdende grf-analoge peptider samt parenterale farmaceutiske praeparater indeholdende grf-analoge peptider |
| WO1984003711A1 (en) * | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Celltech Ltd | A process for the production of a protein |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| AU587176B2 (en) * | 1984-02-14 | 1989-08-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Transfer vector |
| US4767709A (en) * | 1984-06-28 | 1988-08-30 | The Johns Hopkins University | Growth-related hormones |
| DE3426532A1 (de) * | 1984-07-18 | 1986-01-30 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verwendung einer dna-sequenz zur expression sowie dna-struktur und expressionsvektor mit der dna-sequenz |
| CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
| US4612367A (en) * | 1985-04-08 | 1986-09-16 | Eli Lilly And Company | Process for purifying growth hormone-like materials |
| US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| US4656255A (en) * | 1985-09-09 | 1987-04-07 | International Minerals & Chemical Corp. | Protein recovery |
-
1984
- 1984-07-02 BG BG80683/87A patent/BG49718A3/xx unknown
- 1984-07-03 AT AT88121246T patent/ATE136934T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 EP EP95114069A patent/EP0691406A1/en not_active Withdrawn
- 1984-07-03 AT AT84107717T patent/ATE66959T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 EP EP84107717A patent/EP0131843B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 EP EP88121246A patent/EP0319049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 DE DE3486425T patent/DE3486425T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 DE DE8484107717T patent/DE3485003D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-05 CZ CS845246A patent/CZ282867B6/cs unknown
- 1984-07-05 SK SK5246-84A patent/SK278576B6/sk unknown
- 1984-07-06 AU AU30345/84A patent/AU577298B2/en not_active Expired
- 1984-07-11 ZA ZA845345A patent/ZA845345B/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL72396A patent/IL72396A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-12 BG BG66214A patent/BG49721A3/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL91826A patent/IL91826A/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL91828A patent/IL91828A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 NZ NZ208897A patent/NZ208897A/xx unknown
- 1984-07-13 FI FI842842A patent/FI90564C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 HU HU842749A patent/HU209878B/hu unknown
- 1984-07-13 JP JP59145876A patent/JPH0687780B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-13 IE IE181884A patent/IE64174B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 ES ES534321A patent/ES8602947A1/es not_active Expired
- 1984-07-13 RO RO115224A patent/RO91332B/ro unknown
- 1984-07-13 DK DK347184A patent/DK347184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-07-13 CA CA000458833A patent/CA1254527A/en not_active Expired
- 1984-07-13 BR BR8403523A patent/BR8403523A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 NZ NZ227962A patent/NZ227962A/xx unknown
- 1984-07-16 DD DD84283853A patent/DD240217A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-16 DD DD84265320A patent/DD229427A5/de not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-01-14 US US06/691,230 patent/US4871835A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-03 US US06/752,441 patent/US4831120A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-08 ES ES544976A patent/ES8604252A1/es not_active Expired
-
1988
- 1988-07-22 AU AU19777/88A patent/AU615663B2/en not_active Expired
-
1989
- 1989-03-07 US US07/320,320 patent/US4997916A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 IL IL91828A patent/IL91828A0/xx unknown
- 1989-09-28 IL IL91826A patent/IL91826A0/xx unknown
-
1992
- 1992-04-17 IL IL101629A patent/IL101629A0/xx unknown
- 1992-07-29 IE IE922469A patent/IE922469A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-12-01 JP JP5301898A patent/JP2568376B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-21 IL IL10810893A patent/IL108108A0/xx unknown
-
1994
- 1994-12-29 IL IL11217894A patent/IL112178A0/xx unknown
-
1995
- 1995-08-10 HK HK128095A patent/HK128095A/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-07-10 JP JP18085896A patent/JP3146161B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4997916A (en) | Method for recovering a purified animal growth hormone or polypeptide analog thereof from a bacterial cell | |
| EP0518587B1 (en) | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| US5455029A (en) | Therapeutic compositions comprising a mixture of human CuZn superoxide dismutase analogs | |
| CA2033176C (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| HRP960213A2 (en) | RECOMBINANT OBESE (Ob) PROTEINS | |
| JPS6236183A (ja) | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 | |
| SK278336B6 (en) | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides | |
| CA1340464C (en) | Method of producing superoxide dismutase in a bacterial cell | |
| US5256546A (en) | Bacterial expression of porcine growth hormone | |
| US5637495A (en) | Plasmids for production of human growth hormone or polypeptide analog thereof, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby, and related methods | |
| US5527691A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter and T1 T2 rRNA termination sequence, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods | |
| US5198361A (en) | Plasmids for production of met-asp-gln bovine growth hormone, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods | |
| US5670371A (en) | Bacterial expression of superoxide dismutase | |
| US5112744A (en) | Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase | |
| US5151364A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter, T1 T2 RRNA termination sequence, and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid, and hosts containing the plasmids | |
| US5081020A (en) | Expression vectors containing λPL promoter, T1 T2 rRNA termination sequence and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid hosts and related methods | |
| US5059529A (en) | Stabilized expression vectors containing λPL promoter and the gene for the cI434 repressor, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods | |
| US5759816A (en) | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |