JPH08505284A

JPH08505284A - 杉花粉由来のアレルゲン性蛋白質及びペプチド

Info

Publication number: JPH08505284A
Application number: JP6512408A
Authority: JP
Inventors: クウォー，メイチャング; ヘレナユング，シウメイ; ダブリュー．ブラウアー，アンドルー; ポロック，ジョーン
Original assignee: イミュロジックファーマスーティカルコーポレイション
Priority date: 1992-11-12
Filing date: 1993-11-12
Publication date: 1996-06-11
Also published as: WO1994011512A3; EP0669983A1; AU5668194A; CA2148713A1; NZ258701A; WO1994011512A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、Cryptomeria japonica主要花粉アレルゲンCryjII及びその断片をコードする核酸配列を提供する。本発明は又、CryjII又は少なくともその１断片をコードする核酸配列でトランスフォームした宿主細胞にて生成した精製CryjII及びその少なくとも１断片並びに合成により調製したCryjの断片をも提供する。CryjII及びその断片は、杉花粉症を診断し、治療し及び予防するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】杉花粉由来のアレルゲン性蛋白質及びペプチド発明の背景遺伝的素因を有する個人（人口の約１０％に及ぶ）は、彼らがさらされる種々の環境起源の抗原に対して過剰感作（アレルギー性）となる。それらの即時型及び／又は遅延型の過敏症を誘発し得る抗原はアレルゲンとして知られている（Ki ng，T.P.，Adv.Immunol.23:77-105，（1976））。枯草熱、喘息及び発疹の症状を含むアナフィラキシー又はアトピーは、即時型アレルギーの一形態である。それは、草、木、雑草、動物の鱗屑、昆虫、食物、薬物及び化学物質等の種々のアトピー性アレルゲンによって引き起こされ得る。アトピー性アレルギーに関係する抗体は、主として免疫グロブリンＩｇＥクラスに属する。ＩｇＥはマスト細胞及び好塩基球と結合する。特定のアレルゲンと、マスト細胞又は好塩基球に結合したＩｇＥとの結合により、ＩｇＥは、その細胞上で架橋されてＩｇＥ−抗原相互作用の生理的効果を生じ得る。これらの生理的効果は、他の物質のうちで、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、エオシン好性白血球及び／又はロイコトリエンに対する走化性因子、Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の放出を含み、これらは、気管支平滑筋細胞の長期の収縮を引き起こす（Hood，L.E．等、Immunology（第２版），The Benjamin/Cumming Publishing C o.，Inc.（1984））。これらの放出された物質は、ＩｇＥと特異的アレルゲンとの結合により引き起こされるアレルギー性症状を生じるメディエーターである。それらを介してアレルゲンの効果は現れる。かかる効果は、その性質が、抗原が体内に侵入した経路及びＩｇＥのマスト細胞又は好塩基球への付着パターンによって、全身性であり又は局所的である。局所的出現は、一般に、アレルゲンが体内に侵入した場所の上皮表面に起きる。全身性効果は、アナフィラキシー（アナフィラキシー性ショック）を含み、それは、循環（血管内）抗原に対するＩｇＥ −好塩基球の応答の結果である。杉（スギ：Cryptomeria japonica）花粉症は、日本における最も重大なアレルギー性疾患の一つである。この病気を患っている患者数は増加中であり、幾つかの地域では人口の１０％より多くが影響を受けている。杉花粉抽出物を投与してアレルゲンに対して除感作することによる杉花粉症の治療が試みられてきた。しかしながら、杉花粉抽出物を用いる除感作は、高投与量で用いるならばそれがアナフィラキシーを誘出し得るという欠点を有しており、他方、低投与量を用いてアナフィラキシーを回避した場合には治療はその抽出物に対する寛容を確立するために数年間継続しなければならない。杉花粉に由来する主要なアレルゲンは精製され、スギ塩基性蛋白質（ＳＢＰ）又はCryjIと呼ばれている。この蛋白質は、分子量４１〜５０ｋＤａでｐＩ８．８の塩基性蛋白質であることが報告されている。部分的に異なるグリコシレーションのために、このアレルゲンの多くのイソ型があるらしい（Yasueda等（1983）J.Allergy C1in．Immunol.71:77-86；及びTaniai等（1 988）FEBS Letters239:329-332）。CryjIのＮ末端の最初の２０アミノ酸の配列及び１６アミノ酸の内部配列が決定された（Taniai、前出）。第２のアレルゲンが、最近、Cryptomeria japonica（杉）の花粉から単離された（Sakaguchi等（1990）Allergy 45:309-312）。このCryjIIと呼ばれるアレルゲンは、非還元及び還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）にてアッセイした場合、それぞれ、約３７ｋＤａ及び４５ｋＤａの分子量を有すると報告された（Sakaguchi等、前出）。CryjIIはCryjIと免疫学的交差反応性を有しないことが見出された（Sakaguchi（1990）前出；Kawashima等（1992）Int．Arch．Allergy Immunol．98:110-117）。杉花粉による殆どの患者は、CryjI及びCryjIIの両者に対するＩｇＥ抗体を有することが見出された。しかしながら、アレルギー患者の２９％は、CryjIとのみ反応するＩｇＥを有し、アレルギー患者の１４％は、CryjIIとのみ反応するＩｇＥを有した（Sakaguchi （1990）、前出）。CryjIIの等電点電気泳動は、この蛋白質が、CryjIに対するｐＩ８．６〜８．８と比べて、９．５を超えるｐＩを有することを示した（Sakaguch i（1990）、前出）。更に、報告されたCryjIIについてのＮＨ₂末端配列、ＮＨ₂ ＡｌaＩｌｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｙｒ−ＣＯＯＨは、CryjIについて報告されたものと一致しなかった（Sakaguchi（1990）、前出）。杉花粉症アレルゲンに注意が払われたにもかかわらず、人々に悪影響を及ぼす原因であるアレルゲンの特定又は特性決定は非常に不完全である。現在の脱感作治療は、もし高投与量の花粉抽出物を投与するならば付随するアナフィラキシーの危険を伴う花粉抽出物を用いる治療、又は低投与量の花粉抽出物を投与する場合に長期の脱感作時間を要する治療を含んでいる。発明の要約本発明は、Cryptomeria japonica主要花粉アレルゲンCryjIIをコードする核酸配列及びその断片を提供する。本発明は又、CryjIIをコードする核酸配列又は少なくともその１断片でトランスフォームされた宿主細胞内で産生された精製されたCryjII及び少なくともその１断片及び合成により調製したCryjIIの断片を提供する。ここで用いる場合、CryjIIの完全アミノ酸配列をコードする核酸配列の断片とは、CryjII及び／又は成熟CryjIIの完全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりも少ない塩基を有する核酸配列のことをいう。CryjII及びその断片は、杉花粉症を診断し、治療し及び予防するために有用である。この発明を、請求の範囲に一層詳細に記載し且つその好適具体例を以下の説明に記載する。図面の簡単な説明図１ａは、非還元条件下での、CryjIIのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）分析を示している。図１ｂは、還元条件下での、CryjIIのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）分析を示している。図２は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の１ステップのＮａＣｌ勾配にて溶出したCryjIIのモノＳカラムクロマトグラフィーの結果を示している。図３は、還元条件下で分析したCryjIIの精製したサブ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）を示している。図４は、CryjIIをコードする核酸配列（配列番号１）及び演繹されたアミノ酸（配列番号２）を示している。図５は、CryjIIの演繹されたアミノ酸配列を示している。図６は、実施例２で論じるように、Sakaguchi等、前出により規定されたCryjI Iの１０個のアミノ酸の配列（配列番号６）と並べた蛋白質配列分析により決定したCryjIIのロング型（配列番号４）及びショート型（配列番号５）のＮＨ₂末端アミノ酸配列を示している（配列番号３）。図７は、モノクローナル抗体４Ｂ１１及び７人の患者（バッチ１）の血漿ＩｇＥの被覆抗原としての精製CryjIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフ表示である。図８は、モノクローナル抗体４Ｂ１１及び７人の患者（バッチ１）の血漿ＩｇＥの被覆抗原としての天然の精製CryjIIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図９は、モノクローナル抗体４Ｂ１１及び７人の患者（バッチ１）の血漿ＩｇＥの被覆抗原としての組換えCryjII（rCryjII）に対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１０は、８人の患者（バッチ２）の血漿ＩｇＥの天然の精製CryjIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１１は、８人の患者（バッチ２）の血漿ＩｇＥの天然の精製CryjIIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１２は、８人の患者（バッチ２）の血漿ＩｇＥの組換えCryjIIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１３は、８人の患者（バッチ３）の血漿ＩｇＥの天然の精製CryjIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１４は、８人の患者（バッチ３）の血漿ＩｇＥの天然の精製CryjIIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１５は、８人の患者（バッチ３）の血漿ＩｇＥの組換えCryjIIに対する結合応答を示す直接ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。図１６は、患者の血漿試料（バッチ１〜３）について行なったＭＡＳＴ評点及び図７〜１５に示した直接ＥＬＩＳＡの結果を要約した表である（陽性応答は、（＋）符合で示され、各抗原に対する陽性応答の数は、各欄の下に示してある）。発明の詳細な説明本発明は、CryjII（杉花粉に見出されるアレルゲン）をコードする核酸配列を提供する。図４に示すCryjIIをコードする核酸配列（配列番号：１）は、５１４アミノ酸の蛋白質をコードしている。CryjIIの演繹されたアミノ酸配列を図４及び５に示す（配列番号：２）。天然の精製CryjIIの直接蛋白質配列分析は、２つの別々の重複するＮＨ₂末端配列を生じたが、これらは、ロング及びショートと呼ばれ、それぞれ、図４、５及び６のアミノ酸４６〜８９（配列番号：４）及び５１〜８９（配列番号：５）に対応している。以前にSakaguchi等、前出によりC ryjIIについて規定された１０個のアミノ酸の配列ＮＨ₂−ＡｌａＩｌｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｒｙ−ＣＯＯＨ（配列番号：６）は、図４及び６のアミノ酸５５〜６４に対応している。完全長のCryjII配列は、２０個のシステイン残基及び３つの潜在的なＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列とのＮ−結合グリコシル化部位を含んでいる。PCGene，Intelligenetic s（カリフォルニア、Mountain View在）に含まれるプログラムによれば、CryjII のロング及びショート型により規定されるＮＨ₂末端を有する蛋白質は、それぞれ４６９及び４６４アミノ酸を含み、予想分子量５１．５ｋＤａ（ロング）及び５０．９ｋＤａ（ショート）を有する。CryjIIのロング型を表すアミノ酸配列は、図４に示すように塩基１７７〜１５８６に及ぶヌクレオチド配列（配列番号：７）によりコードされ、CryjIIのショート型を表すアミノ酸配列は、図４に示すように１９２〜１５８６に及ぶヌクレオチド配列（配列番号：８）によりコードされる。完全長のCryjIIをコードするＣＤＮＡ挿入物を含むベクターでトランスフォームした宿主細胞を、American Type Culture CollectionにＡＴＣＣＮｏ．６９１０５で寄託した。 CryjIIの断片をコードする核酸配列の断片も又、この発明の範囲内にある。この発明の範囲内の断片は、CryjIIの部分をコードするものを含み、これらは、哺乳動物好ましくはヒトにおいて免疫応答を誘発する（最小量のＩｇＥの剌激；ＩｇＥの結合；ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の産生の誘出；又は増殖及び／又はリンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アネルギーの誘導等のＴ細胞応答の誘出等）。前述のCryjIIの断片を、ここでは、抗原性断片という。この発明の範囲内の断片は、CryjIIと交差反応性のアレルゲンを検出するスクリーニングプロトコールにおいて用いるために、他の植物種からの核酸とハイブリダイズし得るものをも含む。ここで用いる場合、CryjIIをコードする核酸配列の断片とは、CryjII 及び／又は成熟CryjIIの完全アミノ酸配列をコードする核酸配列より少ない塩基を有する核酸配列をいう。一般に、CryjIIの断片をコードする核酸配列を、成熟蛋白質をコードする塩基から選択するが、ある場合には、この発明の核酸配列のリーダー配列部分からの断片の全部又は一部を選択することが望ましい。この発明の核酸配列は又、CryjII又はその断片のクローニング、発現又は精製に有用なリンカー配列、改変された制限エンドヌクレアーゼ部位及びその他の配列をも含む。 CryjIIをコードする核酸配列は、Cryptomeria japonica植物から得ることが出来る。出願人は、新鮮な花粉及び雄蘂を有する球果がCryjIIｍＲＮＡの良い源であることを見出した。Cryptomeria japonicaは杉の周知の種であり、植物材料は野生、耕作又は装飾用植物から得ることが出来る。CryjIIをコードする核酸配列は、ここに開示する方法又は遺伝子の単離及びクローニングのための他の任意の適当な方法を用いて得ることが出来る。この発明の核酸配列はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。本発明は、この発明の核酸配列を発現するための発現ベクター及びトランスフォームした宿主細胞を提供する。CryjIIをコードする核酸配列又はそれらの少なくとも１断片をE．coli等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞中で発現させることが出来る。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素は、Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，ニューヨーク（1989 ）中に見出すことが出来る。他の適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー及び他の発現要素は、当業者には公知である。哺乳動物、酵母又は昆虫細胞内での発現は、組換え物質の部分的な又は完全なグリコシレーション及び鎖間又は鎖内ジスルフィド結合の形成へと導く。酵母内での発現のための適当なベクターは、YepSecl（Baldari等（1987）Embo J.6:229-234）；pMFa（Kurjan及びHers kowitz（1982）Cell30:933-943）；JRY88（Schultz等（1987）Gene54:113-123）及びpYES2（Invitrogen Corporationカリフォルニア、San Diego在）を含む。これらのベクターは自由に入手することが出来る。バキュロウイルス及び哺乳動物発現系も又入手可能である。例えば、バキュロウイルス系は、昆虫細胞中での発現用に市販されており（カリフォルニア、San Diego在、PharMingen）、他方、pMSGベクターは、哺乳動物細胞内での発現用に市販されている（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia )。 E．coli内での発現のためには、適当な発現ベクターは、他のものの内で、pTR C（Amann等（1988）Gene69:301-315）；pGEX（オーストラリア、Melbourne在、Amrad Co rp.）；pMAL（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）；pRIT5（ニュージャージー、Pisca taway在、Pharmacia）；pET-lld（ウィスコンシン、Madison在、Novagen）Jameel等、（ 1990）J.Virol.64:3963-3966；及びpSEM（Knapp等（1990）BioTechniques8:280- 281）を含む。例えば、pTRC及びpET-lldの利用は、未融合蛋白質の発現へと導く。pMAL、pRIT5、pSEM及びpGEXの利用は、マルトースＥ結合蛋白質（pMAL）、蛋白質Ａ（pRIT5）、切り詰めたβ−ガラクトシダーゼ（PSEM）又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（pGEX）に融合したアレルゲンの発現へと導くであろう。CryjII断片又はその断片が融合蛋白質として発現される場合には、キャリアー蛋白質とCryjII又はその断片との間の融合点に酵素開裂部位を導入することは特に有利である。次いで、CryjII又はその断片を融合蛋白質からその酵素部位における酵素間裂並びに蛋白質及びペプチド精製のための従来技術を用いる生化学的精製によって回収することが出来る。適当な酵素開裂部位は、血液凝固因子Ｘａ又はトロンビンに対するものを含み、それに対する適当な酵素は、例えば、ミズーリ、St.Louｉs在、Sigma Chemical Company及びマサチューセッツ、 Beverly在、N.E.Biolabsから入手することが出来る。種々のベクターは、構成的発現又は例えばＩＰＴＧ誘導（PRTCAmann等、（1988）前出；pET-lld，ウィスコンシン、Madison在、Novagen）若しくは温度誘導（pRIT5、ニュージャージー、Piscataway在、P harmacia）を用いる誘導可能な発現を可能にする種々のプロモーター領域を有する。組換えにより発現される蛋白質を分解する能力を変えた種々のE．coli宿主中で組換えCryjIIを発現させることも適当であろう（例えば、米国特許第４，７５８，５１２号）。或は、E．coliにより優先的に利用されるコドンを用いるように核酸配列を変えることは有利であり得る（ここに、かかる核酸の変化は、発現されるアミノ酸配列に影響を与えないものである）。宿主細胞は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は電気穿孔法等の従来技術を用いて、この発明の核酸配列を発現するようにトランスフォームすることが出来る。宿主細胞をトランスフォームするための適当な方法は、Sambrook等、前出及び他の実験室用テキスト中に見出され得る。この発明の核酸配列は又、標準的技術を用いて合成することも出来る。本発明は又、精製した杉花粉アレルゲンCryjII又は少なくともその１断片を製造する方法をも提供し、それは、杉花粉アレルゲンCryjII又は少なくともその１断片をコードするＤＮＡ配列でトランスフォームした宿主細胞を適当な培地中で培養して該杉花粉アレルゲンCryjII若しくはその少なくとも１断片を含む細胞及び培地の混合物を生成し；そしてその混合物を精製して実質的に純粋な杉花粉アレルゲンCryjII又はその少なくとも１断片を生成する工程を含んでいる。CryjII又はその少なくとも１断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフォームした宿主細胞をその宿主細胞に適した培地中で培養する。CryjII蛋白質及びペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動及びCryjII若しくはその断片に特異的な抗体を用いる免疫精製を含むペプチド又は蛋白質を精製するための公知技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞又はその両者から精製することが出来る。単離した及び精製したという用語は、ここでは、交換可能であって、組換えＤＮＡ技術又は化学的前駆体により生成したときに、実質的に細胞性物質若しくは培養培地を含まないペプチド、蛋白質、蛋白質断片及び核酸配列のことをいう。 CryjII蛋白質は又、実施例１に記載するように杉花粉からも単離し得る。ここでは、杉花粉から直接単離されたCryjIIは「天然の精製」CryjIIとして言及する。この発明の天然の精製CryjIIが少なくとも８０％の純度であること、一層好ましくは少なくとも９０％の純度であること、更に好ましくは均質（少なくとも９９％）にまで精製されていることは、好ましいことである。この発明の他の面は、杉花粉アレルゲンCryjII又はその少なくとも１断片（杉花粉アレルゲンCryjIIの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列でトランスフォームした宿主細胞内で合成されたもの、或は化学合成したもの）、及び精製した杉花粉アレルゲンCryjII蛋白質又はこれらの少なくとも１つの抗原性断片（この発明の核酸配列でトランスフォームした宿主細胞内で生成したもの、或は化学合成したもの）を含む調製物を提供する。この発明の好適具体例において、CryjII蛋白質は、少なくとも成熟CryjII蛋白質をコードする核酸配列でトランスフォームした宿主細胞内で産生される。 CryjIIの抗原性断片は、例えば、かかるペプチドをコードするこの発明の対応する核酸配列の断片から組換えにより生成されたペプチドをスクリーニングするか、又は、当業者に公知の技術を用いて化学的に合成されたペプチドをスクリーニングするか、又は、このアレルゲンの化学的開裂により生成したペプチドをスクリーニングすることによって得ることが出来る。このアレルゲンは、これらのペプチドの重複を有しない所望の長さの断片に自由に分割することが出来、或は好ましくはこれらのペプチドの重複を有しない所望の長さの断片に自由に分割することが出来、或は好ましくは所望の長さの重複する断片に分割することが出来る。これらの断片を試験して、それらの抗原性（例えば、実施例７で論ずるような、断片のＴ細胞増殖等の免疫応答を誘導する能力）を測定する。抗原性断片は又、Hill等の論文、Journal of Immunology，147:184-197（1991 ）により論じられたようなアルゴリズムを用いても予想し得る。Hill等により論じられたアルゴリズム等のＴ細胞活性を導出するペプチドを予想するためのアルゴリズムは、蛋白質配列に基いており、そこでは、その配列内のあるパターンはＭＨＣに結合しそうでありそれ故にＴ細胞エピトープを含み得る。実施例７で論じるCryjIIA及びCryjIIB等のアルゴリズムにより予想されたペプチドを、実施例７で論じる様にして組換え又は合成により生成してＴ細胞活性について試験することが出来る。もし杉花粉アレルゲン例えばCryjIIの断片を治療目的に利用すべきであるならば、刺激（即ち、増殖又はリンホカイン分泌）等のＴ細胞応答を導出することが出来及び／又はＴ細胞アネルギーを誘導することの出来る杉花粉アレルゲンの断片は特に望ましく、最小ＩｇＥ刺激活性を有する杉花粉の断片も又望ましい。更に、治療目的のために、精製杉花粉アレルゲン例えばCryjII及びそれらの断片は、好ましくは、杉花粉に特異的なＩｇＥに結合せず、或は天然の精製杉花粉アレルゲンがかかるＩｇＥに結合する程度より実質的に僅かしかかかるＩｇＥに結合しない。もし精製杉花粉アレルゲン又はその断片がＩｇＥに結合するならば、かかる結合がマスト細胞又は好塩基球からのメディエーター（例えば、ヒスタミン）の放出を生じないことが望ましい。最小ＩｇＥ刺激活性は、天然のCryjII蛋白質により刺激されるＩｇＥ生成の量より少ないＩｇＥ刺激活性のことをいう。Ｔ細胞刺激活性を有し、従って、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む本発明の単離した抗原性断片又はペプチドは、特に望ましい。Ｔ細胞エピトープは、アレルギーの臨床症状の原因と成る蛋白質アレルゲンに対する免疫応答の開始及び持続に関与すると考えられている。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上の適当なＨＬＡ分子に結合して関連Ｔ細胞サブポピュレーションを刺激することによりヘルパーＴ細胞のレベルで初期事象の引き金を引くと考えられる。これらの事象は、Ｔ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所的炎症反応、追加の免疫細胞のその部位への補充及び抗体産生へ導くＢ細胞カスケードの活性化へと導く。これらの抗体の１つのイソ型であるＩｇＥは、アレルギー症状の発達に基本的に重要であり、その産生は事象のカスケードの初期に、ヘルパーＴ細胞のレベルで、分泌されたリンホカインの性質により影響を受ける。エピトープは、レセプターによる認識の基本要素又は最小単位であり（特に、免疫グロブリン、組織適合抗原及びＴ細胞レセプター）、このエピトープはレセプター認識に必須のアミノ酸を含んでいる。エピトープ特にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を真似るアミノ酸配列及び蛋白質アレルゲンに対するアレルギー応答を調節するアミノ酸配列（Cryj IIに対するアレルギー応答を下方制御し得るものを含む）は、この発明の範囲内にある。実施例７で論じるように、杉花粉アレルゲンに感受性の個人（即ち、杉花粉アレルゲンに対するＩｇＥ媒介の免疫応答を有する個人）から得たＴ細胞をアレルゲンから誘導したペプチドと共に培養し、このペプチドへの応答においてＴ細胞の増殖が起きるかどうかを、例えばトリチウム化チミジンの細胞への取り込みによる測定により測定することによって、ヒトＴ細胞剌激活性を試験することが出来る。ペプチドに対するＴ細胞による応答についての刺激インデックスを、ペプチドに対する応答における最大ＣＰＭを対照のＣＰＭで除したものとして計算することが出来る。バックグラウンドレベルの２倍以上の刺激インデックス（Ｓ．Ｉ．）を「陽性」と考える。陽性結果を用いて、試験した各ペプチドに対する平均刺激インデックスを計算する。この発明の好適ペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み且つ２．０以上の平均Ｔ細胞剌激インデックスを有する。２．０以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するペプチドは、治療剤として有用であると考えられる。図１７に示すように、CryjIIペプチドのCryjIIA及びC ryjIIBは、少なくとも２の平均刺激インデックスを有し、それ故に、予想されるように、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。杉花粉からの精製蛋白質アレルゲン又はそれらの好適な抗原性断片は、杉花粉感受性の個人又は杉花粉アレルゲンと交差反応性のアレルゲンに対してアレルギー性の個人に投与した場合、その個人の杉花粉若しくはかかる交差反応性のアレルゲンに対するアレルギー応答を調節し、好ましくは、その個人のそのアレルゲンに対するＢ細胞応答、Ｔ細胞応答又はＢ細胞及びＴ細胞応答の両者を調節することが出来る。ここで用いる場合、杉花粉アレルゲンに感受性の個人のアレルギー応答の調節は、標準臨床手順により測定したときに、アレルゲンに対する非応答性又は症状の減少として定義することが出来る（例えば、Varney等、British Medical Journal，302:265-269（1990）を参照されたい）（杉花粉誘発性の喘息症状の減少を含む）。ここでいう場合、症状の減少は、個人がこの発明のペプチド若しくは蛋白質を用いる治療管理を完了した後でのアレルゲンに対する任意のアレルギー応答の減少を含む。この減少は、主観的なものであって良い（即ち、患者がアレルゲンの存在下で一層快適に感じればよい）。症状の減少は又、公知の標準皮膚試験を用いて臨床的に測定することも出来る。精製したCryjII蛋白質又はその断片を、好ましくは、Tamura等（1986）Microb iol.Immunol.30:883-896又は米国特許第４，９３９，２３９号に開示されたマウスモデル等の杉花粉の哺乳動物モデルにて、又はChiba等（1990）Int.Arch.Alle rgy Immunol.93:83-88に開示された霊長類モデルにて試験する。蛋白質又はその断片に対するＩｇＥ結合についての初期スクリーニングは、実験動物又はヒトのボランティアに対するスクラッチ試験又は皮内皮膚試験によって、又はＲＡＳＴ（放射アレルゲン吸着試験）、ＲＡＳＴ阻害、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又はヒスタミン放出にて行なうことが出来る。アレルギーの個人を、本発明の精製した蛋白質アレルゲン又は本発明の抗原性断片（少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、蛋白質アレルゲンから誘導される）にさらすと、適当なＴ細胞サブポピュレーションを寛容化し又は免疫性減少させて、それらを蛋白質アレルゲンに対して非応答性にし且つこのようにさらされても免疫応答の刺激に関与しないようにすることが出来る。更に、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むこの発明の蛋白質アレルゲン又は本発明の抗原性断片の投与は、天然の蛋白質アレルゲン又はその部分にさらすことと比較してリンホカイン分泌プロフィルを調節することが出来る（例えば、ＩＬ−４の減少及び／又はＩＬ−２の増加を生じる）。更に、かかる抗原性断片又は蛋白質アレルゲンにさらすことは、通常そのアレルゲンに対する応答に関与するＴ細胞サブポピュレーションに影響を与えて、それらのＴ細胞が通常そのアレルゲンにさらされる部位（例えば、鼻粘膜、皮膚及び肺）から離れて治療用の断片又は蛋白質アレルゲンの投与部位に向かうようにすることが出来る。このＴ細胞サブポピュレーションの再分配は、アレルゲンに通常さらされる部位において通常の免疫応答を刺激する患者の免疫系の能力を改善し又は減少させ、アレルギー症状の減少を生じる。単離したCryjII蛋白質及びそれらから導かれる断片又は部分を、杉花粉アレルゲン又は交差反応性蛋白質アレルゲンに対するアレルギー反応を診断し、治療し及び予防する方法において用いることが出来る。従って、本発明は、単離した杉花粉アレルゲンCryjII又はその少なくとも１断片（CryjII又はその少なくとも１断片を発現するようにトランスフォームした宿主細胞にて生成したもの）及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療用組成物を提供する。この発明の治療用組成物は又、合成により調製したCryjII又はその少なくとも１断片及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含んでもよい。脱感作されるべき個人への本発明の治療用組成物の投与は、公知技術を用いて行なうことが出来る。CryjII、JunvI若しくはJunsI蛋白質又はそれらの少なくとも１断片を例えば適当な希釈剤、キャリアー及び／又はアジュバントと組合せて個人に投与することが出来る。製薬上許容し得る希釈剤は塩溶液及び緩衝剤水溶液を含む。製薬上許容し得るキャリアーは、ポリエチレングリコール（Wie等（1981）Int.Arch. Allergy Appl.Immunol.64:84-99）及びリポソーム（Strejan等（1984）J.Neuroi mmunol 7:27）を含む。Ｔ細胞アネルギーを誘導する目的には、この治療用組成物を、好ましくは、非免疫原形態（例えば、アジュバントを含まない）で投与する。かかる組成物は、一般に、注射（皮下、静脈等）、経口投与、吸入、経皮適用又は直腸投与により投与する。この発明の治療用組成物を、杉花粉感受性の個人に、その個人の杉花粉に対する感受性を減じる（即ち、アレルギー応答を減じる）のに十分な投与量及び期間で投与する。この治療用組成物の有効量は、その個人の杉花粉に対する感受性の程度、年齢、性別及び体重、並びにCryjII蛋白質又はその断片がその個人における抗原応答を誘出する能力等の因子によって変化する。 CryjIIｃＤＮＡ（又は該ｃＤＮＡが転写されたｍＲＮＡ）又はその一部を用いて、任意の種類又は型の植物において類似の配列を同定することが出来、従って、CryjIIｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はそれらの部分にハイブリダイズするだけ十分な相同性を有する配列（例えば、Cupressus sempervirens，Juniperus sabi noides等のアレルゲンからのＤＮＡ）を低緊縮条件下で同定し又は「引き出す」ことが出来る。それらの十分な相同性（一般に４０％を超える）を有する配列を、ここに記載した方法を用いて、更なる評価のために選択することが出来る。或は、高緊縮条件を用いることが出来る。この方法では、本発明のＤＮＡを用いて、他の型の植物、好ましくは関連する科、属又は種（例えば、Juniperus又はCup ressus）において、杉花粉アレルゲンCryjIIのアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を同定することが出来、それ故、他の種におけるアレルゲンを同定することが出来る。従って、本発明は、CryjIIを含むだけでなく、本発明のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる他のアレルゲンをも含む。この発明は、更に、以前に同定されていない単離したアレルゲン性蛋白質又はそれらの断片を含み、それらは、抗体交差反応（単離したアレルゲン性蛋白質又はそれらの断片はこの発明の蛋白質及びペプチドに特異的な抗体に結合することが出来る）により、又はＴ細胞交差反応（単離したアレルゲン性蛋白質又はそれらの断片はこの発明の蛋白質及びペプチドに特異的なＴ細胞を刺激することが出来る）等により、免疫的にCryjII又はその断片と関係している。本発明のｃＤＮＡによりコードされる蛋白質又はペプチドを、例えば、「精製した」アレルゲンとして用いることが出来る。かかる精製したアレルゲンは、杉花粉症の診断及び治療のための鍵となる試薬であるアレルゲン抽出物の標準化において有用である。更に、CryjIIの核酸配列に基づくペプチドを用いることにより、抗ペプチド抗体又はモノクローナル抗体を、標準的方法を用いて作成することが出来る。これらの血清又はモノクローナル抗体を用いてアレルゲン抽出物を標準化することが出来る。本発明のペプチド及び蛋白質の利用により、首尾一貫した、十分に規定された組成及び生物学的活性を有する製剤を作成して治療目的のために投与することが出来る（例えば、杉感受性の個人のかかる木々の花粉に対するアレルギー応答を調節する等）。かかるペプチド又は蛋白質の投与は、例えば、CryjIIアレルゲンに対するＢ細胞応答、CryjIIアレルゲンに対するＴ細胞応答又はＢ及びＴ細胞の両方の応答を調節することが出来る。精製したペプチドは又、Cryptomeria japo nicaアレルギーの免疫療法の機構を研究し及び免疫療法において有用な改変した誘導体又はアナログをデザインするために用いることも出来る。他の人々の仕事は、一般に、アレルゲンの高投与量が最良の結果（即ち、最大の症状軽快）を生じるということを示した。しかしながら、多くの人々は、アレルゲンに対するアレルギー反応のために、アレルゲンの大量投与に耐えられない。対応する天然のアレルゲンと同じかそれより増大された治療特性を有するが減少した副作用（特に、アナフィラキシー反応）を有する改変したペプチド又は改変したアレルゲンが生成されるような方法で、天然のアレルゲンの改変をデザインすることが出来る。これらは、例えば、本発明の蛋白質又はペプチド（例えば、CryjIIのアミノ酸配列の全部又は一部を有するもの）、又は改変した蛋白質若しくはペプチド、又は蛋白質若しくはペプチドのアナログであってよい。溶解度を増し、治療若しくは予防効果又は安定性（例えば、生体外での貯蔵寿命及びイン・ビボでの蛋白質分解に対する抵抗性）を増大させる等の目的で、この発明の蛋白質又はペプチドの構造を改変することは可能である。免疫原性を改変し及び／又はアレルゲン性を減じるために、アミノ酸置換、欠失又は付加等によってアミノ酸配列が変化した、或は、同じ目的のために成分が加えられた、改変した蛋白質又はペプチドを生成することが出来る。例えば、Ｔ細胞エピトープ機能に必須のアミノ酸残基を公知の技術（例えば、各残基の置換及びＴ細胞反応性の有無の測定）を用いて測定することが出来る。例えば、ペプチドを、強い増殖応答の誘導能力を伴わないでＴ細胞アネルギーを誘導し及びＭＨＣ蛋白質に結合する能力、並びに免疫原形態での投与時の増殖応答を維持するように改変することが出来る。この場合には、Ｔ細胞レセプターに対する重大な結合残基を、公知の技術（例えば、各残基の置換及びＴ細胞反応性の存否の測定）を用いて決定することが出来る。Ｔ細胞レセプターとの相互作用に必須であることが示されたそれらの残基を、必須アミノ酸を他のもの好ましくはその存在がＴ細胞反応性を増大し、関連ＭＨＣへの結合を除去はしないが減少させる類似のアミノ酸残基で置換（保存的置換）することによって改変することが出来る。更に、この発明のペプチドを、ＭＨＣ蛋白質複合体との相互作用に必須であるべきことが示されたアミノ酸を他のもの好ましくはその存在がＴ細胞活性を増大し、除去はしないが減少させ又は該活性に影響しないことが示された類似のアミノ酸残基と置換（保存的置換）することによって改変することが出来る。更に、ＭＨＣ蛋白質複合体との相互作用に必須でないがＭＨＣ蛋白質複合体にやはり結合するアミノ酸残基を、その取り込みがＴ細胞反応性を増大し、影響せず又は除去はしないが減少させる他のアミノ酸で置換することによって改変することが出来る。非必須アミノ酸についての好適なアミノ酸置換は、アラニン、グルタミン酸又はメチルアミノ酸での置換を含む（但し、それらに限定はされない）。蛋白質又はペプチドの改変の他の例は、システイン残基を好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン又はグルタミン酸で置換してジスルフィド結合を介する２量体形成を最少化することである。この発明のペプチドの改変の他の例は、このペプチドのアミノ酸側鎖の化学的改変又は環化である。安定性及び／又は反応性を増大するために、この発明の蛋白質又はペプチドを改変して、その蛋白質アレルゲンのアミノ酸配列に、自然の対立遺伝子変化から生じる１つ以上の多形を取り込むことも出来る。更に、Ｄアミノ酸、非天然アミノ酸又は非アミノ酸アナログを代用とし又は加えて、この発明の範囲内の改変した蛋白質又はペプチドを生成することが出来る。更に、本発明の蛋白質又はペプチドを、A.Sehonと共同研究者（Wie等、前出）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて改変してＰＥＧと結合した蛋白質又はペプチドを生成することが出来る。更に、ＰＥＧを、この発明の蛋白質又はペプチドの化学合成中に加えることが出来る。蛋白質若しくはペプチド又はその部分の改変は又、還元／アルキル化（Tarr、Methods of Protein Microcharacter-ization，J.E.Silver編、Hum ana Press，Clifton，NJ，155-194頁（1986）中）；アシル化（Tarr、前出）；適当なキャリアーへの化学カップリング（Mishell及びShiigi編、Selected Meth ods in Cellu1ar Immunology，WH Freeman，San Francisco，CA（1980）；米国特許第４，９３９，２３９号）；又は温和なホルマリン処理（Marsh International Archiveｓ of Allｅrgy and Applied Immunology，41:1 99-215（1971））をも含むことが出来る。この発明の蛋白質及びペプチドの精製を容易にし且つ溶解度を潜在的に増大させるために、そのペプチドの主鎖にレポーター基を加えることが出来る。例えば、ポリヒスチジンをペプチドに加えてそのペプチドを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーで精製することが出来る（Hochuli，E.等、Bio/Techn olgy，6:1321-1325（1988））。更に、特異的なエンドプロテアーゼ開裂部位を、所望であれば、レポーター基とペプチドのアミノ酸配列との間に導入して無関係の配列を含まないペプチドの単離を促進することが出来る。蛋白質抗原に対して個人を上首尾に脱感作するためには、蛋白質若しくはペプチドの溶解度を、そのペプチドに官能基を付加することにより又は疎水性Ｔ細胞エピトープ若しくはこれらのペプチド中の疎水性エピトープを含む領域若しくはこの蛋白質若しくはペプチドの疎水性領域を含まないことによって、増大させることが必要であろう。ペプチド内のＴ細胞エピトープの適当な抗原プロセッシングを潜在的に補助するために、それぞれ少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む領域間で、標準的プロテアーセ感受性部位を組換えにより又は合成によって工作することが出来る。例えば、ＫＫ若しくはＲＲ等の荷電したアミノ酸の対を、ペプチドの組換え構築中にペプチド内の領域間に導入することが出来る。その結果のペプチドを、カテプシン及び／又は他のトリプシン様酵素開裂に対して感受性にして１つ以上のＴ細胞エピトープを含むペプチドの部分を生成することが出来る。更に、かかる荷電アミノ酸残基は、ペプチドの溶解度の増大を生じさせることが出来る。この発明のペプチド若しくは蛋白質（例えば、CryjII又はその断片）をコードするＤＮＡの位置指定突然変異導入法を利用して、公知の方法によってこのペプチド若しくは蛋白質の構造を改変することが出来る。かかる方法は、その他の方法の内で、縮退したオリゴヌクレオチド（Ho等、Gene，77:51-59（1989））を用いるか又は全合成の突然変異遺伝子（Hostomsky，Z.等、Biochem.Biophys，Res. Comm.，161:1056-1063（1989））を用いるＰＣＲを含む。細菌での発現を促進するために、前述の方法を他の手順と共に用いて、この発明の蛋白質若しくはペプチドをコードするＤＮＡ構築物中の真核生物用コドンを、E．coli、酵母、哺乳動物細胞又は他の真核生物細胞中で優先的に利用されているものに変えることが出来る。現在利用可能な構造的情報を用いて、杉花粉感受性の個人に十分量で投与したときにその個人の杉花粉に対するアレルギー応答を調節するCryjIIペプチドをデザインすることが出来る。これは、例えば、CryjIIの構造を調べ、杉花粉感受性の個人におけるＢ細胞及び／又はＴ細胞応答に影響を与える能力について試験すべきペプチドを（発現系により、合成により若しくはその他の方法により）生成し及びそれらの細胞により認識されるエピトープを含む適当なペプチドを選択することによって行なうことが出来る。杉花粉アレルゲンが杉花粉感受性の個人にアレルギー反応を誘発する能力をブロックし若しくは阻止することの出来る薬剤若しくは薬物をデザインすることも現在可能である。かかる薬剤は、例えば、それらが関連する抗CryjIIＩｇＥに結合し、それ故、ＩｇＥ−アレルゲン結合及びその後のマスト細胞脱顆粒を阻止するような方法でデザインすることが出来る。或は、かかる薬剤は、免疫系の細胞性成分に結合することが出来、Cryptomeria japonica花粉アレルゲンに対するアレルギー応答の抑制若しくは脱感作を生じる。これの非制限的な例は、杉花粉に対するアレルギー応答を抑制する本発明のｃＤＮＡ／蛋白質構造に基づく、適当なＢ及びＴ細胞エピトープペプチド又はそれらの改変物の利用である。これは、杉花粉感受性の個人からの血液成分を用いるイン・ビトロ研究においてＢ及びＴ細胞機能に影響を与えるＢ及びＴ細胞エピトープペプチドの構造を限定することにより行なうことが出来る。本発明の蛋白質、ペプチド又は抗体を、杉花粉症を検出し及び診断するために利用することも出来る。例えば、これは、杉花粉に対する感受性を評価すべき個人から得た血液若しくは血液生成物を、単離した抗原性ペプチド若しくはCryjII のペプチド、又は単離したCryjII蛋白質と、血液成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）とペプチド若しくは蛋白質との結合に適した条件下で合わせて、かかる結合が起きる程度を測定することによって行なうことが出来る。本発明の蛋白質、ペプチド又は抗体を利用し得る他のアレルギー疾患の診断方法は、放射アレルゴソルベント試験（ＲＡＳＴ）、ペーパー放射免疫ソルベント試験（ＰＲＩＳＴ）、酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫−放射分析アッセイ（ＩＲＭＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ヒスタミン放出アッセイ及びＩｇＥ免疫ブロットを含む。他の診断試験において、個人における少なくとも１つの蛋白質アレルゲンCryj IIに特異的なＩｇＥの存在及びそれらの個人のＴ細胞のCryjII蛋白質アレルゲンのＴ細胞エピトープに応答する能力は、それらの個人に即時型過敏症試験及び遅延型過敏症試験を施すことによって測定することが出来る。これらの個人に、Cr yjII蛋白質アレルゲン若しくはその一部分又はCryjII蛋白質若しくはその一部分の改変型（各々は、このアレルゲンに特異的なＩｇＥに結合する）を用いて即時型過敏症試験（例えば、Immunology（1985）Roitt，I.M.，Male，D.K.（編），C .V.Mosby Co.，Gower Medical Publishing，London，NY，19.2-19.18頁；22.1-2 2.10頁を参照）を施した。これらの同じ患者に、即時型過敏症試験を施す前、施すと同時、又は施した後に、遅延型過敏症試験を施した。勿論、即時型過敏症試験を遅延型過敏症試験の前に施す場合は、遅延型過敏症試験は特異的な即時型過敏症反応を示した個人に行なわれる。遅延型過敏症試験は、蛋白質アレルゲン若しくはその一部分の改変型又は蛋白質アレルゲンから導かれたレコンビトープペプチドを利用し、これらの各々は、ヒトＴ細胞刺激活性を有するが、このアレルゲンに感受性の個人集団の相当のパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）においてこのアレルゲンに特異的なＩｇＥに結合しない。上記の診断試験の結果に基いて、特異的な即時型過敏症反応及び遅延型過敏症反応の両方を有することが見出された個人は、治療上有効な量の治療用組成物を投与するための適当な候補である。この治療用組成物は、改変型の蛋白質若しくはその一部分、組換えにより生成した蛋白質アレルゲン、又はレコンビトープペプチド（各々、遅延型過敏症試験で用いられる）及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む。本発明は又、CryjIIのすべての若しくは少なくとも１つの断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含む宿主細胞をCryjII若しくは少なくともその１断片の発現に適した条件下で培養することを含むCryjII若しくはその断片を生成する方法をも提供する。次いで、発現された生成物を公知技術を用いて回収する。或は、CryjII若しくはその断片を、公知の機械的若しくは化学的技術を用いて合成することが出来る。この発明の任意の具体例において用いたＤＮＡは、ここに記載したようにして得られたｃＤＮＡであるか、或は、ここに表示した配列の全部若しくは一部を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド配列又はそれらの機能的等価物であってよい。かかるオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知技術を用いて、化学的若しくは酵素的に生成することが出来る。オリゴヌクレオチド配列の機能的等価物は、１）CryjIIの配列（又は対応する配列部分）又はその断片がハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列、又は２）CryjIIに相補的な配列（又は対応する配列部分）及び／又は３）CryjIIの配列（又は対応する配列部分）によりコードされる生成物と同じ機能的特性を有する生成物（例えば、ポリペプチド又はペプチド）をコードする配列であるものである。機能的等価物が一方の基準を満たさなければならないか両方の基準を満たさなければならないかは、その利用に依る（例えば、もしそれがオリゴプローブとしてのみ用いられるならは、それは第１若しくは第２の基準を満たしさえすれば良く、もしそれがCryjIIアレルゲンを生成するために用いられるならば、第３の基準さえ満たせば良い）。この発明を、更に、下記の非制限的実施例により説明する。実施例１杉花粉アレルゲン（CryjII）の精製以下の杉花粉からの天然アレルゲンCryjIIの精製は、以前に刊行された報告（ Yasueda等、J.Allergy C1in.Immunol.71:77，1983；Sukaguchi等、Allergy，45: 309（1990））を改変したものである。日本国から得た１００ｇの杉花粉（ワシントン、Spokane在、HollisterStir）を１Ｌのジエチルエーテル中で３回脱脂し、濾過後に花粉を集めてエーテルを真空中で乾燥させた。脱脂した花粉を、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．２ＭＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤（２μｇ／ｍｌ（終濃度）大豆トリプシン阻害剤、１ μｇ／ｍｌ（終濃度）ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ（終濃度）ペプスタチン及び０．１７ｍｇ／ｍｌ（終濃度）フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含む２Ｌの抽出用緩衝液中で４℃で一晩抽出した。不溶性物質を１．２Ｌの抽出用緩衝液で４℃で一晩再抽出し、両抽出物を合わせて、抽出用緩衝液で平衡化したWhat man DE-52セルロース（乾重量２００ｇ）を用いてバッチ式吸収により色素脱失した。色素脱失した物質を、次いで、８０％飽和（４℃）の硫安沈澱により分画して、低分子量の物質の多くを除去した。その結果のペレットを、０．４Ｌのプロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に再懸濁させ、同緩衝液に対して十分に透析した。この試料を、更に、下記の２つの方法の何れか１つによる精製にかけた。方法Ａこの試料を、４℃でプロテアーゼ阻害剤を加えた５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した１００ｍＬのＤＥＡＥセルロースカラム（Whatman DE -52）に加えた。ＤＥＡＥセルロースカラムからの未結合物質（塩基性蛋白質）を、次いで、プロテアーゼ阻害剤を加えた４℃の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した５０ｍｌのカチオン交換カラム（Whatman CM-52）に加えた。０−０．３ＭＮａＣｌの直線的勾配を用いてこれらの蛋白質を溶出させた。初期画分はCryjIに富み、他方後期画分はCryjIIに富んでいた。CryjIIを含む画分をプールし、次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）にてｌｍＬのMono S HR5/5カラム（ニュージャージー、Pischatway在、Pharmacia）に加えて蛋白質を室温でＮａＣｌの直線的勾配を用いて溶出させた。残留CryjIは０．２ＭＮａＣｌで溶出し、CryjIIは０．３〜０．４ＭＮａＣｌで溶出した。CryjIIのピークをプールし、凍結乾燥により２倍に濃縮してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。この試料を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び０．１５ＭＮａＣｌにて、ＦＰＬＣ Superdex 7516/60カラム（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmaci a）に、室温で、３０ｍｌ／分の流量で加えた。精製CryjII を３５〜３０ｋＤ領域で回収した。CryjIIは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で分析した際に、非還元条件下で、２つのブロードなバンドとしてCryjIより低く移動した（図１ａ）が、還元条件下では、両バンドとも上方へシフトしてCryjIとして移動した（図１ｂ）。この高度に精製したCryjIIは、CryjIに結合することが示されたＭＡｂ CBF2を用いるウエスタンブロット及びＮ末端蛋白質配列決定により検出したように、依然として少量（〜５％）のCryjIを含んだ。このCryjI I調製物を用いて、後述のように、CryjIIの一次蛋白質配列を生成させた。方法Ｂ硫安沈澱から透析した試料を、プロテアーセ阻害剤を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４℃で平衡化した５．０ｍｌのQ-Sepharose Econapacアニオン交換カートリッジ（カリフォルニア、Richmond在、BioRad）に１ｍｌ／分で加えた。溶出を、０．５ＭＮａＣｌを含む上記の緩衝液を用いて行なった。次いで、塩基性の未結合物質を、プロテアーセ阻害剤を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した５．０ｍｌのCM-Sepharose Econopacカチオン交換カートリッジ（カリフォルニア、Richmond在、BioRad）に加えた。塩基性蛋白質を、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．３ＭＮａＣｌまでの直線的勾配を用いて４℃で１ｍｌ／分にて溶出した。CryjIIに富むピークを勾配の後期にて集めて更にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。ＦＰＬＣゲル濾過を、３２０ｍＬのSuperdex 7526/60（ニュージャージー、Piscataway 在、Pharmacia）カラムを用いて、０．１５ＭＮａＣｌの存在下で２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）にて、０．５ｍｌ／分で行なった。CryjIIを殆ど含む主要ピークは、１６０〜１９０ｍｌにて溶出した。次に、夾雑CryjIを、１０ｍｌＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した１．０ｍｌ Mono S 5/5（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）カチオン交換カラムを用いるＦＰＬＣにより除去した。０〜１ＭＮａＣｌの段階的勾配を、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ及び１Ｍ塩濃度をイソクラティックに維持することにより利用した。複数のピーク（最大９ピーク）を得て（図２）、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）により分析した（図３）。報告されたｐＩ８．６〜８．９（Yasued a等、J．Allergy Clin．Immunol.，17巻（1983））を有するCryjIは、初期のピークに溶出し、約４０ｋＤの分子量を示した。CryjIIは、２本のバンドとして均質にまで精製され（図３）、後期の複数のピークに溶出されたが、これは、イソ型の存在を示唆している。生化学的に精製したCryjIに対して高められたマウスモノクローナル抗体8Bll ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡ分析は、これらの精製CryjI I調製物中にCryjIの存在しないことを確実にした。この精製CryjIIをヒトＩｇＥ反応性の研究（実施例６）において用いた。CryjIIの物理的特性 CryjIIの物理的特性を下記のように研究し、要約した。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下では、CryjIIは、３４０００〜３２０００に及ぶ分子量の２本のバンドからなる。両バンドの分子量は、還元条件下では、約３８〜３６ｋＤまで高分子量側へシフトする（図１ｂ）。このＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でのシフトも他者（Sakaguchi等、Allergy 45:309-312（1990））により観察された。これらの結果は、恐らく分子内ジスルフィド結合がこの蛋白質内に存在することを示唆し、それは、クローン化CryjIIがヌクレオチド配列から演繹される２０個のシステインを含むという現在の発見（実施例３）が支持している。ＩＥＦゲルから評価したCryjIIのｐＩは約１０である。この精製CryjIIは、何人かの患者のヒトＩｇＥと結合する。これらのCryjIIの２つの分子量のバンドを、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、ＰＶＤＦ膜（カリフォルニア、Foster City在、Applied Bi osystems）上にエレクトロブロットした。そのブロットを、クーマシーブリリアントブルーで染色し、切り取ってＮ末端アミノ酸配列決定にかけた（実施例２）。それらの結果は、低分子量のバンドが最初の５アミノ酸を失っていることを除いては、これらの分子量の大きいバンド及び小さいバンドが同じＮ末端配列を有することを示した。ｃＤＮＡの配列に基いて評価した大きい方のバンドの分子量は約５２，０００であり、これは、還元剤の存在及び不在においてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで評価した分子量より有意に大きい。それは又、ゲル濾過及び予備的質量分析から得られたものよりも大きい。この違いを説明する幾つかの可能性がある。１つの可能性は、Cr yjII蛋白質がプロセッシングを受けるということである。この蛋白質のＮ末端及びＣ末端が開裂されるということはあり得ることである。このプロセッシングが細胞中で起こるのか或は、４種の異なるプロテアーセ阻害剤を殆どの精製工程で加えたにもかかわらず精製工程の間の蛋白質加水分解によるものであるのかは現時点では不明である。それにもかかわらず、精製CryjIIから得られた２つのＮ末端配列（実施例２）は又、Sakaguchi等（Allergy，45:309-312（1990））により公表されたＮ末端配列（１０アミノ酸）を含み、これは、恐らくCryjIIのＮ末端が加水分解されていることを示唆している。Sakaguchi等（前出）は彼らの精製において何らプロテアーゼ阻害剤を用いなかったので、高度の加水分解が起きたのであろう。これは、Sakaguchi等が得たＮ末端アミノ酸配列が何故に実施例２で論じるＮ末端配列の下流であったのかを説明することが出来よう。天然CryjII又は組換えCryjIIを精製するために用い得る他のアプローチは、イムノアフィニティークロマトグラフィーである。この技術は、モノクローナル抗体と抗原との間の相互作用の特異性による非常に選択的な蛋白質の精製を提供する。マウスポリクローナル及びモノクローナル抗体を、精製したCryjIIに対して生成させる。これらの抗体を、アレルゲンCryjIIの精製、特性決定、分析及び診断に用いる。実施例２精製CryjIIの蛋白質配列決定 CryjII蛋白質を実施例１におけるようにして単離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで示した二重バンド（図１ａ）をProBlott（カリフォルニア、Foster City在、Applied Bios ystems）上へエレクトロブロットした。配列決定をBeckman/Porton Microsequen cer（モデルLF3000、カリフォルニア、Carlsbad在、Beckman Instruments）、プログラマブルソルベントモジュール（カリフォルニア、Carlsbad在、Beckman Instuments，Sys tem Gold Model 126）及びＰＴＨ−アミノ酸検出用ダイオードアレイデテクターモジュール（カリフォルニア、Carlsbad在、Beckman Instruments，Beckman System Gol d Model 168）を製造者のマニュアルに従って用いて行なった。上方の二重バンドの単一のＮ末端配列分析及び下方の二重バンドの複数のＮ末端配列分析は、両バンドが「ロング」及び「ショート」と呼ばれる２つのＮ末端を含むことを示した。下方の二重バンドは、約３．３ピコモルのロング型と８．３ピコモルのショート型を含んだ。この収量の差異は、各シーケンサーサイクルにおける計量による配列割り当てをするのに十分であった。上方の二重バンドは、約８．３ピコモルの両配列を含んだ。現われたロング配列は、ＮＨ₂−ＲＫＶＥＨＳＲＨＤＡＩＮＩＦＮＶＥＫＹＧＡＶＧＤＧＫＨ−ＤＣＴＥＡＦＳＴＡＷ（Ｑ）（）（）（）ＫＮＰ（） −ＣＯＯＨ（配列番号：４）（ここに、（Ｑ）は、３８位のグルタミンの仮の同定を示し、（）は、３９〜４１及び４５位の未知の残基を示す）であった。現われた「ショート」配列は、ＮＨ₂−ＳＲＨＤＡＩＮＩＦＮＶＥＫＹＧＡＶＧＤＧＫＨＤＣＴＥＡＦＳＴＡＷＳ−ＣＯＯＨ（配列番号：５）であった。従って、ロングCryjII配列は、ショート型よりも５つの更なるアミノ末端残基を有し、ショート型の配列は、ロング型のそれと正確に一致した。更に、CryjIIのロング及びショート両型は、以前にCryjIIについて記載された（Sakaguchi等、1990、前出）１０アミノ酸ＮＨ₂−ＡＩＮＩＦＮＶＥＫＹ−ＣＯＯＨ（配列番号：６）を含んだ。以前に公表された１０アミノ酸（Sakaguchi等、1990、前出）は上記のロング型のアミノ酸１０〜１９に対応する。実施例３杉花粉及び雄蘂を有する球果からのＲＮＡの抽出及びCryjIIのクローニング Arnolｄ Arboretum（マサチューセッツ、Boston）にある１本のCryptomeria japonica （杉）の木から採集した新鮮な花粉及び雄蘂を有する球果試料を直ちにドライアイス上で凍結した。ＲＮＡを５００ｍｇの各試料から、本質的にFrankis及びMascarhenas、（1980）Ann.Bot.45:5 95-599により記載された様にして調製した。これらの試料をドライアイス上で乳鉢と乳棒ですり漬し、０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で一晩処理した０．２ＭＮａＣｌ、１ｍｌＥＤＴＡ、１％ＳＤＳを有する５ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）に懸濁させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１で混合）で５回抽出した後に、ＲＮＡを水相から、０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２容のエタノールで沈殿させた。遠心分離によりペレットを回収し、２ｍｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁させ、６５℃に５分間加熱した。２ｍｌの４Ｍ塩化リチウムを沈澱に加えて、ＲＮＡを一晩Ｏ ℃でインキュベートした。遠心分離によりＲＮＡペレットを回収し、１ｍｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁させ、再び３Ｍ酢酸ナトリウム及びエタノールでドライアイス上で１時間沈澱させた。最後のペレットを７０％エタノールで洗い、空気乾燥させ、１００μｌのＤＥＰＣ処理したｄＨ₂Ｏに再懸濁させて−８０℃に貯蔵した。二本鎖ｃＤＮＡを、４μｇ（花粉）及び８μｇ（頭状花序）のＲＮＡから、市販のキット（ｃＤＮＡ合成システムキット、メリーランド、Gaithersburg在、BRL）を用いて合成した。二本鎖ｃＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈澱し、Rafnar等（1991） J.Biol.Chem.266:1229-1236;Frohman等（1990） Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8998-9002;及びRoux等（1990）BioTech.8:48-57の方法に従って、改変アンカードＰＣＲ反応で用いるために、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ウィスコンシン、Madison在、Promega）で鈍端化し、次いで、エタノール沈澱して自己アニールしたＡＴ及びＡＬオリゴヌクレオチドに繋いだ。オリゴヌクレオチドＡＴは、配列（配列番号：１０）5'-GGGTCTAGAGGTACCGTCCGTCCGATCGATCATT-3' （Rafnar等、前出）を有する。オリゴヌクレオチドＡＬは、配列（配列番号：１１）5'-AATGATCGATGCT-3'（Rafnar等、前出）を有する。 CryjIIのアミノ末端をリンカー結合したｃＤＮＡ（２０μｌ反応の２μｌ）からの増幅における最初の試みは、縮退したオリゴヌクレオチドＣＰ−１１及びオリゴヌクレオチドＡＰを用いて行なった。ＣＰ−１１は配列（配列番号：１２）５’−ＡＴＡＣＴＴＣＴＣＩＡＣＧＴＴＧＡＡ−３’を有し、ここに、１位のＡはＧであってもよく、４位のＣはＴでもよく、７位のＣはＴでもよく、１０位のＩは縮退を減らすためのイノシンであり（Knoth等（1988）Nuleic AcidsRes．16 ：10932）、１３位のＧはＡでもよく、そして１６位のＧはＡでもよい。配列（配列番号：１３）５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＣＧ−３’を有するＡＰは、オリゴヌクレオチドＡＴのヌクレオチド１〜２０に対応する。ＣＰ−１１は、実質的にアミノ酸配列ＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｙｒ（配列番号：１４）（図４のアミノ酸５９〜６４）をコードするコード鎖配列に相補的な縮退オリゴヌクレオチド配列であり、これらは、図４に示した以前に公表されたCryjII配列（Sakaguchi等、前出）のカルボキシ末端に対応する。すべてのオリゴヌクレオチドは、アラバマ州、Huntsville在、Research Genetics Inc. により合成された。ポリメラーセ連鎖反応（ＰＣＲ）を、市販のキット（GeneAmp ＤＮア増幅キット、コネチカット、Norwalk在、Perkin Elmer Cetus）を用いて行ない、ｄＮＴＰを含む１０μｌの１０×緩衝液を１００ｐモルの各オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ（２０μｌの第１鎖ｃＤＮＡ反応混合物の３〜５μｌ）、０．５μｌのAm plitaqＤＮＡポリメラーゼ及び蒸留水（１００μｌにする）と混合した。これらの試料を、プログラム可能な温度制御装置（マサチューセッツ、Cambridge在、M J Research，Inc.）を用いて増幅した。増幅の最初の５回は、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のプライマーのテンプレートへのアニーリング及び７２℃ で１分間の鎖延長からなった。増幅の最後の２０回は、上記のとおりの変性、５５℃で１分間のアニーリング及び上記の通りの鎖延長からなった。第一次ＰＣＲ反応を１００ｐモルの各オリゴヌクレオチドＡＰ及びＣＰ−１１を用いて行なった。次いで、この初期増幅の５パーセント（５μｌ）を、各１００ｐモルＡＰ及びのＣＰ−１２を用いる第二次増幅で用いた。ＣＰ−１２は、配列（配列番号：１５）5'-CCTGCAGTACTTCTCIACGTTGAAIAT-3'を有し、ここで１０位のＣはＴでもよく、１３位のＣはＴでもよく、１６及び２５位のＩは上記の種苦諦を減じるためのイノシンであり、１９位のＧはＡでもよく、２２位のＧはＡでもよい。配列（配列番号：１６）5'-CCTGCAG-3'（ＣＰ−１２の塩基１〜７）は、クローニング目的のために加えられたＰｓｔＩ部位を表す。残りの縮退したオリゴヌクレオチド配列は、CryjIのアミノ酸ＩｌｅＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｙｒ（配列番号１７）（図４のアミノ酸５８〜６４）を実質的にコードするコード鎖に相補的である。増幅したＤＮＡを、逐次的なクロロホルム、フェノール及びクロロホルム抽出と、その後の０．５容の７．５Ｍ酢酸アンモニウム及び１．５容のイソプロパノールでのドライアイス上での沈澱によって回収した。沈澱及び７０％エタノールでの洗浄の後に、このＤＮＡを、５０μｌの反応にてＸｂａＩとＰｓｔＩで同時に消化し、沈殿させて容積を１０μｌに減らして調製用２％ＧＴＧ NuSieve低融点ゲル（メイン、Rockport在、FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡ領域を、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）染色により可視化し、取り出して、市販の配列決定用キット（Sequenase kit，オハイオ、Clevela nd在、U.S.Biochemicals）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（ Sanger等（1977）Proc.N atl.Acad Sci.USA74:54463-5476）により配列決定するために、適当に消化したｐＵＣ１９中に繋いだ。すべての生成したクローンを配列決定したが、CryjII配列を含むものは見出されなかった。代わりの２゜ＰＣＲ反応をＡＰ及びネストしたオリゴヌクレオチドＣＰ−２１を用いて行なった。ＣＰ−２１は、配列（配列番号：１８）５’−ＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＩＡＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴ −３’を有し、ここに、１０位のＣはＴでもよく、１３位のＣはＴでもよく、１６位のＩは上記の縮退を減らすためのイノシンであり、１９位のＧはＡでもよく、２２位のＧあＡでもよく、そして２５位のＧはＡ又はＴでもよい。配列（配列番号：１６）５’−ＣＣＴＧＣＡＧ−３’ＣＰ−２１の塩基１〜７）は、クローニング目的のために加えられたＰｓｔＩ部位を表し；残りの縮退したオリゴヌクレオチド配列は、実質的にアミノ酸ＩｌｅＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｙｒ（配列番号：１７）（図４のアミノ酸５８〜６４）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である。第一次ＰＣＲを、上記のように、二本鎖のリンカー結合したｃＤＮＡにおいて、ＣＰ−２３Ｄ及びＡＰを用いても行なって、CryjIIｃＤＮＡの３’末端を増幅することを試みた。第二次ＰＣＲを、第一次反応の５％を用いて、ＣＰ−２４Ｄ及びＡＰを用いて行なった。ＣＰ−２３Ｄ［配列（配列番号：１９）５’−ＧＣＩＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡ−３’（ここに、６位のＴはＣ又はＡでもよく、９位のＴはＣでもよく、１２位のＴはＣ又はＡでもよく、そして１５位のＴはＣでもよい）］は、実質的にアミノ酸配列ＡｌａＩｌｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅＡｓｎ（配列番号：２０）（図４のアミノ酸５５〜６０）をコードするコード鎖配列であり；ＣＰ−２４Ｄ（配列番号：２１）［配列５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＩＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴ−３’（ここに、１４位のＴはＣ又はＡでもよく、１７位のＴはＣでもよく、２０位のＴはＣ又はＡでもよく、２３位のＴはＣでもよく、そして２６位のＴはＣでもよい）］は、配列５’− ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：２２）（ＣＰ−２４の塩基１〜８）を含み、これは、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ部位を表す。ＣＰ− ２４Ｄの残りの縮退オリゴヌクレオチド配列は、実質的にアミノ酸ＡｌａＩｌｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅＡｓｎＶａｌ（配列番号：２３）（図４のアミノ酸５５〜６１）をコードする。再び、複数クローンを配列決定したが、CryjIIと同定されたものはなく、このアプローチは、これ以上追求しなかった。実施例２に記載した新規なCryjII蛋白質配列データの特性表示に基いて、Cryj IIをクローニングするための新規な縮退オリゴヌクレオチドをデザインして合成した。以後言及するすべてのオリゴヌクレオチドは、ABI 394DNA/RNA Synthesiz eｒ（カリフォルニア、Foster City在、Applied Biosystems）にて合成し、NAP-10カラム（スウェーデン国、Uppsala在、Pharmacia）にて、製造者の支持に従って精製した。縮退オリゴヌクレオチドＣＰ−３５をＡＰと共に二本鎖のリンカー結合したｃＤＮＡにおいて、上記のように行なう第一次ＰＣＲ反応において用いた。ＣＰ−３５は、配列（配列番号：２４）５’−ＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＧＴＴＴ −３’［ここに、３位のＴはＣでもよく、６位のＧはＡ、Ｔ又はＣでもよく、９位のＡはＧでもよく、１２位のＡはＧでもよく、１５位のＡはＧでもよく、そして１８位のＴはＣでもよく、この縮退オリゴヌクレオチド配列は、実質的にアミノ酸配列CryjIIのＬｙｓＨｉｓＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｕＡｌａ（配列番号：２５）（図４のアミノ酸７１〜７７）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である］を有する。次いで、この初期増幅の５パーセント（５μｌ）（ＪＣ１３６と呼ぶ）を、ＡＰ及び縮退CryjIIプライマーＣＰ−３６［配列（配列番号：２６）５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＣ−３’（ここに、１１位のＡはＧでもよく、１４位のＡはＧでもよく、１７位のＡはＧでもよく、２０位のＴはＣでもよく、２３位のＧはＡ、Ｔ又はＣでもよく、２６位のＡはＧでもよい）を有する初期にネストしたCryjIIオリゴヌクレオチドプライマー］の各々１００ｐモルと共に第二次増幅において用いた。ヌクレオチド５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：２７）（ＣＰ−３６の塩基１〜８）は、クローニング目的のために加えられたＰｓｔＩ制限部位を表している。ＣＰ−３６の残りの縮退オリゴヌクレオチド配列は、実質的にCryjIIのアミノ酸ＡｓｐＧｌｙＬｙｓＨｉｓＡｓｐＣｙｓＴｈｒ（配列番号：２８）（図４のアミノ酸６９〜７５）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である。優勢な増幅生成物（ＪＣ１３７と呼ぶ）は、ＥｔＢｒ染色２％ＧＴＧアガロースゲルで可視化したところ、約２６５塩基対のＤＮＡバンドであった。増幅したＤＮＡを、逐次的なクロロホルム、フェノール及びクロロホルム抽出と、その後の０．５容の７．５酢酸アンモニウム及び１．５容のイソプロパノールでの−２０℃での沈澱によって回収した。沈澱及び７０％エタノールでの洗浄の後に、このＤＮＡを、１５μｌの反応にてＸｂａＩとＰｓｔＩで同時に消化して調製用２％ＧＴＧ SeaPlaque低融点ゲル（メイン、Rockport在、FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドを、ＥｔＢｒ染色により可視化し、取り出して、市販の配列決定用キット（Sequenase kit，オハイオ、Cleveland在、U.S. Biochemicals）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等（ 1977）Proc.Natl.Acad Sci.USA74:54463-5476）により配列決定するために、適当に消化したｐＵＣ１９中に繋いだ。ｐＵＣ１９ＪＣ１３７ａ、ｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂ及びｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｅと呼ばれるクローンは、Cryj IIのアミノ末端をコードする配列を含むことが見出された。３クローンは、すべて、５’非翻訳領域において異なる長さを有するにもかかわらず、それらの重複領域において同一の配列を有した。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂは、最長のクローンであった。これらのクローンの翻訳された配列は、開示されたCryjIIの１０アミノ酸配列（Sakaguchi等、前出）並びに実施例２に記載したCryjIIアミノ酸配列と完全な同一性を有した。アミノ酸の番号付けは、完全長の蛋白質の配列に基いており、アミノ酸１はCryjIIの間始メチオニン（Ｍｅｔ）に対応する。開始Ｍｅｔの位置は、上流のインフレームの停止コドンの存在により及び周囲ヌクレオチド配列の植物のコンセンサス配列との７８％相同性により支持された（該コンセンサス配列は、Lutcke等（1987）EMBOJ．6:43-48により報告されたように、開始Ｍｅｔを含む）。 CryjII遺伝子の残りをコードするｃＤＮＡを、リンカー結合したｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＣＰ−３７（配列番号：２９）（これは、配列5'-ATGTTGG ACAGTGTTGTCGAA-3'を有する）及びＡＰを第一次ＰＣＲにおいて用いることによってクローン化し、ＪＣ１３８ｉｉと呼んだ。オリゴヌクレオチドＣＰ−３７は、図４のヌクレオチド１２９〜１４９に対応し、部分的CryjIIクローンｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂについて決定されたヌクレオチド配列に基づいている。第２のＰＣＲ反応を、各１００ｐモルのＡＰ及びＣＰ−３８（配列番号：３０）（これは、配列5'−GGGAATTCAGAAAAGTTGAGCATTCTCGT-3'を有する）、ネストしたプライマーを用いて、初期増幅混合物の５％にて行なった。ヌクレオチド配列（配列番号：３１）5'−GGGAATTC-3'（ＣＰ−３８の塩基１〜８）は、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ制限部位を表す。残りのオリゴヌクレオチド配列は、図４のヌクレオチド１７７〜１９７に対応し、部分的CryjIIクローンｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂについて決定されたヌクレオチド配列に基づいている。増幅したＤＮＡ生成物（ＪＣ１４０ｉｉｉと呼ぶ）を上記のように精製して沈殿させ、その後ＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８で消化して調製用の１％低融点ゲル中で電気泳動した。約１．５５ｋｂ長の優勢なＤＮＡバンドを切り出し、配列決定のためにｐＵＣ１９中にライゲートした。ＤＮＡを、市販のキット（sequenas e kit （オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等、前出）により配列決定した。両鎖を、Ｍ１３順方向及び逆向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）及び内部シーケンシング用プライマーＣＰ−３５、ＣＰ−３８、ＣＰ−４０、ＣＰ−４１、ＣＰ−４２、ＣＰ−４３、ＣＰ−４４、ＣＰ−４５、ＣＰ−４６、ＣＰ−４７、ＣＰ−４８、ＣＰ−４９、ＣＰ−５０及びＣＰ−５１を用いて、完全に配列決定した。ＣＰ−４０（配列番号：３２）は、配列5'-GTTCTTCAATGGGCCATGT-3'有し、図４のヌクレオチド３５９〜３７７に対応する。ＣＰ−４１（配列番号：３３）は、配列5'-GTGTTAGGACTGTCTCTCGG-3'有し、それは、図４のヌクレオチド７２０〜７３９に対応する非コード鎖配列である。ＣＰ−４２（配列番号：３５）は、配列5' -TGTCCAGGCCATGGAATAAG-3'れは、図４のヌクレオチド８６４〜８８３に対応する（但し、最初のヌクレオチドは、正しいＧではなくてＴとして合成）。ＣＰ−４３は、配列（配列番号コロン３５）5'-GCCTTACATGGACTGCAACC-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド１４７６〜１４９５に対応する非コード鎖配列である。ＣＰ−４４は、配列（配列番号：３６）5'-TCCACGGGTCTGATAATCCA-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド６１２〜６３１に対応する。ＣＰ−４５は配列（配列番号：３７）5'-AGGCAGGAAGCAATTTTCCC-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド１２５４〜１２７３に対応する非コード鎖配列である。ＣＰ−４６は、配列（配列番号：３８）5'-TACTGCACTTCAGCTTCTGC-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド１０７７〜１０９６に対応する。ＣＰ−４７は、配列（配列番号：３９）GGGG GTCTCCGAATTTATCA-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド１０３９〜１０５８に実質的に対応する非コード鎖である（但し、ＣＰ−４７の第５ヌクレオチドは、正しいヌクレオチドＴではなくＧとして合成）。ＣＰ−４８（配列番号：４０）は、配列5'-GGATATTTCAGTGGACACGT-3'を有し、図４のヌクレオチド１２９０〜１３０９に対応する。ＣＰ−４９（配列番号：４１）は、配列5'-TATTAGAAGACCC TGTGCCT-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド８２１〜８４０に対応する非コード鎖配列である。ＣＰ−５０（配列番号：４２）は、配列5'−CCATGTAAGGCCAA GTTAGT-3'を有し、それは、図４のヌクレオチド１４８５〜１５０４に対応する。CＰ−５１（配列番号：４３）は、配列5'-ACACCTTTACCCATTAGAGT-3'、それは、図４のヌクレオチド４８６〜５０５に対応する非コード鎖である。３つのクローン（ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉａ、ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄ及びｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｅと呼ぶ）は、実質的に部分的なCryjII配列を含むことが見出された。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄの配列を、それが最長の３’非翻訳領域を有するので、コンセンサス配列として選択した。ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄ及びｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂの配列を用いて、図４に示した複合CryjII配列を構築した。この複合体において、ヌクレオチド２３０は、ｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂ中に（ｐＵＣ１９ＪＣ１３７ａ、ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉａ及びｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｅにおいても）見出されるＡとして報告されており、ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄ中にＧとして見出されるものではない。しかしながら、ヌクレオチド２３０のＡ及びＧの両者は、アミノ酸６３のＬｙｓをコードしている。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉａ配列はｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄのそれと同一であったが、次の点は除く：ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉａは、ヌクレオチド３５７にＣの代りにＴを有し（アミノ酸１０６に予想される変化はない）、ヌクレオチド７５４にＴではなくＣを有し（アミノ酸２３８のＩｌｅからＴｈｒへの変化）、ヌクレオチド１２４６にＴではなくＣを有し（アミノ酸４０２のＬｅｕからＰｒｏへの変化）、そしてヌクレオチド１６７２にＣではなくＴを有する（非翻訳領域）。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｅの配列は、ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄのそれと同一であったが、但し、ヌクレオチド７９４はＡではなくＧであり（アミノ酸２５１のＩｌｅからＭｅｔへの変化）、そしてヌクレオチド３５７はＣの代りにＴであった（アミノ酸１０６に予想される変化はない）。ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化（オリゴヌクレオチドＡＰは、Ｘｂａ及びＡｓｐ７１８制限酵素部位の両者を有する）を用いるＪＣ１４０ｉｉｉＰＣＲ生成物のクローニングにおける初期の試みは、CryjIIｃＤＮＡ中の内部ＸｂａＩ制限部位のために半分に切断されたｃＤＮＡを生成して、８００及び７５０ｂｐバンドを生じ、７５０ｂｐのバンドは上首尾にＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化したｐＵＣ１９中にクローン化され、配列決定された。２つの７５０ｂｐクローンを配列決定してCryjII分子の５’半分であることを見出した（クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０−２ａ及びｐＵＣ１９ＪＣ１４０−２ｂ）。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０−２ａは、ヌクレオチド２９７にＴの代りにＣを有し（アミノ酸８６のＣｙｓからＡｒｇへの変化）及びクローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０−２ｂはヌクレオチド７５３にＡではなくＧを有する（アミノ酸２３８のＩｌｅからＶａｌへの変化）。両クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０−２ａ及びクローンｐＵＣ１９ＪＣ１４０−２ｂはヌクレオチド３５７にＣの代りにＴを有する（アミノ酸１０６に予想される変化はない）。２つの異なるＰＣＲ増幅は又、クローン化CryjII配列をAmplitaq Cycle Seque ncing kit（コネチカット、Norwalk在、Perkin Elmer Cetus）を用いて、直接、配列決定して確認した。この手順は、オリゴヌクレオチド配列決定用プライマーの［³² Ｐ］末端標識を含み、それは、次いで、テンプレートＤＮＡにアニールされ（１ μｌ中の１．６ｐモル）及びジデオキシＮＴＰを用いて、４μｌ１０ＸCycling Miｘ（０．５Ｕ／μｌ Amplitaq ＤＮＡポリメラーセを含有）、５μｌテンプレートＤＮＡ（１０〜１００ｆモル）及び２０μｌにするだけのｄＨ₂Ｏをも含むＰＣＲ反応において延長される（Sanger等（1977）Proc.Natl .Acad.Sci.USA 74:5463-5476）。このキットにおける停止用混合液中のｄＧＴＰは、７−デアザ−ｄＧＴＰで置き換えた（ＤＮＡの高Ｇ＋Ｃ領域を含む配列の増大した解像を与える）。テンプレートＤＮＡは、ＰＣＲ生成物であり、それは、順次、クロロホルム、フェノール及びクロロホルム抽出し、０．５容の７．５酢酸アンモニウム及び１．５容のイソプロパノールで−２０℃で沈殿させることにより回収し、次いで、調製用の１又は２％のSeaPlaque低融点ゲル（ＦＭＣ）中を電気泳動したものであった。適当な寸法のＤＮＡバンドをＥｔＢｒ染色により可視化し、切り出してGelase（ウィスコンシン、Madison在、Epicentre Technologies）で処理してアガロースを除去した。このＤＮＡを再沈殿させ、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーセ（インジアアナ、Indianapolis在、Boehringer Mannheim）を含む５０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再懸濁させた。CryjIIをクローン化するのに用いた２つの第二次増幅を繰り返し、そしてＰＣＲサイクル配列決定ようのテンプレートとして用いた：ＪＣ１３７ｉｉ、５’末端ＰＣＲ（上記の１゜ＰＣＲＪＣ１３６から増幅）をオリゴヌクレオチドＡＰ及びＣＰ−３６を用いて再増幅し；ＪＣ１４０ｉｉ、３’末端ＰＣＲ（上記の１゜ＰＣＲＪＣ１３８ｉｉから増幅）をオリゴヌクレオチドＡＰ及びＣＰ −３８を用いて再増幅した。用いた１゜増幅の両者を沈殿させ、１又は２％の調製用SeaPlaque低融点ゲル（ＦＭＣ）を通して電気泳動し、適当な寸法のバンドをＥｔＢｒ染色により可視化して切り出した。次いで、各１゜増幅の２μｌを対応する２゜ＰＣＲ反応において用いた。次いで、２゜ＰＣＲ生成物を、ＰＣＲサイクル配列決定用のＤＮＡテンプレートとして調製した。ＰＣＲサイクル配列決定におけるプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド（その多くは、これらのクローンを配列決定するのに用いた）は、ＪＣ１３７ｉｉについて次の通りである：ＣＰ−３６及びＣＰ−３９（配列番号：４４）（これは、配列5'-CTGTCCAAC ATAATTTGGGC-3'及び図４のヌクレオチド１２０〜１３９に対応する非コード鎖配列である）。ＪＣ１４０ｉｉを配列決定するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＰ−３８、ＣＰ−４０、ＣＰ−４１、ＣＰ−４２、ＣＰ−４３、ＣＰ−４４、ＣＰ−４５、ＣＰ−４６、ＣＰ−４７、ＣＰ−４９、ＣＰ−５０、ＣＰ−５４（配列番号：４５）（これは、配列5'-CATGGCAGGGTGGTTCAGGC-3'を有し、図４のヌクレオチド９８５〜１００４に対応する）、ＣＰ−５５（配列番号：４６）（これは、配列5'-TAGCCCCATTTACGTGCACG-3'を有し、図４のヌクレオチド９２９〜９４８に対応する非コード鎖配列である）及びＣＰ−５６（配列番号：４７）（これは、配列5'-TTGGGGTCGAGGCCTCCGAA-3'を有し、図４のヌクレオチド１４３７〜１４５６に対応する）であった。この全長ＰＣＲサイクル配列決定の配列は、図４に示した複合ｐＵＣ１９ＪＣＣ１３７ｂ／ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄCryjII 配列と２ヌクレオチドだけ変化していた（これらの何れもアミノ酸変化へと導かない）。ヌクレオチド３５７にはＣの代りにＴ（アミノ酸１０６に予想される変化はない）があり、ヌクレオチド６３５にはＡの代りにＣがあった（アミノ酸変化なし）。 CryjIIのヌクレオチド及びアミノ酸配列を図４及び５に示す。これは、２つの重複するクローンｐＵＣ１９ＪＣ１３７ｂ及びｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄからの複合ヌクレオチド配列である。複数の独立のクローンの配列決定及びＰＣＲ生成物のサイクル配列決定は、図４のヌクレオチド配列を確実にした。上記のように、予想されるアミノ酸変化を生じる幾つかのヌクレオチド変化があった。しかしながら、すべてのヌクレオチドの多形（ヌクレオチド３５７におけるＴによるＣの置換を除く）は、単一クローン又は配列決定において認められただけであった。Ｔが、ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄを除くすべてのクローンでヌクレオチド３５７において見られたにもかかわらず、Ｃ及びＴの両者はアミノ酸１０６においてＬｅｕをコードしている。 CryjIIに対する完全なｃＤＮＡ配列は、５’非翻訳配列の４１ヌクレオチド、開始Ｍｅｔに対するコドン（図４のヌクレオチド４２〜４４）で始まる１５４２ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム、及び１４３ｂｐの３’非翻訳領域を含む１７２６ヌクレオチドからなる。コンセンサスポリアデニル化シグナル配列が、ポリＡテールの６４ヌクレオチド５’側の３’非翻訳領域にある（図４のヌクレオチド１６５４〜１６５９）。開始Ｍｅｔの位置は、インフレームの上流の停止コドンの存在により及び開始Ｍｅｔを含む植物のコンセンサス配列との７８％の相同性により確認される（該開始Ｍｅｔは、CryjII中に見出されるTAAAAUG GC（図４の塩基３８〜４６（配列番号：４８））で、これは、植物についてのコンセンサス配列AACAAUGGC（配列番号：４９）Lutcke等（1987）EMBO J.6:43 -48に匹敵する）。このオープンリーディングフレームは、CryjIIについての公表された部分的蛋白質配列（Sakaguchi等、前出）（図４のアミノ酸５５〜６４に対応）との完全な配列同一性を有する演繹された５１４アミノ酸の蛋白質をコードする。予想されるCryjII蛋白質は、２０個のＣｙｓを有し、コンセンサス配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔに対応する４つの潜在的Ｎ結合グリコシレーション部位を含み、予想分子量５６．６ｋＤａ及び予想ｐＩ９．０８を有する。 CryjIIについての３つの別々のＮＨ₂末端配列（実施例２で測定したロング型及びショート型及び、図６に示すように、Sakaguchi等、前出により測定されたＮＨ₂末端）の検出は、成熟Cryj II蛋白質のアミノ末端がブロックされていること及び精製蛋白質の配列分析により得られた配列が蛋白質加水分解開裂生成物を表すということを示唆する。図６に示すように、CryjIIのロング型のアミノ酸配列は、アミノ酸４６で始まり、Cr yjIIのショート型のアミノ酸配列は、アミノ酸５１で始まり、そして、Sakaguch i等により測定されたＮＨ₂末端配列は、アミノ酸５４で始まる。アミノ酸１〜４５が、酵素的に開裂されて図４のアミノ酸４６で始まる機能的に活性な蛋白質を与えるCryjIIのリーダー／プレプロ位置を表すということはあり得る。アミノ酸５１及び５４で始まる配列は、アミノ酸４６で始まる蛋白質の分解生成物を表す。von Heijneの方法（Nucleic Acids Res.（1986）14:4683-4690）を用いて、図４のアミノ酸２２と２３の間に予想される開裂部位がある。もし成熟CryjII蛋白質が図４のアミノ酸２３で始まるならば、その蛋白質は、４９２アミノ酸長であって予想分子量５４．２ｋＤａ及び予想ｐＩ９．０を有するであろう。 Swiss-ProtデータベースのCryjII配列についてのサーチは、CryjIIが、コーン、トウモロコシのポリガラクチュロナーセに対して、４３．３％相同（トマト（ Lycopersicon esculentum）のポリガラクチュロナーセに３３．３％同一）及び４８．４％相同（３２．６％同一）であることを示した。すべてのヌクレオチド及びアミノ酸配列分析は、PCGENE（カリフォルニア、Mountain View在、Intelligenetics）を用いて行なった。実施例４日本で採集された杉花粉からのＲＮＡの抽出及び組換えCryjIIの発現日本でCryptomeria japonica（杉）の木のプールから採集した新鮮な花粉を直ちにドライアイス上で凍結した。この花粉５００ｍｇから、本質的にFrankis及びMascarenhas Ann.Bot.45:595-599に記載されたようにしてＲＮＡを調製した。試料をドライアイス上で乳鉢と乳棒ですり潰して、一晩０．１％ＤＥＰＣで処理した０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳを加えた５ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）に懸濁させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１で混合）で５回抽出した後に、ＲＮＡを、０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２容のエタノールで水相から沈澱させた。ペレットを遠心分離で回収し、２ｍｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁させて６５℃に５分間加熱した。これらのＲＮＡ調製物に２ｍｌの４Ｍ塩化リチウムを加えて、一晩０℃ でインキュベートした。遠心分離によりＲＮＡペレットを回収して、１ｍｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁させ、再び３Ｍ酢酸ナトリウム及びエタノールで一晩沈殿させた。最終的ペレットを１００μｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁させて−８０℃で保存した。二本鎖ｃＤＮＡを、８μｌ花粉ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成システムキット（BR L）を用いてGubler及びHoffman（1983）Gene25:263-269の方法に従ってオリゴｄＴプライミングで合成した。ＰＣＲを、ｄＮＴＰを含む１０μｌの１０×緩衝液を各１００ｐモルのセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ（４００μｌの二本鎖ｃＤＮＡ反応混合物の１０μｌ）、０．５ μｌのAmplitaqＤＮＡポリメラーセ及び蒸留水（１００μｌにする）と混合して、GeneAmpＤＮＡ増幅キット（Perkin Elmer Cetus）を用いて行なった。これらの試料を、MJ Research，Inc.（マサチューセッツ、Cambridge在）プログラム可能な温度制御装置を用いて増幅した。最初の５回の増幅は、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のプライマーのテンプレートへのアニーリング及び７２℃で１分間の鎖延長からなった。最後の２０回の増幅は、上記の通りの変性、５５℃ で１分間のアニーリング及び上記の通りの鎖延長からなった。新たなプライマー対のセットを、開始Ｍｅｔから停止コドンまでのCryjIIｃＤＮＡの増幅用に合成した。ＣＰ−５２（配列番号：５０）は、配列5'-GCCGAATTC ATGGCCATGAAATTAATT-3'を有し、ここに、ヌクレオチド配列5'-GCCGAATTC-3'（配列番号：５１）（ＣＰ−５２の塩基１〜９）は、クローニング目的のために加えたＥｃｏＲＩ制限部位を表し、残りの配列は図４のヌクレオチド４２〜５９に対応する。ＣＰ−５３（配列番号：５２）は、配列5'-CGGGGATCCTC ATTATGGATGGTAGAT-3'を有し、ここに、ヌクレオチド配列5'-CGGGGATCC-3'（配列番号：５３）（ＣＰ−５３の塩基１〜９）は、クローニング目的のために加えられたＢａｍＨＩ制限部位を表し、残りのＣＰ−５３のオリゴヌクレオチド配列は、図４のヌクレオチド１５７２〜１５８９に対応するコード鎖配列に相補的である。ＣＰ−５２及びＣＰ−５３を用いる二本鎖杉花粉ｃＤＮＡでのＰＣＲ反応は、ＥｔＢΓ染色したアガロースミニゲル上で約１．５５ｋｂのバンドを生じ、ＪＣ１４５と呼ばれた。増幅されたＤＮＡを、逐次的なクロロホルム、フェノール及びクロロホルム抽出と、その後の−２０℃での０．５容の７．５酢酸アンモニウム及び１．５容のイソプロパノールでの沈澱により回収した。沈澱及び７０％エタノールでの洗浄の後に、ＤＮＡを、１５μｌの反応にて、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで同時に消化し、調製用１％SeaPlaque低融点ゲル（FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドをＥｔＢｒ染色により可視化し、取り出し、市販の配列決定用キット（オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いるジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA74 :5463-5476）によるジデオキシＤＮＡ配列決定のために適当に消化したｐＵＣ１９中に繋いだ。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４５ａ及びｐＵＣ１９ＪＣ１４５ｂを、Ｍ１３順方向及び逆向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Bio labs）及び内部配列決定用プライマーＣＰ−４１、ＣＰ−４２、ＣＰ−４４、ＣＰ−４６及びＣＰ−５１を用いて、完全に配列決定した。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４５ａ及びｐＵＣ１９ＪＣ１４５ｂのヌクレオチド及び演繹されたアミノ酸配列は、図４のCryjII配列と同一であったが、次の点を除く。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４５ａは、前に知られたCryjII配列との単一のヌクレオチドの違いを含むことが見出された。それは、図４のヌクレオチド位置１２３４に、以前に記載されたＴではなくＣを有する。このヌクレオチド変化は、CryjII蛋白質のアミノ酸３９８に、ＩｌｅからＴｈｒへの予想されるアミノ酸変化を生じる。クローンｐＵＣ１９ＪＣ１４５ｂは、図４のヌクレオチド位置１０８８に、以前に記載されたＡではなくＧを有し、ヌクレオチド１３３９にＧの代りにＡを有する。１０８８におけるヌクレオチド変化はサイレントであり、予想されるアミノ酸変化を生じない。位置１３３９でのヌクレオチド変化は、CryjII蛋白質のアミノ酸４３３におけるＳｅｒからＡｓｎへの予想されるアミノ酸変化を生じる。これらの多形の何れも、未だ、独立に誘導されたＰＣＲクローン又は直接アミノ酸配列決定によって確認されておらず、Ｔａｑポリメラーセの本来のエラー率によるものであろう（約２×１０^-4、Saiki等（1988）Science 239:487-491）。しかしながら、かかるヌクレオチド及びアミノ酸の一次配列における多形は、予想されるものである。 CryjIIの発現を以下のように行なった。１０ｇのｐＵＣ１９ＪＣ１４５ｂをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで同時に消化した。CryjIIをコードするヌクレオチド挿入物（図４のヌクレオチド４２〜１５８９に及ぶ）を、この消化の１％SeaPlaqu e 低融点アガロースゲル中での電気泳動により単離した。次いで、この挿入物を、ユニークなＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位が後に続くＡＴＧ開始コドンの直３’側の６ヒスチジン（Ｈｉｓ６）をコードする配列を含むように改変した適当に消化した発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ウィスコンシン、Madison在、Noagen ；Jameel等（1990）J．Virol．64:3963-3966）中にライゲーションした。隣接するＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーセ制限部位と共にベクター中の第２のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーセ制限部位を、予めＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化、鈍端化及びライゲーションにより除去した。このヒスチジン（Ｈｉｓ６）の配列は、組換え蛋白質（CryjI）のＮｉ²⁺キレーティングカラムにおけるアフィニティー精製のために加えられた（Hochuli等（1987）J.Chromatog.411 :177-184;Hochuli等（1988）Bio/Tech.6:1321-1325）。組換えクローンを用いて大腸菌株ＢＬ２１−ＤＥ３をトランスフォームしたが、該株は、Ｔ７ポリメラーゼをコードする遺伝子に先行するイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導可能なプロモーターを有するプラスミッドを有する。ＩＰＴＧでの誘導は、ｐＥＴ−１１ｄにおける組換え蛋白質の発現に必要な高レベルのＴ７ポリメラーセ発現へと導く。クローンｐＥＴ−１１ｄΔＨＲｈｉｓ６ＪＣ１４５ｂ．ａは、発現のための正しいリーディングフレーム中のCryjIIクローンであることが、ＣＰ−３９を用いるジデオキシ配列決定（Sanger等、前出）により確認された。組換え蛋白質の発現を、初期小規模培養で試験した。クローンｐＥＴ−１１ｄ ΔＨＲｈｉｓ６ＪＣ１４５ｂ．ａの一晩培養を用いて、アンピシリンを含む５０ｍｌの培地（Brain Heart Infusion Media，Difco）に接種し、Ａ₆₀₀＝１．０まで成育させ、次いで、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）で２時間誘導した。この細菌の１ｍｌのアリコートを誘導の前後で採取して、遠心分離によりペレット化し、そのペレットを５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）２ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．２５％ブロモフェノールブルー中で５分間煮沸することにより粗細胞溶解物を調製した（St udier等、（1990）Methods in Enzymology 185:60-89）。組換え蛋白質発現を、 Sambrook等、前出の方法に従って、クーマシーブルー染色した１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で試験した（ゲルには、２５μｌの粗溶解物を載せた）。陰性対照は、誘導してないCryjIIのプラスミッドを含有する細菌からの粗溶解物からなった。Ｈｉｓ６リーダーを有する組換えCryjIIについて予想されるサイズの５８Ｋｄの範囲には、何れの組換え大腸菌蛋白質の産生の著しい増加はなかった。次いで、このｐＥＴ−１１ｄΔＨＲｈｉｓ６ＪＣ１４５ｂ．ａクローンを何れかの組換え蛋白質が発現されたか否かを調べるために大規模に成育させた。組換えプラスミッドを含む培養細菌２ｍｌを８時間成育させ、次いで、３μｌを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（メリーランド、Gaithersburg在、Gibc o-BRL）中の１．５％アガロースを含む６個の各ペトリ皿（１００×１５ｍｍ）上に線状にこすり付け、集密になるまで一晩成育させ、次いで、掻き取ってアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）を含む６Ｌの液体培地（Brain Heart Infusion培地、Difco）に加えた。この培養を、吸光度Ａ₆₀₀が１．０になるまで成育させ、ＩＰＴＧを加え（終濃度１ｍＭ）、更に２時間成育させた。細菌を遠心分離（７，９３０×ｇ、１０分間）により回収して、５０ｍｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）中で激しく震盪しながら１時間溶解させた。不溶性物質を遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分間、４℃）により除去した。溶解物のｐＨを８．０に調節し、６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）で平衡化した５０ｍｌのニッケルＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に加えた。そのカラムを、６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、次いで、８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）で、最後に８Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ卜リス−ＨＣｌ（ｐＨ６．３）で、逐次的に洗った。カラムを、各緩衝液で、通過した流れのＡ₂₀₈が０．０５以下になるまで洗った。組換え蛋白質CryjIは、８Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）で溶出され、１０ｍｌのアリコートで採集した。各画分の蛋白質濃度を、Ａ₂₈₀の吸収により測定して、ピーク画分をプールした。採集した組換え蛋白質のアリコートを、Sambrook等、前出の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。この６Ｌの調製物、ＪＣＩＩｐＥＴ−１は、１．５ｍｇの組換えCryjIIを産生したが、それは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２４ｋＤａ及び５８ｋＤａの２本の主要バンドに分離された。この５８ｋＤａのバンドは、組換えCryjIIを表すが、濃度測定（Shimazu Flying Spot Scanner、マサチューセッツ、Braintree在、Shimazu Sc ientific Instruments）により測定したところ全蛋白質の約９〜１０％であった。２４ｋＤａのバンドは、全蛋白質の約９０％を説明し、組換えCryjIIの分解生成物又は大腸菌夾雑物を表すのであろう。他のCryjII発現用構築物を、ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄCryjII挿入物の適当に消化したｐＥＴ１１ｄΔＨＲ（６ヒスチジンリーダーを有する）中へのライゲーションにより作成した。このベクターを、挿入物がＥｃｏＲＩ部位（５’ｐＥＴ１１ｄΔＨＲ挿入物接続）及びＡｓｐ７１８部位（挿入物の３’末端）を与える他のｐＥＴ１１ｄΔＨＲ構築物から誘導した。この構築物をこれらの２種の酵素で消化し、上記の低融点ミニゲルにて電気泳動し、そしてベクターを低融点アガロース中のバンドとして回収した。ｐＵＣ１９ＪＣ１４０ｉｉｉｄ構築物をＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８で消化してCryjII挿入物を放出させた（それを、低融点ミニゲルにて単離し、上記のように調製したＥｃｏＲＩ／Ａｓｐ７１８消化したｐＥＴ１１ｄΔＨＲベクター中にライゲーションした）。５つのクローンが、挿入物／ベクター５’接続部に正しいヌクレオチド配列を含むことが、ＣＰ− ３９を用いるジデオキシ配列決定（上記）により見出された。この新しい構築物は、発現させたときに、図４及び５に示すように、CryjIIのアミノ酸４６で始まる。この組換え蛋白質は、rCryjIIΔ４６と呼ばれる。５０ｍｌの小規模発現試験（上記のように実施）は、ｐＥＴ１１ｄΔＨＲＪＣ１４０ｉｉｉｄ２と呼ばれるこの構築物からのrCryjIIΔ４６の発現レベルがｐＥＴ１１ｄΔＨＲＪＣ１４５ｂ２からの初期発現レベルよりずっと高いことを示した。９Ｌの調製物（ＪＣＩＩｐＥＴ−３）を上記のように処理し、２００ｍｇのrCryjIIΔ４６を純度８０％（クーマシーブルー染色した１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定による測定）で産出した。実施例５杉花粉起源のＲＮＡのノーザンブロット分析 Arnold Arboretumの木及びプールした日本からの木の両方からの杉花粉から分離したＲＮＡに関してノーザンブロット分析を行った。本質的に上記のSambrook の方法を用いて、Arnolｄ Arboretum（マサチューセッツ、Boston）で採集した杉花粉から単離したＲＮＡ１０μｇ及び日本の木から採集した杉花粉から単離したＲＮＡ１５μｇを、ホルムアルデヒド３８％及び１ＸＭＯＰＳ（２０Ｘ＝０．４ＭＭＯＰＳ、０．０２ＭＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０）溶液を含有する１．２％アガロースゲル上で泳動した。ＲＮＡ試料（初めに酢酸ナトリウム１／１０容積、エタノール２容積で沈殿させて容積を減少させ、ｄＨ₂Ｏ５．５μｌに再懸濁させた）を、最終濃度ホルムアルデヒド１５．５％、ホルムアミド４２％、及び１．３ＸＭＯＰＳ溶液を有するローディング色素を含有するホルムアルデヒド／ホルムアミド緩衝液１０μｌにより泳動した。試料を１０ ×ＳＳＣ（２０Ｘ＝３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）におけるキャピラリートランスファーによりＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎＰｌｕｓ（ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ、ボストン）に移した後に、膜を８０℃で２時間ベークし、３分間紫外線照射した。膜のプレハイブリダイゼーションは、４ｍＬの０．５ＭＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、及び７％ＳＤＳ中６０℃において１時間であった。アンチセンスプローブを非対称性ＰＣＲにより低メルトアガロース（上記）においてＪＣ１４５の増幅で合成した。この場合、２ μｌのＤＮＡを２μｌのｄＮＴＰミックス（０．１６７ｍＭｄＡＴＰ、０．１６７ｍＭｄＴＴＰ、０．１６７ｍＭｄＧＴＰ及び０．０３３ｍＭｄＣＴＰ）、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１０μｌの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（１００μＣｉ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ、アーリントンハイツ）、１μｌ（１００ｐモル）のアンチセンスプライマーＣＰ−１７、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ、及びｄＨ₂Ｏにより増幅して２０μｌにする。１０×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ及びＴａｑポリメラーセはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ（コネチカット、ノアウオーク）からのものであった。増幅は９４℃において４５秒間３０回数変性し、プライマーを６０℃において４５秒間テンプレートにアニールしかつ７２℃ において１分間鎖延長することからなるものであった。反応を、ＴＥ１００μｌを加えることによって停止させ、プローブを３ｃｃのＧ−５０スピンカラム（ＴＥで平衡にしたグラスウールを詰めた３ｃｃのシリンジ中の２ｍｌのＧ−５０Ｓｅｐｈａｄｅｘ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スエーデン、アップサラ］）で回収し、１５００ＴｒｉＣａｒｂＬｉｑｕｉｄＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋｅｒｄ、イリノイ、ダウナースグロウブ）でカウントした。プローブをプレハイブリダイジング緩衝液に１０⁶ｃｐｍ／ｍｌで加え、プレハイブリダイゼーションを６０℃において１６時間行った。ブロットを高緊縮条件：３×６５℃における０．２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳによる１５分、において行い、次いでプラスチックラップにラップして−８０℃のフィルムに暴露した。このノーザンブロット分析の７時間暴露は、Arboretumの木から採集したＲＮＡ及び日本からのプールした木から採集したＲＮＡの両方についておよそ１．７ｋｂにおいて単一の厚いバンドを示した。このメッセージはｃＤＮＡのＰＣＲ分析によって予測される通りのＣｒｙｊＩＩについて予期されるサイズである。実施例６ CryjI、CryjII及び組換えCryjIIに対するＩｇＥの直接結合アッセイコーニングアッセイプレート（＃２５８８２−９６）を、４℃で一晩、CryjI 若しくはCryjIIlで（２μｇ／ｍＬ）又は組換えCryjII調製物（１０μｇ／ｍＬ）（約２０％の純度）で、５μＬにてコート。被覆抗原を除去し、ウェルを０５％セラチン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）（１ｇ／ｍＬＰＢＳ）で、室温で２時間ブロックした（２００μｌウェル）。抗CryjIモノクローナル抗体４Ｂ１１を、ＰＢＳ−Tween20で、１：１０００稀釈で開して、逐次稀釈した。ヒト血漿を、ＰＢＳ−Tweenにて、１：２稀釈で開始して、逐次稀釈した。このために、ＩｇＥ結合分析について選択した杉花粉アレルギーの徴候を示す患者からの２３試料をセットした。第１の抗体のインキュベーションを４℃で一晩行なった。ＰＢＳ−Tweenでの３回の洗浄の後に、第２抗体を加え（ヤギ抗マウスＩｇ又はヤギ抗ヒトＩｇＥ、両者とも１：２０００）そして２時間室温でインキュベート（１００μｌ／ウェル）。この溶液を取り出し、１：１０，０００まで稀釈したストレプトアビジン−ＨＲＰＯを１００μＬ／ウェルで加えた。２〜５分間発色させた。反応を、１００μＬ／ウェルの１Ｍリン酸の添加により停止させた。プレートを４５０ｎｍフィルターを有する Microplate IL310Autoreader （バーモント、Vinooski在、Biotek Instruments社）にて読んだ。２重のウェルの吸光度レベルを平均した。ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ化した結果（稀釈の対数対吸光度）を図７〜１５に示す。これらの結果の要約を図１６に与える。血漿の第２稀釈（１：６）でバックグラウンドの２倍以上の読みであるものを陽性の結合結果（プラス符号で示す）とした。図７において、モノクローナル抗体４Ｂ１１及び７人の患者（バッチ１）の血漿ＩｇＥの結合応答を、被覆抗原としての精製CryjIに対して示す。精製CryjIに対して高めたモノクローナル抗体は、全稀釈系列に対して結合の飽和レベルを示している。個々の患者の試料は、CryjI調製物に対するＩｇＥ結合の変わり易い応答を示す。１人の患者（１０３４番）は、この蛋白質調製物に対する検出可能な結合を有しない。すべての患者の試料は、杉花粉アレルギーの徴候を訴えた個人から得た。そして、それらのＭＡＳＴ評点の結果を図１６に示す。図８は、図７と同じ抗体セットの天然の精製CryjIIに対する結合を表すグラフである。抗CryjIモノクローナル抗体４Ｂ１１は、この調製物において陰性である（２つのアレルゲン抗原の間の交差反応性の欠如を示す）。一般に、この杉花粉のアレルゲン性成分に対する一層低い全体的応答があり、減少した結合を示す一層多くの患者の試料を伴う。しかしながら、１０３４番の患者はCryjIにおいて陰性であり、CryjIIに対する非常に強い反応性を示す。組換えCryjII（rCryjII）を用いる最後の抗原セットにおいて（図９）、モノクローナル抗体４Ｂ１１の反応性は陰性であり、生化学的に精製した CryjIIと比較して、ヒトＩｇＥ試料の結合に更なる減少がある。１１４３番及び１１４６番の患者２人は、生化学的に精製した型に対して最強反応した患者（１０３４番）が陰性であるにもかかわらず、組換え型のCryjIIに対するＩｇＥ結合について明確に陽性である。図１０〜１５は、同じ抗原セットの適用を、次の１６人の患者（患者バッチ２及び患者バッチ３と呼ぶ）の直接結合分析について表している。図１６に示した表には、出荷前に血漿試料について市販のキットを用いて日本で実施したＭＡＳＴ評点及び上で概説した直接ＥＬＩＳＡの結果を要約してある。２人の患者は、ＭＡＳＴアッセイにより陰性であったが、これらの患者の１人（１１４３番）は、すべてのＥＬＩＳＡ抗原について陽性であった。各抗原についての陽性応答の数を示し、これは、種々のアレルゲン調製物の測定の相対的アレルゲン性を表す。これらの結果は、CryjIIが、ヒトアレルギー患者のＩｇＥ反応性により規定して、アレルゲンであること及びCryjIには反応性でないがCryjI Iに反応性の何人かの患者がいることを示す。この患者の集団における応答の頻度は、CryjIに対するよりCryjIIに対して一層低い。実施例７ CryjII及びCryjIIペプチドを用いた杉花粉アレルギー患者のＴ細胞の研究 CryjIIペプチドの合成杉花粉CryjIの重複するペプチドを、標準的Ｆｍｏｃ／ｔＢｏｃ合成化学を用いて合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。図１３は、これらの研究で用いたCr yjIペプチドを示す。ペプチドの名称は、一貫している。杉花粉抗原ペプチドに対するＴ細胞応答末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、季節性鼻炎の臨床症状を示し且つ杉花粉に対するＭＡＳＴ及び／又は皮膚試験陽性の杉花粉アレルギー患者からの６０ｍｌのヘパリン化した血液のリンパ球分離培地（ＬＳＭ）遠心分離によって精製した。長期Ｔ細胞系統を、完全培地（熱で不活性化した５％ヒトＡＢ血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、５×１０^-5Ｍ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭＨＥＰＥＳ）のバルク培養における２×１０⁶ＰＢＬ／ｍｌの、保湿した５％ＣＯ₂インキュベエター内での、２０μｇ／ｍｌの部分精製した天然CryjI（７５％の純度で、図２の３本のバンドと類似した３本のバンドを含む）での３７℃で７日間の刺激によって樹立し、CryjI反応性Ｔ細胞を選択した。この量のプライミング抗原は、殆どの杉花粉アレルギー患者からのＴ細胞の活性化に最適であることが測定された。生存細胞をＬＳＭ遠心分離により精製し、５単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２及び５単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４を補った完全培地中で、細胞がもはやリンホカインに応答せず且つ「休止した」と考えられるまで最長で３週間培養した。次いで、Ｔ細胞の、選択したペプチド、組換えCryjI（rCryjI）、精製した天然CryjI又は組換えAmb a I．１（rAmb aI．１）に対して増殖する能力を評価した。アッセイのために、２×１０⁴の休止細胞を、２×１０⁴のエプスタイーバールウイルス（ＥＢＶ）トランスフォームした自家Ｂ細胞（後述のようにして調製した）（２５，０００ＲＡＤでガンマー照射したもの）の存在下で、丸底９６ウェルプレートの２若しくは３ウェル中の２００μｌの容積の完全培地中で、２〜５０ｐｇ／ｍｌのrCryjII、精製した天然CryjIIペプチドCryjIIA及びCryjIIB（天然のCryjIの）で２〜４日間再刺激した。次いで、各ウェルに、１μＣｉのトリチウム化チミジンを１６〜２０時間加えた。取り込まれたカウントをガラス繊維フィルターマット上に集め、液体シンチレーション計数処理した。図１２は、組換えCryjI、精製した天然CryjI及び組換えAmb a Ｉ．１並びに上記のようにして合成した幾つかの抗原性ペプチドを用いるアッセイにおいて抗原量を変えることの効果を示している。幾つかのペプチドは、これらのアッセイにおいて、高濃度では阻害的であることが見出された。滴定を用いて、これらのペプチドのＴ細胞アッセイにおける投与量を最適化した。各ペプチドの滴定における最大応答を、刺激インデックス（Ｓ．Ｉ．）として表す。このＳ．Ｉ．は、ペプチドへの応答において細胞により取り込まれたカウント／分（ＣＰＭ）を、培地のみの中で細胞により取り込まれたＣＰＭで除したものである。バックグラウンドの２倍以上のＳ．Ｉ．値は、「陽性」と考えられ、そのペプチドがＴ細胞エピトープを含むことを示す。これらの陽性結果は、試験した患者の群の各ペプチドの平均剌激インデックスの計算において使用した。図１２に示したこれらの結果は、９９９番の患者が、組換えCryjI及び精製した天然CryjI並びにペプチドＣＪ１−２、３、２０及び２２に対してよく応答するが組換えAmb a I．１には応答しないことを示している。これは、CryjIＴ細胞エピトープがこの特定のアレルギー患者からのＴ細胞により認識されること、並びにrCryjI並びにペプチドＣＪ１−２、３、２０及び２２がかかるＴ細胞エピトープを含むことを示す。更に、これらのエピトープは、しばしば、隣接する重複するペプチドで検出されず、従って、恐らく、反応性ペプチドの重複しない中央の残基に及ぶ。対照抗原でプライムされたＴ細胞又は他の抗原に対してCryjIプライムされたＴ細胞を用いるＴ細胞アッセイにおいて、有意の交差反応性は見出されなかった。抗原提示細胞としての利用のための（ＥＢＶ）トランスフォームしたＢ細胞の調製自家ＥＢＶトランスフォームした細胞系統を、２５，０００ラドでガンマー照射して、第２増殖アッセイ及び第２バルク刺激において抗原提示細胞として用いた。これらの細胞系統を、免疫蛍光フローサイトメトリー分析においても対照として用いた。これらのＥＢＶトランスフォームした細胞系統を、５×１０⁶ＰＢＬを１ｍｌのＢ−５９／８マーモセット細胞系統（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１２、メリーランド、Rockville在、American Type Culture Collection）調整培地と共に、１μｇ／ｍｌのフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下で、３７ ℃で６０分間、１２×７５ｍｍポリエチレン製丸底Falconスナップキャップチューブ（ニュージャージー、Lincoln Park在、Becton Dickinson Labware）中でインキュベートすることにより作成した。これらの細胞を、次いで、前述のようにＲＰＭＩ −１６４０にて１．２５×１０⁶細胞／ｍｌに希釈した（但し、熱で不活性化したウシ胎児血清１０％を補い、２００μｌのアリコートを平底培養プレートにて肉眼でコロニーが検出されるまで培養した）。次いで、それらを、細胞系統が樹立されるまで、より大きいウェルに移した。この発明が好適具体例に言及して記載されたにもかかわらず、他の具体例は、同じ結果に到達することが出来る。本発明の変形及び改変は、当業者には自明であり、すべてのかかる改変及び等価物は添付の請求の範囲に包含され且つ本発明の真の精神及び範囲に従うものである。配列表（１）一般的情報：（i）出願人：（A）名称：IMMULOGIC PHARMACEUTICAL CORPORATION （B）通り：610 Lincoln Street （C）市：Waltham （D）州：マサチューセッツ（E）国：USA （F）郵便番号：02154 （G）電話：（617）466-6000 （H）テレファックス：（617）466-6040 （ii）発明の名称：杉花粉由来のアレルゲン性蛋白質及びペプチド（iii）配列の数：55 （iv）コンピューター読み取り可能形式：（A）媒体型：フロッピーディスク（B）コンピューター：IBM PC 互換機（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：ASCII（TEXT）（v）現出願のデータ：（A）出願番号：（B）出願日：（vi）先願のデータ：（A）出願番号：（B）出願日：（viii）代理人の情報：（A）名称：Vanstone,Darlene （B）登録番号：35,729 （C）参照/ドケット番号：IPC-033PC （ix）電信用情報：（A）電話：（617）466-6000 （B）テレファックス：（617）466-6040 （２）配列番号１の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：１７２６塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （ix）配列の特徴：（A）特徴を表わす記号：CDS （B）存在位置：42..1586 （xi）配列（配列番号１）：（２）配列番号２の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：５１４アミノ酸（B）型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：蛋白質（xi）配列（配列番号２）：（２）配列番号３の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：４５アミノ酸（B）型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（v）フラグメント型：中間部（xi）配列（配列番号３）：（２）配列番号４の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：４１アミノ酸（B）型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:ペプチド（v）フラグメント型：中間部（xi）配列（配列番号４）（２）配列番号５の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：３６アミノ酸（B）型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:ペプチド（v）フラグメント型：中間部（xi）配列（配列番号５）：（２）配列番号６の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：１０アミノ酸（B）型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（v）フラグメント型：中間部（xi）配列（配列番号６）：（２）配列番号７の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：１４１０塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列（配列番号７）（２）配列番号８の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：１３９５塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列（配列番号８）：（２）配列番号９の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：１４７９塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列（配列番号９）：（２）配列番号１０の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：３５塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ０７Ｋ 14/415 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 8828−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ブラウアー，アンドルーダブリュー. アメリカ合衆国 01970 マサチューセッツ，セイレム，ゲドニーコート 21 (72)発明者ポロック，ジョーンアメリカ合衆国 02174 マサチューセッツ，アーリントン，ニューカムストリート 51

Claims

【特許請求の範囲】１．杉花粉アレルゲンCryjII又はその少なくとも１つの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、又は該ヌクレオチド配列の機能的等価物。２．該ヌクレオチド配列が、本質的に図４のヌクレオチド配列（配列番号：１）のコード部分の少なくとも１断片からなる、請求の範囲第１項に記載の核酸。３．該断片が、図４のヌクレオチド配列（配列番号：１）の塩基１０８〜１５８６（配列番号：９）を含む、請求の範囲第１項に記載の核酸。４．該ヌクレオチド配列が、本質的に図４のヌクレオチド配列（配列番号：１）からなる、請求の範囲第１項に記載の核酸。５．該断片が、図４のヌクレオチド配列の塩基１７７〜１５８６（配列番号：７）及び図４のヌクレオチド配列（配列番号：１）の塩基１９２〜１５８６（配列番号：８）からなる群より選択する塩基を含む、請求の範囲第１項に記載の核酸。６．杉花粉アレルゲンCryjII又はその少なくとも１つの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列の機能的等価物を含む発現ベクター。７．該ヌクレオチド配列が、本質的に図４のヌクレオチド配列（配列番号：１）のコード部分の少なくとも１断片からなる、請求の範囲第６項に記載の発現ベクター。８．該ヌクレオチド配列が、図４のヌクレオチド配列の塩基１０８〜１５８６（配列番号：９）を含む、請求の範囲第６項に記載の発現ベクター。９．請求の範囲第１項に記載の核酸によりコードされる蛋白質又はペプチドを発現するようにトランスフォームされた宿主細胞。１０．請求の範囲第１項に記載の核酸でトランスフォームした宿主細胞において産生された、単離されたCryjII蛋白質又はその少なくとも１つの抗原性断片。１１．杉花粉アレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥと結合しないか又は該免疫グロブリンＥとの結合が起きる場合でもかかる結合がマスト細胞若しくは好塩基球からのヒスタミンの放出を生じない、請求の範囲第１０項に記載の抗原性断片。１２．天然の精製CryjII蛋白質が免疫グロブリンＥに結合するよりも実質的に低い程度で免疫グロブリンＥに結合する、請求の範囲第１０項に記載の抗原性断片。１３．宿主細胞が大腸菌である、請求の範囲第１０項に記載の単離したCryjII蛋白質。１４．CryjII蛋白質又は少なくともその１断片の製造方法であって、下記の工程：ａ．CryjII蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列でトランスフォームした宿主細胞を適当な培地で培養してCryjII蛋白質又は少なくともその１断片を含む細胞及び培地の混合物を生成し、そしてｂ．前記の混合物を精製して実質的に純粋なCryjII蛋白質又は少なくともその１断片を生成することを含む、上記の方法。１５．CryjIIの全部又は一部をコードするヌクレオチド配列含む核酸でトランスフォームした宿主細胞中で合成したCryjII蛋白質又はその少なくとも１断片を含む蛋白質調製物。１６．前記のCryjIIの少なくとも１断片が抗原性断片である、請求の範囲第１５項に記載の蛋白質調製物。１７．化学的に合成したCryjII蛋白質又はその少なくとも１断片を含む蛋白質調製物。１８．前記のCryjII蛋白質が図４に示すアミノ酸配列（配列番号：２）を含む、請求の範囲第１５項に記載の蛋白質調製物。１９．前記のCryjII蛋白質が図４に示すアミノ酸配列（配列番号：２）を含む、請求の範囲第１７項に記載の蛋白質調製物。２０．少なくとも１つのCryjIIのＴ細胞エピトープを含む単離したペプチド。２１．最小免疫グロブリンＥ刺激活性としての、請求の範囲第２０項に記載の単離したペプチド。２２．杉花粉アレルゲンに特異的な免疫グロブリンＥに結合しないか又は該免疫グロブリンへの結合が起きる場合でもかかる結合がマスト細胞若しくは好塩基球からのヒスタミンの放出を生じない、請求の範囲第２０項に記載の単離したペプチド。２３．天然の精製CryjII蛋白質が免疫グロブリンＥに結合するよりも実質的に低い程度で免疫グロブリンＥに結合する、請求の範囲第２０項に記載の単離したペプチド。２４．単離したCryjII蛋白質又はその抗原性断片であって、それを投与された杉花粉に感受性の個人において、その個人の杉花粉アレルゲンに対するアレルギー応答を調節する、上記の蛋白質又はその抗原性断片。２５．個人の杉花粉アレルゲンに対するＢ細胞応答、個人の杉花粉アレルゲンに対するＴ細胞応答、又は個人の杉花粉アレルゲンに対するＢ細胞応答及びＴ細胞応答の両方を調節する、請求の範囲第２４項に記載の単離したCryjII蛋白質又は抗原性断片。２６．杉花粉に感受性の個人に投与したときにその個人のCryjIIに対するアレルギー応答を減じる修飾CryjII蛋白質又はその少なくとも１修飾断片。２７．単離したCryjII蛋白質又はその少なくとも１断片及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療用組成物。２８．前記のCryjII蛋白質が図４に示したアミノ酸配列（配列番号：１）を含む、請求の範囲第２７項に記載の治療用組成物。２９．杉花粉アレルゲン、又は杉花粉アレルゲンと免疫学的に交差反応性のアレルゲンに感受性の個人において、その個人に治療上有効な量の請求の範囲第２７項に記載の組成物を投与することを含む、当該抗原に対する感受性を治療する方法。３０．個人における杉花粉アレルゲンに対する感受性を検出する方法であって、その個人から得た血液試料を、請求の範囲第１項に記載の核酸でトランスフォームした宿主細胞にて生成するか又は化学的に合成した単離したCryjII蛋白質又はその抗原性断片と、血液成分の蛋白質若しくはその断片との結合に適当な条件下で合わせ、そしてかかる結合が起きる程度を測定することを含む、上記の方法。３１．結合が起きる程度を、Ｔ細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能、蛋白質又はその断片の血液中に存在する抗体又はその断片に対する結合を評価することにより測定する、請求の範囲第３０項に記載の方法。３２．CryjII蛋白質又はその少なくとも１つの抗原性断片と特異的に反応性である、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はそれらの免疫学的に反応性の断片。３３．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して約４０ｋＤの分子量を有する、杉花粉から単離したCryjII蛋白質。３４．ＡＴＣＣ寄託番号６９１０５を有する、CryjIIのｃＤＮＡ挿入物を含むベクターでトランスフォームした宿主細胞。３５．蛋白質アレルゲンCryjIIの少なくとも１つのエピトープを有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、組換えＤＮＡ分子。