WO2004087910A1

WO2004087910A1 - 組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官の生産方法及び新規組換えタンパク質

Info

Publication number: WO2004087910A1
Application number: PCT/JP2004/004382
Authority: WO
Inventors: Koichi Sugita; Saori Kasahara; Hiroyasu Ebinuma; Humio Takaiwa; Takahito Jomori; Yuji Hayashi; Akira Tashita; Yukari Kobara
Original assignee: National Institute Of Agrobiological Sciences; National Agriculture And Bio-Oriented Research Organization; Nippon Paper Industries Co., Ltd.; Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2004-10-14
Also published as: AU2004225649A1; US20070033676A1; AU2009200434B2; CN1816622B; US7847063B2; CA2520537C; US20110203016A1; JPWO2004087910A1; EP1609855A4; EP2256189A1; AU2004225649B2; KR20060013369A; CA2741545A1; CN1816622A; AU2009200434A1; CA2520537A1; JP4543236B2; EP1609855A1; CN102134577A

Abstract

　組換えタンパク質を植物貯蔵器官中に高生産させる方法、及び、ＧＬＰ−１誘導体を提供するものである。組換えタンパク質の遺伝子、サイトカイニン関連遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有するＤＮＡ因子を含み、かつ、サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子は脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一にする位置に存在し、植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパクは脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一にしない位置に存在するベクターを用いて、形質転換することにより、組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を得る。該方法によりＧＬＰ−１を生産し、更に酵素の分解作用に対して安定化した誘導体を提供する。

Description

明細書組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官の生産方法及び新規組換えタンパク質技術分野

本発明は、組換えタンパク質が高生産された植物の貯蔵官を生産する方法、及び、ぺプチダ一ゼ耐性化したヒトグル力ゴン様ペプチド一 1 (GL P - 1 ) の新規誘導体とその利用に関する。なお、本発明で、「組換えタンパク質」とは、「組換えペプチド及び組換えタンパク質」を包含するものである（以下、「組換えタンパク質」と表示する）。背景技術

遺伝子工学技術を利用した医薬品、臨床検査薬や工業原料の生産は、既に実産業において多大の貢献をなしており、中でも、微生物又は哺乳類培養細胞を宿主とした、物質生産系は特に広く利用されている。しかしながら、これらの細胞を培養するには、無菌環境が整った培養設備や培地等が必要であり、さらに、石油エネルギーの消費が避けられないためコスト高となっている。また、哺乳類細胞を宿主として用いると、人体に有害なウィルスの混入リスクが避けられない。

そのため、微生物や哺乳類細胞の培養による物質生産にかわる、安価で安全な物質生産システムとして形質転換植物を用いた物質生産システムの開発が行われている。例えば、生分解性ポリエステル等の高分子化合物（例えば、特開 2 0 0 2— 2 6 2 8 8 6号公報）、ワクチン（例えば、 G. Jaeger et al. , Eur. J. Biochem. 259, 426, 1999) ゃラクトフエリン（D. Chong et al. , Transgenic. Res. 9, 71, 2000) 等のタンパク質、エンケフアリン（特開 2 0 0 0— 1 0 6 8 9 0号公報）等のぺプチドを生産する形質転換植物の作製が現在までに報告されている。

形質転換植物の場合、その植物の可食部、例えば、ダイズゃイネの種子、野菜の葉などで人体に有益な機能性物質を生産させれば、目的物質の抽出工程を経ることなく、直接人体に経口摂取することが可能である。さらに、種子の場合には、冷蔵装置の完備した設備で保存や輸送を行う必要がなく、室温での安定的な長期保存が可能である。また、目的の物質を抽出する場合にも、種子は葉と異なり、フヱノール性物質の混入がほとんどないため、容易に精製することができる。従って、種子は目的の遺伝子産物を生産させる器官として理想的だと考えられ、これまでに、例えば、グリシニン（T. Katsube et al. , Plant. Physiol. 120, 1063, 1999)等のタンパク質、（ 1， 3— 1， 4)一 /3—ダルカナーゼ（H. Horvath et al. , Pro Nathl. Acad. Sci. USA. , 97, 1914, 2000)等の酵素、ェンケフアリン（D. Chong et al. , Transgenic. Res. , 9， 71, 2000) 等のべプチドを生産した種子の作製が報告されている。

しかしながら、形質転換植物による物質生産システムは、前記の優れた特性を持つ反面、現在の主流である微生物や哺乳類細胞培養システムに比較して生産効率が悪く、特に、植物貯蔵器官による生産効率は悪かつた。この問題を解決するため、形質転換植物における物質生産能力の増強策が様々に考案されている。例えば、貯蔵器官の一つである種子での物質生産能力を改善するため、導入した目的遺伝子の発現や遺伝子産物の蓄積向上を図る観点から、種子で強力に発現する種子貯蔵タンパク質のプロモー夕一の利用（例えば、 T. Katsube et al. , Plant. Physiol. , 120， 1063, 1999)、このプロモーターとこれに作用して発現を向上させる転写因子との併用（例えば、 D. Yang et al. , Pro Nathl. Acad. Sci. USA. , 98, 11438, 2001), 5，非翻訳領域の揷入（例えば、特開 2 0 0 2 - 5 849 2号公報）、遺伝子中の C + G含量の最適化（H. Horvath et al. , Proc. Nathl. Acad. Sci. USA. , 97, 1914, 2000)、小胞体への移行シグナルの付加（例えば、特開 2 0 0 0— 5 0 4 5 6 7号公報）等に関する研究が、精力的に行われている。また、外来遺伝子を導入する植物体として種子貯蔵タンパク質を欠く突然変異体を用いることにより、外来遺伝子産物の種子での生産量が向上したことも報告されている（特開 2 0 0 2 - 5 84 9 2号公報）。しかしながら、これらの改良だけでは、まだ十分に種子での物質生産能力が増強されたとは言えず、新たな手法の開発が望まれていた。

一方、 GL P— 1 (Glucagon like peptide-l) は、食物摂取により消化管より分泌され、塍臓に働いて糖依存的なィンスリン分泌を刺激するホルモンとして知られている。 2型糖尿病患者では、この GL P— 1に対する応答性は維持されているが、量的な不足がいわれている。 GL P 一 1剤の開発は、 GL P _ 1の不足分を補う、インスリン分泌促進剤としての糖尿病治療薬への応用に期待が持たれている。しかしながら、 G L P— 1の活性本体は、 GL P— 1 ( 7 - 3 6) アミドあるいは GL P — 1 ( 7 - 3 7) のポリペプチドであり、 G L P _ 1の経口摂取では消化管内で消化酵素により消化 '分解され、十分に吸収されない。このため臨床では、点滴による静脈内注射や皮下注射が試みられているのが現状である。しかも、 GL P— 1は、血中や組織に存在するジぺプチジルぺプチダ一ゼ IV (D P P— IV) によっても分解を受け、活性半減期が 1 〜 2分と非常に短いことや、腎臓から排泄され易く血中半減期が 5分以内であることが報告されており、これらが臨床応用へのネックになっている。

そこで、分解されにくく半減期の長い GL P— 1誘導体の開発が行われている。例えば、 8位アミノ酸置換誘導体（Di abet ol ogi a 41, 271 -278, 1998、 Bioc em 40, 2860-2869, 2001) 、 N末端および C末端アミノ酸の修飾体（W〇 9 8 0 8 8 7 1など）、 3 4位を A r gに置換し 2 6位 L y sに親油性基を導入した誘導体（W〇 0 0 0 7 6 1 7 ) 、及び配列全般に渡るアミノ酸置換による誘導体（W 09 94 3 7 0 5、 W09 1 1 1 4 5 7 ) 等である。また、皮下からの吸収が遅い徐放型注射剤の開発、あるいは GL P— 1様ァゴニスト活性をもち、血中半減期の長いトカゲ由来の合成 E X e n d i n - 4での注射剤の開発が行われている。しかし、これらは注射剤であり、患者の負担を考慮すると注射以外の経路で投与される新規 GL P— 1誘導体が望まれる。

本発明の課題は、組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法、該方法により生産された組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官、及び、ぺプチダーゼ耐性化したヒトグルカゴン様べプチドー 1 (GL P— 1 ) の新規誘導体とその利用を提供することにある。すなわち、形質転換植物の貯蔵器官における物質生産を増強させるため、前記のような様々な試みがなされている。しかしながら、医薬品等として有用な組換えタンパク質が生産された植物貯蔵器官を食事として摂取し、その十分な機能を体内で発揮させるには、より高度に組換え夕ンパク質が生産された植物貯蔵器官を生産する方法の開発が必要である < 同時に、植物から組換えタンパク質を抽出し、医薬品や機能性食品として加工する場合にも、それらの貯蔵器官に組換えタンパク質が高生産されていることがコスト面で重要である。従って、本発明の目的の一つは、形質転換植物において、組換えタンパク質が高生産された貯蔵器官を生産する新規な方法を提供することにある。

また、前記方法の植物貯蔵器官中で高生産させる組換えタンパク質として GL P— 1を選択すれば、通常の食事のように果実や米等を摂取するだけで糖尿病治療効果が期待できる。しかし、前記したように、この天然型 G L P— 1は、消化管内で消化酵素により消化 ·分解されるので、経口的に安定して投与することができず、したがって、現状では注射以外の有効な投与方法がない。そこで、何らかの方法により消化を受けずに胃を通過できれば、小腸で吸収されるのではないかと考えられる。ただし、吸収時には、 G L P— 1は単体として存在しなければならない。その際に、天然型 G L P— 1では、トリプシンなどの酵素により分解を受け失活してしまう。

更に、天然型 G L P— 1は、吸収された後もジぺプチジルぺプチダ一ゼ IVによる分解を受け、作用の持続は期待できない。したがって、 G L P— 1の経口投与によって薬理効果を得るには、アミノ酸置換によってトリプシンやジぺプチジルぺプチダ一ゼ IVによる分解を受けにくく、活性に持続性のある G L P— 1誘導体をデザィンする必要がある。

従って、本発明の他の目的の一つは、トリプシン等の消化酵素に対する耐性をもつ経口投与が可能な新規 G L P - 1誘導体、更に好ましくは、ジぺプチジルぺプチダ一ゼ IV に対する耐性をも合わせもつ新規 G L P 一 1誘導体を提供することにある。このためには、食事として摂取された場合に吸収され、薬理効果を示す G L P— 1誘導体を得ることである。発明の開示

本発明者は、形質転換植物において、組換えタンパク質が高生産された貯蔵器官を生産する方法について、鋭意研究した結果、植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質の遺伝子、サイトカイニン関連遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有する D N A因子を含み、かつ、サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子は脱離能を有する D N A因子と挙動を一にする位置に存在し、植物の貯蔵器官中に発現させる組換え夕ンパク質の遺伝子は脱離能を有する D N A因子とは挙動を一にしない位置に存在するべクタ一を構築し、該ベクターを細胞中に導入し、該遺伝子が導入された植物の細胞から形質転換体を再分化せしめ、該再分化した形質転換体から貯蔵器官を得ることにより、形質転換植物において、組換えタンパク質が高生産された貯蔵器官を生産することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。

また、本発明は、該組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法を、糖依存的なィンスリン分泌を刺激するホルモンとして知られている GL P— 1に適用すると共に、該 GL P— 1の誘導体を作製して、消化酵素等により消化 ·分解されない、更には、血漿中でも安定な GL P— 1の誘導体を提供するものである。すなわち、本発明者らは、 GL P— 1 ( 7 - 3 6) あるいはそのアミノ酸配列の 1 もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列からなり、かつ G L P— 1活性を有するペプチドにおいて、 2 6位をグルタミンに、 34 位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換した GL P— 1誘導体が、天然型 GL P— 1 と同程度の活性を維持し、トリプシンのような消化酵素に対する耐性をもち、小腸からの吸収が可能であることを見い出した。また、更に 8位のァラニンをセリン又はダリシンに変更することにより、ジぺプチジルぺプチダーゼ IVに対する耐性をも獲得し、血漿中でも安定であることを見い出し本発明をなした。また、従来ペプチドを経口投与した場合胃においてペプシンで分解されてしまうので、ペプチドの経口投与は不可能であった。しかし本発明の植物貯蔵器官で産生させることにより、ペプシン耐性を獲得することができ、経口投与が可能となった。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の実施例において、 p G 1 b G L P 1 3 0 Hm作製スキムのうち、 P TL 7から p G 1 b GL Pの作製までを示す図である。第 2図は、本発明の実施例において、 p G l b GL P 1 3 0 Hm作製スキムのうち、 p UC 1 8及び p NP 1 1 3 0から P NP I 1 3 0 PU Cの作製までを示す図である。

第 3図は、本発明の実施例において、 p G 1 b GL P 1 3 0 Hm作製スキムのうち、 p N P I 1 4 0及び p N P I 1 3 0 P U Cから p N P I 1 3 0 Hmの作製までを示す図である。

第 4図は、本発明の実施例において、 p G l b GL P及び p N P I l 3 0 Hmから p G l b GL P 1 3 0 Hmの作製までを示すと共に、 p G 1 b G L P 1 3 0 Hmの制限酵素地図を示す図である。

第 5図は、本発明の実施例において、実施例 1及び比較例 1で得られたイネ完熟種子における、 GL P— 1誘導体融合タンパク質の蓄積レべルを示す図である。

第 6図は、本発明の実施例において、従来型べクタ一 p G 1 b GL P —Hmの制限酵素地図を示す図である。

第 7図は、本発明の実施例において、実施例 2に示した方法に従って、比較製造例 1の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) (天然型 GL P— 1 ) 、比較製造例 2の [S e r s] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) 、比較製造例 3の [G 1 y 8] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) , および製造例 1の [G 1 n 26, A s η 34] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) のサイクリック AM P産生活性を測定した結果を示す図である。

第 8図は、本発明の実施例において、実施例 3に示した方法に従って、 [G i n A s n ] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) をトリプシン処理し、トリプシン処理したものと処理なしのものとで、サイクリック A M P産生活性の濃度依存性を比較した図である。

第 9図は、本発明の実施例において、実施例 4で示した方法に従い、実施例 1で得られたイネ完熟種子の白米及びその粉末由来の GL P - 1 誘導体、比較製造例 1の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) (天然型 G L P一 1 )、製造例 2の [S e r ⁸， G l n ²⁶, A s p ³⁴] — GL P— 1 ( 7 - 3 6)、製造例 3の [S e r ⁸, G l n ²⁶, A s n ³⁴] — GL P— 1 ( 7 - 3 6) を用いて、ペプシンに対する安定性を比較した図である。

第 1 0図は、本発明の実施例において、実施例 5で示した方法に従い、ィネ完熟種子から融合タンパクとして [ S e r 8， G 1 n 26， A s p ] 一 GL P— 1 (7 - 3 6) を抽出し、この抽出画分のトリプシン処理時間とサイクリック AMP産生活性の関係を示した図である。

第 1 1図は、本発明の実施例において、実施例 6で示した方法に従い、比較製造例 1 の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) (天然型 GL P— 1 )、製造例 2の [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s p ³⁴] 一 GL P— 1 (7— 3 6 )、製造例 3の [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s n ³⁴] 一 GL P— 1 ( 7— 3 6) を用いて、トリプシン耐性を比較した図である。

第 1 2図は、本発明の実施例において、実施例 7で示した方法に従い、比較製造例 1の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) (天然型 GL P— 1 )、製造例 2の [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s p ³⁴] 一 GL P— 1 (7— 3 6)、製造例 3の [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s n ³⁴] 一 GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) を用いて、 D P P— I V耐性を比較した図である。

第 1 3図は、本発明の実施例において、実施例 8で示した方法に従い、比較製造例 1 の GL P— 1 ( 7 - 3 6) (天然型 G L P— 1 amide)、製造例 2の [S e r ⁸，G l n ²⁶, A s p ³⁴] — GL P— 1 (7— 3 6 )、製造例 3の [S e r ⁸,G l n ²⁶， A s n ³⁴] — GL P— 1 ( 7— 3 6) を用いて、ィンスリン分泌促進活性を比較した図である。

第 1 4図は、本発明の実施例において、実施例 9で示した方法に従い、比較製造例 1 の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) (天然型 GL P— 1 )、製造例 2の [S e r ⁸，G l n ²⁶, A s p ³⁴] 一 GL P— 1 (7— 3 6 )、製造例 3の [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s n ³⁴] — GL P— l ( 7 - 3 6 ) を用いて、マウス経口糖負荷試験における血糖低下効果を比較した図で、図 1 5の 0から 1 2 0分までの血糖値の変動を示すグラフの曲線下面積を、血糖値変化量として示している。

第 1 5図は、本発明の実施例において、実施例 9で示した方法に従い、比較製造例 1 の GL P— 1 (7 - 3 6 amide) (天然型 GL P— 1 )、製造例 2の [S e r ⁸,G l n ²⁶， A s p ³⁴] — GL P— l ( 7— 3 6)、製造例 3の [S e r ⁸，G l n ²⁶， A s n ³⁴] 一 GL P— l ( 7 - 3 6 ) を用いて、マウス経口糖負荷試験における血糖低下効果を比較した図で、 0から 1 2 0分までの血糖値の経時的な変化を示している。発明を実施するための最良の形態

[組換えタンパク質高生産植物貯蔵器官の生産]

本発明は、組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法であって、次の過程（A) 、 (B) 、 (C) からなるものである： (A) 植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子、サイトカイニン関連遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有する DN A因子を含み、かつ、サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子は脱離能を有する DN A因子と挙動を一にする位置に存在し、植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子は脱離能を有する DN A因子とは挙動を一にしない位置に存在するべクタ一を構築し、該ベクターを細胞中に導入する過程、（B) 上記（A) により、ベクターが導入された植物細胞を、薬剤添加培地及び薬剤非添加培地にて培養を行うことにより形質転換体を再分化せしめる過程、（C) 上記（B) にて再分化した形質転換体から、植物貯蔵器官を得る過程。以下、本発明について詳細に説明する。 (対象植物）

本発明で植物貯蔵器官の生産に用いる対象植物としては、貯蔵器官が形成されるものであれば、特に限定されるものではないが、双子葉植物としては、タバコ、ナタネ、ダイズ等を、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ等の穀類やアスパラガス等を、代表的なものとして挙げることができる。また、本発明で組換えタンパク質を高生産させる植物貯蔵器官としては、特に限定されるものではないが、果実、塊根、塊茎、種子等を、代表的なものとして挙げることができる。

(使用する遺伝子）

本発明において使用する遺伝子は、 c DNA又はゲノム DNAのクロ一二ングにより得ることができる。また、あらかじめその D N A配列が明らかにされているものであれば、これを化学合成して得てもよい。さらに、 DNA配列が明らかでなくとも、アミノ酸配列が明らかであれば、アミノ酸配列から推定される DN A配列を化学合成できる。

本発明において、遺伝子は、必要に応じ、その発現のために必要なプ口モーター及び又は夕—ミネ—夕—の配列と、さらには遺伝子産物を貯蔵器官へ効率的に移行させるシグナル配列とを連結して使用する。これらのプロモータ一、夕一ミネ一夕一及びシグナル配列は、植物において機能するものでありさえすれば、別に制限なく使用することができる。例えば、このようなプロモータ一としては、カリフラワーモザイクウイルスの 3 5 Sプロモーター（ J . T. Ode 11 et al. , Nature (London), 313, 810, 1985)、ノパリン合成酵素のプロモ一夕一（W. H. R. Langridge et al. , Plant Cell Rep. , 4, 355, 1985)等を使用することができる。更に，誘導型プロモー夕一を用いれば、遺伝子発現を制御することができる。かかる誘導型プロモー夕一は現在までに数多く知られている。例えば、化学物質に反応して誘導されるものとして、ダルタチオン— s— トランスフエラーゼ I系遺伝子のプロモ一夕一（特開平 5— 2 6 8 9 6 5号公報）、ダル夕チオン— S—トランスフェラ一ゼ II系遺伝子のプロモータ — (国際公開 WO 9 3 Z 0 1 2 9 4号公報）、 T e t リプレッサー融合型カリフラワーモザイクウィルス 3 5 S プロモーター（C. Gatz et al. , Mol. Gen. Genet. , 227, 229, 1991)、 L a cォペレ一夕一/リブレッサ —系プロモ一ター（R. J. Wilde et al. , The ΕΜΒΟ Journal, 11, 1251, 1992)、 a 1 c R/ a 1 c A系プロモーター（国際公開 WO 94/ 0 3 6 1 9号公報）、ダルココルチコイド系プロモー夕一（青山卓史、蛋白質核酸酵素、 4 1 : 2 5 5 9、 1 9 9 6)、 p a r系プロモ一夕一（T. Sakai et al. , Plant Cell Physiol. , 37, 906， 1996) 等が、また光に反応して誘導されるものとしてリブロース 2リン酸カルボキシラ一ゼ小サブュニット遺伝子（ r b c S ) のプロモーター（R. Fluhr et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 83, 2358, 1986)、フルクトース一 1， 6 _ビスホスファ夕ーゼ遺伝子のプロモーター（特表平 7— 5 0 1 9 2 1号公報）、集光性クロロフィル aZb結合タンパク質遺伝子のプロモーター（特開平 5— 8 9号公報）等が、その他、傷害、温度などのさまざまな外部環境等に反応して誘導されるプロモーターが知られている。

本発明の組換えタンパク質遺伝子のプロモータ一としては、上記のように、 3 5 Sプロモータ一等の恒常的発現を示すプロモーターや、誘導型プロモーターを用いることもできるが、組換えタンパク質遺伝子を生産させようとする植物貯蔵器官中での発現が保証されている、該植物貯蔵器官特異的プロモーターが特に望ましい。このように植物の特定組織や器官において特異的な発現を促進するプロモータ一に関しても、当業者らに広く知られている。例えば、本発明においては、かかるプロモーターとして、イネ種子で外来遺伝子を発現させる種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモータ一である、グロブリン遺伝子のプロモータ一（M. Nakase et al. , Plant Mol. Biol. , 33, 513, 1997)、グルテリン遺伝子のプロモータ一（F. Takaiwa et al. , Plant Mol. Biol. , 17, 875, 1991) 等を用いることができる。さらに、インゲンマメ、ソラマメ、エンドゥ等の豆科作物や、ピ一ナツ、ゴマ、ナタネ、綿実、ヒマヮリ、サフラヮ一等の油糧用種子作物の種子で外来遺伝子を発現させるプロモーターである、グリシニン遺伝子のプロモーター、グルシフェリン遺伝子のプロモーター（J. Rodin et al. , Plant Mol. Biol. , 20, 559, 1992)等、各作物の主要な種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモ一夕一も用いることができる。

一方、本発明において、ターミネータ一としては、ノパリン合成酵素の夕一ミネ一夕一（A. Depicker et al.、 J. Mol. Ap l. Gen. , 1， 561, 1982)、ォクトビン合成酵素のタ一ミネ一夕一（J. Gielen et al. , EMB0 J. , 3, 835, 1984)を始め、 D Ν Αデ一夕ベースに登録されている植物遺伝子の夕一ミネ一夕一等を種々選択して使用することができる。

本発明において、植物に導入できる組換えタンパク質遺伝子は、人や家畜等の動物の健康に寄与できる機能性べプチド、医薬用べプチド等をコードする遺伝子だけでなく、機能未知な任意のぺプチド又は夕ンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、本発明の実施例においては、 GL P— 1誘導体をコードする遺伝子を植物に導入し、植物の種子において GL P— 1誘導体を生産させたが、本発明の手法により植物の貯蔵器官で生産させることができる組換えタンパク質としては、 GL P— 1やその誘導体に限られるものではなく、既に医薬品として使用又は開発されている様々なペプチドやタンパク質（S. 〗osephson and R. Bishop, TIBTECH, 6, 218, 1988)を始め、近年見出されたコレステロ一ル低減化べプチド（例えば、特開 2 0 0 1— 1 1 4 8 0 0号公報）、ダ二や花粉抗原の T細胞ェピトープペプチド（例えば、米国特許 6 2 6 8 4 9 1号、特開平 1 0— 7 7 0 0号公報、特開平 1 0— 2 5 9 1 9 8号公報、特開平 1 0— 5 0 6 8 7 7号公報、特開平 1 1一 9 2 4 9 7号公報、特開 2 0 0 0— 3 2 7 6 9 9号公報）等、様々なぺプチドゃタンパク質を本発明の手法により植物貯蔵器官で生産させることができる。更に、これらのペプチドは、その性質及び目的に応じて適宜改変したものを生産させてもよい。即ち、 GL P— 1について例示すると、本発明は G L P— 1の他、 GL P— 1 (7 - 3 6 ) あるいはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び /又は付加された配列からなり、かつ GL P— 1活性を有するペプチド、又は、該ペプチドの 2 6位をグルタミンに、 34位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換したアミノ酸配列を有する GL P— 1誘導体に適用できる。また、本発明は、 GL P— 1 ( 7 - 3 6) 或いはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び又は付加された配列からなり、かつ GL P— 1活性を有するペプチドが、 GL P— 1 ( 7 - 3 6) 、 GL P — 1 ( 7 - 3 7 ) 又はそれらの C末端アミドである GL P— 1誘導体にも適用できる。更に、本発明は、これらの G L P _ 1誘導体の 8位をセリン又はダリシンに置換した GL P - 1誘導体及び配列番号 2に記載の GL P— 1誘導体にも適用できる。

(導入組換えタンパク質遺伝子の構築）

本発明においては、これら組換えタンパク質をコードする遺伝子（D NA配列）を、例えば、種子貯蔵タンパク質等、本発明の手法により組換えタンパク質を高生産させようとする植物貯蔵器官で本来発現しているタンパク質の遺伝子中、そのタンパク質の蓄積量等に悪影響を生じさせない可変領域をコ一ドする遺伝子配列に挿入、又は置換した融合遺伝子を用いることができる。例えば、実施例においては、上記 GL P— 1 誘導体をコ一ドする遺伝子をグロプリン遺伝子中、夕ンパク可変領域を

3 コードする位置に挿入し、融合遺伝子として使用した。また、このとき、組換えタンパク質遺伝子とこれを挿入、又は置換した植物貯蔵器官で本来発現している貯蔵夕ンパク質遺伝子との境界に酵素切断配列を配置することにより、かかる融合遺伝子の発現産物を抽出した後、酵素処理により、目的の組換えタンパク質を切り出し、精製することができる。さらに、トリプシンなどの消化酵素による切断配列をここに配置すれば、本発明の手法により組換えタンパク質が高生産された種子等の植物貯蔵器官を食事として摂取した後、目的のぺプチド又はタンパク質が小腸で切り出されて体内へ吸収され、様々な生理機能を発揮することとなる。なお、種子貯蔵タンパク質とは、主として種子に貯蔵されるタンパク質であり、発芽に必要な栄養素として重要な働きをする（稲学大成第 3 巻、農山漁村文化協会）。本発明で用いることができる種子貯蔵タンパク質遺伝子の種類は特に限定されるものではなく、例えば、イネのグロブリンや、グルテリン、プロラミン、シロイヌナズナの 2 Sアルブミン (特開 2 0 0 0— 1 0 6 8 9 0号公報）等の遺伝子を用いることができる。更に、組換えタンパク質遺伝子の挿入位置は、種子貯蔵タンパク質遺伝子が本来コ一ドしているタンパクの特性に変化を生じさせない可変領域であれば、特に限定されるものではない。例えば、本発明の実施例では、イネのグロブリンの 1 0 9番目のアミノ酸部位をコードする位置へ G L P— 1誘導体をコードする遺伝子を挿入した。

(導入べクタ一の構築）

本発明においては、サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子が、脱離能を有する D N A因子と挙動を一つにする位置に存在し、また、これとは挙動を一つにすることのない位置に前記組換えタンパク質遺伝子が存在するように構築したベクタ一により、植物への遺伝子導入を行う。

ここでサイトカイニン関連遺伝子とは、植物における細胞分裂の促進や植物の組織からの定芽ゃ不定芽の分化等を引き起こす機能を有する、サイトカイニンの生成等に関与する遺伝子のことをいう。

かかるサイトカイニン関連遺伝子としては、例えば、ァグロパクテリゥム ■ ッメファシエンス（以下、 A. ッメファシエンスと略する。）由来の i p t遺伝子 (A. C. Smigocki, L. D. Owens, Pro atl. Acad. Sci. USA 85， 5131, 1988) 、ロドコッカス由来の i p t遺伝子、シロイヌナズナ由来のサイトカイニン合成酵素遺伝子、シユードモナス由来の p t z遺伝子等のサイトカイニン合成遺伝子の他、不活性型サイトカイニンを活性化する遺伝子である大腸菌由来の /3 -glucuronidase 遺伝子 (Morten Joersbo and Finn T.Okkels, Plant Cell Reports 16, 219- 221 , 1996) や、サイトカイニン受容体遺伝子と考えられているシロイヌナズナ由来の C K I 1遺伝子（Kakimoto T. Science 274， 982-985, 1996) 等のサイトカイニン関連遺伝子が、いずれも本発明において使用することができる。

また、本発明において、薬剤耐性遺伝子とは、これが導入された植物細胞に、抗生物質耐性や農薬耐性を付与する遺伝子のことをいう。かかる抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子 (HP T ：ハイグロマイシンリン酸化酵素遺伝子）やカナマイシン耐性遺伝子（NP T I I ：ネオマイシンリン酸化酵素遺伝子）等を、農薬耐性遺伝子としては、スルフォニルゥレア系耐性遺伝子（AL S ；ァセトラクテート合成酵素遺伝子）等を使用することができる。

脱離能を有する DNA因子とは、これらが存在し、機能する染色体 D NA等から、それ自身が脱離し得る能力を有する DNA配列をいう。植物ではこのような因子として、染色体 DN Aに存在するトランスポゾンと呼ばれるものが知られており、その構造と働き、そしてその挙動もほぼ判明している。すなわち、トランスポゾンが機能するためには、原則として、その内部にある遺伝子から発現し、それ自身の脱離及び転移を触媒する酵素（転移酵素）と、やはりその内部の末端領域に存在し、この転移酵素が結合し作用する D N A配列という、 2つの構成要素が必要とされる。これらの働きにより、トランスポゾンはその存在する染色体 DNAから脱離し、その後、普通は DN A上の新たな位置に転移するが、一定の確率で転移できぬままその機能を失い、消失等をする場合も生ずるので、本発明ではこのようなトランスポゾンの転移ミスを利用する。なおトランスポゾンには、このような自律性トランスポゾン、すなわち、転移酵素と DN A結合配列という 2つの要素を保持していて、トランスポゾン内部から発現する転移酵素が末端領域に存在する DN A配列に結合して作用することにより、自律的にその存在する染色体上から脱離して転移しうるものの他、非自律性トランスポゾンと呼ばれるタイプもある。この非自律性トランスポゾンとは、転移酵素が結合し作用する末端の DN A配列は保持しているものの、内部にある転移酵素遺伝子に変異が生じており、転移酵素の発現がないため、自律的に染色体上から脱離することができないものをいう。しかし、非自律性トランスポゾンも、自律性トランスポゾンあるいはこれとは独立して存在する転移酵素遺伝子から転移酵素が供給されると、自律性トランスポゾンと同様の挙動を示すこととなる。

自律性トランスポゾンとしては、トウモロコシより単離された A c と S pm等がある（A. Gieri and H. Saedler, Plant ol. Biol. , 19, 39, 1992) 。とりわけ A cは、トウモロコシの染色体中、 wx— m 7遺伝子座を制限酵素 S a u 3 Aで切り出すことにより得ることができる（U. Behrens et al. , Mol. Gen. Genet. 194, 346, 1984) 、植物トランスポゾンの中では最も解析の進んでいる自律性トランスポゾンであり、その DNAシーケンスも既に解明されているので（M. Mul ler-Neumann et al. , Mol. Gen. Genet., 198, 19, 1984) 、当業者が容易に取得可能なことから、本発明に使用する DNA因子として相応しい。また、非自律性トランスポゾンとしては、それぞれ A c、 S pmの内部領域が欠損したものである、 0 3ゃ013 111を始め（H. - P. Dor ing and P. Starl inger, Ann. Rev. Genet. 20, 175, 1986) 、トウモロコシ以外にも、キンギヨソゥ、アサガオ等の多くの植物から単離されたもの（例えば、 Y. Inagaki et al. , Plant Cell, 6， 375, 1994) が知られている。

因みに、これらのトランスポゾンは、その由来する植物と異なる種類の植物の染色体に導入された場合でも、その能力を発揮して脱離し、転移することが多くの例で知られている（例えば、 B. Baker et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

83, 4844, 1986) 。なお、本発明においては、自律性、非自律性のいずれのトランスポゾンを使用することもできる。非自律性のトランスポゾンを用いる場合には、これに加え、自律性卜ランスポゾン等から取得、または合成した転移酵素遺伝子を導入する必要があるが、その場合は、本発明のベクターにこの非自立性トランスポゾンと共に組込んで導入してもよく、また、全く別個に導入してもよい。

更に、植物以外に存在する脱離能を有する DNA因子としては、部位特異的組換え系（site-specific recombination system) に由来するものが知られている。この部位特異的組換え系は、特徴的な DN A配列を有する組換え部位（本発明の脱離能を有する DNA因子にあたる。）、及びこの D N A配列に特異的に結合して、その配列が 2以上存在したとき、その配列間の組換えを触媒する酵素、という 2つの要素からなり、そして、この D N A配列が同一 D N A分子上に、同一方向を向いてある一定の間隔で 2か所存在している場合には、これに挟まれた領域がこの DNA分子（プラスミド、染色体等）から脱離し、またこの配列が対向する方向を向いて 2か所存在している場合には、この領域が反転する、という挙動を示す。本発明では、この前者の脱離作用を利用する。なお組換え酵素をコードする遺伝子は、必ず組換え部位と同一の DNA分子上に存在する必要はなく、これと同一細胞内に存在し、発現していさえすれば、この DNA配列間の脱離，反転を生ぜしめ得ることが知られている（N. L. Craig, Annu. Rev. Genet. , 22, 77, 1988) 。

現在、部位特異的組換え系は、ファージ、細菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離された C r e / 1 o x系、 RZR S系、 F L P系、 c e r系、 f i m系等が知られているが（総説として、 N. L. Craig, Annu. Rev. Genet. , 22, 17, 1988) 、高等生物ではまだその存在を知られていない。しかし、これらの微生物から分離された部位特異的組換え系も、国際公開 WO 9 3/ 0 1 2 8 3号公報において、 P 1ファージ由来の C r e / 1 o x系が植物への遺伝子導入用べクタ一に利用されているように、植物等、その由来する生物種と異なる生物種に導入された場合でも、そのそもそもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが明らかとなっている。ちなみに本発明の一実施例では、酵母（Zygosaccharomyces rouxii) の部位特異的組換え系である R/R S系（H. Matsuzaki et al. , J. Bacteriology, 172, 610, 1990) を、その組換え部位間に組換え酵素を挿入して利用したが、この RZR S系もまた、高等植物においてその本来の機能を維持することがすでに報告されている（H. Onouchi et al. , Nucleic Acid Res. , 19, 6373, 1991) 。

本発明において、サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子を挿入する場所は、脱離能を有する DNA因子と共に、これが脱離し得る位置でありさえすればよい。例えば、脱離能を有する DNA因子として自律性トランスポゾンを用いた場合には、転移酵素遺伝子のプロモーター領域より上流で、この転移酵素が結合する末端領域よりは下流の、トラン

8 スポゾンの脱離に影響を及ぼさない位置にこれを挿入することができるまた R/R S系を用いた場合には、組換え部位に挟まれた領域内で、組換え酵素の発現を阻害しない位置でありさえすれば、これをどこにでも揷入することができる。

(構築したベクターの植物細胞への導入）

本発明においては、こうして構築したベクタ一を植物細胞に導入する。該ベクターを導入する植物としては、前記（対象植物）の項で記載したように、貯蔵器官を形成する植物であれば特に限定はされないが、例えば、単子葉植物であれば、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ等の穀類やアスパラガス等を、双子葉植物であれば、タバコ、ナタネ、ダイズ等を代表的な植物として挙げることができる。また、構築したベクタ —の植物細胞への導入も、公知の方法を使用して行うことができる。例えば、ァグロパクテリゥム属細菌を介する方法の他、エレクト口ポレーシヨン法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法等、公知の方法をいずれも使用することができ、特に限定されることはない。

例えば、本発明の方法を用いてイネに組換えタンパク質遺伝子を導入する場合には、特許第 3 1 4 1 0 8 4号記載の方法を好適に使用することができる。このときイネ種子を播種し、発芽させるための播種培地としては、例えば、 N 6 C 1 2培地（N 6無機塩類及びビタミン類（Chu C. C. , 1978, Proc. S卿. , Plant Tissue Culture , Sience Press Peking, pp.43-50) , 3 0 g/L シユークロース、 2. 8 g/L プロリン、 0. 3 gZL カザミノ酸、 l mgZL 2， 4—D、 4 gZL ゲルライト）等を使用することができる。しかしながら、上記培地組成に特に限定されることはなく、その組成物の種類や濃度を変更することによっても、本発明を実施することができる。

(形質転換体の再分化）組換えタンパク質遺伝子を導入した植物細胞又は組織からの形質転換体の再分化にあたっては、遺伝子導入処理後の細胞又は組織を薬剤添加培地及び薬剤非添加培地にて、公知の方法を用いて培養すればよい。なお、本発明において、形質転換体とは、定芽、不定芽、不定根等の植物組織又は幼植物体のことを言う。

例えば、本発明により、イネに組換えタンパク質遺伝子を導入して形質転換体を得る場合であれば、前記のようにして構築したベクタ一を用い、特許第 3 141 084号記載の方法に従って遺伝子導入処理を行った発芽種子よりイネの胚盤組織を切り出して、この胚盤組織を、例えば、薬剤添加培地 N 6 C 1 2 T CH 2 5培地（N 6無機塩類及びビタミン類、 30 gノ L シユークロ一ス、 2.8 g/L プロリン、 O. S gZL 力ザミノ酸、 2mgZL 2 , 4一 D、 500 m g / L カルペニシリン、 2 5 m g/L ハイグロマイシン、 4 gZL ゲルライト）で 1週間培養した後、更に、薬剤添加培地 N 6 C 1 4TCH25培地（N 6無機塩類及びビタミン類、 30 gZL シユークロース、 2. 8 g L プロリン、 0. 3 g/L カザミノ酸、 4mgZL 2， 4一 D、 5 00 m g/L カルべニシリン、 2 5mgZL ハイグロマイシン、 4 gZL ゲルライト）で 1週間培養し、次に薬剤非添加培地 MS RC培地（MS 無機塩類及びビタミン類（MurasMge, T. and Skoog, F. , 1962, Physiol. Plant., 15, 473) , 30 g / L シュ一クロース、 30 g/L ソルピトール、 2 gZL カザミノ酸、 S O Omg/L カルペニシリン、 4 g/L ゲルライト）で培養することにより、芽又は幼植物体として形質転換体を得ることができる。もちろん、上記に例示した培養条件は絶対的なものではなく、必要に応じ、培地組成の種類や濃度を変更したり、種々の植物ホルモンや薬剤を添加したり、培養期間を変更することができる。なお、薬剤添加培地としては、前記のようにして構築し、遺伝子導入に用いたベクターに組込まれた、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した培地を用いる。例えば、このベクターにハイグロマイシン耐性遺伝子を組込んだ場合はハイグロマイシンを添加した培地を、カナマイシン耐性遺伝子を組込んだ場合はカナマイシンを添加した培地を、スルフォニルゥレア系耐性遺伝子を組込んだ場合はスルフォニルゥレア系農薬を添加した培地を用いればよい。

(植物貯蔵器官の取得）

本発明において植物貯蔵器官は、組換えタンパク質遺伝子を導入した植物細胞又は組織より、上記のようにして形質転換体を再分化した後、公知の方法を用いてこの形質転換体を生育させることで、取得すればよい。例えば、この形質転換体が不定芽である場合には、公知の方法により、発根処理等を行なって、植物個体を再生し、該植物個体を育成して結実させ、組み換えタンパク質が高生産された植物成熟種子等の貯蔵器官を収穫すればよい。なお、不定芽の発根は、 MS寒天培地に不定芽を揷しっける等の方法を用いて行うことができる。また、形質転換体が幼植物体として得られた場合には、発根処理等を行わずとも形質転換植物を得ることができる。さらに、植物貯蔵器官として塊根や塊茎等を利用する場合には、得られた形質転換体から、植物個体の再生過程を経ることなく、公知の手段により、これらの組織を分化させて取得することも出来る。

(G L P— 1類の生産）

本発明では、本発明の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法を用いて、 GL P— 1類を提供する。 GL P— 1は、糖依存的なィンスリン分泌を刺激するホルモンとして知られているもので. G L P - 1 ( 7 - 3 6 ) とは、 H i s — A l a— G l u— G l y— Th r - P h e -T r - S e r -A s p -V a 1 一 S e r - S e r - T y r - L e u -G l u - G l y - G l n -A l a - A 1 a - L y s - G 1 u - P h e - I 1 e - A 1 a -T r p -L e u -V a 1 - L y s - G 1 y - A r gで示される配列を持つペプチドである。本発明においては、該 GL P— 1 (7— 3 6) のアミノ酸配列をコードする遺伝子、或いは、 GL P— 1 (7 - 3 6) のアミノ酸配列の 1 もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列からなり、かつ GL P— 1活性を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子を、上記組換えタンパク質として本発明において構築したベクターに組込み、該遺伝子を発現させて、 GL P— 1類を生産する。

(GL P - 1誘導体）

本発明は、上記のように GL P— 1類の生産方法を提供すると共に、該 GL P— 1の誘導体を作製して、消化酵素等により消化 ·分解されない、更には、血漿中でも安定な G L P - 1の誘導体を提供するものである。本発明の誘導体は、 G L P— 1 ( 7— 3 6 ) 或いはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び z又は付加された配列からなり、かつ GL P— 1活性を有するペプチドにおいて、 2 6位をグルタミンに、 34位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換して、該 GL P— 1誘導体が、天然型 GL P一 1 と同程度のィンスリン分泌促進活性を維持し、かつトリプシンのような消化酵素に対する耐性を持たせることによって、小腸からの吸収が可能となるように改変したものである。また、更に 8位のァラニンをセリン又はグリシンに変更することにより、ジぺプチジルぺプチダーゼ IVに対する耐性をも獲得し、血漿中でも安定であるように改変したものである。

すなわち、本発明の GL P— 1誘導体は、 GL P— 1 ( 7— 3 6 ) 、或いは、そのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列からなり、かつ、 GL P— 1活性を有するぺプチドの， 2 6位をグルタミンに、 3 4位をァスパラギンもしくはァスパラギン酸に置換したものであるが、ここで、 GL P— 1 ( 7 - 3 6) 或いはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z 又は付加された配列からなり、かつ GL P— 1活性を有するペプチドとは、 GL P— 1の前駆体、類縁体、およびこれらの C末端アミド体をも含むものであり、好ましくは、 GL P— 1 ( 7— 3 6) 、 GL P— 1 ( 7 - 3 7 ) 又はそれらの C末端アミドである。本発明の GL P— 1誘導体は、更に、 8位をセリン又はグリシンに置換するのが、特に好ましい。ジぺプチジルぺプチダ一ゼ IVは、ポリべプチド鎖の N末端から 2番目のプロリンあるいはァラニンを認識して、そのカルボキシル基側を加水分解する酵素である。そこで、本発明の GL P— 1誘導体は、 8位のァラニンをセリンあるいはグリシンに変更することが好ましい。この 8位置換体は、天然型 GL P— 1と同程度の活性を維持し、血漿中でも安定である。

上記のとおり、本発明で用いる GL P— 1 ( 7 - 3 6) は、次のアミノ酸配列： H i s - A 1 - G l u - G l y -T h r -P h e -Th r 一 S e r -A s p -V a 1 — S e r - S e r -Ty r -L e u - G l u - G l y - G l n -A l a - A 1 a— L y s — G l u— P h e— I 1 e - A 1 a -T r p - L e u -V a 1 — L y s— G l y— A r gで示される配列を持つペプチドであるが、 8位をセリンに改変した [ S e r ⁸] とは、 2番目（8位に相当）の A 1 aが S e rに変換されていることを示す。本発明の GL P— 1誘導体は、化学合成あるいは遺伝子組換え技術により、製造することができる。

即ち、ポリペプチドの化学合成の原理は本分野にて周知であり、以下のような本領域の一般のテキストを参考にできる； Dugas H.及び Penney C, Bioorganic Chemistry, 1981, Spr inger-Ver 1 ag, New York, pp.54- 92、 Merrif ields JM, Chera. Soc, 85, 2149, 1962、 Stewar t及び Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp.24-66, Freeman (San Francisco, 1969)。例えば、 43 O Aペプチド合成機 (PE-Applied Biosystems Inc, 850 Lincoln Center Drive, Foster City CA 94404) 及び PE- Applied Biosystems により供給された合成サイクルを用いて、固相方法により本発明のペプチドを合成できる。 B o cァミノ酸及びその他の試薬は、 PE-Applied Biosystems及び他の薬品供給業者から購入可能である。本発明の GL P一 1誘導体の遺伝子組換え技術による生産は、 GL P 一 1誘導体の D N Aを全合成、又はより大きな天然のグルカゴンがコードしている DN Aの修飾により得た遺伝子を用いて行うこともできる。合成遺伝子の構築方法は本分野では周知であり、 Brown らの Methods in Enzymology, Academic Press, NY, 第 6 8巻， 1 0 9— 1 5 1頁を参照できる。

また、本発明の GL P— 1誘導体の産生に用いる DNAには、上記の他にも、発現量を高め産物を宿主内に安定的に蓄積させる工夫、生産後の精製を容易にする工夫、あるいは融合タンパク質として生産させ容易に GL P— 1誘導体を切り出す工夫等を施すことができる。例えば、 β —ガラクトシダーゼ、 /3—ラク夕マーゼ、プロテイン A、 T r p Eなどのタンパク質の遺伝子に繋ぎ、融合タンパク質として産生させるといつた手法がそれである。これらの場合、例えば、産生後に GL P— 1誘導体を単体として得るには、各遺伝子との間にアミノ酸のメチォニンに対応する遺伝子を入れておき、臭化シアン処理することができる。この場合に、 C末端は H s e (ホモセリン）になる。また、本発明の GL P— 1誘導体の中には、 C末端のみにアルギニンをもつものがあり、アルギ二ルェンドぺプチダ一ゼによる酵素処理により、 GL P— 1誘導体の単体を得ることができる。

なお、前記 GL P— 1誘導体をコードする遺伝子は、公知の遺伝子ェ学技術により、植物以外の細胞に導入して発現させることで、 GL P— 1誘導体を生産することもできる。この場合には、 GL P— 1誘導体をコードする遺伝子を、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組換え DN A発現ベクターに揷入する。 GL P— 1誘導体のための発現ベクタ一を構築した後、そのベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換させる。宿主細胞には真核性細胞又は原核性細胞のいずれをも使用できる。ベクターの構築及び細胞を形質転換するための技術は本分野において周知であり、一般には Maniatis らの、 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, NY, Vol . 1-3, 1989 を参照できる。その際、目的の遺伝子の効率的な転写を達成するために、それをプロ一モータ——オペレータ一領域と機能的に結合させる。原核細胞及び真核細胞の形質転換に使用できる種々の発現べクターは周知であり、 The Promega Biological Research Products Catalogue及び The Stratagene Cloning Systems Catalogueが参照できる。本発明の GL P— 1誘導体の生産には、広く用いられている微生物と哺乳類培養細胞を宿主とした物質生産系が利用できる。また、安価で安全な物質生産システムとして、前記のような形質転換植物を用いた物質生産システムも利用できる。

[本発明 GL P一 1誘導体の利用]

本発明で生産された GL P— 1誘導体は、植物種子等の貯蔵器官の形で、或いは精製、分離して製剤の形で、或いは該成分を添加した飲食品のような形で摂取して、利用することができる。製剤の形で利用する場合は GL P— 1誘導体からなる成分を、製剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または吸収促進剤と組み合わせて製剤化し、医薬組成物として利用することもできる。本発明の GL P— 1誘導体は、 GLP— 1が関与する各種疾患に有効であり、例えば、インスリン非依存性慢性糖尿病の処置、インスリン依存性慢性糖尿病の処置、肥満の処置、または、食欲抑制のために、使用することができる。

(実施例）

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。しかしながら、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、分子生物学的手法については Molecular Cloning (Sambrook et. al. , 1989) 又は製造業者の取り扱い説明書に従い行われた。

[実施例 1]

I . プラスミド pG l b GL P 1 30Hmの作製

p T L 7 (H. Eb inuma et al.， Molecular Methods of Plant Analysis, 22:95, 2002) の E c o R I— S s e 83 87 I制限酵素部位間に、制限酵素 E c o R Iと S s e 8387 Iとを用いて切り出したイネグロブリンプロモ一夕一、配列番号 1に示す [S e r 8、 G 1 n 26、 A s ρ 34] — G L P - 1 ( 7 _ 3 6 amide) をコ一ドする遺伝子が可変領域（ 1 09番目のアミノ酸部位）に挿入されたイネグロブリン遺伝子、及び、ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナルが連結された遺伝子断片を挿入して、プラスミド p G l bGL Pを得た。なお、 [S e rs、 G i n 26、 A s p 3 ] - G L P - 1 (7 - 36) は、配列番号 2に示すように、 G L P— 1の？〜 36番目のアミノ酸からなり、その 8位をセリンに、 26 位をダル夕ミンに、 34位をァスパラギンに置換した誘導体であるが、イネグロプリン遺伝子への挿入にあたって、その N末側にリジン残基（ A AG) を付加している。一方、制限酵素 K ρ η I にて、プラスミド p U C 1 8の K p n I制限酵素部位を切出し、 T 4ポリメラーゼによりその切断末端を平滑化した後、再結合して、プラスミド p UC 1 8 ΔΚ p n I を得た。この p U C 1 8 ΔΚρ ηΙ の S s e 8 3 8 7 I制限酵素部位に、プラスミド p N P 1 1 3 0 (特開平 9 - 1 5 4 5 8 0号公報）より、酵母の部位特異的組換え系の組換え配列 R sに挟まれた領域を制限酵素 S s e 8 3 8 7 Iで切出して、揷入することにより、プラスミド p NP I 1 3 O P UCを得た。

更に、プラスミド p NP I 1 4 0 (特開平 9— 1 5 4 5 8.0号公報）より、 C aMV 3 5 Sプロモー夕一、 Hm (ハイグロマイシン耐性）遺伝子及びノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナルが連結された遺伝子断片を、制限酵素 K p η Iで切出して ρΝ Ρ I 1 3 O P UCの Κ ρ η I制限酵素部位に挿入し、プラスミド p NP I 1 3 0 Hmを得た。

目的とするプラスミドは、この pNP I 1 3 O Hmより、酵母の部位特異的組換え系の組換え配列 R sに挟まれた領域を制限酵素 S s e 8 3 8 7 Iで切出して、 p G l b GL Pの S s e 8 3 8 7 I制限酵素部位間に挿入することにより得られ、これをプラスミド p G 1 b GL P 1 3 0 Hm (国際寄託番号 F E RM B P— 8 34 3 ) と命名した。この p G l b GL P 1 3 0 Hmは、植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子として、 [S e r ⁸、 G l n ²⁶、 A s p ³⁴] — GL P— 1 ( 7 — 3 6) をコードする遺伝子が、イネグロブリン遺伝子の可変領域（ 1 0 9番目のアミノ酸部位）に挿入された形で存在しており、また、サイトカイニン関連遺伝子として i p t遺伝子、薬剤耐性遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を有し、酵母の部位特異的組換え系 RZR S系を脱離能を有する D N A因子として使用している。

p G 1 b G L P 1 3 0 Hmの作製スキムを図 1〜 4に、また、この p G 1 b GL P 1 3 0 H mにおいて植物染色体中に組込まれることとなる領域（T— DNA領域）の制限酵素地図を図 4に示す。図 1〜4中、 G 1 b— Pはイネグロプリン遺伝子のプロモーターを、 GL Pは [S e r G i n 26、 A s p 34] — GL P— l ( 7— 3 6) をコードする遺伝子を、 globulinはイネグロブリン遺伝子を、 Tはノパリンシン夕ーゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを、 1 aは 1 a c Z，遺伝子の断片を、 3 5 S— Pはカリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーターを、 i p tは i p t遺伝子を、丸で囲った Tは i p t遺伝子自身のポリアデニル化シグナルを、 Hmはハイグロマイシン耐性遺伝子を、 Rは組換え酵素遺伝子を、矩形で囲まれた三角形は組換え配列 R s とその配列方向を、また RBと L Bは T— DN A領域の境界配列を表している。

II. ァグロパクテリゥムへの p G 1 b GL P 1 3 O H mの導入

A.ッメファシエンス EHA l 0 5株を、 1 O mLの YE B液体培地 (ビーフエキス 5 gZL、酵母エキス l g/L、ペプトン 5gZL、ショ糖 5 gZL、 2 mM Mg S〇4、 2 2 °Cでの p H 7. 2 (以下、特に示さない場合、 2 2°Cでの pHとする。） ) に接種し、 OD 6 3 0が 0. 4 から 0. 6の範囲に至るまで、 2 8 °Cで培養した。培養液を、 6 9 0 0 X g、 4° (：、 1 0分間遠心して集菌した後、菌体を 2 0 m 1 の 1 0 mM HE P E S ( p H 8. 0) に懸濁して、再度 6 9 0 0 X g、 4 °C 1 0 分間遠心して集菌し、次いでこの菌体を 2 0 0 i 1 の YE B液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。

このプラスミド導入用菌液を用い、ァグロパクテリゥムへの p G l b G L P 1 3 0 Hmの導入を、以下のようにして行った。即ち、 0. 5 m 1チュ一ブ内で、上記プラスミド導入用菌液 5 0 l と p G l b G L P 1 3 0 H m 3 1 を混合した混合液に、ジーンパルサ一 11 システム [BIORAD社] を用いてエレクト口ポーレ一シヨンを行い、エレクトロポ —レーション処理後の混合'液に、 2 0 0 1 の Y E B液体培地を加えて 2 5 で 1時間振とうして培養した後、菌体を、 5 0 mg/L カナマイシン添加 YE B寒天培地（寒天 1. 5 wZ V %、他の組成は上記に同じ。）に播種して 2 8 °Cで 2 日間培養した。さらに、得られた菌コロニーを YE B液体培地に移植して培養し、次いで、その菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出して、これらの菌が、 EHA 1 0 5株に p G 1 b G L P 1 3 0 Hmが導入されたものであることを確認し、これらを、 EH A 1 0 5 (p G 1 b G L P 1 3 O H m)とした。

III. 感染材料の調製

遺伝子導入の対象として、イネ品種「日本晴」を用い、その完熟種子の殺菌を、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 4 モデル植物の実験プロトコ一ル（p 9 3— 9 8 ) の方法に従い行った。殺菌された完熟種子を、 N 6 C 1 2培地（N 6無機塩類及びビタミン類、 3 0 gZL シユークロース、 2. 8 g /L プロリン、 0. 3 gZL カザミノ酸、 l mgZL 2 , 4— D、 4 g/L ゲルライト、 p H= 5. 8 ) に置床し、サージカルテープでシールして 2 8 °C明所で培養して発芽させ、ァグロパクテリゥム EHA 1 0 5 ( p G 1 b GL P 1 3 0 Hm) による感染材料とした。

IV. EHA 1 0 5 (p G l b GL P 1 3 0 H m)によるイネの形質転換および形質転換イネの作製

YE B寒天培地（ビーフエキス 5 gZL、酵母エキス l gZL、ぺプトン 5 g/L、ショ糖 5 gZL、 2 mM M g S C 、 1 5 g/L ノクトァガー）で培養したァグロパクテリゥム EHA 1 0 5 (p G l b G L P 1 3 0 Hm) を、 Y E B液体培地に移植して、 2 5°C、 1 80 r p m で一晩培養後、 300 0 r pm、 20分間遠心して集菌し、ァセトシリンゴン（1 Omg/L) を含む N 6液体培地（N 6無機塩類及びビ夕ミン類、 30 gZL シュ一クロース、 2mgZL 2, 4— D、 p H = 5. 8) に、〇D 630= 0. 1 5となるように懸濁し、感染用ァグロバクテリゥム懸濁液とした。

III で調整した発芽種子を 5 Om 1チューブに入れ、そこに上記感染用ァグロパクテリゥム懸濁液を注ぎ浸漬した。 1. 5分間の浸漬後、ァグロバクテリゥム懸濁液を捨て、発芽種子を滅菌したろ紙の上に置いて余分な水分を除去してから、 N 6 C 1 2培地（N 6無機塩類及びビタミン類、 S O gZL シユークロ一ス、 2. 8 g/L プロリン、 0. 3 g/L カザミノ酸、 lmg/L 2, 4 4 g/L ゲルライト、 p H= 5. 2) に置床し、サージカルテープでシールして 28 °C暗所で 3日間共存培養を行い、更に N6 C 1 2 TCH2 5培地（N 6無機塩類及びビタミン類、 3 0 gZL シユークロース、 2. 8 g/L プロリン、 0. 3 g/L カザミノ酸、 2mgZL 2, 4_D、 500 m g ZL カルペニシリン、 2 5 mgZL ハイグロマイシン、 4 gZL ゲルライト）に移植して 1週間培養した後、発芽した芽をこの発芽種子の胚盤組織から切除した。

次いで、この胚盤組織を N 6 C 1 4 T CH 2 5培地（N 6無機塩類及びビタミン類、 30 gZL シュ一クロース、 2. 8 gZL プロリン、 0.3 g/L カザミノ酸、 4mgZL 2, 4—D、 50 0mgZL 力ルペニシリン、 2 5mgZL ハイグロマイシン、 4 gZL ゲルライト）で 1週間培養し、更に、 MS RC培地（M S無機塩類及びビタミン類、 S O gZL シュ一クロ一ス、 S O gZL

ソルビトール、 2 gZL カザミノ酸、 S O OmgZL カルべニシリン、 4 gZL ゲルライト）で培養したところ、 EHA 1 0 5 (p G 1 b G L P 1 3 0 Hm)との共存培養後、 1ヶ月から 2ケ月の間に芽又は幼植物体が再分化した。再分化した芽又は幼植物体は発根培地に移植して生育させ、背丈 2 0 c m程度の幼苗を得た。この幼苗より、 DNeasy 96 Plant Kit (Q I AG E N社）を用いて染色体 D N Aを抽出し、 P C R法にて [S e r s、 G i n 26、 A s p 3 ] — GL P— 1 ( 7— 3 6 ) をコードする遺伝子の存在を確認した。

このとき、 P C Rプライマ一としては、グロブリン遺伝子の可変領域に挿入された [S e r s、 G i n 26、 A s p 34] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) をコードする遺伝子を検出するため、プライマ一 3— 1 :5' - GGATCCATGGCTAGCAAGGTCGTC -3' (配列番号 3 ) と 3— 3 :5'- GATCACTATCTCGTTGCATGCAACAC -3' (配列番号 4) を用いた。得られた P C R反応物（約 7 0 0 b p) はァガロースゲル電気泳動を用いて分析し、染色体 DNA中の、 [ S e r 8、 G l n26、 A s p 34] — GL P— 1 ( 7 - 3 6) をコードする遺伝子の存在を確認した。

その結果、ァグロパクテリゥム感染処理に供したィネ種子の約 3 %に、上記 [S e r s、 G i n 26、 A s p 34] — GL P— l ( 7— 3 6 ) をコードする遺伝子が導入されていることが判明した。

こうして得られ、 [ S e r s、 G l n26、 A s p 3 ] — GL P— l ( 7 - 3 6 ) をコードする遺伝子の導入が確認されたイネ幼苗の形質転換体は、土に馴化し、太陽光室にて栽培し、生育させて完熟種子を収穫した。

V. タンパク解析

I V. で得られた完熟種子 1 0 mgを、 1 0 % (v /v) グリセ口一ル、 0. 2 5 % (w/v) S D S、 5 % 2—メルカプトエタノールを含む、 6 2. 5 mMの T r i s — HC 1 ( D H 6. 8 ) 抽出バッファ一 2 50 z lにて、 1 0 0 °C、 5分間処理することにより、これらの種子中の全タンパク質を抽出し、その抽出液を SD S— PAGEに供した。 SDS— PAGEは 1 5 % (w/ v) ポリアクリルアミド（アクリルァミド： N， N'—メチレンビスアクリルアミド = 30 : 0. 8) ゲルを用いて行った。

得られたゲル画像を、解析ソフト Image Gauge (富士写真フィルム）にて解析し、 [S e rs、 G i n 26、 A s p 34] - G L P - 1 (7 - 36) をコ一ドする遺伝子がグロプリンの可変領域に揷入された融合夕ンパク質の蓄積レベルを調査した。その結果を図 5に示す。

[比較例 1]

イネグロプリンプロモーター、配列番号 1に示す [S e r 8、 G 1 n 26, A s p 34] — GL P— l (7 - 36) をコードする遺伝子が可変領域に挿入されたグロブリン遺伝子、及び、ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナルが連結された遺伝子断片からなる、図 6記載の従来型べクタ — p G l bGLP _ H mを用いてイネの完熟種子に遺伝子導入を行った他は、実施例 1と同様にして、遺伝子導入を行い、芽又は幼植物体を再分化させ、この芽又は幼植物体から植物個体を再生して形質転換イネを得、完熟種子を収穫して、この完熟種子についてタンパク解析を行った。その結果を図 5に示す。

図 5より明らかなように、 [ S e r 8、 G 1 n 26、 A s p 34] — G L P - 1 (7 - 36) をコードする遺伝子がグロブリンの可変領域に挿入された融合タンパク質は、実施例 1で生産されたイネ完熟種子中に高蓄積し、比較例 1と比較して最高で約 6倍のレベルを示した（図 5) 。

[実施例 2]

I . G L P - 1誘導体の合成

以下に示す GL P— 1誘導体を、 Model 430Aペプチド合成機（PE- Applied Biosystems, Foster City, CA) による固相合成によって合成し、 HP L Cにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。純度は 9 5 %以上のものを使用し、インビトロおよびィンビポでの試験に供した。

比較製造例 1. GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide)

(天然型 GL P - 1 )

比較製造例 2. [ S e r 8] 一 GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide)

比較製造例 3. [G 1 y«] 一 GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide)

製造例 1. [G i n 26, A s n3 ] - GL P - 1 ( 7 - 3 6 amide) (製造例 1の非アミド体のアミノ酸配列を配列番号 5に示した）製造例 2. [S e r ⁸， G i n ²⁶, A s p ³⁴] — GL P— 1 ( 7

- 3 6 )

製造例 3. [S e r ⁸, G i n ²⁶, A s n³⁴] — GL P— 1 ( 7

- 3 6)

(製造例 3のアミノ酸配列を配列番号 6に示した）

II. G L P - 1誘導体のサイクリック AMP産生活性

ヒト G L P— 1受容体の公表された D N A配列（Graziano ら、 Biochem Biophys Res Com, 196: 141-146, 1993) に基づき発現べクタ一を構築した。チャイニーズハムスター卵巣 CHO— K 1細胞を当該べクタ一で形質転換し、ヒト GL P— 1受容体を発現する組換え CH〇— K 1細胞を得た。このヒト GL P— 1受容体発現細胞を 1 X 1 (He e 1 1 s /m 1 /w e 1 1で 24ゥエルプレートに植え込み、 3 日後にアツセィに使用した。

アツセィ方法は、前記細胞を GL P— 1誘導体の存在下に緩衝液（P B S、 5. 6mMグルコース、 1 mMイソブチルメチルキサンチン、 2 0 M R o 2 0— 1 7 2 4、 0. 5 % B S A、 p H 7. 4) 中で 3 7 °C、 3 0分間インキュベーションした。 5 N塩酸を 1 O 1加えてインキュベーションを停止した。各種 GL Ρ— 1誘導体と GL Ρ一 1受容体との反応により細胞内に形成されるサイクリック AM Ρを、 cAMP- ScreenTM system (Applied Biosystems) によるェンザィムィムノアッセィにより測定した。図 7に各種 GL P— 1誘導体のサイクリック AMP産生活性示した。

この結果、 [ S e r 8] — G L P— 1 ( 7 _ 3 6 amide) 、 [ G 1 y «] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) 、および [G 1 n 26, A s n 3 ] - G L P - 1 ( 7 - 3 6 amide) は、天然型 G L P— 1と同等のサイクリック A MP産生活性を持っていた。

[実施例 3 ]

製造例 1の [G i n 26， A s n 3 ] —GL P— l (7 - 3 6 amide) について、トリプシン処理後、実施例 2と同様にしてサイクリック AMP 生産活性を測定することにより、トリプシン耐性を調査した。

即ち、合成で得た上記 GL P— 1誘導体を、 5 0mM炭酸水素アンモニゥム溶液（pH 7. 8) に 5 0 0 g/m 1の濃度になるように溶解した。この溶液 I O O I に、 5 0 0 g /m 1 トリプシン溶液（Promega 社製： Cat.No. V5113) を 5 ^ 1加えて、 3 7°C、 1時間反応させた。反応停止は、 7 1. 5 %エタノール 1 2 0 0 1 (final 6 5 %) を加えて行い、 4°Cで 5分間の 1 5， 0 0 0 r pm遠心により上清を回収し、エバポレーシヨンした。乾固物を蒸留水に溶解し、活性測定に用いた。図 8は、トリプシン処理前と処理後の [G 1 n26, A s n 3 ] - G L P - 1 ( 7— 3 6 amide) の活性の濃度依存性を示したものである。 [G 1 n 26, A s n 3 ] —GL P— l ( 7 - 3 6 amide) は、トリプシン処理前と処理後で活性に違いがなく、トリプシンに対して耐性であることがわかった [実施例 4]

イネ完熟種子中の G L P - 1誘導体のペプシンに対する安定性を調べた。

実施例 1で得られたイネ完熟種子の白米及びその粉末を使用し、 1. 9倍量の水を加えて 1 0 0 °C、 1 5分間の加熱により炊飯した。粒のものは押しつぶして均一としてから蒸留水で 5倍稀釈してサンプルとし、粉末のものはそのまま蒸留水で 5倍稀釈してサンプルとした。一方、合成品の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide)、 [S e r ⁸, G l n ²⁶, A s p ³⁴] - G L P - 1 ( 7— 3 6 )、 [S e r ⁸, G l n ²⁶, A s n³⁴] - G L P - 1 ( 7 - 3 6) については、 0. 2 % B S A溶液で 1 0 gZm 1溶液を調製し、サンプルとした。

各サンプルに、 7. 6 mgZm 1ペプシンを含む 1 0倍濃度の人工胃液（p H l . 2)を 1 1 0量加ぇて、 3 7 で 1時間反応後、 N a〇H で中和した。 GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide), [S e r ⁸， G 1 n ²⁶, A s p ³⁴] - G L P - 1 ( 7 - 3 6)、 [S e r ⁸, G i n ²⁶, A s n³⁴] — GL P— 1 ( 7 - 3 6) についてはその後、米由来のものについては、次いでタンパク質を抽出し、トリプシン処理により GL P— 1単体を得た後、サイクリック AMP産生にもとづく活性測定を行った。その結果、合成由来の GL P - 1誘導体はペプシンで完全に失活したが、米では、 3 1〜 6 5 %の0 ？ー 1活性が残存することが明らかとなった（図 9 ) _t これらのことから、ィネ完熟種子に含有される G L P— 1誘導体は、ペプシン消化を受けくく、胃を通過し小腸に到達することが推察された。

[実施例 5 ]

実施例 1で得られたイネ完熟種子より、 0. 0 2 5 M水酸化ナトリウム溶液により、 [S e r 8、 G i n 26、 A s p ] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) とグロブリンとが融合したタンパク質を抽出し、これを 5 0 mM炭酸水素アンモニゥム P H 7. 8で 1 5倍希釈した。この希釈液に、 8 3 g/m 1 トリプシン溶液（Promega社製： Cat. No. V5113) 6 n 1 を加えて、 3 7 °<0で 1、 2、 4、 6又は 2 0時間反応させた後、 7 1. 5 % エタノール 1 2 0 0 1 (final 6 5 %) を加えて反応を停止させ、 4 °C で 5分間の 1 5 , 0 0 0 r p m遠心により上清を回収して、エバポレ一シヨンし、その乾固物を蒸留水に溶解し活性測定を行った。

図 1 0は、イネ完熟種子に発現させ、融合タンパク質として得た [S e r 8, G i n 26， A s p ] - G L P - 1 ( 7— 3 6 ) のトリプシン処理時間と活性の関係をみたものである。トリプシン処理により初めてサイクリック AMP産生活性が出現し、またトリプシン処理時間に関係なく、この活性が維持された。これらのことから、イネ完熟種子中で [S e r 8， G 1 n 26， A s p 3 ] — G L P— 1 ( 7 - 3 6 ) は、活性を持つた形で発現されており、かつトリプシン耐性であることがわかった。従つて、 G L P— 1誘導体の発現によりイネ完熟種子に含有される [S e r ⁸, G i n ²⁶, A s p ³⁴] — GL P— 1 ( 7— 3 6) は、小腸でトリプシンによる分解を受けることなく吸収されうることが推測された。

[実施例 6 ]

[ S e r ⁸，G l n ²⁶, A s n ³⁴] — GL P— 1 ( 7— 3 6)および [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s p³⁴] —GL P— 1 ( 7 - 3 6) について、トリプシン処理後、実施例 2と同様にしてサイクリック AMP生産活性を測定することにより、トリプシン耐性を調査した。

即ち、 0. 2 %ゥシ血清アルブミン溶液で 1 0 gZm 1 に稀釈した上記合成 GL P一 1誘導体 8 1 5 OmM炭酸水素アンモニゥム溶液 ( H 7. 8 ) を 1 1 2 1 および 8 3 g Zm l トリプシン溶液 (Promega社製： Cat.No. V5113) を 6 1加えて、 3 7 で 1時間反応させた。反応停止は、 7 1. 5 %エタノール 1 2 0 0 ^ 1 (final 6 5 ) を加えて行い、 4 °Cで 5分間の 1 5， 0 0 0 r pm遠心により上清を回収し、エバポレーシヨンした。乾固物を蒸留水に溶解し、活性測定に用いた。

図 1 1は、 GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide)、 [ S e r ⁸,G 1 n ²⁶, A s n ³⁴ ] 一 GL P— 1 ( 7 - 3 6) および [S e r ⁸，G l n ²⁶， A sp³⁴] -GL P - 1 ( 7 - 3 6) のトリプシン処理時間に対する活性の変動を示したものである。天然型の GL P— 1 ( 7 - 3 6 amide) に比較して、 [S e r ⁸,G l n ²⁶, A s n ³⁴] 一 GL P— 1 ( 7— 3 6) および [S e r ⁸,G 1 n ²⁶, A sp³⁴] — GL P— 1 ( 7— 3 6) は、トリプシン処理により活性に変動がなく、トリプシンに対して耐性であることがわかった。

[実施例 7 ]

本発明の GL P— 1誘導体が、天然型 GL P - 1 と比較し有意な D P P — I V耐性を示すかどうかを調べた。 GL P— 1 ( 7 - 3 6 anide) (天然型 GL P— 1 ) を 5 0 0 0 pM、 [S e r ⁸， G i n ²⁶, A s n³⁴] ― GL P— 1 (7— 3 6 ) を 5 0 0 pM、 [S e r ⁸， G i n ²⁶, A s p ³ ⁴] — GL P— l ( 7 - 3 6 ) を 5 0 0 0 pM用いて、それぞれ 4 0 U/ A1の D P P— I V (Sigma, D7052)と混和し、 3 7 °Cにて 0、 1 5、 3 0、 6 0分間反応させた後、 2倍量のエタノールで抽出し、遠心エバポレー夕一にて乾固した。得られた乾固物を 1 % B S A含有蒸留水に溶解し、 G L P— 1 レセプ夕一発現細胞に作用させてサイクリック AM P 産生量を測定した。図 1 2に D P P— I V処理のない場合を 1 0 0 %としてサイクリック AMP産生活性を比較した。 G L P— 1 ( 7 - 3 6 amide) に比較して、 [S e r ⁸, G i n ²⁶, A s n³⁴] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) および [S e r ⁸， G i n ²⁶, A s p ³⁴] - GL P— l ( 7 - 3 6) は、明らかな D P P— I V耐性が確認された。 [実施例 8 ]

本発明の GL P一 1誘導体のィンスリン分泌促進活性を調べた。

I C Rマウスの塍臓からコラゲナーゼによりランゲルハンス島を取り出し、 24ゥエルプレ一トにゥエルあたり 2〜 3個のランゲルハンス島を入れてー晚培養した。その後、 1 6. 7 mMグルコース、 0. 2 % B S Aおよび 1 0 mM Hepes を含むクレプス一リンゲル緩衝液に溶解した本発明の GL P— 1誘導体を加え、 3 7 °Cに 3 0分間置き、この上清中のインスリン濃度をェンザィムィムノアッセィキット（シバヤギ製）で測定した。

GL P - 1 ( 7 - 3 6 amide)、 [S e r ⁸， G i n ²⁶, A s p ³⁴] — G L P— l ( 7 - 3 6 ) および [S e r ⁸， G i n ²⁶, A s n³⁴] — GL P— 1 ( 7— 3 6 )、のいずれのぺプチドにおいても、用量依存的なィンスリン分泌促進活性が認められた。特に [S e r ⁸, G i n ²⁶, A s n³ ⁴] 一 GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) に高濃度で強いインスリン分泌促進活性が認められた（図 1 3 )。

[実施例 9]

経口糖負荷試験（OGTT) における GL P— 1誘導体皮下投与による血糖低下効果を調べた。

ー晚絶食したマウスにグルコース 1 gZk gを経口投与レ、直後に GL P - 1 ( 7 - 3 6 amide)、 [S e r ⁸, G i n ^{2 6}, A s n³⁴] — G L P — 1 ( 7 - 3 6 ) または [S e r ⁸, G i n ²⁶, A s p ³⁴] 一 GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) を背部皮下投与（5、 2 0 gZk g)した。コントロール群には生理食塩水を投与した。グルコース負荷前ならびに 2 0、 6 0、 1 2 0分後に眼下静脈叢より経時的に採血を行い、血糖値を測定した。 G L P— 1誘導体において血糖上昇のピーク値が低下する傾向が見られ、 [S e r ⁸, G i n ^{2 6}, A s n³⁴] — GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) に強い作用が認められた（図 1 4 )。また、その作用は、投与後 1 2 0分まで持続していた（図 1 5 )。 G L P— 1ペプチドの改変により、生体内での血中安定性が飛躍的に上昇し、持続性が確保できたことが明らかになった。産業上の利用可能性

本発明により、遺伝子工学を用いた、安価で安全な、かつ効率的な物質生産システムとして、組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官の生産方法による物質生産システムが提供される。本発明の方法により、健康増進に役立つ成分を有意に蓄積した食品を提供することを可能とする。また、本発明の方法は、医薬品や工業原料として有用な物質を生産する高付加価値な植物を作製する基礎技術となりうる。

更に、本発明は、食物摂取により消化管より分泌され、塍臓に働いて糖依存的なィンスリン分泌を刺激するホルモンとして知られている G L P— 1を本発明の方法により製造することを包含するものである。

更に本発明において提供される新規 G L P— 1誘導体は、その利用に際しての摂取時に問題となるトリプシン等の消化酵素による分解に対し. 該酵素に対する耐性をもち、更に、摂取、吸収後の血漿中での安定性に対して問題となるジぺプチジルぺプチダ一ゼ IVによる分解に対し、該酵素に対する耐性を持つという優れた特性を有するものであり、医薬としての利用が期待できるものである。すなわち、本発明の G L P— 1誘導体は、経口摂取された場合においても、薬効発現が可能であり、例えば、本発明方法により植物の貯蔵器官に発現させ、経口的に摂取したような場合でも、分解されることなく小腸から吸収され、薬効を発現することが可能となる。したがって、本発明で提供される G L P— 1誘導体は、 G L P — 1の臨床応用の可能性を格段に高めるものであり、糖尿病患者及び肥満患者の Q O Lの改善に役立つものと考えられる。

Claims

請求の範囲

1. 組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法であつて、次の過程（A) 、 (B) 、 (C) 、からなることを特徴とする方法。

(A)植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子、サイトカイ

' ニン関連遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有する DNA因子を含み、かつ. サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子は脱離能を有する DN A因子と挙動を一にする位置に存在し、植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子は脱離能を有する D N A因子とは挙動を一にしない位置に存在するベクタ一を構築し、該ベクタ一を細胞中に導入する過程。

(B) 上記（A) により、ベクタ一が導入された植物細胞を、薬剤添加培地及び薬剤非添加培地にて培養を行うことにより形質転換体を再分化せしめる過程。

(C) 上記（B) にて再分化した形質転換体から、植物貯蔵器官を得る過程。

2. ベクターが導入された植物細胞から形質転換体を再分化せしめる過程において、ベクターが導入された植物細胞を植物ホルモン及び薬剤添加培地で培養した後、植物ホルモン及び薬剤非添加培地で培養を行うことを特徴とする、請求項 1記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

3. 植物貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子が、該植物貯蔵器官特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項 1 又は 2記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

4. 植物貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子が、該植物貯蔵器官で本来発現しているタンパク質遺伝子中、夕ンパク可変領域をコ

—ドする位置に挿入又は置換されていることを特徴とする、請求項 1〜 3記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法,

5 . 組換えタンパク質遺伝子と植物貯蔵器官で本来発現しているタンパク質遺伝子との境界に、該組換えタンパク質を植物貯蔵器官で本来発現しているタンパク質から切断分離するための酵素切断アミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を配置することを特徴とする、請求項 4記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

6 . 植物貯蔵器官が種子であることを特徴とする、請求項 1〜5のいずれかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

7 . 植物貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子を、タンパク可変領域に挿入又は置換する該植物貯蔵器官で本来発現している遺伝子が、種子貯蔵タンパク質遺伝子であることを特徴とする、請求項 6に記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

8 . サイトカイニン関連遺伝子が、サイトカイニン合成系遺伝子であることを特徴とする、請求項 1〜 7のいずれかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

9 . サイトカイニン合成系遺伝子がイソペンテニルトランスフェラ一ゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項 8記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 0 . 薬剤耐性遺伝子がハイグロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項 1〜 9のいずれかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 1 . 脱離能を有する D N A因子が、部位特異的組換え系又はトランスポゾンに由来するものであることを特徴とする、請求項 1〜 1 0のいず

4 れかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 2. 植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子が、 GL P - 1 ( 7 - 3 6) 遺伝子、あるいは、 GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) のアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列からなり、かつ G L P— 1活性を有するペプチドをコードする遣伝子であることを特徴とする、請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 3. 植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子が、 GL P - 1 ( 7 - 3 6) あるいはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び又は付加された配列からなり、かつ GL P— 1 活性を有するペプチドにおいて、 2 6位をグルタミンに、 34位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換した GL P - 1誘導体をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 4. 植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子が、アミノ酸配列の' 8位をセリン又はダリシンに置換した G L P - 1誘導体をコ ―ドする遺伝子であることを特徴とする、請求項 1 2又は 1 3に記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 5. 植物の貯蔵器官中に発現させる組換えタンパク質遺伝子が、配列表の配列番号 1に記載の遺伝子であることを特徴とする、請求項 1 4に記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 6. 植物が、単子葉植物であることを特徴とする、請求項 1〜 1 5のいずれかに記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 7. 単子葉植物がイネであることを特徴とする、請求項 1 6記載の組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官を生産する方法。

1 8. 請求項 1〜 1 7のいずれかに記載の生産方法により生産された組換えタンパク質が高生産された植物貯蔵器官又はそれを生産する形質転換植物。

1 9. GL P— 1 ( 7 - 3 6 ) あるいはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列からなり、かつ G L P— 1活性を有するペプチドにおいて、 2 6位をグルタミンに、 3 4位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換したアミノ酸配列を有する GL P— 1誘導体。

2 0. GL P— 1 ( 7— 3 6 ) 或いはそのアミノ酸配列の 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列からなり、かつ G L P— 1活性を有するペプチドが、 GL P— 1 ( 7 - 3 6) 、 GL P— 1 ( 7 - 3 7) 又はそれらの C末端アミドである、請求項 1 9に記載の G L P - 1誘導体。

2 1. アミノ酸配列の 8位をセリン又はグリシンに置換したことを特徴とする、請求項 1 9又は 2 0に記載の G L P - 1誘導体。

2 2. 配列表の配列番号 2、 5、又は 6に記載のアミノ酸配列を有する GL P— 1誘導体。