JP4120972B2 - 融合蛋白質を開裂させる方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、組み換えて生産されたポリペプチドを回収するための、改良方法に関する。この方法は、プロ−ペプチドとの融合蛋白質としての、組み換えポリペプチドの発現に関する。このプロ−ペプチド−ポリペチド融合蛋白質は、開裂させる事ができ、そしてその組み換え蛋白質は適切な条件下で放出される。
発明の背景
価値の高い組み換え（遺伝的に設計された）ポリペプチド、例えば薬剤として使われる蛋白質の調製は、これらのポリペプチドを融合又はハイブリッド蛋白質として生産する事に関する技術にしばしば依存する。これらの技術は、ハイブリッド遺伝子の調製に基づいており、その様なハイブリッド遺伝子の例として、興味の対象であるポリペプチドをコードする遺伝物質を含み、興味の対象であるポリププチドとは別途の遺伝物質と結合した遺伝子がある。融合蛋白質の作成は、生物学的な宿主細胞システムへのハイブリッド遺伝子の導入を伴い、その様な生物学的な宿主細胞システム、例えば酵母細胞は、その融合ポリペプチドの発現及び蓄積を可能とする。興味の対象であるポリペプチドの回収は、回裂反応を行う事を伴い、結果として求めるポリペプチドを「融合相手」より分離する結果となる。
興味の対象である蛋白質を融合蛋白質として生産するには、その活性型を直接生産する場合と比較して、別途の段階が必要であるのにかかわらず、ハイブリッド蛋白質の生産は多くの問題を克服する事が見出されている。まず、過剰に生産されたポリペプチドは宿主細胞中で、封入体として知られている不溶画分中に集合体を形成する。この不溶材料の転換は、しばしば時間のかかる複雑なリフォールディングの方法を伴うために、蛋白質の精製を困難としている。第二に、不溶性の形で細胞質に存在するこれらの蛋白質は、しばしば宿主特異的な酵素により分解される対象となり、そのために回収可能な活性蛋白質の量が低下する。興味の対象であるポリペプチドを融合相手と結合させる事は、これらの問題を抑えることが見出されている。先行技術で知られている融合相手には、マルトース結合蛋白質（Ｄｉ Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：２１−３０）、グルタチオンーＳ−トランスフェラーゼ（Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５８５−５８７）、ユビキチン（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：６９８−７０４）、βーガラクトシダーゼ（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７３：１０６−１１０）、及びチオレドキシン（Ｌａ Ｖａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１：１８７−１９３）がある。
融合相手をアフィニティーペプチドとして用いる事もまた、求められる。この方法論は、融合相手の物理化学的性質を利用する事により、宿主細胞から融合ペプチドを単離して回収する事を容易にする（例えば、ＷＯ９１／１１４５４を見よ）。
最終的に、融合相手を用いる事により、そうでなければ小さ過ぎて蓄積されず、宿主細胞システムより効果的に単離されないであろう、ポリペプチドの生産を可能にする。この技術は、例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚらにより述べられている（１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５３８５−５３９２）。
これらの方法は全てハイブリッド蛋白質を作成するという結果となり、そのハイブリッド蛋白質中において、興味の対象である蛋白質は別途の蛋白質に結合している。活性ポリペプチドを回収するためには、一般的には、興味の対象であるポリペプチドから融合相手を分離する必要がある。最も一般的には、酵素的手段又は化学的手段のいずれかにより、開裂反応が行われる。その様な反応には、ペプチド結合の加水分解により作用する試薬が使用され、そして開裂試薬の特異性は、開裂するペプチド結合における、又はその近傍のアミノ酸残基の同一性により決定される。
先行技術において「蛋白質分解酵素」として知られている酵素は、融合蛋白質の開裂に特に良く適している事が見出された。その開裂反応は、融合蛋白質と蛋白質分解酵素を、適切な条件下で接触させる事により行われる。この方法論の一例が、米国特許４，７４３，６７９において述べられており、その特許はヒト上皮成長因子の生産過程を開示しており、その過程は黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼによる融合蛋白質の開裂より成る。
対照的に、化学試薬を使用する事は化学的開裂を伴い、その様な化学試薬の使用により、特異的な条件下においてペプチド結合の加水分解が可能となる事が知られている。例えば、臭化シアンはメチオニン残基においてポリペプチド鎖を開裂する事が知られている。この技術に基づいた、ウレアーゼ及びフォスフォリラーゼｂの、臭化シアン開裂による加水分解反応が、Ｓｅｋｉｔａらにより述べられている（（１９７５），Ｋｅｉｏ Ｊ．Ｍｅｄ．２４：２０３−２１０）。
化学的開裂反応及び酵素的開裂反応の両者とも、用いた開裂試薬により開裂可能なペプチド結合が存在する必要がある。このため、融合相手と標的蛋白質の接合部に、適当な標的配列が存在する事は、しばしば望ましい事となる。蛋白質分解酵素の標的を含んでいる「リンカー」配列を含む融合ペプチドは、常法であると見做されている遺伝工学技術を用いて、容易に構築する事ができる。
それらの大きな有用性にもかかわらず、先行技術の開裂方法は、開裂特異性が不十分である、又は欠いていると認識されている。不十分な開裂は、蛋白質精製効率が低下するという結果となり、一方、開裂特異性の欠如は何カ所にもおいて開裂するという結果となり、そのために生成物を損失したり不純断片が生成したりするという結果となる。これはしばしば、求める蛋白質がほんの一部分した回収されない、という結果となる。更に、一般的に広く使用されている蛋白質分解酵素、例えば血液凝固因子Ｘａ及びトロンビンは、高価であり、血液病原体による最終生成物の汚染は、考慮するべき問題である。
これらの欠点より見ると、先行技術として知られている開裂方法の限界は、明らかである。
ペプシンやキモシンの様なチモーゲンは、インビボで不活性前駆体として合成される酵素である。適切な条件下でチモーゲンは活性化されて、アミノ末端ペプチドの開裂を伴う過程により成熟した活性蛋白質を生成し、「プロ−ペプチド」、「プロ−領域」又は「プロ−配列」と言われている。チモーゲンの活性化は、別途の特異的な蛋白分解酵素の存在を必要とする事があり、例えばインスリン等の種々のホルモンは、特異的な蛋白質分解酵素により処理される。もう一つの方法として、別途の酵素触媒がなくても、活性化が起こる事がある。これらの種類のチモーゲンはしばしば、「自己触媒的に成熟する」チモーゲンと言われている。自己触媒的に成熟するチモーゲンの例として、ペプシン、ペプシノーゲン及びキモシンが含まれて、それらは酸性環境下、例えばヒトの胃の中で活性化される。
チモーゲンの自己触媒的活性化及びプロセッシングは、広く記載されている（例えば、ＭｃＣａｍａｎ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，（１９８６），Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１：１５３４５−１５３４８，Ｋｏｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４３：６−１０）。チモーゲンの活性化には、プロ−ペプチドと成熟蛋白質とが物理的に結合する事を必ずしも必要でない事もまた、記載されている（Ｓｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ，３４１：４６２−４６４）。
組み換えて生産されたポリペプチドを、それらの発現システムより回収するための改良された過程が必要とされている。
発明の要約
本発明者らは、組み換えて生産されたポリペプチドを回収するための新規な方法を開発した。本方法は、プロ−ペプチドとの融合蛋白質としてポリペプチドを発現させる事を伴い、そのために組み換えポリペプチドは適切な条件下でプロ−ペプチドから開裂させる事ができる。
一つの観点において、本発明は、融合蛋白質をコードするキメラ核酸配列を与え、そのキメラ核酸配列は自己触媒的に成熟したチモーゲンより得られたプロ−ペプチドをコードする第一の核酸配列及びプロ−ペプチドとは非相同なポリペプチドをコードする第二の核酸配列を含む。
もう一つの観点において、本発明は、（ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られたプロ−ペプチド、及び（ｂ）そのプロ−ペプチドとは非相同であるポリペプチド、を含む融合蛋白質を提供する。一つの実施例において、非相同ポリペプチドは治療剤又は栄養剤であるペプチドであり、その融合蛋白質は、薬剤組成物又は食品組成物として投与される。その様な実施例において、その組成物が宿主に一旦運ばれると、標的器官、組織又は体分泌液における生理的条件の結果として、非相同ポリペプチドは開裂する。
更なる観点において本発明は：
（ａ）宿主細胞中に発現ベクターを導入し、
その発現ベクターは以下の核酸配列：
（１）宿主細胞内で転写制御が可能な核酸配列、
その核酸配列は機能を保つ様に（２）に結合し、
（２）融合蛋白質をコードするキメラ核酸配列、
そのキメラ核酸配列は以下の核酸配列：
（ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られたプロ−ペプチドをコードし、読み取り枠中において（ｂ）と結合している核酸配列、
（ｂ）プロ−ペプチドと非相同であり、組み換えポリペプチドをコードする核酸配列、
を含み、機能を保つ様に（３）に結合し、
（３）宿主細胞中で機能できる終結領域をコードする、核酸配列、
を含み、
（ｂ）宿主細胞を培養して前記融合蛋白質を製造し；及び
（ｃ）融合蛋白質の環境を変えて、それによりプロ−ペプチドは融合蛋白質より開裂し、組み換えポリペプチドを放出する、
という過程を含む、組み換えポリペプチドの調製方法を提供する。
融合蛋白質の環境は、多くの手段を用いて変える事が可能であり、その手段には、ｐＨ、温度又は塩濃度、又はプロ−ペプチドを融合蛋白質より自己開裂させて、組み換えポリペプチドを放出させる事を可能にする、他の変化が含まれる。好適な実施例においては、成熟したチモーゲンは、（ｃ）の過程においてこの方法に加えられて、融合蛋白質からプロペプチドを開裂させる補助を行う。
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な記載より、容易に明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好適形態を示しているものの、実例として与えられているだけである事を理解するべきであり、なぜなら、本発明の精神及び範囲内である種々の改変及び修正は、この詳細な記述の分野の当業者には、明らかとなると思われるからである。
【図面の簡単な説明】
本発明は、以下の図との関連において述べられる。
図１は、ＧＳＴ−キモシン プロ−ペプチド−ヒルジン配列の核酸配列（配列番号１）及び推定アミノ酸配列（配列番号２）である。
図２は、ポリヒスチジンのタグをつけたキモシンプロ−ペプチドとコイ成長ホルモン（Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ）の融合蛋白質の核酸配列（配列番号３）及び推定アミノ酸配列（配列番号４）である。
図３は、プロ−ｃＧＨ融合構築物の模試図である。
図４は、精製したＨｉＳ−プロ−ｃＧＨの、インビトロの開裂を図解している。
図５は、精製したＨｉｓ−プロ−ｃＧＨの、インビボの開裂を図解している。
発明の詳細な説明
前に述べた様に、本発明は組み換えポリペプチドを調製して回収するための新規の方法、融合蛋白質をコードするキメラ核酸配列、及び薬剤及び栄養剤の組成物中において有用な融合蛋白質に関する。
従って、本発明は以下の過程より構成される組み換えポリペプチドの調製方法を提供し、その過程は；
（ａ）宿主細胞中に発現ベクターを導入し、
その発現ベクターは以下の核酸配列：
（１）宿主細胞内で転写制御が可能な核酸配列、
その核酸配列は機能を保つ様に（２）に結合し、
（２）融合蛋白質をコードするキメラ核酸配列、
そのキメラ核酸配列は以下の核酸配列：
（ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られたプロ−ペプチドをコードし、読み取り枠中において（ｂ）と結合している核酸配列、
（ｂ）プロ−ペプチドと非相同であり、組み換えポリペプチドをコードする核酸配列、
を含み、機能を保つ様に（３）に結合し、
（３）宿主細胞中で機能できる終結領域をコードする、核酸配列、
を含み、
（ｂ）宿主細胞を培養して前記融合蛋白質を製造し；及び
（ｃ）融合蛋白質の環境を変えて、それによりプロ−ペプチドは融合蛋白質より開裂し、組み換えポリペプチドを放出する、
という過程を含む、組み換えポリペプチドの調製方法を提供する。
融合蛋白質の環境は、多くの手段を用いて変える事が可能であり、その手段には、ｐＨ、温度又は塩濃度、又はプロ−ペプチドを融合蛋白質より自己開裂させて、組み換えポリペプチドを放出させる事を可能にする、他の変化が含まれる。好適な実施例においては、成熟したチモーゲンは、（ｃ）の過程においてこの方法に加えられて、融合蛋白質からプロペプチドを開裂させる補助を行う。
「プロ−ペプチド」という用語は、チモーゲンのアミノ末端部分、又は最大成熟部位までの機能可能な一部分を、ここでは意味している。
「自己触媒的に成熟するチモーゲン」という用語は、
（ｉ）チモーゲンは、別途の特異的プロテアーゼを必要とせずに、その活性型にプロセスされる事が可能である事
（ｉｉ）成熟型のチモーゲンは、開裂反応を補助する事が可能である事
を、ここでは意味している。
「成熟チモーゲン」という用語は、プロ−ペプチド配列又はその一部分を含有しないチモーゲンを、ここでは意味している。
このポリペプチドは、プロ−ペプチドと非相同である任意のポリペプチドである事が可能であり、それはこのポリペプチドがチモーゲンとしてプロ−ペプチドと普通に結合する成熟蛋白質ではない事を意味している。
他の観点において、本発明は、融合蛋白質をコードするキメラ核酸配列を与え、そのキメラ核酸配列は自己触媒的に成熟したチモーゲンより得られたプロ−ペプチドをコードする第一の核酸配列及びプロ−ペプチドとは非相同なポリペプチドをコードする第二の核酸配列を含む。そのキメラ核酸配列は、チモーゲン全体をコードする核酸配列を、一般的には含まない。
本発明の融合蛋白質をコードするキメラ核酸配列は、宿主細胞中での良い発現を保証する組み換え発現ベクター中へ、既知の方法で導入する事が可能である。
従って本発明は、本発明のキメラ核酸分子より構成される組み換え発現ベクターもまた含み、そのキメラ核酸分子は宿主細胞中において発現するのに適している調節配列及び終結領域に、機能を保つ様に結合している。
「核酸配列」という用語は、ヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーの配列の事であり、天然に存在する塩基、糖及び糖鎖間（主鎖）結合より構成される。その用語は、天然に存在しないモノマー又はその一部分により構成されて、同様に機能する、修飾又は置換された配列もまた含む。本発明の核酸配列はリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でも良く、アデニン、グアニン、シトシンチミジン及びウラシルを含む、天然に存在する塩基を含有できる。その配列には、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル及び他のアルキルアデニン類、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン類、８−ヒドロキシルアデニン及び他の８−置換アデニン類、８−ハログアニン類、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン類、８−ヒドロキシルグアニン及び他の８−置換グアニン類、他のアザ及びデアザウラシル類、チミジン類、シトシン類、アデニン類、又はグアニン類、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロチトシンの様な修飾塩基を含む事もまた、可能である。
「宿主細胞中で発現するのに適した」という用語は、組み換え発現ベクターが、本発明のキメラ核酸配列である制御配列及び終結部位を含有している事を意味し、その制御配列及び終結部位は発現に用いるために宿主細胞に基づいて選択され、機能を保つ様にキメラ核酸配列に結合している。機能を保つ様に結合するとは、キメラ配列が発現できる様な様式で、キメラ核酸配列が制御配列及び終結部位に結合している事を意味している。制御配列及び終結部位は、その分野で認識されており、適切な宿主細胞中において、求める蛋白質を直接的に発現させる様に選択された。従って、制御配列という用語にはプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御因子が含まれる。その様な制御配列は、当業者に知られており、又はＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）の中で述べられている物を喪散る事ができる。発現ベクターのデザインは、形質転換する宿主細胞の選択及び／又は発現を望んでいる蛋白質の型、の様な要因に依存するしているであろうことが理解されなければならない。その様な発現ベクターを、細胞を形質転換するために使用する事が可能であり、それによりここで述べられた核酸によりコードされた融合蛋白質又はペプチドを生産する。
本発明の組み換え発現ベクターを、原核細胞又は真核細胞中において、コードされた融合蛋白質が発現する様に設計する事が可能である。例えば、融合蛋白質を、大腸菌の様な細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウィルスを用いて）、酵母細胞、植物細胞又は哺乳細胞中において発現させる事が可能である。他の適切な宿主細胞が、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）の中で見出される。融合蛋白質の発現のために選択された宿主細胞の型は、本発明において重要ではなく、望みの細胞を用いる事ができる。
原核細胞中における発現は多くの場合、融合蛋白質の発現を支配する構成的又は誘導可能なプロモーターを含有するベクターを有している大腸菌中において行われる。誘導可能な発現ベクターには、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が含まれる。一方、標的遺伝子の発現は、ｐＴｒｃ中における、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター由来の宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存し、ｐＥＴ１１ｄ中に挿入した標的遺伝子の発現は、共発現したウィルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）により仲介された、Ｔ７ ｇｎ１０−ｌａｃ０融合蛋白質由来の転写に依存している。このウィルスポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、Ｔ７ ｇｎ１に結合しているレシデントλプロファージから、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御の下、提供される。他の魅力的な細菌発現システムはｐＧＥＸ発現システム（ファルマシア）であり、そのシステムにおいて遺伝子はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合産物として発現し、それにより発現した遺伝子をＧＳＴアフィニティーカラムから精製する事が容易となる。
大腸菌中において組み換え蛋白質の発現を最大とする戦略の一つは、宿主細菌中において組み換えて発現した蛋白質の蛋白質分解の能力を減少させる事である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。他の戦略は、キメラＤＮＡの核酸配列を変えて、発現ベクター中に挿入される様にする、というものであり、それによりそれぞれのアミノ酸に対する個々のコドンは、高度に発現した大腸菌蛋白質中において、好んで用いられるものとなるであろう（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の、その様な核酸配列の変換は、通常のＤＮＡ合成技術により行う事ができる。
酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）中における発現に用いるベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ．（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン社、サンディエゴ、ＣＡ）が含まれる。
バキュロウィルスベクターを、培養した昆虫細胞（ＳＦ９細胞）中において蛋白質を発現させる目的で使用する事ができ、その様なバキュロウィルスベクターにはｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）が含まれる。
Ｔｉ及びＲｉプラスミドの様なベクターを、植物の形質転換及び発現に用いる事が可能である。これらのベクターによりＤＮＡ転移機能が特定された。そして、その構築物を植物中に導入し、アグロバクテリウムにより仲介された形質転換を通じて安定に結合したい時に、それらのベクターを用いた。
典型的な構築物は、５’から３’方向に、植物中で発現を支配できるプロモーターが完全に含まれる制御領域、蛋白質コード領域、及び植物中での転写終結シグナルの機能を含む配列より構成される。構築物を構成するその配列は、天然又は合成、又はその任意の組み合わせが可能である。
３５−Ｓ ＣａＭＶプロモーター（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｇｅｎｅ ５３：１５３−１６１）の様な非種特異的なプロモーター及び、種特異的な発現を求める場合にはファセオリンプロモーター（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：３３２０−３３２４）又はシロイヌナズナ１８ｋＤａオレオシンプロモーター（Ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１１７７−１１７９）の様な種特異的なプロモーター、の両者を用いる事ができる。プロモーターに加えて、制御領域は植物中で転写産物の翻訳を可能とするリボゾーム結合部位を含み、ＡＭＶリーダーの様な一つ又はそれ以上のエンハンサー配列（Ｊｏｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ，（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５）もまた含む事があり、それにより産物の発現が増加する。
構築物のコード領域は、典型的には求める蛋白質と読み枠中で融合したプロ−ペプチド領域をコードする配列より構成されて、翻訳終結コドンで終了する。その配列は、イントロンを含む事もまたできる。
転写終結シグナルを含む領域は、ノパリン合成酵素終結配列の様な、植物中で機能するような任意の配列によい構成され、また発現産物を増加させるエンハンサー配列を更に含む事ができる。
その構築物の種々の成分は常法を用いて結合、典型的にはｐＵＣ−に基づいたベクターへ結合させる事ができる。この構築物を、その後アグロバクテリウムベクターへ、引き続き宿主植物中に導入する事が可能であり、導入には下記に述べる形質転換方法の一つが用いられる。
発現ベクターは、普通は植物細胞中での発現を可能にするマーカーも含む。便利な事に、そのマーカーは例えばグリフォセートの様な除草剤に対する抵抗性であったり、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール又はそれらと類似の抗生物質に対する耐性であったりする。用いた特定のマーカーは、導入した組み換え核酸分子を欠損している細胞に由来する、形質転換細胞の選抜を可能とするものとなるであろう。
核酸配列、特にＤＮＡを植物宿主細胞中に導入するのに、種々の技術を用いる事が可能である。例えば、キメラＤＮＡ構築物を宿主細胞中に導入する事が可能であり、当該宿主細胞は、例えばタバコの様な双子葉植物、及びＢ．ｎａｐｕｓの様な油性の種より得る事が可能であり、遺伝子導入は標準的なアグロバクテリウムベクターを用いて、Ｍｏｌｏｎｅｙら、（１９８９）、（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，８：２３８−２４２）又はＨｉｎｃｈｅｅら（１９８８），（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６：９１５−９２２）；により述べられている様な形質転換プロトコール、又は当業者間において知られている他の技術を用いて行う。例えば、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞の形質転換に使用する事は、広範囲に研究されており、ＥＰＡ番号１２０，５１６の：Ｈｏｅｋｅｍａら，（１９８５），（Ｃｈａｐｔｅｒ Ｖ，Ｉｎ：Ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ）；Ｋｎａｕｆら，（１９８３），（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｐ．２４５，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ−Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ）；及びＡｎら（１９８５）、（ＥＭＢＯ Ｊ．，４：２７７−２８４）において述べられている。便利な事に、外植体をＡ．ツメファシエンス又はＡ．リゾゲネスと共に栽培する事が可能であり、それにより転写構築物を植物細胞に転移する事が可能である。アグロバクテリウムを用いた下記の形質転換に続いて、選抜するために植物細胞を適切な培地に分散し、引き続いてカルス、芽、そして最終的には幼植物が得られる。アグロバクテリウム宿主は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に転移するのに必要な遺伝子より成るプラスミドを有しているであろう。インジェクションとエレクトロポレーションの為に（下を見よ）、ディスアームしたＴｉプラスミド（ガン遺伝子、特にＴ−ＤＮＡ領域を欠損している）を植物細胞中へ導入する事ができる。
非アグロバクテリウム法を用いる事により、ここで述べた構築物を使用する事が可能であり、それにより広範囲の単子葉及び双子葉植物及び他の生物を形質転換して発現させる事ができる。これらの技術は、アグロバクテリウム形質転換システムにおいては使いづらい種において、特に有用である。他の遺伝子送達の技術には、バイオリスティックス（Ｓａｎｆｏｒｄ，（１９８８），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６：２９９−３０２）、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８；Ｒｉｇｇｓ ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５６０２−５６０６）又はＰＥＧに仲介されたＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６９−１７７）が含まれる。
Ｂ．ｎａｐｕｓの様な特別な適用例においては、組み換えＤＮＡ構築物を得る事を目指した宿主細胞は、典型的にはＭｏｌｏｎｅｙら（１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，８：２３８−２４２）により述べられた様に子葉性葉柄（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ ｐｅｔｉｏｌｅｓ）より得られる。市販の油の種を用いた他の例には、ダイズ外植体中の子葉形質転換（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び綿の茎の形質転換が含まれる（Ｕｍｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：２６３−２６６）。
形質転換に続いて、例えばリーフディスクとして、細胞を選抜培地中で生育した。一度芽が出始めたら、それらを切り取って出根培地に置いた。十分に根がでたら、植物を土に移植した。形質転換したと思われる植物につき、その後、マーカーの存在を試験した。適切なプローブ、例えばキモシン プロ−配列を用いて、ゲノミックＤＮＡについてサザンブロッティングを行い、宿主細胞のゲノム中へ、求める配列が組み込みまれた事を示した。
常法に従って生育した形質転換植物を播種した。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，５：８１−８４）を見よ。適当な遺伝子プローブを用いて、転写が起こっているであろうと思われる組織、例えば種子胚より単離したＲＮＡ、についてノザンブロッティングをする事ができる。転写産物の大きさを、その後、融合蛋白質転写産物の推定された大きさと比較する事が可能である。
形質転換植物を、２世代又はそれ以上の世代の間生育する事ができ、掛け合わせた交配又は自己交配を行い、求める表現型の特徴を有する植物と株を同定する事が可能であり、その様な求める特徴には、組み換え蛋白質の生産が含まれる。組み換え蛋白質を生産する植物、株又は系統の同型接合性を保証する事は望ましく、それにより組み換えた特徴の遺伝が継続している事が保証される。同質の植物を選抜する方法は、植物育種の当業者には良く知られており、反復自己交配し、選抜し、約培養を行い、小胞子培養を行う。同型接合体の植物は、ハプロイドの細胞又は組織を形質転換し、続いてハプロイドの幼植物を再生し、引き続いて任意の既知の手段により（例えば：コルヒチン又は他の微小管破壊試薬による処理）ディプロイドへ変換する。
本発明のポリペプチドは、本方法で用いたプロ−ペプチドと、普通には融合しない、任意のペプチドである事ができる。当該ポリペプチドは、例えば酸性ｐＨの様な開裂条件下で好ましくは安定であり、そして当該ポリペプチドは開裂した後にｐＨを調整したり、又は他の環境を変えた時に活性化されて、さもなければ酵素活性に至適の条件が作られる。組み換え細胞システム中での融合蛋白質の生産開始と同時に、開裂反応はいつでも行う事ができる。好適な実施例において、開裂反応は組み換え蛋白質を生産している粗細胞抽出物又はその任意の精製画分を用いて行われる。
本発明で使用されるプロ−ペプチドは、任意の自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られる任意のプロ−ペプチドである事が可能であり、自己触媒的に成熟するチモーゲンにはアスパラチックプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼが含まれる。本発明の好ましい実施例において、当該プロ−ペプチドはキモシン、ペプシン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ペプシノーゲン、カテプシン又は酵母プロテイナーゼＡより得られる。ペプシノーゲン（Ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９６８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６１０４−６１０９：Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７３），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３５：２５５−５２６）、キモシン（Ｆｏｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）：Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０：２１７７−２１８７）、酵母プロテイナーゼＡ（Ａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４９０−２４９９：Ｗｏｏｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２５００−２５１０）、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（Ｒａｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．３：５７−６９）、カテプシン（ＭｃＩｎｔｙｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５６７−５７２）及びペプシンのアミノ酸及び／又はＤＮＡ配列が入手可能である（Ｋｏｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４３：６−１０）。これらの配列に基づいて、当該プロペプチドをコードする遺伝物質を含むｃＤＮＡクローンを調製する事ができ、本発明に従い、そして当業者に既知の市販の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを見よ）を実施する事により、融合遺伝子を得る事ができる。
希望する特徴を有する他のプロ−配列を同定するために、自己触媒的に開裂を受けるチモーゲンについては単離されている時に（例えば、キモシンと酵母プロテインＡ）、蛋白質の部分配列の解読を行い、それにより他のプロ−ペプチド類を同定するための核酸プローブを設計する事ができる。核酸プローブを、任意の生細胞又はウィルスより調製されたｃＤＮＡ又はゲノミックライブラリーをスクリーニングするために用いる事もできる。適切な条件下で当該プローブとハイブリダイズする配列を、その後単離する事ができる。
他のプロ−配列もまた、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングする事により単離する事ができる。現存するプロ−ペプチドに対する抗体が得られる事もあり、そして元来Ｈｕｙｎｈら（１９８５，ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．１，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）により述べられた方法により、これらの抗体によってｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。発現ライブラリーは、任意の生細胞又はウィルスより調製する事ができる。
自己触媒的にプロセスされる他のチモーゲンが、当業者によって発見される可能性もある。選択された実質的なプロ−配列は、決定的に重要ではなく、希望のもので良い。本発明の精神又は範囲より離れる事なく、自己触媒的に成熟する任意のチモーゲンを使用できる事が、明確に理解されるべきである。
プロ−配列の単離に関して、遺伝物質をコードするプロ−ペプチドを、興味のあるポリペプチドをコードする遺伝物質と融合する事ができ、その際に制限消化、ライゲーション、ゲル電気泳動、ＤＮＡ配列決定及びＰＣＲの様な、当業者に知られているＤＮＡクローニング技術が用いられる。必要なクローニングの段階を行うために、広範囲のクローニングベクターを使用する事ができる。この目的に特に適しているのは、大腸菌中で機能する事ができる複製システムを含むクローニングベクターであり、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等である。これらのベクター中に配列を導入することができ、そしてそれらのベクターは大腸菌宿主を形質転換するために使用され、その大腸菌は適切な培地中で培養される。細胞を回収して可溶化して、プラスミドを回収する事ができる。
本発明は、全長のプロ−ペプチドのみならず、当該プロ−ペプチドの機能部分、又は機能を有する当該プロ−ペプチド変異した形態も含む。変異した形態のプロ−ペプチドは、当該プロ−ペプチドと非相同蛋白質の間の、特異的な開裂をす得るために使用される。プロ−ペプチド中に変異が起こると、温度、ｐＨ、塩濃度の様な至適条件が変化する事があり、その条件下で非相同ペプチドの開裂が起こる（ＭｃＣａｍａｎ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ Ｃｕｍｍｕｎｇｓ，Ｄ．Ｂ．，（１９８６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１５３４５−１５３４８）。プロ−ペプチドに依存して、種々のプロ−ペプチドからの非相同蛋白質の開裂は、種々の異なった条件下で至適となるであろう。そこで、本発明は非相同蛋白質に影響を受け易く、非相同蛋白質は種々の望ましい条件下で選択的に開裂する。
非相同ポリペプチドをコードする核酸配列は、プロ−ペプチドをコードする核酸配列の上流又は下流で融合する事ができ、非相同蛋白質と融合したプロ−ペプチドの繰り返し単位を含むコンカテマーを使用できる。好適な実施例において、非相同蛋白質はプロ−ペプチドの下流で融合している。プロ−ペプチドをコードする核酸配列は、通常は成熟した型のチモーゲンを含まない。
一つの実施例において、プロ−ペプチドはキモシンより得られたプロ−ペプチドであり、非相同ポリペプチドはヒルジン（Ｄｏｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６５：１８０−１８３）である。特に本発明者らは、キメラＤＮＡ配列を構築し、当該キメラＤＮＡ配列中においてキモシンプロ−ペプチドをコードするＤＮＡは、ヒルの抗凝血蛋白質であるヒルジンをコードするＤＮＡ配列の上流と融合している。その遺伝子融合体（プロ−ヒルジン）を大腸菌中で発現した。ｐＨをｐＨ２に、より好ましくはｐＨ４．５に下げた時に、少量の成熟キモシンの存在下において、非相同的に融合した蛋白質であるヒルジンが、キモシン プロ−ペプチドより効率的に開裂する事が見出された。
自己触媒的な開裂には、融合ペプチドの環境の変化が必要とされる。これには、ｐＨ、温度、塩濃度、他の化学薬剤の濃度の変化、又は融合蛋白質の自己触媒的な開裂を起こさせるであろう環境条件をもたらす結果となる、他の任意の変化が含まれる。融合蛋白質を適切な開裂環境に送る事により、その環境を変える事ができる。開裂の環境は、哺乳動物の胃、腸、腎臓、乳又は血液の様な生理的な環境であったり、又は人工的に作られた環境条件である事もある。一つ又は複数の作用物質を加える事により、又は融合蛋白質の温度環境を変える事によっても、開裂環境が作られる。融合蛋白質が純粋であったり、実質的に純粋である時だけでなく、細胞抽出物の様なもっと未処理な調製をした中に存在する時にも、開裂反応は起こる。
好適な実施例において、開裂反応中で補助するために、本発明者らは成熟キモシンを用いた。一般的に、成熟した酵素を加える事は、開裂反応の助けとなる。この反応に用いられる酵素は、プロ−ペプチドと相同である場合があり、例えば、求める蛋白質と融合したプロ−キモシンの開裂を補助するのにキモシンが使われる事があり、又、プロ−ペプチドと非相同な場合があり、例えば、求める蛋白質と融合したプロ−キモシンの開裂を補助するのにペプシンが使われる事がある。
好適な実施例において、成熟したキモシンが添加されるが、他のプロ−ペプチドを用いた時には、効率的に開裂させるために成熟ペプチドを添加する事を必要とはしない事も考えられる。
融合蛋白質の活性化は、インビボであっても、インビトロであっても良い。一つの実施例において、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／２１０２９の中で開示されている、油体上で組み換えて生産した蛋白質からの開裂を促進するために、プロ−ペプチドを使用している。この実施例において、当該プローペプチドは油体蛋白質の下流と、興味の対象である組み換え蛋白質又はペプチドの上流で融合するであろう。
他のインビボの適用においては、２つのベクターが同一の宿主中に導入されるであろう。一つのベクターにおいて、チモーゲン又は成熟蛋白質の発現は、誘導可能なプロモーターシステムにより制御されるであろう。もう一つのベクターは、興味の対象である非相同蛋白質の上流と融合したプロ−ペプチドを含むであろう。そこで、プロモーターを通じてプロ−ペプチドの下流のペプチド又は蛋白質の開裂の時期を制御する事は可能であり、そのプロモーターはチモーゲン又は成熟蛋白質の発現を制御している。替わりに、発現した二つの遺伝子は、同一のベクターの中で結合されるであろう。本出願の好適な実施例において、用いたプロ−ペプチドは、生理的な条件下で開裂する。
もう一つの観点からすると、本発明は（ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られたプロ−ペプチド、及び（ｂ）当該プロ−ペプチドに対して非相同であるポリペプチド、を含む融合蛋白質を提供する。一つの実施例において、そのポリペプチドは治療剤又は栄養剤として使われるペプチド又は蛋白質であり、そのペプチド又は蛋白質を不活性な融合蛋白質として投与する事ができる。開裂を通しての活性化又は成熟は、それが送られる時にのみ、特異な生理的条件下において起こると考えられ、その生理的条件は、標的器官、組織、又は例えば哺乳動物の胃、腸、腎臓、乳又は血液等の中の体分泌液において一般的なものである。開裂は、ペプチドに対して特異的なプロテアーゼにより促進されるかもしれず、好ましくはプロ−ペプチドと相同な成熟チモーゲンが用いられる。この方法は、経口で摂取されるワクチン、サイトカイン、ガストリックリパーゼ、ペプチド抗生物質、及びラクターゼ及びキシラナーゼ及びセルラーゼの様な消化を促進するウシの餌の酵素を送るのに特に有効である。例えば、キモシンプロ−ペプチドの下流と融合している薬剤又は栄養剤として使われるペプチド又は蛋白質は、摂取された時に、哺乳動物の胃の中で活性化されるであろう。成熟した型のキモシン又はキモシンの不活性型前駆体を、薬剤又は栄養剤として使われるペプチドの開裂を助ける目的で、添加する事がある。
従って、本発明の一つの実施例において、（ａ）自己触媒的に成熟したチモーゲンより得られたプロ−ペプチド、及び（ｂ）当該プロ−ペプチドとは非相同であり、適切な希釈剤又は担体との混合物であるポリペプチド、を含む融合蛋白質を含む薬剤組成物を提供する。その組成物は、経口的に、静脈注射により、又は任意の他の移行経路を通じて投与する事ができる。
当該融合蛋白質及び／又は成熟蛋白質は、食用の食材、例えば動物の乳又は食用穀物中でも生産する事ができ、それらはそれ以上の精製を必要とせずに消費される。従って、本発明のもう一つの実施例において、（ａ）自己触媒的に成熟したチモーゲンより得られたプロ−ペプチド、及び（ｂ）当該プロ−ペプチドとは非相同であり、適切な希釈剤又は担体との混合物であるポリペプチド、を含む融合蛋白質を含む食品組成物を提供する。栄養剤の組成物は任意の液体又は固体食物と混合され、ヒト又は動物により消費される。
本発明の組成物には、キメラ核酸配列又は本発明のキメラ核酸配列を含む発現ベクターが含まれる。その様な実施例においては、当該融合蛋白質は宿主細胞中において、インビボで生産される。本発明のキメラ核酸配列を、輸送媒介物を用いて、インビボで細胞又は組織に導入する事ができ、輸送媒介物としてレトロバイラルベクター、アデノバイラルベクター及びＤＮＡウィルスベクターがある。キメラ核酸配列を、インビトロで細胞中に導入する事もまた可能であり、その手段としてマイクロインジェクション及びエレクトロポレーションの様な物理的な技術、又共沈殿及びリポソーム中へ核酸の導入の様な化学的方法を使用できる。発現ベクターを、エアロゾル又は洗浄の形で移行する事もできる。
本発明は、組み合え蛋白質の精製過程でもまた利用できる。一つの実施例において、プロペプチドと非相同蛋白質の、発現した融合蛋白質を含む細胞抽出液を、クロマトグラフィーカラムに適用する。プロ−ペプチド配列に対して作成し、カラムに固定した抗体に対して、融合蛋白質が選択的に結合し、その結果融合蛋白質質が選択的に保持される事になる。プロ−ペプチド配列に対する抗体に拠る替わりに、他の免疫源となる領域をコードする遺伝子又は一般的に用いられるカラム材料と親和性を有するペプチドをコードする遺伝子が遺伝子融合物中に含まれ、そのようなカラム材料としては、例えばセルロース、グルタチオン−Ｓ−セファロース又はキチン、又は望ましい任意のタグがある。
他の予想できる適用としては、細胞壁中で融合蛋白質をつなぐ結果となる配列をコードするペプチドも、この発明の構成に含まれるであろう。つなぎとなる様な、この適用に適する蛋白質は、α−グルテニンＦＬＯ１、下等真核生物の主要細胞壁蛋白質、及び乳酸菌のプロテイナーゼ（ＰＣＴ９４／１８３３０）であろう。融合蛋白質の発現は、興味の対象である蛋白質を、細胞壁に固定化する結果となるであろう。興味の対象である蛋白質は、細胞を水又は洗浄バッファーで洗浄する事により単離できるであろう。開裂した時に、細胞は単純な遠心分離のステップを用いて除くことができ、洗浄バッファーより蛋白質が単離されるであろう。
下記の実施例は非限定的なものであり、本発明を解説するものである。
実施例
実施例１
最初の例において、蛋白質のヒルジンが、キモシンプロ−ペプチドとの融合蛋白質として調製され、そして、開裂反応を行った時、大腸菌の細胞抽出物中で、ヒルジンが活性である事が示された。
ｐＧＥＸ−Ｐｒｏ−ヒルジン融合物の構築
我々が研究した融合蛋白質は、ヒルジン変異体１（Ｄｏｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６５：１８０−１８３）と融合した子牛キモシンＢ（Ｆｏｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９７７：Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：２１７７−２１８７）のプロ−ペプチドより成る。この融合蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子は、標準的なＰＣＲ法（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ，７７：６１−６８）を用いて構築された。このＰｒｏ−ヒルジン融合物のＤＮＡ配列は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマシア）の中の、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする遺伝子の下流にクローンされた。ＧＳＴ−Ｐｒｏ−ヒルジン配列の全配列を、図１に示す。
ｐＧＥＸ−４Ｔ−３とｐＧＥＸ−Ｐｒｏ−ヒルジンで形質転換した大腸菌の生育
ｐＧＥＸ−４Ｔ−３とｐＧＥＸ−Ｐｒｏ−ヒルジンの両プラスミドを、大腸菌株ＤＨ５α中に形質転換し、高いレベルで発現できる様にした。５ｍｌのＬＢ−ａｍｐブイヨンに接種するのに、一つのコロニーを用いた。それぞれの一晩培養した培養液の１ｍｌを、５０ｍｌのＬＢ−ａｍｐブイヨンに接種するのに使用した。これらの培養液を、ＯＤ₆₀₀が０．６になるまで生育した。このＯＤにおいて、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加して、ＧＳＴ蛋白質及びＧＳＴ−Ｐｒｏ−ヒルジン融合蛋白質の発現を誘導した。この誘導を行った後に、培養液を更に、３７℃で３時間生育した。細胞を５０００ｘｇで１５分間ペレットし、５ｍｌのトリスで緩衝した生理食塩水（ＴＢＳ）中に再懸濁した。再懸濁した細胞を超音波破砕し、１２０００ｘｇで１５分間遠心分離し、可溶性蛋白質（上清画分）から封入体（ペレット画分）を分離した。ペレット及び上清の両画分のウエスタンブロッティングにより、下記に述べた生育条件下において、かなりの量（５−１０％）のＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｐｒｏ−ヒルジン蛋白質が上清画分に見出される事が示された。残り（９０−９５％）が、封入体中に蓄積した（結果を示さない）。
ヒルジン活性測定
ＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｐｒｏ−ヒルジンの両者の上清画分について、抗トロンビン活性を試験した。両サンプルを、下記の様に試験した。
Ａ）２０μｌの上清 ＋ ２０μｌの水
Ｂ）２０μｌの上清 ＋ ２０μｌの１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ２．０
Ｃ）２０μｌの上清 ＋ ２０μｌの１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ２．０ ＋ ２μｇ キモシン（シグマ）
Ｄ）２０μｌの上清 ＋ ２０μｌの１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ４．５
Ｅ）２０μｌの上清 ＋ ２０μｌの１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ４．５ ＋ ２μｇ キモシン
これらのサンプルを、室温で１時間インキュベートした。全体の１０μｌのサンプルを、１ｍｌのアッセイバッファー（２０ｍＭ トリス［ｐＨ７．５］，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ₂，０．１ユニットのトロンビン）に添加し、５０μｌのｐ−ｔｏｓ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ニトロアニリド（１ｍＭ）を添加する前に、２−３分間インキュベートした。トロンビン活性は、４０５ｎｍにおける吸収の増加を経時的に観察する事（Ｃｈａｎｇ，１９８３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１６４：３０７−３１３）により、クロモザイムを開裂する機能として測定された。△_abs（４０５ｎｍ）は、２分後に測定された。活性測定の結果を、表１に示す。
表１より見られる様に、顕著な抗トロンビン活性を示した唯一の抽出物は、ＧＳＴ−プロ−ヒルジン融合物を含み、ｐＨ４．５で処理されて、２μｇのキモシンが添加された（Ｅ）、抽出物であった。ウエスタンブロッティン（結果を示さない）により、ｐＨ４．５での処理から離れても、ＧＳＴ−Ｐｒｏ−ヒルジン融合物がｐＨ２．０で処理されて、２μｇのキモシンが添加された時にもまた、完全な開裂が観察される事が示された。プロセスされないキモシンがｐＨ２．０に置かれた時、キモシンへと成熟する前にシュードキモシンを生成する事が、良く書かれている（Ｆｏｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４２：６５−７９；Ｆｏｌｔｍａｎｎ，１９２２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：２３２１−２３２４；ＭｃＣａｍａｎ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１５３４５−１５３４８）。シュードキモシンの開裂部位は、Ｐｈｅ²⁷−Ｌｅｕ²⁸ペプチド結合の間に位置し、その位置は図１に示されている。ＧＳＴ−プロ−ヒルジン融合物が、ｐＨ２．０で処理されて２μｇのキモシンが添加された時に、トロンビン活性を阻害できない事は、Ｐｈｅ⁴³−ＶＡＬ⁴⁴ペプチド結合よりもＰｈｅ²⁷−Ｌｅｕ²⁸ペプチド結合において開裂が起こる事により説明されるかもしれず、Ｐｈｅ⁴³−ＶＡＬ⁴⁴ペプチド結合において成熟ヒルジンからキモシンプロ−ペプチドが分離する。成熟ヒルジンは、その天然のＮ末端配列に別途のアミノ酸を有していない時にのみ活性である事が、良く書かれている（Ｌｏｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：７２−７７）。
実施例２
第二の実施例において、コイの成長ホルモン（ｃＧＨ）を、プロ−キモシンの融合蛋白質として調製した。開裂反応を行った時に、コイの成長ホルモンが大腸菌の細胞抽出物中に存在している事が示されている。
ｐＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合物の構築
コイ成長ホルモン（Ｋｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｇｅｎｅ ６７：３０９−３１５）と融合した子牛キモシンＢ（Ｆｏｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７７），Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：２１７７−２１８７）のプロ−ペプチドより構成される融合蛋白質が構築された。この融合蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子が、ＰＣＲより仲介された遺伝子融合を用いて構築された。このＰｒｏ−ｃＧＨ融合物のＤＮＡ配列が、ｐＵＣ１９中にクローンされ、ｐＰｒｏ−ｃＧＨプラスミドを得た。ＳｗａＩ／ＫｐｎＩ分解により、Ｐｒｏ−ｃＧＨ遺伝子融合物がｐＰｒｏ−ｃＧＨより遊離し、ｐＲＳＥＴＢ（インビトローゲン社）のＰｖｕＩＩ／ＫｐｎＩ部位へ挿入され、ｐＲＳＥＴＢは精製を促進するためのポリヒスチジンのタグ、及びｐＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨを生成するためのエンテロキナーゼの認識及び開裂部位を含む。
ｐＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨにより形質転換した大腸菌の生育
ｐＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１株中へ形質転換され、高いレベルの発現を可能とした。単一のコロニーを用いて、ＬＢ−ａｍｐブイヨンを接種した。１ｍｌの、それぞれの一晩の培養物を用いて、５０ｍｌのＬＢ−ａｍｐブイヨンを接種した。これらの培養物を、ＯＤ₆₀₀が０．６になるまで生育した。このＯＤにおいて、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）を添加して、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合蛋白質の発現を誘導した。この誘導を行った後に、培養液を更に、３７℃で３時間生育した。細胞を５０００ｘｇで１０分間ペレットし、５ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．３）中に再懸濁した。再懸濁した細胞をフレンチプレスで破砕して、１００００ｘｇで１０分間遠心分離した。封入体を５ｍｌの水に再懸濁し、ゆっくりとＮａＯＨを添加して溶解した。１ｍｌの１０ｘＰＢＳをこの溶液に添加して、容量を１０ｍｌに調整した。ゆっくりとＨＣｌを添加して溶液のｐＨを８．０に調整し、その溶液を４℃で２時間インキュベートした。ｐＨを７．５に調整し、この時点で溶液を１００００ｘｇで１５分間遠心分離し、不溶物を除いた。Ｈｉ−Ｔｒａｐ金属結合カラム（ファルマシア）を用いて、アフィニティーカラムをキレートする事により、その後融合蛋白質を精製した。カラムは亜鉛イオンにより飽和され、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合蛋白質をアフィニティー精製するために、製造業者より提供された説明書に従って使用された。
ｐＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨで形質転換した大腸菌中で生産されたｃＧＨの開裂
融合蛋白質を開裂するために、、１５μｌの蛋白質調製液（およそ１μｇ）を、１７μｌのＰＢＳ（Ｕｎｃｕｔ）、１４μｌのＰＢＳ及び３μｌのエンテロキナーゼ（Ｃｕｔ（ＥＫ））、又は１６μｌのリン酸バッファー（ｐＨ２）及び１μｌのキモシン（Ｃｕｔ（ＰＲＯ））のいずれかで処理を行った。全てのサンプルを、３７℃で２時間インキュベートして、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと引き続いてのウエスタンブロッティングで解析を行った。使用した一次抗体は、ｃＧＨに対して調製したウサギ抗血清である。二次抗体は、アルカリフォスファターゼと結合した、ヤギの抗ウサギＩｇＧである。
図３で見られる様に、融合蛋白質の開裂がエンテロキナーゼにより見られ、Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合物の計算上の分子量（２６ｋＤａ）に相当する蛋白質のバンドが得られる。同様に、キモシンを用いた開裂により、ｃＧＨポリペプチドの、期待される理論上の分子量（およそ２２ｋＤａ）に相当する蛋白質のバンドが得られる。
実施例３
この実施例において、コイ成長ホルモン（ｃＧＨ）の蛋白質が、プロ−キモシンの融合蛋白質として調製された。コイ成長ホルモン融合蛋白質は、レッドチュルニップビートル（ｒｅｄ ｔｕｒｎｉｐ ｂｅｅｔｌｅ）の腸管抽出物により開裂し、それにより本発明のインビボでの適用を述べる。
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨは、実施例２のプロトコールに従って調製された。腸管抽出物は、以下の様にして、レッドチュルニップビートルの幼虫より調製された。レッドチュルニップビートル（Ｅｎｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｂｒｏｗｎ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ））の卵は、実験室で育てられた成虫により産まれ、使用する前に少なくとも３カ月間−２０℃で貯蔵した。湿った濾紙を含むディッシュの中で卵を孵化し、幼虫はカノーラの苗木の上で飼育した。活発に餌を食べる幼虫だけを使用した。第二の脱皮中間形態（ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｓｔａｒ）の幼虫に由来する中腸を、生理食塩水中で解剖を行って切り取り、生理食塩水中で−２０℃において貯蔵した。腸を解凍し、純水（ｄｄＨ₂Ｏ：腸あたり５０μｌ）の中で洗浄した。ホモゲネートを１６０００ｘｇ（１０分間、４℃）で遠心分離し、デカントした上清を蛋白質分解アッセイにおいて使用した。
図４で見られる様に、レッドチュルニップビートルの腸管より調製された抽出物は、融合蛋白質を開裂し、ｃＧＨポリペプチドを遊離した。開裂は完全であるとは見られなかった。これは、腸の抽出物におけるｐＨは、開裂反応が進行するには至適でなかった、という事実によるのかもしれない。
本発明を、現在好適な実施例であると見做されている例により述べてきたが、添付したクレームの精神及び範囲に含まれる、種々の変更及び均等なアレンジを含む事を本発明は意図している事を理解するべきである。
引用文献として、すべての出版物、特許及び特許公報は、あたかもそれぞれの個々の出版物、特許及び特許公報が、引用文献として完全に挿入される事を、明らかにそして個々に指示されたのと同じくらいに完全に挿入されてる。
詳細な図の説明
図１．ＧＳＴ−Ｐｒｏ−ヒルジン配列の、核酸及び推定アミノ酸配列。キモシン プロ−ペプチドの推定された配列には下線がひかれ、ヒルジン蛋白質の推定配列はイタリックで示されている。ヒルジンの核酸配列は、植物コドンとして使用するために最適化された。Ｐｈｅ２７−Ｌｅｕ２８の間の、シュードキモシン開裂部位、及びプロ−キモシンと成熟ヒルジンを解離するペプチド結合（Ｐｈｅ４２−Ｖａｌ４３）は、矢印で示した（↑）。
図２．Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ配列の、核酸及び推定アミノ酸配列。キモシン プロ−ペプチドの推定された配列には下線がひかれ、ｃＧＨの推定配列はイタリックで示されている。Ｌｙｓ３１−Ａｓｐ３２の間の、エンテロキナーゼ開裂部位、及びプロ−キモシンと成熟ｃＧＨを解離するペプチド結合（Ｐｈｅ８４−Ｓｅｒ８５）は、矢印で示した（↑）。ポリ−ヒスチジン部位（Ｈｉｓ５−Ｈｉｓ１０）及びエンテロキナーゼ認識部位（Ａｓｐ２７−Ｌｙｓ３１）もまた示した。
図３は、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ構築物の模試図である。エンテロキナーゼ開裂部位（エンテロキナーゼ開裂）及びプロ−キモシン開裂部位（ＰＲＯ開裂）を矢印で示した（↑）。
図４は、精製したＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨの開裂を説明している。抗ｃＧＨ抗体で検出したウエスタンブロットで示したのは、カラムで精製したＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ蛋白質抽出物であり、その蛋白質抽出物はＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合構築物を発現している大腸菌より得られ、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合構築物はエンテロキナーゼで処理をされ（Ｃｕｔ（ＥＫ））、低いｐＨにおいて成熟キモシンで処理をされ（Ｃｕｔ（ＰＲＯ））、及びＰＢＳバッファーで処理されたコントロールである（Ｕｎｃｕｔ）。
図５は、精製したＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨの開裂を説明している。抗ｃＧＨ抗体で検出したウエスタンブロットで示したのは、カラムで精製したＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ蛋白質抽出物であり、その蛋白質抽出物はＨｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合構築物を発現している大腸菌より得られ、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ｃＧＨ融合構築物は低いｐＨにおいて成熟キモシンで処理をされ（Ｃｕｔ（ＰＲＯ））、エンテロキナーゼで処理をされ（Ｃｕｔ（ＥＫ））、レッドチュルニップビートル由来の腸管抽出物で処理をされた（Ｃｕｔ（Ｒｅｄ Ｔｕｒｎｉｐ Ｇｕｔ））。

配列表
（1）一般情報
（i）出願人
（A）名前：セムバイオシス ジェネテクス インコーポレテッド
（B）通り：ノース ウエスト ユニバースティ ドライブ ２５００
（C）市：カルガリー
（D）州：アルバータ
（E）国：カナダ
（F）郵便番号：2N IN4
（G）電話番号：（403）220-5161
（H）テレファックス：（403）220-0704
（A）名前：ファン ローイェン ヘイス
（B）通り：ノース ウエスト ベアーズポウ ドライブ ３２２３
（C）市：カルガリー
（D）州：アルバータ
（E）国：カナダ
（F）郵便番号T2L 1T1
（A）名前：アルカンタラ ジョーネル
（B）通り：ノース イースト キャスルデイル プレイス ３
（C）市：カルガリー
（D）州：アルバータ
（E）国：カナダ
（F）郵便番号T3J IY4
（A）名前：モロニー モーリス
（B）通り：ノース ウエスト エッジブルック コーヴ ３４
（C）市：カルガリー
（D）州：アルバータ
（E）国：カナダ
（F）郵便番号T3A 5N5
（ii）発明の名称：融合蛋白質を開裂させる方法
（iii）配列の数：4
（iv）連絡先住所
（A）受信人：ベアスキン＆パール
（B）通り：ウエスト キングストリート４０
（C）市：トロント
（D）州：オンタリオ
（I）国：カナダ
（F）郵便番号：M5H 3Y2
（v）コンピューター解読型式：
（A）メディアの型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC コンパティブル
（C）オペレーティングシステム：PC−DOS／MS−DOS
（D）ソフトウェア：Patentin Release #1.0,Version #1.30
（vi）現在の出願のデータ：
（A）出願番号：ＰＣＴ
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）代理人情報：
（A）名前：グラベル ミシェリン
（B）登録番号：40,261
（C）整理番号：9369−54
（ix）電話連絡情報：
（A）電話番号：（416）364−7311
（B）テレファックス：（416）361−1398
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：1096塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を示す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．１０３２
（xi）配列の記載：配列番号１

（2）配列番号２の特徴：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：344アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２

（2）配列番号３の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：819塩基付
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．８１９
（xi）配列の記載：配列番号３：

（2）配列番号４の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２７３アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号４：

Claims (29)

1. 組み換え体ポリペプチドを調製する方法であって、
   ａ）宿主細胞中に以下の核酸配列を含む発現ベクターを導入し：
   （１）宿主細胞内で転写制御が可能な核酸配列、
   その核酸配列は機能を保つ様に（２）と結合し、
   （２）融合蛋白質をコードし、
   （ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られたプロ−ペプチドをコードし、読み取り枠中において（ｂ）と結合している核酸配列、
   （ｂ）プロ−ペプチドと非相同であり、前記組み換え体ポリペプチドをコードする核酸配列、
   を含むキメラ核酸配列、
   前記キメラ核酸配列において、非相同核酸配列はプロ−ペプチドをコードする核酸配列のすぐ下流に位置し、前記キメラ核酸配列は成熟型のチモーゲンをコードする配列を含まず、キメラ核酸配列は機能を保つ様に（３）と結合し、
   （３）宿主細胞中で機能できる終結領域をコードする、核酸配列、
   ｂ）宿主細胞を培養して前記融合蛋白質を製造し；及び
   ｃ）融合蛋白質の環境を変える事によりプロ−ペプチドを融合蛋白質より開裂させて、組み換え体ポリペプチドを放出させる、
   ことを含む方法。
2. 前記プロ−ペプチドが蛋白質分解酵素より得られた、請求項１記載の方法。
3. 前記プロ−ペプチドがアスパラチックプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はシステインプロテアーゼより得られた、請求項１記載の方法。
4. 前記プロ−ペプチドが、キモシン、トリプシノーゲン、ペプシン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ペプシノーゲン、カテプシン又は酵母プロテイナーゼＡより成る群より選択された、請求項１記載の方法。
5. ポリペプチドがヒルジン又はコイ成長ホルモンである、請求項１記載の方法。
6. 環境の変化が、ｐＨを変える事、塩濃度を変える事、又は温度を変える事より成る、請求項１記載の方法。
7. ｐＨを変える事が、２から４．５のｐＨへ、ｐＨを変える事より成る、請求項６記載の方法。
8. 環境の変化が、インビトロの条件下で起こる、請求項１記載の方法。
9. 環境の変化が、インビボの条件下で起こる、請求項１記載の方法。
10. インビボの条件が、動物の組織又は体分泌液の中において生じるものである、請求項９記載の方法。
11. 組織又は体分泌液が、前記動物の乳、血液、胃、腸又は腎臓より成る、請求項１０記載の方法。
12. 成熟型の、自己触媒的に成熟するチモーゲンが、段階（ｃ）において添加され、段階（ｃ）において前記チモーゲンがプロ−ペプチドと相同である、請求項１記載の方法。
13. 成熟型の、自己触媒的に成熟するチモーゲンが、段階（ｃ）において添加され、段階（ｃ）において前記チモーゲンがプロ−ペプチドと非相同である、請求項１記載の方法。
14. 成熟チモーゲンが、インビトロの条件下で添加される、請求項１２又は１３記載の方法。
15. 成熟チモーゲンが、インビボの条件下で添加される、請求項１２又は１３記載の方法。
16. 前記インビボの条件が、動物の組織又は体分泌液中において生じるものである、請求項１５の方法。
17. 組織又は体分泌液が、前記動物の胃、腎臓、腸、血液又は乳である、請求項１６記載の方法。
18. 前記核酸配列がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、請求項１から１３のいずれか一つに記載の方法。
19. キメラ核酸配列であり、
    （ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンに由来するプロ−ペプチドをコードする核酸配列、及び
    （ｂ）前記プロ−ペプチドと非相同であるポリペプチドをコードする核酸配列、を含む融合蛋白質をコードして、前記キメラ核酸配列において非相同核酸配列がプロ−ペプチドをコードする核酸配列のすぐ下流に位置しており、前記キメラ核酸配列は成熟型のチモーゲンをコードする配列を含まない、キメラ核酸配列。
20. プロ−ペプチドが蛋白質分解酵素より得られた、請求項１９記載のキメラ核酸配列。
21. プロ−ペプチドがセリンプロテアーゼ、アスパルチックプロテアーゼ又はシステインプロテアーゼより得られた、請求項１９記載のキメラ核酸配列。
22. プロ−ペプチドがキモシン、トリプシノーゲン、ペプシン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ペプシノーゲン、カテプシン又は酵母プロテイナーゼＡより得られた、請求項１９記載のキメラ核酸配列。
23. ポリペプチドがヒルジン又はコイ成長ホルモンである、請求項１９記載のキメラ核酸配列。
24. 前記核酸配列がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、請求項１９から２３のいずれか一つに記載のキメラ核酸配列。
25. キメラ核酸配列が配列番号１又は配列番号２中に示されている配列である、請求項２４記載のキメラ核酸配列。
26. 請求項１９から２３のいずれか一つに記載のキメラ核酸配列及び宿主細胞中において発現するのに適している制御配列を含む、発現ベクター。
27. 請求項２６記載の発現ベクターを含む、形質転換宿主細胞。
28. 請求項２６記載の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞であり、形質転換宿主細胞において宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、植物細胞又は動物細胞である、形質転換宿主細胞。
29. 融合蛋白質は
    （ａ）自己触媒的に成熟するチモーゲンより得られたプロ−ペプチド、及び
    （ｂ）プロ−ペプチドと非相同であるポリペプチド、
    を含み、前記融合蛋白質において非相同ポリペプチドが当該プロ−ペプチドのすぐ下流に位置しており、前記融合タンパク質は成熟型のチモーゲンを含まない、融合蛋白質。

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