KR100635623B1

KR100635623B1 - 융합 단백질의 절단방법

Info

Publication number: KR100635623B1
Application number: KR1020057018518A
Authority: KR
Inventors: 마우리스 몰로니; 조넬 알칸트라; 로이젠 기스 반
Original assignee: 셈비오시스제네틱스인코포레이티드
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2006-10-18
Also published as: JP4120972B2; DK0977873T3; EP0977873B1; ZA983471B; BR9809416A; MX9909801A; DE69836075T2; TW505697B; ATE341633T1; AU7024098A; AR012499A1; IL132259A; CA2286861A1; WO1998049326A1; NZ500736A; JP2001527400A; IL132259A0; KR20050100712A; US7501265B1; ES2273414T3

Abstract

재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 회수하는 개선된 방법을 기술한다. 상기 방법은 프로펩티드를 가진 융합 단백질로서 상기 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것을 포함한다. 적절한 조건하에서 프로펩티드-폴리펩티드 융합 단백질을 절단하고 재조합 폴리펩티드를 유리시킬 수 있다.

프로펩티드, 재조합 폴리펩티드

Description

융합 단백질의 절단방법{METHOD FOR CLEAVAGE OF FUSION PROTEINS}

도 1은 GST-키모신 프로펩티드-히루딘 서열의 핵산서열(SEQ ID NO:1)과 유추된 아미노산 서열(SEQ. ID. NO:2)을 나타낸다.

도 2는 폴리 히루딘 택이 붙은 키모신 프로펩티드 카프 성장호르몬(His-Pro-cGH) 융합 단백질의 핵산서열(SEQ ID NO:3)과 유추된 아미노산 서열(SEQ. ID. NO:4)을 나타낸다.

도 3은 Pro-cGH 융합체 제조의 개략적인 도표이다.

도 4는 정제된 His-Pro-cGH의 시험관내 절단을 나타낸다.

도 5는 정제된 His-Pro-cGH의 생체내 절단을 나타낸다.

가치있는 재조합(유전적으로 가공된) 폴리펩티드, 예를 들면 약제 단백질의 제조는 종종 이러한 단백질을 융합 단백질이나 혼성단백질로 제조하는 기술에 의존한다. 이러한 기술은 하이브리드 유전자, 즉 목적 유전자에 결합된 부가적인 유전적 물질과, 이에 결합된 목적 폴리펩티드를 코딩하는 유전적 물질로 이루어지는 유전자의 제조에 기초한다. 융합 폴리펩티드의 제조에는 하이브리드 유전자를 생물학 적 숙주체계, 예를 들면 효모세포등으로 도입하여, 융합 폴리펩티드의 발현 및 축적을 가능하게 하는 것이 관련된다. 목적 펩타이드의 회수에는 "융합 파트너"로부터 원하는 폴리펩티드를 분리하기 위한 절단반응의 수행을 포함한다.

직접인 활성화 형태가 아니라 융합 단백질로 목적 단백질을 제조하기에 필요한 부가적인 단계가 필요함에도 불구하고, 하이브리드 단백질의 생산은 다수의 문제점을 극복했다. 첫째, 과도하게 생산된 폴리펩티드는 봉입체(inclustion body)로 알려진 불용성 부분으로 숙주세포에 축적될 수 있다. 이러한 불용성 물질을 전환시키는 것은 종종 느리고 복잡한 재접힘(refolding) 방법이 포함되어 단백질 정제를 어렵게 한다. 둘째, 세포질에서 수용성 상태로 존재하는 이들 단백질등은 숙주 특이적 효소에 의해서 분해되기 쉬워서, 회수될 수 있는 활성 단백질의 양을 감소시킨다. 융합 파트너에 목적 폴리펩티드를 연결함으로써 이러한 문제를 감소시킴을 알았다. 종래에 알려진 융합 파트너는 말토스 결합 단백질(Di Guan et al., (1998) Gene 67:21-30), 글루타니온-S-트랜스퍼라제(Johnson (1989) Nature 338:585-587), 유비퀴틴(Miller et al. (1998) Biotechnology 7:698-704), 베타-칼락토시다제(Goeddel et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:106-110) 및 티오레독신(LaVallie et al. (1993) Biotechnology 11:187-193)을 포함한다.

또한, 친화성 펩티드를 융합 파트너로 사용할 것이 제안되었다. 이러한 방법은 융합 파트너의 물리-화학적 특성을 이용함으로써 숙주세포에서 융합 펩티드의 회수 및 분리를 용이하게 한다(WO 91/11454를 예로서 참고할 것).

마지막으로, 융합 파트너를 사용하지 않았더라면 재조합 숙주체계에서 펩티 드가 너무 작아서 축적이나 회수가 효율적으로 이루어지지 않았을 펩티드의 생산이 융합 파트너의 사용으로 용이하다. 이런 기술은 예를 들면 Schultz등(1987, J. Bacteriol. 169; 5385-5392)에 의해서 설명되었다.

이러한 모든 절차를 진행한 결과, 부가적인 폴리펩티드에 목적 단백질이 연결된 하이브리드 단백질을 생산하게 된다. 활성 폴리펩티드를 회수하기 위해서는, 일반적으로 융합 파트너를 목적 단백질로부터 분리해야 한다. 대부분의 경우에는, 효소적 방법이나 화학적 방법에 의한 절단반응을 수행한다. 이러한 방법에는 펩티드 결합을 가수분해를 사용하고, 절단되는 펩티드 결합자리나 그 근처에 있는 아미노산의 동정으로 절단자리의 특이성을 결정한다.

종래에 알려진 "단백질 분해 효소(proteolytic enzyme)"가 특히 융합 단백질의 절단에 적합하다는 것을 알았다. 적합한 조건하에서 융합 단백질에 단백질 분해 효소를 반응시킴으로서 절단반응을 수행한다. 이러한 방법의 예가 미국 특허 제 4,743,679에 기술되어 있으며, 이 특허는 스타필로코커스 오레우스 V8 프로테아제로 융합 단백질을 절단하는 것을 포함하는 사람의 피부성장인자의 제조방법에 관한 것이다.

이와 반대로, 화학적 절단에는 특이적인 조건하에서 펩티드 결합을 가수분해하는 것으로 알려진 화학제를 사용한다. 예를 들면, 시아노겐브로마이드가 메티오니 잔기에서 폴리펩티드 사슬을 절단하는 것으로 알려져 있다. 이러한 기술에 기초하여 시아노겐브로마이드가 단백질 우레아제 및 포스포릴라제 b를 절단하는 가수분해 반응이 Sekita등 (1975) keio, J. Med 24: 203-210에 기재되어 있다.

효소적 절단반응과 화학적 절단반응 모두는 절단제에 의해서 절단될 수 있는 펩티드 결합이 존재할 것을 요한다. 따라서, 표적 단백질과 융합 파트너사이에 적절한 표적 서열을 두는 것이 종종 바람직하다. 단백질 분해 효소의 표적을 포함하는 "링커" 서열을 포함하는 융합펩티드는 종래에 알려진 유전공학의 기술로 용이하게 제조될 수 있다.

큰 효용성에도 불구하고 종래의 절단 방법은 비효율적이거나 절단의 특이성이 부족하였다. 비효율적인 절단으로 단백질 정제 효율이 낮았고, 절단 특이성이 낮아 몇몇 위치에서 절단되므로 산물의 손실과 오염단편이 생성되는 문제가 있었다. 이러한 결과로 종종 원하는 단백질을 매우 적게 얻게된다. 추가로, 혈액 응고 인자 Xa 및 트롬빈과 같은 현재의 널리 알려진 단백질 분해 효소는 비싸고, 혈액 병원체에 의해 최종 산물이 오염될 수 있다.

이러한 단점을 고려할 때, 종래에 알려진 절단방법이 갖는 한계는 명백하다.

펩신 및 키모신과 같은 지모겐(zymogen)은 생체내에서 비활성인 전구체로 합성되는 효소이다. 적합한 조건하에서 지모겐을 활성화하여, 아미노-말단 펩티드의 절단에 관련된 방법으로 성숙한 활성 단백질을 형성한다. 상기 아미노-말단 펩티드는 "프로펩티드(pro-peptide)", "프로-영역(pro-region)" 또는 "프로-서열(pro-sequence)"로 언급될 수 있다. 추가적인 특이적 단백질 분해 효소가 지모겐의 활성화에 필요하며, 예를 들면, 특이적인 단백질 분해 효소에 의해서 인슐린과 같은 다양한 호르몬이 가공된다. 또는, 지모겐은 추가의 효소적 촉매없이도 활성화가 일어난다. 이러한 종류의 지모겐을 종종 "자기촉매적 성숙(autocatalytically mature)" 이라고 한다. 자기촉매적으로 성숙되는 지모겐의 예로는 펩신, 펩시노겐 및 키모신이 포함되며, 이들은 포유류의 위장에서와 같은 산성조건에 의해 활성화된다.

지모겐의 자기촉매적 활성화 및 가공은 많은 문헌에 기재되어 있다(예를 들면, McCaman and Cummings, (1986), J. Biol. Chem. 261:15345-15348; Koelsch et al. (1994). FEBS Letters 343:6-10). 지모겐 활성화에 성숙한 단백질에 프로펩티드의 생리적 연관이 요구되지 않는다는 것도 문헌에 기재되어 있다(Silen et al. (1989), Nature, 341: 462-464).

발현시스템에서 재조합 방법으로 생산된 폴리펩티드를 회수하는 개선된 방법이 요구된다.

본 발명은 재조합방법으로 제조된 폴리펩티드를 회수하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 방법은 프로펩티드(pro-peptide)를 갖는 융합 단백질로서 재조합 폴리펩티드를 발현키시는데 관련되며, 적절한 조건하에서 프로펩티드-폴리펩티드 융합 단백질을 절단하고 재조합 단백질을 방출할 수 있다.

발명의 요약

본 발명자들은 재조합방법으로 생산된 폴리펩티드의 새로운 회수방법을 개발하였다. 이 방법은 적합한 조건하에서 재조합 폴리펩티드가 프로펩티드에서 절단될 수 있도록, 프로펩티드를 갖는 융합 단백질로서 상기 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것을 포함한다.

일양상에서, 본발명은 융합 단백질을 코딩하는 키메릭 핵산 서열을 제공하 며, 상기 키메릭 핵산 서열은 자기촉매적으로 성숙할 수 있는 지모겐에서 유래된 프로펩티드를 코딩하는 첫 번째 서열과, 프로펩티드와 이종의(heterologous) 폴리펩티드를 코딩하는 두 번째 핵산서열로 이루어진다.

또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 자기촉매적으로 성숙하는 지모겐에서 유래된 프로펩티드와, (b)프로펩티드와 이종의 폴리펩티드로 이루어지는 융합 단백질을 제공한다. 한가지 구체예에서, 이종의 폴리펩티드는 치료적 펩티드 또는 영양적 펩티드이고 융합 단백질은 약학 조성물이나 영양조성물로서 주입될 수 있다. 그러한 예에서, 일단 상기 조성물이 숙주에게 절단되면, 이종 폴리펩티드는 체액이나, 표적기관, 조직에서 생리적인 조건에 의해 절단될 수 있다.

추가의 양상에서, 본 발명은 다음으로 이루어지는, 재조합 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다:

(a) 다음을 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계:

(1) 하기의 (2)서열에 작동가능하도록 연결되고, 숙주세포에서 전사를 조절할 수 있는 핵산서열,

(2) 하기의 (3)서열에 작동가능하도록 연결되고 융합단백질을 코딩하는 키메릭 핵산으로서, 프로펩티드와 이종이며 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열과 동일한 리딩프레임에 연결되고 자기촉매적으로 성숙되는 지모겐에서 유래된 프로펩티드를 코딩하는 핵산서열로 이루어지는 키메릭 핵산서열, 및 (3) 숙주세포에서 기능하는 종료영역을 코딩하는 핵산서열,

(b) 숙주세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 생산하는 단계;

(c) 융합 단백질의 환경을 변화시켜 프로펩티드가 절단되어 융합 단백질로부터 재조합 폴리펩티드를 유리시키는 단계.

PH, 온도, 염농도의 변화, 또는 프로펩티드의 자기-절단으로 융합단백질로부터 재조합 폴리펩티드가 유리되도록 하는 다른 변화를 포함하는 많은 방법으로 융합 단백질의 환경을 변화시킬 수 있다. 바람직한 예에서, 프로펩티드가 융합 단백질로부터 용이하게 절단되도록, 상기 (c)단계에 지모겐을 추가할 수 있다.

본 발명의 다른 특징이나 장점은 다음의 상세한 설명에 의해서 더욱 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본발명의 바람직한 예를 나타내는 구체적인 실시예는 단지 예시로서 제공된 것으로 이해되어야 하며, 본발명의 범위 및 취지내에서 다양한 변형과 변화가 가능함은 본발명이 속하는 분야의 전문가에게는 명백할 것이다.

상기한 바와 같이, 본발명은 재조합 폴리펩티드의 제조 및 회수방법, 약학 조성물 및 영양 조성물에 유용한 융합 단백질, 이를 코딩하는 키메릭 핵산서열에 관한 것이다.

따라서, 본발명은 다음으로 이루어지는, 재조합 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다:

(a) 다음을 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계:

"프로펩티드"는 지모겐의 아미노-말단부분 또는 지모겐의 기능이 있는 부분에서 성숙한 자리까지를 본명세서에서 의미한다.

"자기촉매적으로 성숙하는 지모겐"이라 함은 I) 추가적인 특이적 프로테아제의 필요없이 활성화된 형태의 지모겐으로 가공될 수 있고 ii) 절단반응에서 성숙 지모겐 형태가 지지되는 지모겐을 본명세서에서 의미한다.

"성숙 지모겐"이라 함은 본 명세서에서 프로펩티드 서열이나 그 부분을 포함하지 않는 지모겐을 의미한다.

폴리펩티드는 프로펩티드와 이종인 어떠한 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 프 로펩티드와 이종인 폴리펩티드는 일반적으로 지모겐으로서의 프로펩티드와 관련된 성숙한 단백질이 아닌 폴리펩티드를 의미하는 것이다.

또다른 양상에서, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 키메릭 핵산서열를 제공하며, 상기 키메릭 핵산 서열은 자기촉매적으로 성숙하는 지모겐에서 유래된 프로펩티드를 코딩하는 첫 번째 서열과, 프로펩티드와 이종의 폴리펩티드를 코딩하는 두 번째 핵산서열로 이루어진다. 대개 이 키메릭 핵산 서열은 완전한 지모겐을 코딩하는 유전자 서열을 포함하지 않는다.

본발명의 융합 단백질을 코딩하는 키메릭 핵산 서열은 숙주세포에서 발현을 보장하는 재조합 발현벡터에 공지의 방법으로 병합될 수 있다.

따라서, 본발명은 또한 숙주세포에서의 발현에 적합한 조절서열과 종료영역에 작동가능 하도록 연결된 본발명의 키메릭 핵산서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 포함한다.

"핵산 서열"이라 함은 자연적으로 존재하는 염기, 당 및 당간 결합(골격)으로 이루어지는 뉴클레오티드서열 또는 뉴클레오시드 단량체를 언급한다. 또한 상기 용어는 자연에 존재하지 않는 단량체 또는 이들의 부분을 포함하, 변형 또는 치환된 서열로서 유사하게 기능하는 서열을 포함한다. 본발명의 핵산서열은 리보핵산 또는 데옥시리보핵산일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함하는 자연적으로 존재하는 염기일 수 있다. 상기 서열은 또한 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌, 5-할로우라실, 5-할로시토신, 6-아자시토신 및 6-아자티미딘, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올알킬 아데닌, 8-히드록시 아데닌, 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌, 8-히드록시 구아닌, 및 다른 8-치환된 구아닌, 다른 아자 및 데아자 우라실, 티미딘, 시토신, 아데닌, 또는 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신과 같은 변형된 염기일 수 있다.

"숙주세포에서 발현에 적합한"이라 함은 본발명의 키메릭 핵산서열, 발현에 사용되는 숙주세포에 기초하여 선택되고 상기 키메릭 핵산서열에 작동가능하도록 연결된 조절서열 및 종료영역를 발현벡터가 포함하는 것을 의미한다. "작동가능 하도록 연결된"이라 함은 키메릭 핵산서열의 발현이 가능하도록 키메릭 핵산서열이 상기 조절서열 및 종료영역에 연결되는 것을 의미한다. 조절서열 및 종료 영역은 이미 공지된 것이며. 상기 원하는 단백질의 발현을 지시하기 위해 적합한 숙주세포에서 선택된다. 따라서, 조절서열이라 함은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현조절 요소를 포함한다. 그러한 조절서열은 당업자에게 알려져 있으며, Goleddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)되어 있다. 발현벡터의 고안은 형질전환될 숙주세포의 선택 및/또는 발현될 단백질의 종류와 같은 인자에 의존적일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그러한 발현벡터를 사용하여 세포를 형질전환시켜 본명세서에서 기술한 핵산에 의해서 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 생산한다.

진핵세포 또는 원핵세포에서 코딩된 융합 단백질의 발현을 위해서 본발명의 재조합 발현벡터를 고안할 수 있다. 예를 들면, E.coli와 같은 박테이아세포, 곤충 세포(예를 들면, 바쿨로바이러스(baculobirus)), 효모세포, 식물세포 또는 포유류 세포에서 융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 다른 적합한 숙주세포는 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diege, CA(1990)에 기재되어 있다. 융합 단백질의 발현을 위해 선택되는 숙주세포의 종류는 본발명에서 주요한 것이 아니라 단지 바람직한 사항일 뿐이다.

원핵세포에서의 발현은 E.coli에서 융합 단백질의 발현을 지시하는 유도성(inducible) 또는 구성적인(constitutive) 프로모터를 포함하는 벡터로 흔히 수행한다. 유도성 발현벡터는 pTrc(Amann et al., (1998)Gene 69:301-315) 및 pET 11d(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). pTrc에서 표적 유전자의 발현은 하이브리드 trp-lac융합 프로모터에서부터 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존적이지만, pET 11d에 삽입된 유전자의 발현은 함께 발현되는 바이러스의 RNA 폴리머라제(T7 gn1)에 의해서 매개되는 융합 프로모터인 T7 gn10-lac0 에서부터의 전사에 의존적이다. lacUV5프로모터의 전사조절하에서 T7 gn1을 수확하는 잔류성 감마 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해서 상기 바이러스의 폴리머라제가 공급된다. 또다른 좋은 박테리아 발현 시스템은 pGEX 발현시스템(Pharmacia)이며, 여기서 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)의 융합산물로서 발현되어 발현산물을 GST 친화성 칼럼에서 용이하게 정제할 수 있다.

E.coli에서 재조합 단백질을 최대로 발현시키는 한가지 방법은 재조합방법으로 발현되는 단백질을 분해하는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 상기 단백질을 발현하는 것이다(Gottesman, S., Gene Expresssion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). 또다른 방법은 각 아미노산에 대한 각 코돈이 고발현 E.coli단백질에서 우선적으로 이용되는 것일 수 있도록 발현벡터에 삽입될 키메릭 DNA의 핵산서열을 변화시키는 것이다(Wada et al., 1992, Res. 20: 2111-2118). 본발명의 핵산서열의 그러한 변형은 일반적인 DNA 합성 기술로 수행할 수 있다.

효모, 사카로미세스 세레비지의 발현벡터는 pYepSec1(Baldari. et al., (1987) Embo J. 6:29-234), pMFa(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), pYES2(Invirtogen Corporation, San Diego, CA)를 포함한다.

배양된 곤충세포(SF9 세포)에서 단백질의 발현을 위한 바쿨로바이러스는 pAC시리즈(Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL-시리즈(Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology)를 포함한다.

식물의 형질전환과 발현에는 Ti 및 Ri 플라스미드와 같은 벡터를 사용할 수 있다. 이들 벡터는 DNA 전달 기능을 가지므로, 상기 구조물을 식물에 도입시키고 아그로박테리아-매개 형질전환을 통하여 게놈에 안정하게 병합되는 것이 요구되는 경우에 사용된다.

전형적인 구조물은 5'에서 3'방향으로 식물에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터로 완성되는 조절영역, 단백질 코딩 영역 및 식물에서 전사 종료신호를 포함하는 서열로 이루어진다. 상기 구조물로 이루어지는 서열은 자연적인 것, 합성된 것 또는 이들의 혼합일 수 있다.

종자-비특이적 프로모터, 예를 들면 35-S-CaMV 프로모터(Rothstein et al., (1987), Gene 53:153-161)가 사용되고 종자특이적 발현이 필요하다면 종자특이적 프로모터, 예를 들면 파세올린(phaseolin)프로모터(Sengupta-Gopalan et al., (1985), PNAS USA 82:3320-3324) 및 Arabidopsis 18kDa 올레오신(Van Rooijen et al. (1992) Plnt Mol. Biol. 18:1177-1179) 프로모터가 모두 사용될 수 있다. 프로모터에 더하여, 식물에서 전사체의 번역을 가능하게 하는 리보솜 결합 자리를 포함하고, 또한 산물의 발현을 증가시키기 위해서 AMV 리더(Jobling and Gehrke, (1987), Nature 325:622-625)와 같은 하나 이상의 인핸서 서열을 포함할 수 있다.

상기 구조물의 코딩영역은 일반적으로 프레임내에서 원하는 단백질과 융합되고 번역 종료 코돈으로 종료되는 프로펩티드 영역을 코딩하는 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 또한 인트론을 포함할 수도 있다.

전사 종료 신호를 포함하는 영역은 노팔린 합성효소 종료 서열과 같은 식물에서 기능하는 어떠한 서열을 포함할 수 있고, 추가로 산물의 발현을 증가시키기 위해 인핸서 서열을 포함할 수도 있다.

상기 구조물의 다양한 성분들을 일반적으로 pUC-기재 벡터로 종래의 방법으로 연결할 수 있다. 그런 후에, 이 구조물을 다음에 개략적으로 기재하는 형질전환 방법중 어느 하나를 이용하여 아그로박테리아 벡터에 이어서 숙주세포로 도입한다.

또한, 발현벡터는 통상 식물세포에서 발현을 가능하게 하는 마커를 포함할 것이다. 편리하게도, 마커는 예를 들면 글리포세이트(glyphosate)와 같은 제초제에 내성을 갖거나, 또는 카나마이신, G418, 블레오마이신, 히그로마이신, 클로로암페니콜과 같은 항생제에 내성을 가질 수 있다. 사용되는 구체적인 마커는 도입된 재조합 핵산분자를 가지지 않는 세포와 형질전환된 세포를 선별할 수 있는 것이다.

핵산을 도입, 구체적으로 DNA를 식물 숙주세포에 도입하는데 이용 가능한 다양한 기술이 있다. 예를 들면, 담배와 같은 쌍떡잎 식물에서 얻은 숙주세포 및 B.napus와 같은 외떡잎식물에서 유래된 세포로 표준 아그로박터 벡터를 사용하여 키메릭 DNA 구조물을 도입할 수 있다; Moloney et al. (1989), (Plant Cell Rep., 8:238-242) 또는 Hinchee et al., (1988), (Bio/Technol., 6:915-922)에 기재된 형질전환방법, 또는 본 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 식물세포의 형질전환을 위한 T-DNA를 다음의 문헌에서 광범위하게 연구하고 자세히 기재하고 있다; EPA Serial No. 120,516; Hoekema et al., (1985), (Chapter V, In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam); knauf, et al., (1983),(Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterim, P.245, In Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interation, Puhler, A. et., Springer-Verlag, NY);and An et al., (1985), (EMBO J., 4:277-284). 편리하게도, 외식편(explant)을 A. tumefaciens 또는 A. rhizogenes와 함께 배양하여 전사체 구조물을 식물세포로 전달시킨다. 아그로박테리움을 사용하여 형질전환한 후에, 선별을 위해서 식물세포를 적절한 배지에 분산시키고, 캘러스, 슈트(shoot) 및 궁극적으로 묘목으로 복귀시킨다. 아그로박테리움 숙주는 T-DNA를 식물세포로 전달하는데 필요한 vir유전자를 가 지고 있다. 주입 및 전기천공(electroporation)을 위해서, 암(arm)이 제거된 Ti-플라스미드(종양 유전자, 구체적으로 T-DNA영역이 없음)(아래 참조)를 식물세포에 도입시킬 수 있다.

아그로박테리움을 사용하지 않은 기술에 의해서도, 본발명의 구조물이 다양한 쌍떡잎, 외떡잎식물, 및 다른 생명체에서도 형질전환과 발현을 얻을 수 있다. 이러한 기술은 특히 아그로박테리움 형질전환 시스템을 이용할 수 없는 종에 유용하다. 유전자를 전달하는 다른 기술로는 바이오리스틱(biolistics) (Sanford, (1988), Trends in Biotech., 6:299-302), 전기천공(Fromm et al., (1985), Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5824-5828; Riggs and Bates, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83L 5602-5606), PEG-매개 DNA 도입(Potrykus et al., (1985), Mol. Gen. Genet., 199:169-177)등이 있다.

구체적인 적용에 있어서, 재조합 DNA 구조물을 수용하는 B.napus와 같은 숙주세포는 일반적으로 Moloney 등의 (1989, Plant Cel Rep., 8:238-242)에서 기재되어있는 바와 같이 쌍떡잎 잎자루에서 유래된다. 상업적인 기름 종자를 사용하는 다른 예로는 대두 외식편에서 쌍떡잎 형질전환(Hinchee et al., (1988). Bio/Technology, 6:915-922)과 면화의 줄기 형질전환(Umbeck et al., (1981), Bio/Technology, 5:263-266)을 포함한다.

형질전환한 후에, 예를 들면 잎 디스크와 같은 세포를 선택배지에서 성장시킨다. 일단 슈트가 나타나기 시작하면, 슈트를 절단하여 루팅(rooting)배지에 둔다. 충분한 루트가 생성된 후에, 식물을 토양으로 옮긴다. 마커의 존재여부에 대해 서 추정된 형질전환된 식물을 조사한다. 원하는 서열이 숙주세포에 병합되었는지를 확인하기 위해서, 적절한 프로브, 예를 들면 키모신 전서열을 사용하여 게놈 DNA상에서 서던 블랏을 행한다.

종래의 방법으로 성장시킨 형질전환된 식물이 종자를 맺게 한다. 예를 들면 McCormick 등 (1986, Plant Cell Reports, 5:81-84)를 참조할 것. 종자배와 같이 전사가 예상되는 조직에서 분리된 RNA를 적절한 유전자 프로브를 이용하여 노던 블랏을 행한다. 융합 단백질 전사체의 예상된 크기와 전사체의 크기를 비교할 수 있다.

2이상 세대의 트랜스제닉 식물이 자랄 수 있으며 교배하거나 자가수분하여, 재조합 단백질의 생산을 포함하는 원하는 표현형 특성으로 상기 식물 및 균주를 동정을 할 수 있다. 재조합 특성을 계속적으로 승계하는 것을 보장하기 위해서, 재조합 단백질을 생산하는 식물, 균주 또는 세포주의 동형접합성(homogenecity)을 확실히 하는 것이 바람직하다. 동형접합 식물을 선택하는 방법은 식물 육종 분야의 전문가에게는 잘 알려져 있으며, 반복적인 자가수분 및 선택과 꽃밥과, 미세포자 배양을 포함한다. 또한, 반수체 세포나 조직을 형질전환시키고, 반수체 묘목을 재생하고, 알려진 방법(예, 콜리친이나 다른 미소관 파괴제를 처리)으로 이를 이배체 식물로 전환하여 동형접합 식물을 얻을 수 있다.

본발명의 폴리펩티드는 상기의 방법에서 사용된 프로펩티드에 융합될 수 있는 어떠한 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 산성 PH와 같은 절단조건하에서 매우 안정하고, 효소적 활성에 최적 조건이 이루어진 환경을 변화시키거나 PH를 조절 하여 절단한 후에 활성화될 수 있다. 재조합 세포시스템에서 융합 단백질의 생산이 시작된 때에 언제든지 절단반응을 수행할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 재조합 단백질을 생산하는 세포 조추출물이나 이들의 정제된 부분을 사용하여 절단 반응을 수행한다.

본 발명에서 사용된 프로펩티드는 프로테아제에서 유래된 프로펩티드, 아스파틱 프로테아제, 세린 프로테아제 및 시스테인 프로테아제를 포함하는 자기촉매적으로 성숙하는 모든 효소에서 유래되는 어떤 프로펩티드일 수 있다. 본발명의 바람직한 구체예에서, 프로펩티드는 키모신, 펩신, HIV-1 프로테아제, 펩시노겐, 카텝신, 또는 효모 프로테아제 A에서 유래된 것이다. 펩시노겐(Ong et al.(1968), J. Biol. Chem. 6104-6109; Pedersen et al., (1973), FEBS Letters, 35:255-526), 키모신(Foltmann et al., (1977); Harris et al., (1982), Nucl. Acid. Res., 10:2177-2187), 효모 프로테아제 A(Ammerer et al., (1986), Mol. Cell. Biol. 6:2490-2499; Woolford et al., (1986), Mol. Cell. Biol. 6:2500-2510), HIV-1 프로테아제(Ratner et al., (1987), AIDS Res. Human Retrovir. 3:57-69), 카텝신(McIntyre et al., (1994), J. Biol. Chem. 269:567-572), 및 펩신(Koelsch et al., (1994), FEBS Lett. 343:6-10)의 아미노산 및/또는 DNA서열이 이용가능 하다. 이러한 서열에 기초하여, 프로펩티드를 코딩하는 유전적 물질로 이루어져 있는 cDNA 클론을 제조할 수 있고, 본발명 및 당업자에게 알려져 있는 일반적으로 사용하는 기술(Sambrook et al., (1990), Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Haror Press)에 따라 융합 유전자를 제조할 수 있다.

바람직한 특성을 지닌 다른 프로-서열을 동정하기 위해서, 여기서 자기촉매적으로 절단되는 지모겐을 분리하고(예를 들면, 키모신 및 효소 단백질 A), 상기 단백질을 부분적으로 서열을 확정하고 그 결과로 다른 프로펩티드를 동정하기 위한 핵산 프로브를 고안하였다. 핵산 프로브를 사용하여 어떠한 생세포나 바이러스에서 제조된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선별할 수 있다. 그런 후에, 엄격한 조건하에서 상기 프로브와 혼성화하는 서열을 분리하였다.

또한, cDNA발현 라이브러리를 선별하여 다른 프로-서열을 분리할 수 있다. 존재하는 프로펩티드에 대한 항생제를 얻을 수도 있으며, Huynh등(1985, in DNA cloning, Vol. 1, a Practical Approach, ed. D. M. Glover, IRL Press)에 기술된 바와 같이 이들 항생제로 cDNA발현 라이브러리를 선별할 수도 있다.

본기술분야에 속하는 전문가가 자기촉매적으로 가공되는 다른 지모겐을 발견할 수도 있다. 선택된 실제 프로-서열은 결정적이지 않으며 바람직한 사항일 수 있다. 본발명의 범위내에서 자기촉매적으로 성숙되는 모든 지모겐의 프로-서열을 사용할 수 있음이 명백히 이해되어야 한다.

프로-서열을 분리한 후에, 제한 효소절단, 결합, 전기영동, DNA서열결정 및 PCR과 같은 당업자에게 알려진 DNA 클로닝 기술을 사용하여 목적 폴리펩티드를 코딩하여 유전적 물질에 유전적 물질을 코딩하는 프로펩티드를 융합시킬 수 있다. 필요한 클로닝 단계를 수행하기 위해서 다양한 클로닝 벡터가 이용될 수 있다. 이러한 목적에 특히 적합한 클로닝 벡터로는 pBR 322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184, pBluescrip 등과 같이 E.coli에서 기능가능한 복제시스템을 포함하는 것 이다. 이들 벡터에 서열을 도입하고, 적합한 배지에서 자랄 수 있는 E.coli에 형질전환시킬 수 있다. 세포를 수확하여 용해시키고 세포로부터 플라스미드를 회수한다.

또한, 본발명은 프로펩티드의 기능적 일부 또는 프로펩티드의 기능적인 변이 형태뿐만 아니라 완전한 길이의 프로펩티드로 포함된다. 프로펩티드와 이종 단백질사이를 특이적으로 절단시키기 위해서 상기 프로펩티드의 변이형태를 사용할 수 있다. 프로펩티드상의 변이로 이종 펩티드의 절단이 달성되는 조건하에(McCaman, M.T. and Cummings, D.B., (1986), J. Biol. Chem. 261:15345-15348) 온도, PH, 및 염농도등의 최적조건이 변할 수 있다. 프로펩티드에 따라서, 다양한 프로펩티드부터의 이종 단백질의 절단은 다양하게 다른 조건하에서 최적일 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 바람직한 조건하에서 우선적으로 절단되는 이종 단백질에 달려있다.

이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 프로펩티드를 코딩하는 핵산서열의 상류 또는 하류에 융합될 수 있으며, 이종 단백질에 융합된 프로펩티드가 반복단위를 갖는 연쇄체(concatamer)일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이종 단백질은 프로펩티드의 하류에 융합된다. 프로펩티드를 코딩하는 핵산서열은 일반적으로 성숙한 현태의 지모겐을 포함하지 않는다.

일예에서, 프로펩티드는 키모신에서 유래된 프로펩티드이고 이종 폴리펩티드는 히루딘이다(Dodt et al., (1984), FEBS Letters 65:180-183). 특히, 본발명자는 키모신 프로펩티드를 코딩하는 DNA을 리치(leech) 항응혈제 단백질인 히루딘을 코딩하는 DNA서열의 상류에 융합된, 키메릭 DNA서열을 제조하였다. 이 유전자 유합체 (Pro-히루딘)을 E.coli세포에서 발현하였다. PH 2로, 바람직하게는 PH 4.5로 감소시키고 성숙한 키모신이 소량 존재할 때, 이종적으로 융합된 단백질, 즉 히루딘은 키모신 프로펩티드로부터 효율적으로 절단된다.

자기촉매적 절단은 융합 펩티드의 환경을 변화시킬 것을 요한다. 이것은 PH, 온도, 염농도, 다른 화학제의 농도의 변화, 또는 융합 단백질의 자기촉매적 절단을 가져오는 환경상의 변화가 포함된다. 융합 단백질을 적절한 절단 환경으로 이동시킴으로써 상기 환경이 변화될 수 있다. 포유류의 위, 창자, 신장, 우유나 혈액과 같은 생리적 환경이거나 인공적인 환경조건일 수 있다. 또한, 작용제(들)을 첨가하거나 융합 단백질 환경의 온도를 변화시킴으로써 절단환경을 만들 수 있다. 융합 단백질이 더 조야한 제제, 예를 들면 세포추출물뿐만 아니라, 순수하거나 실질적으로 순수한 융합단백질일 때도 절단반응은 일어날 수 있다.

바람직한 구체예에서, 발명자들은 절단 반응이 용이하도록 성숙 키모신을 사용하였다. 일반적으로, 성숙 효소의 첨가로 절단반응이 용이해진다. 상기 반응에 사용된 효소는 프로펩티드와 동종인 것일 수 있으며, 예를 들면, 원하는 단백질에 융합된 프로-키모신을 절단을 용이하게 하기 위해 키모신을 사용할 수 있으며, 이종인 것일 수 있으며, 예를 들면 원하는 단백질에 융합된 프로-키모신의 절단을 돕도록 펩신을 사용할 수도 있다.

바람직한 구체예에서 키모신을 첨가할지라도, 다른 프로펩티드의 사용은 효율적인 절단을 위해서 성숙 펩티드의 첨가를 요하지 않을 수도 있다는 것을 명심하여야 한다.

융합 단백질의 활성화는 시험관내에서 또는 생체내에서 할 수 있다. 일예에서, PCT 공개공보 WO 96/21029에 기술된 바와 같이 기름체에서 재조합적으로 제조된 단백질의 절단을 용이하게 하기 위해서 프로펩티드가 사용될 수 있다. 이 구체예에서, 프로펩티드는 기름체 단백질의 하류에 재조합 단백질 또는 목적 펩티드의 상류에 융합된다.

또다른 생체내 적용에 있어서, 두가지 벡터가 동일한 숙주에서 도입된다. 한 벡터에서, 지모겐 또는 성숙 단백질은 유도가능한 벡터 시스템에 의해서 조절될 것이다. 다른 벡터는 이종의 목적 단백질의 상류에 융합된 프로펩티드를 포함할 것이다. 따라서, 지모겐 또는 성숙 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 통해서 프로펩티드의 하류 단백질 또는 펩티드의 절단 순간을 조절할 수 있다. 혹은, 두 발현 유전자를 동일한 벡터에 결합할 수 있다. 이러한 적용의 바람직한 일예에서, 사용된 프로펩티드는 생리적 조건하에서 절단된다.

또다른 양상에서, 본발명은 (a) 자기촉매적으로 성숙되는 지모겐에서 유래된 프로펩티드와 (b) 프로펩티드와 이종의 폴리펩티드로 이루어지는 융합 단백질을 제공한다. 일예에서, 상기 폴리펩티드는 불활성 융합 단백질로서 투여될 수 있는 치료적 또는 영양적 단백질 또는 펩티드이다. 표적 기관, 조직 또는 체액, 예를 들면, 포유류의 위, 창자, 신장, 우유 또는 혈액에서 우세한 독특한 생리적 조건으로 이동된 경우에만 절단을 통한 활성화와 성숙이 일어날 것이다. 상기 펩티드에 특이적인 프로테아제로 절단을 향상시킬 수 있으며, 바람직하게는 프로펩티드에 동질적인 성숙 지모겐을 사용할 수 있다. 이 방법은 경구에서 분해되는 백신, 사이토카 인, 장내 리파제, 펩티드 항생제, 락타제 및 자일라자네 및 셀룰라제와 같은 분해가 용이한 소의 식이효소(feed enzyme)의 전달에 특히 유용하다. 예를 들면, 키모신 프로펩티드의 하류에 융합된 치료적 또는 영양적 펩티드 또는 단백질을 포유류 위에서 섭취로 활성화할 수 있다. 키모신의 성숙한 형태, 또는 키모신의 비활성 전구체 형태를 첨가하여 영양적 또는 치료적 펩티드의 절단을 용이하게 할 수 있다.

따라서, 일예에서 본발명은 적합한 담체 또는 희석제의 혼합형태로, (a) 자기촉매적으로 성숙하는 지모겐으로부터 유도된 프로펩티드와 (b) 프로펩티드와 이종의 폴리펩티드로 이루어지는 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물을 경구로, 정맥으로 또는 다른 전달 경로로 투여할 수 있다.

또한 동일 우유와 같이 먹을 수 있는 음식원 또는 식용 작물형태로 융합 단백질 및/또는 성숙 단백질을 제조할 수 있으며, 이는 추가의 정제없이 소비할 수 있다. 따라서, 또다른 예에서 본발명은 적합한 담체 또는 희석제의 혼합형태로, (a) 자기촉매적으로 성숙하는 지모겐으로부터 유도된 프로펩티드와 (b) 프로펩티드와 이종적인 폴리펩티드로 이루어지는 음식 조성물을 제공한다. 상기 영양적 조성물을 액상이나 고상음식과 혼합할 수 있고 사람이나 동물이 소비할 수 있다.

본발명의 조성물은 키메릭 핵산 서열 또는 본발명의 키메릭 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 융합 단백질을 숙주동물의 생체내에서 생산할 수 있다. 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 DNA바이러스 벡터와 같은 전달운반체를 사용하여 생체내에서 조직이나 세포로 직접 본발명의 키메릭 핵산 서열을 도입할 수 있다. 또한 미세주입(microinjection) 및 전기 천공과 같은 물리적 방법 또는 공동침전 및 핵산의 리포좀으로의 병합등의 화학적 방법으로 세포로 시험관내에서 도입할 수 있다.

또한 본 발명은 재조합 단백질의 정제방법에 유용하다. 일예에서, 발현된 프로펩티드-이종 융합 단백질을 포함하는 세포추출물을 크로마토그래피 칼럼에 적용한다. 칼럼에 고정된 프로펩티드 서열에 대한 항체에 융합 단백질이 선택적으로 결합하여 융합 단백질이 선택적으로 남게된다. 프로펩티드 서열에 대한 항체대신에, 다른 면역원성 도메인을 코딩하는 유전자 또는 일반적으로 사용하는 칼럼물질, 예를 들면 셀룰로스, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 키틴에 친화성을 갖는 펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 다른 바람직한 택(tag)이 유전자 융합에 사용될 수 있다.

또다른 예측되는 적용에 있어서, 세포벽에 융합 펩티드를 고정시키는 서열을 코딩하는 펩티드가 구조물에 포함될 수 있다. 이러한 적용을 위해서 적절한 고정 단백질로는 효모 알파-글루테닌 FLO1, 하등 진핵생물의 주요 세포벽 단백질, 및 젖산균의 프로테인아제일 수 있다(PCT 94/18330). 융합 단백질의 발현으로 목적 단백질이 세포벽에 고정된다. 간단한 원심분리 단계를 사용하여 목적 단백질을 분리하고 세척 완충액으로부터 단백질을 분리할 수 있다.

다음의 비제한적인 실시예는 본발명을 예시하는 것이다.

실시예 1

실시예 1에서, 히루딘 단백질을 키모신 프로펩티드와 융합 단백질로서 제조 하고 히루딘은 절단반응을 수행할 때 E.coli의 세포 추출물에서 활성인 것으로 나타났다.

pGEX -Pro-히루딘 융합체

본발명자가 연구한 융합 단백질은 히루딘 변형체 I(Dobt et al., 1984, REBS Letters 65:180-183)에 융합된 소의 키모신 B(Foltmann et al., 1977; Harris et al., 1982, Nucl. Acids. Res., 10:2177-2187)의 프로펩티드로 이루어진다. 이러한 융합 단백질을 코딩하는 하이브리드 유전자를 표준 PCT방법(Horton et al., 1989, Gene, 77;61-68)으로 제조하였다. 이 Pro-히루딘 융합체의 DNA서열을 pGEX-4T-3(Pharmacia사)에 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 코딩하는 유전자의 하류에 클로닝하였다. GST-Pro-히루딘 서열의 완전한 서열을 도 1에 나타냈다.

pGEX -4T-3 및 pGEX -Pro-히루딘으로 형질전환시킨 E. coli 의 성장

고수율의 발현을 위해 플라스미드 pGEX-4T-3 pGEX-Pro-히루딘를 E.coli DH5α를 형질전환시켰다. 단일 콜로니을 사용하여 5ml LB-amp 브로쓰에 접종하였다. 이 배양물을 하룻밤 배양시켰다. 각각의 하룻밤 지난 배양물의 1 ml를 사용하여 LB-amp브로쓰 50ml에 접종하였다. OD600=0.6까지 배양시키고, 이 OD에서 IPTG(최종 농도 1mM)을 GST GST-Pro-히루딘 융합체 단백질의 발현을 유도하기 위하여 첨가하였다. 유도후에, 37℃에서 추가로 3시간동안 배양하였다. 10분간 5000g에서 세포를 모으고 5ml의 TRis완충액 식염수(TBS)에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 초음파를 처리하고 15분간 12000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛과 현탁한 부분 모두에 대해서 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 상술한 배양조건하에서 상당량(5-10%)의 GST GST- Pro-히루딘 단백질이 상등액 부분에서 관찰되었다. 나머지(90-95%)는 봉입체(inclusion body)에 축적되었다(결과를 나타내지 않음).

히루딘의 활성 측정

GST와 GST-Pro-히루딘 모두의 상등액 부분에 대해 안티-트롬빈 활성을 테스트 하였다. 상기 샘플을 다음과 같이 처리하였다: A) 20㎕ 상등액 + 20㎕ 물 B) 20㎕ 상등액 + 20㎕ 의 100mM소디움 포스페이트 pH 2.0 + 2㎕ 키모신(sigma사) C) 20㎕ 상등액 + 20㎕ 의 100mM 소디움 포스페이트 pH 4.5, E) 20㎕ 상등액 + 20㎕의 100mM 소디움 포스페이트 pH 4.5 + 2㎕ 키모신. 이러한 샘플을 실온에서 1시간동안 배양하였다. 전체 10㎕의 샘플을 1ml의 분석 완충액(20mM Tris [pH 7.5], 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1 단위의 트롬빈)에 첨가하여 2-3분간 배양한 후에, 50㎕의 p-tos-gly-pro-arg-니트로아닐라이드(1mM)을 첨가하였다. 405nm의 파장에서 흡수 증가를 측정함으로써 크로모짐의 기능으로서 트롬빈의 활성을 측정하였다(Chang, 1983, FEBS Letters, 164: 307-313). △Abs (405nm)를 2분후에 결정하였다. 활성 측정의 결과를 표 1에 나타냈다.

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 상당한 안티-트롬빈 활성을 나타내는 유일한 추출물은 pH 4.5에서 처리하고 2㎍의 키모신을 처리한 GST-Pro-히루딘 융합체를 포함하는 추출물(E)이었다. 웨스턴 블랏(결과는 제시하지 않음)은 pH 4.5에서의 처리와는 별도로 pH 2.0으로 처리하고 2㎍의 키모신을 처리한 GST-Pro-히루딘 융합의 경우에 완전한 절단을 또한 관찰되었음을 나타낸다. 가공되지 않음 키모신을 pH 2.0에 노출시켰을 때, 성숙하여 키모신으로 되기전에 슈도키모신을 형성한다는 것 은 잘 알려져 있다(Foltmann et al., 1977, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 42:65-79; Fotmann, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 74; 2321-2324; McCaman and Cummings, 1998, J. Biol. Chem. 261: 15345-15348). 슈도 키모신의 절단자리는 Phe27-Leu28 펩티드 결합에 있으며 이를 도 1에 나타냈다. pH 2.0으로 처리하고 2㎍의 키모신을 첨가한 경우에 히루딘 활성을 저해하는 GST-Pro-히루딘 융합체의 무능력을, 성숙한 히루딘에서부터 키모신 프로펩티드를 분리하게 하는 Phe43-Val44펩티드 결합이 아닌 Phe27-Leu28 펩티드 결합에서 절단이 일어난다는 사실에 의해서 설명할 수 있을 것이다. 성숙한 히루딘은 자연의 N말단 서열에 부착된 어떠한 부가적인 아미노산이 없는 경우에만 활성이 있다는 것도 또한 문헌에 잘 알려져 있다(Loison et al., 1988, Bio/Technology, 6:72-77).

실시예 2

실시예 2에서, 단백질 카프(carp) 성장인자(cGH)를 프로-키모신의 융합체로서 제조하였다. 카프 성장인자는 절단 반응의 수행시에 E.coli의 세포추출물에 존재함을 나타냈다.

pHis -Pro- cGH융합체

카프 성장호르몬(Koren et al., (1989), Gene 67:309-315)에 융합된 소의 키모신 B의 프로펩티드(Foltmann et al., (1977), Harris et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10:2177-2187)로 이루어지는 융합 단백질을 제조하였다. 이 융합 단백질을 코딩하는 하이브리드 유전자를 PCR매개 유전자-융합을 사용하여 제조하였다. 이 Pro-cGH에 대한 DNA 서열을 pUC19에 클로닝하여 pPro-cGH을 제조하였다. Swal/KpnI 분 해에 의해서 pPro-cGH로부터 Pro-cGH유전자 융합체가 분리하였고, 이를 폴리 히스티딘 택을 가지고 있어 정제와 엔테로키나제 인식이 용이하고 절단자리가 있어 pHis-Pro-cGH의 생산이 가능한 pRSETB(Invitrogen 사)의 PvuII/KpnI 자리에 삽입하였다.

pHis -Pro- cGH 로 형질전환된 E. coli 의 성장

고수율의 발현을 위해 플라스미드 pHis-Pro-cGH로 E.coli BL 21를 형질전환시켰다. 단일 콜로니을 사용하여 5ml LB-amp 브로쓰에 접종하였다. 이 배양물을 하룻밤 배양시켰다. 각각의 하룻밤 지난 배양물의 1 ml를 사용하여 LB-amp브로쓰 50ml에 접종하였다. OD600=0.6까지 배양시키고, 이 OD에서 IPTG(최종 농도 0.5 mM)을 pHis-Pro-cGH 융합체 단백질의 발현을 유도하기 위하여 첨가하였다. 유도후에, 37℃에서 추가로 3시간동안 배양하였다. 10분간 5000g에서 세포를 모으고 5ml의 TRis완충액 식염수(TBS)(pH 7.3)에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 프렌치-프레스로 파괴하고 10분간 10,000 x g에서 원심분리하였다. 집합체를 5ml의 물에 재현탁시키고 천천히 NaOH를 첨가하였다. 1ml의 10 x PBS를 첨가하여 부피를 10ml로 하였다. HCl을 천천히 첨가하여 상기 용액의 pH를 8.0으로 맞추고 2시간동안 4℃에서 배양하였다. PH를 7.5로 맞추고 불용성 물질을 제거하기 위해서 15분간 10,000g에서 원심분리하였다. Hi-Trap금속 결합 칼럼(Pharmacia)을 사용하는 친화성 크로마토그래피로 킬레이팅하여 융합 단백질을 정제하였다. 상기 칼럼을 Zn++으로 포화시키고 친화성을 사용하여 제조자의 지시에 따라 His-Pro-cGH를 정제하였다.

pHis -Pro- cGH 로 형질전환된 E. coli 에서 생산된 cGH 의 절단

절단을 위해서, 17㎕의 PBS(Uncut), 14㎕의 PBS 및 3㎕의 엔테로키나제(Cut (EK)), 또는 16㎕의 포스페이트 완충액(PH 2) 및 1㎕의 키모신(Cut(PRO))중 어느 하나로 융합 단백질을 처리하였다. 2시간동안 모든 샘플을 37℃에서 배양한 후에, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. 사용된 첫 번째 항체는 cGH에 대한 토끼 항혈청이고 두 번째 항체는 알칼라인 포스파타제에 컨주게이트된 염소 안티-토끼 IgG이다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 엔테로키나제로 융합 단백질의 절단하여 Pro-cGH 융합체의 계산된 분자량(26kDa)에 해당하는 단백질을 생산했음이 관찰되었다. 유사하게 키모신에 의한 절단으로 cGH 폴리펩티드의 예측된 이론 분자량(22kDa)에 대응하는 단백질 밴드를 나타냈다.

실시예 3

프로-키모신과 융합체로서 단백질 카프 성장 호르몬(cGH)을 제조하였다. 카프 성장 호르몬 융합체 단백질을 레드 턴잎 비틀(red turnip beetle)의 커트 추출물로 절단하였으며, 이는 본 발명의 생체내 적용을 예시하는 것이다.

His-Pro-cGH를 실시예 2의 방법에 따라 준비하였다. 다음과 같이 레트 턴잎 비틀의 유충에서부터 거트 추출물을 제조하였다. 실험실에서 성장시킨 성출이 낳은 레드 턴잎 비틀의 알을 사용하기전에 적어도 3달동안 -20℃에서 저장하였다. 수분 여과지가 있는 접시에서 알을 가고 유충을 카놀라 시들링에서 유지하였다. 활발하게 먹는 유충만을 사용하였다. 2령의 유충에서 중간 창자를 식염수에서 절단하여 제거항고 -20℃에서 저장하였다. 거트를 녹이고 ddH2O(거트당 50㎕)에서 헹구었다. 균질액을 16,000 x g(10분, 4℃)에서 원심분리하고 병에 옮긴 상등액을 단백질 분해 분석에 사용하였다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 레드 턴잎 비틀의 거트로 제조된 추출물은 융합 단백질을 절단시켜 cGH 폴리펩티드를 방출하였다. 절단물은 완전한 것으로 보여지지는 않았다. 이는 거트 추출물의 pH가 절단 반응을 진행하기에 적절하지 않았다는 사실에서 비롯될 수 있다.

바람직한 실시예로서 여겨지는 것에 대한 참고로서 본발명을 기술하고 있지만, 본 발명은 다음의 특허청구범위 및 본발명의 원리내에서 다양한 변형과 동등한 치환을 모두 포함하려는 의도이다.

모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 전체로서 본명세서의 참고문헌으로 병합된다고 구체적으로 또는 개별적으로 언급한 것과 같이 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 전체로서 본명세서의 참고문헌으로 병합되었다.

도면에 관한 상세한 설명

도 1은 GST-Pro-히루딘 서열의 핵산 및 유추된 아미노산이다. 키모신 프로펩티드의 유추된 서열은 밑줄을 그었고 히루딘의 유추된 서열을 이탤릭체로 표시하였다. 히루딘의 핵산 서열을 식물 코돈 사용빈도에 맞게 최적화하였다. Phe27-Leu28슈도키모신 절단자리와 프로키모신과 성숙 히루딘을 분리하는 펩티드 자리(Phe2-Val43)을 화살표로 나타냈다.

도 2는 His-Pro-cGH서열의 핵산서열과 유추된 아미노산 서열이다. 키모신 프 로펩티드의 유추된 서열에 밑줄을 그었고 cGH의 유추된 아미노산 서열을 이탤릭체로 표시하였다. Lys31-Asp32의 엔테로키나제 절단자리와 프로키모신 및 성숙한 cGH을 분리하는 펩티드 서열(PHe84-Ser85)을 화살표로 나타냈다. 폴리히스티딘 자리(His5-His10)와 엔테로키나제 인식자리(Asp27-Lys31)도 또한 표시하였다.

도 3은 His-Pro-cGH 융합체 제조의 개략적인 도표이다. 엔테로키나제 절단자리(엔테로키나제 절단) 및 프로-키모신 절단자리( PRO Cleavage)을 화살표로 나타냈다.

도 4는 정제된 His-Pro-cGH의 절단을 예시하고 있다. 안티-cGH 항체를 프로브로 한 웨스턴 블랏에서 나타나 바와 같이, 항체는 E.coli에서 얻은 정제된 His-Pro-cGH 단백질 추출물이며, 상기 E.coli는 엔테로키나제(EK), 낮은 PH(Cut (PRO)) 및 PBS완충액(Uncut)으로 처리한 조건하에서 성숙 키모신으로 치리한 His-Pro-cGH 융합 구조물을 발현한다.

도 5는 정제된 His-Pro-cGH의 절단을 예시하고 있다. 안티-cGH 항체를 프로브로 한 웨스턴 블랏에서 나타나 바와 같이, 항체는 E.coli에서 얻은 정제된 His-Pro-cGH 단백질 추출물이며, 상기 E.coli는 낮은 PH(Cut (PRO))에서 성숙키모신으로, 엔테로키나제(EK)로 처리, 레드 턴잎 비틀(Cut(Red Turnip Gut))의 거트 추출물로 처리한 His-Pro-cGH 융합 구조물을 발현한다.

[표 1]

GST(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 및 GST-Pro-히루딘 융합체를 함유하는 박테리아 추출물의 활성 측정

[서열정보]

본 발명의 방법인 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 회수하는 방법은 적절한 조건하에서 프로펩티드-폴리펩티드 융합 단백질을 절단하고 재조합 폴리펩티드를 유리시킬 수 있다.

Claims

a) 다음의 서열을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 단계:

(1) 하기의 서열 (2)에 작동 가능하도록 연결되고, 상기 숙주 세포에서 전사를 조절할 수 있는 핵산 서열,

(2) 하기의 서열 (3)에 작동 가능하도록 연결되고, 융합 단백질을 코딩하는 키메릭 핵산으로서, (a) 자기 촉매적으로 성숙하는 지모겐으로부터 유래하는 프로펩티드를 코딩하고, 리딩 프레임 내에서 하기의 서열 (b)에 연결되어 있는 핵산 서열 및 (b) 상기 프로펩티드와 이종이고 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 프로펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 인접한 하류에 위치하는 이종 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열, 및

(3) 상기 숙주 세포에서 기능하는 종료 영역을 코딩하는 핵산 서열;

b) 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 생산하는 단계; 및

c) pH, 염농도 및 온도로 이루어진 군에서 선택되는 융합 단백질의 환경을 변화시켜, 상기 융합 단백질로부터 프로펩티드를 절단시키고 재조합 폴리펩티드를 유리시키는 단계로 이루어지고,

상기 프로펩티드와 이종이라 함은 상기 지모겐 유래 프로펩티드와 관련된 성숙한 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드를 의미하는 것인,

재조합 폴리펩티드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로펩티드가 프로테아제에서 유래된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로펩티드가 아스파틱 프로테아제, 세린 프로테아제 또는 시스테인 프로테아제에서 유래된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로펩티드가 키모신, 트립시노겐, 펩신, HIV-1프로테아제, 펩시노겐, 카텝신(cathepsin) 및 효모 프로테아제 A로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 히루딘 또는 카프(carp) 성장 호르몬인 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 pH의 변화는 pH를 2 내지 4.5로 변화시키는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 환경의 변화가 시험관내(in vitro) 조건 하에서 일어나는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 환경의 변화가 생체내(in vivo) 조건 하에서 일어나는 것인 방법.
제 9 항에 있어서, 생체내 조건이 동물의 조직 또는 체액에서 발생하는 것인 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 조직 또는 체액이 상기 동물의 우유, 혈액, 위, 창자 또는 신장인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자기촉매적으로 성숙하는 지모겐의 성숙한 형태를 단계 (c)에 첨가하고, 상기 지모겐이 프로펩티드와 동종인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자기촉매적으로 성숙되는 지모겐의 성숙한 형태를 단계 (c)에 첨가하고, 상기 지모겐이 프로펩티드와 이종의 것인 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 성숙 지모겐이 시험관내 조건하에서 첨가되는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 성숙 지모겐이 생체내 조건하에서 첨가되는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 생체내 조건이 동물의 조직이나 체액에서 발생하는 조건인 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 조직 또는 체액이 동물의 위, 신장, 창자, 혈액, 또는 우유인 방법.
제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 데옥시리보핵산(DNA) 서열인 방법.
(a) 자기 촉매적으로 성숙되는 지모겐에서 유래된 프로펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) 상기 프로펩티드와 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 키메릭 핵산 서열로서, 상기 이종 핵산 서열은 프로펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 인접한 하류에 위치하는 것이고, 상기 프로펩티드와 이종인 폴리펩티드는 상기 지모겐 유래 프로펩티드와 관련된 성숙한 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드를 의미하는 것인 키메릭 핵산 서열.
제 19 항에 있어서, 상기 프로펩티드가 프로테아제에서 유래된 것인 키메릭 핵산 서열.
제 19 항에 있어서, 상기 프로펩티드가 세린 프로테아제, 아스파틱 프로테아제 또는 시스테인 프로테아제인 키메릭 핵산 서열.
제 19 항에 있어서, 상기 프로펩티드가 키모신, 트립시노겐, 펩신, HIV-1 프로테아제, 펩시노겐, 카텝신 또는 효소 프로테아제A에서 유래된 것인 키메릭 핵산 서열.
제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 히루딘 또는 카프 성장 호르몬인 키메릭 핵산 서열.
제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 데옥시리보핵산(DNA) 서열인 키메릭 핵산 서열.
제 24 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 서열이 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO.2에서 나타낸 서열인 키메릭 핵산 서열.
제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 핵산 서열과, 숙주 세포에서 발현에 적합한 조절 서열을 포함하는 발현 벡터.
제 26 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 형질 전환된 숙주 세포.
제 26 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 박테리아 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 또는 동물 세포인, 제 26항에 따른 발현 벡터를 포함하는 형질 전환된 숙주 세포.