CN102389575B

CN102389575B - 一种基因工程口服dna疫苗及制备方法和应用

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Publication number: CN102389575B
Application number: CN 201110367094
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 王健
Original assignee: WUHAN KAITAILAI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HUBEI TAIYANGHONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: CN102389575A

Abstract

本发明公开了一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用，其步骤：A、鲤鱼生长激素成熟肽基因的制备：用鲤鱼脑垂体，提取其总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，设计并合成引物；B、融合基因sgh的制备；C、融合基因真核表达载体的构建：用限制性内切酶NheI, 　 XhoI双酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1（-），胶回收开环质粒pcDNA3.1（-）和SGH基因的片段，连接后转化到感受态JM109中，得到阳性克隆子为JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH；D 、质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌：将质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumW0420感受态细胞中，得菌株SalmonellatyphimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，为口服DNA疫苗。易于工业化生产，操作简单，成本低，安全性好。该疫苗具有转运促生长的DNA疫苗到克氏螯虾体内的能力，该DNA疫苗能够明显促进克氏螯虾幼虾生长；具有水产养殖业的应用前景。

Description

一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域。更具体涉及一种基因工程口服DNA疫苗，同时还涉及一种基因工程口服DNA疫苗的制备方法，还涉及一种基因工程口服DNA疫苗的用途，具体涉及构建对虾抗菌肽Penaeidin-2信号肽与鲤鱼生长激素基因的融合基因sgh，并将融合基因构建到真核表达载体pcDNA3.1-中，质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH通过电转的方法转入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420中，制备促进克氏螯虾生长的口服DNA疫苗。

背景技术

生长激素(Growth Hormone，GH)是动物腺垂体细胞合成并分泌的一种具有种属特异性的单链蛋白质类激素，一般由186～191个氨基酸组成，分子量约为2.1～2.2KDa。一般情况下，生长激素呈脉冲式分泌，其分泌受下丘脑产生的生长激素释放素(GHRH)的调节。生长激素作用机理较为复杂，生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长，能促进骨骼生长，蛋白质合成，对胰岛素有拮抗作用，并影响葡萄糖和脂类的代谢，与动物生长发育和繁殖等密切相关。

鱼类生长激素(fish growth hormone，fGH)是由鱼脑垂体合成并分泌的一种蛋白多肽。鱼类生长激素参与体内蛋白质合成，脂类的代谢和降解等生理功能，能够显著提高鱼的生长速率，在水产领域里有较高的应用价值和市场前景。上世纪70年代中期研究学者首次分离到鱼类生长激素。1976年Farmer等从罗非鱼脑垂体中分离得到生长激素。最初鱼类生长激素分离主要通过柱层析，再经过沉淀分级，从垂体的碱性提取物中获得生长激素。目前研究学者对鱼类生长激素的组成、结构、功能、基因调控等方面进行了较为系统的研究，并取得了一定的研究成果。通过基因工程技术将鱼类生长激素在大肠杆菌或酵母中高效表达。进一步的研究证实，在大肠杆菌或酵母中表达的鱼类生长激素通过喂食、肌肉注射、高渗浸泡等方法对鱼体具有显著促进生长作用。即通过基因工程技术表达重组鱼类生长激素与天然鱼类生长激素具有相似的生物活性和功能，目前重组鱼类生长激素已经应用于促进鱼，虾和贝类的生长。

鱼类生长激素主要是通过激活靶细胞膜上的受体来实现其生物学活性，鱼类生长激素受体主要分布在肝脏细胞膜上，近年来研究发现鱼类生长激素也可以直接作用于其它组织细胞，如肾脏、心脏和肌肉等组织的细胞膜上。鱼类生长激素是新陈代谢的调节子元件，能促进鱼生长和发育，提高饵料中蛋白质转化效率，促进机体内蛋白质的合成，对糖类代谢的影响主要表现在可以促进肝糖原的消耗和增强对碳水化合物的利用能力。近年来有研究学者表明，鱼类生长激素能刺激卵巢细胞产生类固醇激素调节其性腺发育，鱼血清中生长激素水平与季节变化也存在一定的关系。研究学者阐明鱼生长激素对蛙科鱼类渗透压调节起到了重要作用。生长激素能够提高Na⁺-K⁺ATP酶的活性，同时抑制鱿科鱼类从淡水到海水迁移时引起的血浆渗透性和离子浓度提高。鱼类生长激素还能参与鱼类各种应激反应。

1995年HJ Tsai和KLLin利用原核表达系统在大肠杆菌中表达黄鳍鲷生长激素，并将表达的黄鳍鲷生长激素经复性纯化后注射到黄鳍鲷体内，12周后注射生长激素的实验组黄鳍鲷体长和体重与对照组比较分别提高了22％和65％(HJTsai.，KLLinJ.，C Kuo.Highly efficient expression of fish growth hormone by Escherichiacoli cells[J].Appl.Envir.Microbiol，1995，61：4116-411.)。研究学者表明喂食外源生长激素能够增加鱼类蛋白质的合成，还可以增强鱼类对饵料中某些必需氨基酸的吸收。Sheridan等研究学者证实生长激素能提高鱼肝脏中脂肪酶活性，促进脂肪分解，以作为能量促进鱼类生长。

生长激素作用途径有以下两种，一种是诱导肝细胞、肌细胞产生胰岛素样生长因子家族(insulin-like growth factor，IGFs)等生长介导素，再经胰岛素样生长因子间接起作用，IGF-1由70个氨基酸组成的单链多肽，分子量为7.6kDa，与胰岛素原约有50％的序列相似性。IGF-1通过与受体结合而发挥作用，其受体主要为IGF1受体(IGF1R)和IGF/胰岛素杂合受体。另一种是生长激素激活JAK2(JanusKinase)，JAK2和生长激素受体(GHR)磷酸化，并同磷酸化的受体一起将生长激素信号向下游传递。无论上述哪一种生长激素作用途径，生长激素都必须首先与细胞表面的特异性受体结合，通过受体的介导，激发一系列生化反应最终发挥其生物效应。生长激素还能通过JAK2介导胰岛素受体底物(IRS-1或IRS-3)的磷酸化来激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3-K/Akt)信号通路。

2008年Arenal A等研究学者，将罗非鱼生长激素基因构建在真核表达载体中，通过胚胎电穿孔方法，将质粒导入到南方滨对虾胚胎受精卵中，PCR和Southern杂交分析有36％的幼虾中检测到罗非鱼生长激素基因，后续研究证实与对照组比较，南方滨对虾幼虾的体重有32％的增加(Arenal A.，Pimentel R. Growthenhancement of shrimp(Litopenaeus schmitti)after transfer of tilapia growth hormone gene[J].Biotechnol Lett，2008，30(5)：845-851)。2007年Gutiérrez A等将幼虾蜕皮阶段注射重组人活牛胰岛素，测定虾体血淋巴(肌肉，肝胰脏，鳃)中葡萄糖/糖原水平发现，注射后1h后血淋巴中血糖水平增加，并注射5h后血糖水平开始下降。研究表明胰岛素很可能是在甲壳类动物中参与调节了糖代谢(Gutiérrez A.，Nieto J.，Pozo F.，Stern S.，Schoofs L.Effect of insulin/IGF-I like peptides on glucose metabolism in thewhite shrimp Penaeus vannamei[J].Gen Comp Endocrinol.2007，153：170-175.)。孙孝文等用显微注射法将生长激素基因导入中国对虾受精卵中，基因转移比例可以到达3％以上(孙孝文，刘萍等.显微注射生长激素基因导入中国对虾受精卵的研究.中国水产科学，1996，3(4)：35-38)。

DNA疫苗是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在机体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗具有减毒疫苗的优点，又无逆转的危险，因此越来越受到研究学者的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。

DNA疫苗具有以下优点：构建载体结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，适于大批量生产，生产成本较低；随着分子生物学技术的不断发展，DNA克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据实际需求随时进行更新；质粒DNA分子较为稳定，可制成DNA疫苗冻干苗便于保存；与传统疫苗比较，DNA疫苗安全性更高，其具有与减毒疫苗等同的免疫原性，能够激活T淋巴细胞而诱导细胞免疫，由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能性，因而不存在减毒疫苗毒力回升的问题；质粒DNA疫苗抗原表位比较稳定，DNA疫苗不像减毒疫苗或亚单位疫苗那样，会出现表位丢失；目前将多种DNA混合，组成多价疫苗，从而使一种DNA疫苗能够诱导机体产生针对多个抗原表位的免疫保护作用，使DNA疫苗生产的灵活性显著提高。

目前有研究学者对质粒DNA疫苗的安全性问题存在疑虑，担心质粒DNA可能会整合到宿主细胞的染色体上造成插入突变，但现阶段研究表明并未发现有插入突变产生。质粒DNA在动物体内会缓慢降解，不会造成动物的自体免疫。质粒DNA疫苗主要免疫方法是将质粒溶入阳性脂质体，使用基因枪皮内或肌内注射。DNA疫苗还可以通过静脉、鼻内、口服等接种方法。

1892年科学家首次从小鼠体内分离出鼠伤寒沙门氏菌，1893年证实该菌可引起人食物中毒，明确该菌是人、鼠共同致病菌。后续研究表明沙门氏菌属于肠道病原菌，是一种侵袭性胞内菌，与宿主通过III型分泌机制介导，这种机制使该菌的效应蛋白转移到真核细胞。沙门氏菌侵入机体的途径可分为两种：以M细胞为代表的上皮细胞途径和以树突状细胞为代表的细胞途径。沙门氏菌可选择性地入侵派伊尔结(Payer’s pathch，PP)的M细胞，随后破坏M细胞，然后被位于上皮下穹隆区的APCs捕获。M细胞自身可对许多外源物质进行吞饮，将抗原物质转运至细胞内，从介导淋巴细胞产生初级免疫应答。寒沙门氏菌也可通过非M细胞途径进入机体。目前有报道表明，树突状细胞(dendritic cell，DC)在摄取肠腔中的物质方面起到了重要作用。树突状细胞广泛分布于脾脏、派伊尔结、淋巴结等组织中。肠道内树突状细胞主要定位于肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN)和肠道上皮黏膜固有层(lamia propria，LP)。沙门氏菌侵入肠上皮组织后进入淋巴系统，通过血液循环，定居在肝脏和脾脏等器官。

研究学者最早发现的减毒沙门氏菌是链霉素依赖型菌株，需要宿主体内保持一定浓度水平的链霉素才能稳定增殖。上世纪70年代Germarier等采用化学诱变剂对沙门氏菌进行化学诱变，从大量的诱变菌株中筛选得到一株减毒沙门氏菌菌株。目前研究学者已对沙门氏菌致病机理有了较深入的研究，基本能够判定沙门氏菌病原体在宿主体内寄生的必需基因，能确定沙门氏菌减毒的部分基因。通过基因定点突变，获得减毒沙门氏菌安全菌株。通过化转和电转的方法将质粒DNA转化到减毒沙门氏菌菌株后，带有质粒DNA减毒沙门氏菌通过自然感染的途径，高效地将质粒DNA直接运送到体内的抗原提呈细胞(APCs)和巨噬细胞，淋巴组织诱发细胞免疫和体液免疫。沙门氏菌主要减毒突变株：asd突变株；aro突变株：aro基因系列(aroA、aroC、aroD)；dam突变株；cya、crp/cdt突变株和phoP/phoQ突变株等。

将沙门氏菌染色体中编码天门冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)突变，该基因编码合成二氨基庚二酸(DAP)途径中的一种酶，DAP是合成革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖的重要组成部分。哺乳动物组织中不含DAP，因此该突变菌在动物体内或不含DAP的培养基中均被裂解。将构建含asd质粒转化突变菌后可形成互补，菌体能稳定生长和繁殖。

aroA基因编码EPSP(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸)合成酶，该酶催化对氨基苯甲酸和2，4-二羟基苯甲酸盐分支酸途径的中间反应，产生芳香族氨基酸。当aroA基因缺失时，该减毒菌株在无法在哺乳动物体获得这些化合物，生长受到限制而被减毒。研究学者在后续研究中构建了aroC和aroD等基因突变减毒株。

dam基因编码DNA腺苷酸甲基化酶，该酶编码的甲基化酶能将甲基转移到GATC序列中的腺嘌呤N6位点上，这些位点的甲基化可以控制RNA聚合酶和调节蛋白的相互作用。当dam基因缺失后，细菌基因组突变率会明显增高，从而达到减毒目的。

cAMP受体蛋白(crp)基因和腺苷酸环化酶(cya)基因在转录水平上可以调节许多基因的表达，在运输氨基酸和表达表面蛋白中发挥着重要作用。由于crp和cya基因的缺失，消除了细菌在哺乳动物中摄取cAMP的唯一途径，因此该突变型菌株在宿主细胞内不能转化成野生型菌株。

phoP基因编码转录激活因子，phoQ基因编码传感器激酶，phoP毒力调节子是鼠沙门氏菌致病和在巨噬细胞存活的必需因子。它由PhoP蛋白、PhoQ蛋白和受它们调节的系列基因组成。PhoP/PhoQ蛋白能对脂多糖(LPS)成分中的类脂A进行结构修饰，改变LPS刺激宿主细胞细胞因子表达的水平，而减少内毒素作用。phoP/phoQ基因编码高度保守的双因子调节系统，其产物参与调节酸性磷酸酶的合成，促使细菌在巨噬细胞内的生存，与鼠伤寒菌的毒力、侵袭力密切相关。因此phoP/phoQ基因缺失突变的沙门氏菌是减毒株，并为接受宿主提供了安全保证。

1997年Destoumieux等研究学者首次从凡纳滨对虾的血淋巴中分离得到对虾抗菌肽penaeidins家族，随后对其结构、功能、表达调控等方面进行了深入的研究(Destoumieux D，Bulet P，Loew D.Penaeidins，a new family of antimicrobialpeptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda).J.Biol.Chem.1997，272(28)：398-406)。penaeidins家族是一种新型的天然抗菌肽，并具有与DNA或几丁质结合功能，现已在不同对虾中发现了超过40种penaeidin存在。Penaeidins分子大小为5.48-6.62kDa，是阳离子抗菌肽。Penaeidins具有两个活性结构域，N末端的区域有一个富含脯氨酸结构域，C末端区域含有4-6个半胱氨酸，可以形成2-3对二硫键，这两个结构域在penaeidins各个亚家族中都高度保守，但各个penaeidins亚家族之间也具有一定差异性。研究学者由cDNA合成的氨基酸序列中发现，Penaeidins的合成要经过信号肽的前体合成过程。该信号肽位于Penaeidins的前端，且该信号肽氨基酸序列高度保守，由19-21个氨基酸残基组成。研究表明penaeidins初始翻译产物均含有信号肽，该信号肽主要负责Pen的加工和翻译后运输。

本发明将一种对虾抗菌肽Penaeidin-2的信号肽与鲤鱼生长激素基因融合，并将融合基因构建到真核表达载体pcDNA3.1-中，质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH通过电转的方法转入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420中，制备促进克氏螯虾生长的口服DNA疫苗。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种口服DNA疫苗基因工程菌株，该菌株是减毒鼠伤寒沙门氏菌，具有较好的安全性。将对虾抗菌肽Penaeidin-2信号肽与鲤鱼生长激素基因融合，并将融合基因构建到真核表达载体pcDNA3.1-中，质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH通过电转的方法转入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420中，制备促进克氏螯虾生长的口服DNA疫苗。通过口服应用于克氏螯虾养殖试验，结果证明该口服DNA疫苗具有促进对虾生长发育，减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420能够将质粒DNA运送到克氏螯虾幼虾体内，生长激素口服DNA疫苗促进克氏螯虾幼虾生长。

本发明的另一个目的是在于提供了一种口服DNA疫苗基因工程菌株的制备方法，易于工业化生产，操作简单，成本低，安全性好。该口服DNA疫苗具有转运促生长的DNA疫苗到克氏螯虾体内的能力，并且该DNA疫苗能够明显促进克氏螯虾幼虾生长；具有水产养殖业的应用前景。

本发明的再一个目的是在于提供了一种口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯虾幼虾养殖业中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的技术要点之一是基因工程菌株的构建。

本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

一种基因工程口服DNA疫苗的制备方法，其步骤如下：

1.鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽基因的制备：

用两条鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒的方法提取其总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据GenBank鲤鱼生长激素的cDNA序列，设计并合成引物，以上述得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到鲤鱼生长激素GH基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量(15-20μg)提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含gh基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-GH。

2.融合基因sgh的制备：

PCR扩增sgh基因：通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成sgh。以实验室保存的pGEM-T-GH质粒为模板，上游引物P1：5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物P4：5_GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_划线处为XhoI位点，退火温度为56℃，PCR扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P2：5_GTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_，下游引物P4：5_GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_，退火温度56℃做PCR，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P3：5_GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3_(划线处为NheI位点)，下游引物P4：5_GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3_，退火温度56℃做PCR，PCR扩增目的基因sgh。PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含sgh基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-SGH。

3.融合基因真核表达载体的构建：

用限制性内切酶NheI，XhoI双酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1(-)(购置Invitrogen公司)，胶回收开环质粒pcDNA3.1(-)和SGH基因的片段，4℃连接后转化到感受态JM109中，所得到的阳性克隆子命名为JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH。

4.质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌：

将质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH(5μl)转化减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium W0420感受态细胞中。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的口服DNA疫苗Salmonella typhimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH。

一种基因工程口服DNA疫苗菌株，其特征在于，该疫苗为基因工程菌株，Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，CCTCC NO：M2011233。

所述的基因工程菌株Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，重组质粒/pcDNA3.1(-)--signal-GH为本发明所构建。所述的基因工程菌株Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，重组质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH为本发明所构建，保藏编号：保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年7月4日，分类命名：CCTCC NO：M2011233，Salmonella typhimuriu W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH。所述的一种分离的蛋白质(pcDNA3.1(-)--signal-GH编码基因)，其序列为SEQUENCENO.1所示的核苷酸序列。所述的一种分离的蛋白质，蛋白SGH是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的蛋白。其序列为SEQUENCE NO.2所示的氨基酸序列。

通过上述的制备，获得了因工程菌株Salmonella typhimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，一种口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯虾幼虾养殖业中的应用，其应用基本步骤是：

本发明与现有报道DNA疫苗相比，其优势在于：(1)本研究以减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420作为质粒DNA的转运载体，将质粒DNA转运到克氏螯虾幼虾体内。(2)本研究首次通过PCR重叠延伸技术将对虾抗菌肽Penaeidin-2的信号肽与鲤鱼生长激素基因融合，并将融合基因构建到真核表达载体pcDNA3.1-中。分别将质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH通过电转的方法转入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420中。(3)将重组菌Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH包被饲料喂食克氏螯虾幼虾，与对照组Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1-克氏螯虾幼虾相比，前者生长速率显著提高。(4)本发明所涉及的口服DNA疫苗便于大规模生产，成本低廉，操作工艺简单。

附图说明

图1为一种真核表达质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH的构建过程示意图。

图2为一种真核表达质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH的酶切和PCR鉴定示意图。

M.DL2000 1.sgh PCR产物2.pcDNA3.1(-)--signal-GH质粒3.pcDNA3.1(-)--signal-GH质粒单酶切/XhoI 4.pcDNA3.1(-)--signal-GH质粒双酶切/NheI、XhoI 5.DL10000。

图3为一种重组菌Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH的PCR鉴定示意图。

M Marker D2000；1阴性对照；2沙门氏菌特异引物；3GH特异引物

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

实施例1：鲤鱼生长激素成熟肽基因(GH)的制备。

(1)鲤鱼生长激素RNA的提取：

取两条鲤鱼脑垂体，按照RNeasy^R Kit的操作说明书提取其总RNA，提取得到的总RNA放置-80℃备用。

(2)合成GH cDNA的第一条链

按照Reverse Transcription System试剂盒说明书，以Oligo(dT)₂₀为引物合成cDNA第一链。反应体系如下，依次将12μl 25mM MgCl₂；6μl ReverseTranscription 10×Buffer；6μl dNTP Mixture 10mM；2μl Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor；4μl AMV Reverse Transcriptase；6μl Oligo(dT)₂₀ Primer；15μl Total RNA加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR管中。反应程序为42℃反应1小时，95℃反应5分钟，4℃反应5分钟。将上述反应后的产物放置于-20℃以作为目的基因克隆的模板。

(3)鲤鱼生长激素GH的制备：

依据GenBank中已发表的鲤鱼生长激素GH cDNA序列，综合分析后设计合成一对PCR引物。上游引物P1：ATGTCAGACAACCAGCGG，下游引物P2：CTACAGGGTGCAGTTGG。引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA第一链为模板，按照以下反应体系：2μl cDNA第一链；4μl 25mM MgCl₂；2μlReverse Transcription 10×Buffer；4μl dNTP Mixture 10mM；2μl Upstream primer(20μM/L)；2μl Downstream primer(20μM/L)；0.5μl Taq DNA Polymerase；3.5μlDEPC处理的去离子水。应用降落式PCR的形式进行反应，其反应参数为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，60-50℃退火30min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环，72℃再延伸10min。将上述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并回收纯化。具体步骤如下：将上述PCR产物在1％(质量体积比)琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下要回收的目的条带。用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的条带，具体操作如下：将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称其重量。向胶块中加入3倍体积的溶胶液(凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，以此类推)。55℃水浴10分钟，其间每3分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取650μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃以下相同)放置2-3分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置5-10分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。将纯化的PCR产物与pGEM-T载体(在promega公司购置)连接。连接体系如下：1μl 10×Ligation Buffer；2μl pGEM-T载体；6μl纯化后的PCR产物；1μl T4 DNA Ligase。连接反应液4℃水浴放置过夜。转化感受态大肠杆菌JM109。从LB平板上挑取单菌落于300μl新鲜液体LB培养基(含终浓度100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，以上游引物P1、下游引物P2进行PCR初步鉴定，并送上海生工有限公司测序。将阳性克隆的菌液转接5μl于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，置于-20℃备用。重组质粒命名为pGEM-T-GH。

实施例2：融合基因sgh的制备。

PCR扩增sgh基因：通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成sgh。以实验室保存的pGEM-T-GH质粒为模板，上游引物P3：5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物P4：5_GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_划线处为XhoI位点，退火温度为56℃，PCR扩增目的片段。PCR反应体系：5μl 10×KOD Buffer；2μl MgCl₂(25mM)；5μl dNTP Mixture(2.5mM)；1μl Upstream primer(25pmol)；1μl Downstream primer(25pmol)；1μl Template；1μl Taq DNAPolymerase(1U/μl)；加无菌水至终体积为50μl。sgh基因的PCR反应条件为：94℃30s，56℃30s，68℃1min(30个循环)，68℃10min。将上述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并回收纯化。具体步骤如下：先将PCR产物在1％(质量体积比)琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下要回收的目的条带。用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的条带，具体操作如下：将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称其重量。向胶块中加入3倍体积的溶胶液(凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，以此类推)。55℃水浴10分钟，其间每3分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取650μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃以下相同)放置2-3分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置5-10分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。以上一步回收产物为模板，以上游引物P5：5_GTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_，下游引物P4：5_GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_，退火温度56℃做PCR，PCR反应体系：5μl 10×KOD Buffer；2μl MgCl₂(25mM)；5μl dNTPMixture(2.5mM)；1μl Upstream primer(25pmol)；1μl Downstream primer(25pmol)；1μl Template；1μl Taq DNA Polymerase(1U/μl)；加无菌水至终体积为50μl。sgh基因的PCR反应条件为：94℃30s，56℃30s，68℃1min(30个循环)，68℃10min。将上述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并回收纯化。具体步骤如下：先将PCR产物在1％(质量体积比)琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下要回收的目的条带。用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的条带，具体操作如下：将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称其重量。向胶块中加入3倍体积的溶胶液(凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，以此类推)。55℃水浴10分钟，其间每3分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取650μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃以下相同)放置2-3分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置5-10分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。以上一步回收产物为模板，以上游引物P6：5_GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3_(划线处为NheI位点)，下游引物P4：5_GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3_，退火温度56℃做PCR，PCR扩增目的基因sgh。PCR反应体系：5μl 10×KODBuffer；2μl MgCl₂(25mM)；5μl dNTP Mixture(2.5mM)；1μl Upstream primer(25pmol)；1μl Downstream primer(25pmol)；1μl Template；1μl Taq DNAPolymerase(1U/μl)；加无菌水至终体积为50μl。sgh基因的PCR反应条件为：94℃30s，56℃30s，68℃1min(30个循环)，68℃10min。将上述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并回收纯化。具体步骤如下：先将PCR产物在1％(质量体积比)琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下要回收的目的条带。用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的条带，具体操作如下：将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称其重量。向胶块中加入3倍体积的溶胶液(凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，以此类推)。55℃水浴10分钟，其间每3分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取650μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃以下相同)放置2-3分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置5-10分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。

实施例3：亚克隆构建

用限制性内切酶NheI，XhoI双酶切pcDNA3.1(-)和纯化的sgh PCR产物。酶切体系如下：依次加入30μl pcDNA3.1(-)质粒或纯化的PCR产物；4μl 10×buffer2；1μl NheI；1μl XhoI；2μl ddH₂O。酶切反应条件为37℃，酶切时间3-4个小时。酶切产物经1％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收开环pcDNA3.1(-)和sgh PCR酶切片段。将sgh PCR酶切片段与开环pcDNA3.1(-)连接。连接体系如下：依次加入2μl开环pcDNA3.1(-)；6μl sgh酶切片段；1μl10×Ligation Buffer；1μl T4 DNA Ligase。连接反应体系16℃水浴连接14-16小时，贮于-4℃备用。

实施例4：重组质粒转化大肠杆菌JM109。

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：其步骤是：

(1)用接种环挑取固体LB平板上新活化的大肠杆菌JM109单菌落，接种到20ml液体LB培养基(将1g蛋白胨、0.5g酵母粉、1g NaCl溶解在75mlddH₂O中，调整pH值至7.0，最后加ddH₂O定容至100ml，分装于五个三角瓶里，115磅灭菌处理20min后备用)中，37℃，300rpm摇床活化过夜。

(2)无菌条件下取60μl上述活化的大肠杆菌于新鲜的20ml液体LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养3小时左右至OD₆₀₀值为0.4-0.6。(下述所有步骤均需无菌操作)

(3)无菌条件下取1.5ml上述菌液于无菌Eppendorf管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。4000rpm，4℃离心10分钟，用移液枪吸干上清。

(4)加入300μl冰预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬菌体沉淀，冰浴30分钟，4000rpm，4℃离心10分钟，用移液枪吸干上清。

(5)加入100μl冰预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬沉淀，即得感受态细胞，置于4℃保存，24小时内使用为宜。

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：

在无菌条件下取过夜连接反应液10μl，加入到100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(上述步骤均需无菌操作)

42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰上静置，冰浴2-3分钟。

加入800μl液体LB培养基，37℃，150rpm轻摇，温育45分钟。

4000rpm离心10分钟，吸取800μl上清弃去，将剩余菌液用移液枪轻轻混匀。将上述菌液用无菌三角涂布棒均匀涂布在终浓度为100μg/ml Amp的LB平板上，正向放置0.5小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37℃培养箱中培养12-16小时。用接种环挑取LB平板上单菌落于300μl新鲜液体LB培养基(含终浓度100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，上游引物P6、下游引物P4进行PCR初步鉴定，并送上海生工有限公司测序。由上述方法可以制备得到JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH的菌株。

实施例5：重组质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH转化减毒鼠伤寒沙门氏菌。

减毒鼠伤寒沙门氏菌感受态的制备：

(1)用接种环在LB平板上挑取活化的减毒鼠伤寒沙门氏菌株Salmonellatyphimurium W0420单菌落，将其接种到5ml液体LB培养基中，37℃，300rpm摇床过夜培养。

(2)将培养过夜菌液的以1％的比例接种到新鲜20mlLB中以300rpm的转速培养。待菌液培养至OD600约为0.6时，取1.5ml上述菌液于灭菌的Eppendorf小管中，于4℃、4000rpm离心10min，去上清。

(3)加入无菌水重悬菌体，4℃、4000rpm离心10min，去上清。

(4)重复(3)2次后用100μl冰冷的无菌水重悬菌体。

(5)制备的感受态可暂时保存于4℃立即使用。

重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌：

(1)将5μl pcDNA3.1(-)--signal-GH质粒加入到制备好的100μl减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420感受态细胞中混匀。

(2)将混合物加入直径为2mm的电转化杯底，于1.5kV，25μF的条件下进行电转。

(3)电转完毕立即加入1ml新鲜LB培养基，于37℃、150rpm温育45Min。

(4)将取100μl菌液均匀涂布于终浓度100μg/ml氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃倒置培养过夜。

减毒鼠伤寒沙门氏菌阳性重组子的鉴定：

从平板上挑取单个菌落接种于新鲜液体LB(Amp⁺)中，37℃、300rpm培养3-4h后，分别用gh基因特异性引物和沙门氏菌fliC基因特异性引物进行菌落PCR鉴定，鉴定后重组子命名为Salmonella typhimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH。

实施例6：基因工程口服DNA疫苗的制备及药效试验。

将重组菌Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH和Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3.1-于LB(Amp⁺)中培养16h后4000rpm、30min离心收集菌体，菌液稀释适当倍数后于平板上计数。在37℃水浴锅中将菌体重悬于含0.5％(质量体积比)琼脂的PBS中。克氏鳌虾商业化饲料与菌悬液以5∶1(g/ml)比例混合包被饲料，保存于4℃备用。将克氏螯虾按实验要求分组，8只/盒。饲料以0.4g/只的日剂量投喂克氏螯虾(相当于10⁹CFU/只)，每天投喂一次，共喂食10天。喂食10天后开始每天以0.4g/只的日剂量投喂商业化饲料20天，在这期间记录每组幼虾的生长情况和体重变化。各实验组每头克氏螯虾

幼虾经免疫后平均体重统计

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉凯肽来生物科技有限公司

<120> 一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用

<130> 一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> sgh

<400> 1

atggggcgcc tcgtggtctg cctggtcttc ttggcctcct tcgccctggt ctgccaaggc 60

tcagacaacc agcggctctt caataatgca gtcattcgtg tacaacacct gcaccagctg 120

gctgcaaaaa tgattaacga ctttgaggac agcctgttgc ctgaggaacg cagacagctg 180

agtaaaatct tccctctgtc tttctgcaat tctgactaca ttgaggcgcc tgctggaaaa 240

gatgaaacac agaagagctc tatgctgaag cttcttcgca tctcttttca cctcattgag 300

tcctgggagt tcccaagcca gtccctgagc ggaaccgtct caaacagcct gaccgtaggg 360

aaccccaacc agctcactga gaagctggcc gacttgaaaa tgggcatcag tgtgctcatc 420

caggcatgtc tcgatggtca accaaacatg gatgataacg actccttgcc gctgcctttt 480

gaggacttct acttgaccat gggggagaac aacctcagag agagctttcg tctgctggct 540

tgcttcaaga aggacatgca caaagtcgag acctacttga gggttgcaaa ttgcaggaga 600

tccctggatt ccaactgcac cctgtag 627

<210> 2

<211> 208

<212> PRT

<213> SGH

<400> 2

Met Gly Arg Leu Val Val Cys Leu Val Phe Leu Ala Ser Phe Ala Leu

1 5 10 15

Val Cys Gln Gly Ser Asp Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile

20 25 30

Arg Val Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Lys Met Ile Asn Asp Phe

35 40 45

Glu Asp Ser Leu Leu Pro Glu Glu Arg Arg Gln Leu Ser Lys Ile Phe

50 55 60

Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Gly Lys

65 70 75 80

Asp Glu Thr Gln Lys Ser Ser Met Leu Lys Leu Leu Arg Ile Ser Phe

85 90 95

His Leu Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Gln Ser Leu Ser Gly Thr

100 105 110

Val Ser Asn Ser Leu Thr Val Gly Asn Pro Asn Gln Leu Thr Glu Lys

115 120 125

Leu Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Ser Val Leu Ile Gln Ala Cys Leu

130 135 140

Asp Gly Gln Pro Asn Met Asp Asp Asn Asp Ser Leu Pro Leu Pro Phe

145 150 155 160

Glu Asp Phe Tyr Leu Thr Met Gly Glu Asn Asn Leu Arg Glu Ser Phe

165 170 175

Arg Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr

180 185 190

Leu Arg Val Ala Asn Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys Thr Leu

195 200 205

Claims

1.一种基因工程DNA疫苗，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种基因工程DNA疫苗，其编码的多肽为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种基因工程DNA疫苗，其特征在于：该疫苗为重组基因工程菌株Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)-signal-GH，CCTCC NO:M2011233。

4.一种用于权利要求3所述的基因工程DNA疫苗的制备方法，包括下列步骤：

A、鲤鱼生长激素成熟肽基因的制备：

用鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒的方法提取其总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据GenBank鲤鱼生长激素的cDNA序列，设计并合成引物，上游引物P1：5-ATGTCAGACAACCAGCGG-3，下游引物P2:5-CTACAGGGTGCAGTTGG-3；以得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到鲤鱼生长激素GH基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化到大肠杆菌JM109，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含GH基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-GH；

B、融合基因SGH的制备：

PCR扩增SGH基因：通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成SGH，以pGEM-T-GH质粒为模板，上游引物P 1:5-TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC-3，下游引物P4:5-GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT-3划线处为XhoI位点，退火温度为56℃，PCR扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P2:5-GTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG-3，下游引物P4:5-GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT-3，退火温度56℃做PCR,电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P3:5-GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC-3，下游引物P4:5-GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA-3，退火温度56℃做PCR，PCR扩增目的基因SGH，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化到大肠杆菌JM109，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含SGH基因的大肠杆菌，为pGEM-T-SGH；

C、融合基因真核表达载体的构建：

用限制性内切酶NheI,XhoI双酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1（-），胶回收开环质粒pcDNA3.1（-）和SGH基因的片段，4℃连接后转化到感受态JM109中，所得到的阳性克隆子为JM109/pcDNA3.1(-)-signal-GH；

D、质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌：

将质粒pcDNA3.1(-)-signal-GH 5μl转化减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimuriumW0420感受态细胞中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得即口服DNA疫苗。