JP4227894B2 - グルカゴン様ペプチド１アナログ - Google Patents

グルカゴン様ペプチド１アナログ Download PDF

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Description

糖尿病の治療法を改良するための研究が、過去数十年間にわたって絶え間なくなされてきた。糖尿病患者の約90％は、インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）とも呼ばれる2型糖尿病を持っている。2型糖尿病患者は一般に依然インスリンを産生しているが、体細胞はそのインスリンを有効に利用することができない。これは主として、血糖レベルの上昇に応答して産生されるインスリンの量が、細胞にグルコースを効率よく取り込ませて血糖レベルを低下させるには十分でないことによる。
NIDDMを持つ個体は、多くの場合、最初のうちは、経口薬の服用によって血中グルコースレベルを制御することができる。しかし経口薬は2型患者で起こるβ細胞機能の進行性喪失を遅らせるわけではなく、最終的には、これらのタイプの薬では、血中グルコースレベルを制御することができなくなってしまう。
グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）がNIDDMの処置薬として極めて有望であること、特に経口剤が効力を失い始めた場合にそうであることは、多くの前臨床研究データと臨床研究データが示唆している。GLP-1は、例えばインスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、胃内容排出の阻害、グルコース利用の増進、および体重低下の誘発など、数多くの生物学的効果を誘発する。さらにGLP-1は、疾患の進行と共に起こるβ細胞の劣化を予防するように作用する可能性も、前臨床研究によって示唆されている。GLP-1の最も顕著な特徴は、インスリン療法を使用した場合またはインスリン発現を増加させることによって作用する他のタイプの経口治療法を使用した場合にみられる低血糖症の危険を冒さずに、インスリン分泌を刺激できるということだろう。
NIDDMが進行するにつれて、ほぼ正常な血糖制御を達成することにより、長期にわたる高血糖症に伴う合併症を最小限に抑えることが、極めて重要になってくる。GLP-1は最適な薬であるように思われる。しかしGLP-1ペプチドを用いる治療法の有用性には、GLP-1(1-37)が活性に乏しく、2つの天然切断型ペプチドGLP-1(7-37)OHおよびGLP-1(7-36)NH2は生体内では迅速に除去されて、生体内半減期が極めて短いという事実による限界があった。さらに、現在開発されているGLP-1化合物製剤は経口投与することができず、インスリンのように注射しなければならない。したがって、GLP-1を用いる治療法には明らかな医学的利点があるにもかかわらず、半減期が短いために1日に1回以上の注射が必要になってしまうことが、商業的な開発努力の妨げになっている。
一般に、患者を注射治療法に移行させることは、極めて困難である。多くの糖尿病患者は、十分なグルコース制御を維持するために何度も受ける必要がある注射には不快感を覚えるので、どのタイプの集中的注射治療も受けたがらない。その上、インスリン処置を受けている糖尿病患者は一般に血中グルコースをモニターする必要があり、そのために別途、針を突き刺す必要もある。このタイプの治療法は心理的にも肉体的にも苦痛を与えるといえる。これは、患者が疾患の経過中、常に経口薬による処置しか受けてこなかった場合は、特にそうであるといえる。したがって、経口経路または経肺経路などの代替手段によるGLP-1化合物の投与を用いる非注射治療法が必要とされている。非侵襲的搬送技術は、患者の便宜を増し、したがって2型糖尿病の発症を潜在的に遅延させうる治療法の遵守性を向上させる手段になる。今までに記載されたGLP-1アナログはこの技術には向いていない、なぜなら、それらの効力は一般に低すぎて、経口経路または経肺経路による投与を皮下注射と比較した場合に予想される生物学的利用率の低下を相殺することはできないからである。したがって、タンパク質およびペプチドの経口または経肺投与に関する制限因子は、吸収および局所代謝が不十分であるために、比較的多量のタンパク質が必要になることである。
本発明は、極めて強力な新規GLP-1アナログの開発によって、GLP-1の非侵襲的搬送に関係する課題を解決するものである。これらのアナログは効力が増大しているため、生物学的利用率が限られている搬送技術を利用しやすい。本発明は、経済的な量の強力な生物活性GLP-1化合物を治療上有効な血清レベルが達成されるように搬送することによる非注射治療法を可能にする。
8、12、16、18、19、20、22、25、27、30、33、および37位の1つまたは複数に改変を持つ多くのGLP-1化合物は、Val8-GLP-1(7-37)OHと比較して、増大した効力を示すことが、ここに見いだされた。
本発明の一態様は、以下の式1（配列番号1）のアミノ酸配列を含むGLP-1化合物である：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
式1（配列番号1）
［式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、またはα-メチル-ヒスチジンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrであり、
Xaa12は、Phe、Trp、またはTyrであり、
Xaa16は、Val、Trp、Ile、Leu、Phe、またはTyrであり、
Xaa18は、Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu、またはValであり、
Xaa19は、Tyr、Trp、またはPheであり、
Xaa20は、Leu、Phe、Tyr、またはTrpであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Asp、またはLysであり、
Xaa25は、Ala、Val、Ile、またはLeuであり、
Xaa27は、Glu、Ile、またはAlaであり、
Xaa30は、AlaまたはGluであり、
Xaa33は、Val、またはIleであり、かつ
Xaa37は、Gly、His、もしくはNH2であるか、または存在しない。
ただし、本GLP-1化合物は、次に挙げる化合物の配列を持たないものとする：GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)-NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Lue8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr12-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Asp22-GLP-1(7-37)OH、Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、Val8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-His37-GLP-1(7-37)OH、Leu8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-His37-GLP-1(7-37)OH、Ile8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-His37-GLP-1(7-37)OH、Ser8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-His37-GLP-1(7-37)OH、Thr8-His37-GLP-1(7-36)NH2］。
本発明のもう一つの態様は、以下の式II（配列番号2）のアミノ酸配列を含むGLP-1化合物である：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
式II（配列番号2）
［式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、またはα-メチル-ヒスチジンであり、
Xaa8は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrであり、
Xaa16は、Val、Phe、Tyr、またはTrpであり、
Xaa18は、Ser、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、Leu、またはValであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Asp、またはLysであり、
Xaa25は、Ala、Val、Ile、またはLeuであり、
Xaa33は、ValまたはIleであり、かつ
Xaa37は、Gly、もしくはNH2であるか、または存在しない。
ただし、本GLP-1化合物は、次に挙げる化合物の配列を持たないものとする：GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)-NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Lue8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Asp22-GLP-1(7-37)OH、Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-36)NH2］。
式IおよびIIの好ましい態様には、GLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-36)NH2との相違点が6残基、5残基、4残基または3残基を超えないGLP-1化合物が包含される。式IおよびIIのGLP-1化合物は、8位にバリンまたはグリシンを持ち、22位にグルタミン酸を持つことも好ましい。式IおよびIIのGLP-1化合物は、8位にバリンまたはグリシンを持ち、30位にグルタミン酸を持つことも好ましい。式IおよびIIのGLP-1化合物は、8位にバリンまたはグリシンを持ち、37位にヒスチジンを持つことも好ましい。
本発明は、GLP-1受容体刺激を必要としている対象のGLP-1受容体を刺激する方法であって、有効量の本明細書記載のGLP-1化合物を前記対象に投与する工程を含む方法も包含する。GLP-1受容体刺激を必要としている対象には、インスリン非依存性糖尿病を持つものおよび肥満を持つものが含まれる。
GLP-1化合物は、約25個〜約39個の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を持つポリペプチドであり、GLP-1(7-37)OHに対して十分な相同性を持つので、インスリン分泌促進活性を示す。
「インスリン分泌促進活性」とは、グルコースレベルの上昇に応答してインスリン分泌を刺激することにより、細胞によるグルコースの取り込みと血漿グルコースレベルの低下とを引き起こす能力を指す。インスリン分泌促進活性は、GLP-1受容体結合活性またはGLP-1受容体の活性化を測定するインビボ実験およびインビトロアッセイを用いることなど、当技術分野で知られている方法によって、例えばそれぞれGelfandらのEP619,322および米国特許第5,120,712号に記載されている膵島細胞またはインスリノーマ細胞を利用するアッセイなどによって、評価することができる。これらの文献の内容はすべて参照により本明細書に組み込まれるものとする。インスリン分泌促進活性は、ヒトでは、常法により、インスリンレベルまたはC-ペプチドレベルを測定することによって測定される。
非天然アミノ酸の例には、α-メチルアミノ酸（例えばα-メチルアラニン）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば2-アミノヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンおよびα-メチル-ヒスチジン）、側鎖に余分なメチレンを持つアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、側鎖のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置き換えられているアミノ酸（例えばシステイン酸）などがある。しかし、好ましくは、本発明のGLP-1化合物は、本明細書に特に別段の記載がない限り、天然アミノ酸だけを含む。
GLP-1化合物は、典型的には、GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-37)OHのアナログ、GLP-1(7-37)OHの断片、またはGLP-1(7-37)OHアナログの断片のアミノ酸配列を持つポリペプチドからなる。GLP-1(7-37)OHは、以下の配列番号3のアミノ酸配列を持っている。
7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly
（配列番号3）。
当技術分野での慣例により、GLP-1(7-37)OHのアミノ末端には残基番号7が割り当てられ、カルボキシ末端には番号37が割り当てられている。配列番号3に示すように、ポリペプチド中の他のアミノ酸には連続した番号が与えられる。例えば12位はフェニルアラニンであり、22位はグリシンである。明記しない場合、C末端は通常のカルボキシル型をとる。
「GLP-1断片」は、GLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OHアナログのN末端および/またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を切り落とすことによって得られるポリペプチドである。GLP-1(7-37)OHの記載に使用される命名法はGLP-1断片にも適用することができる。例えば、GLP-1(9-36)OHは、N末端から2つのアミノ酸を切り落とし、C末端から1つのアミノ酸を切り落とすことによって得られるGLP-1断片を表す。断片中のアミノ酸は、GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と同じ番号で表される。例えば、GLP-1(7-37)OHの場合と同様に、GLP-1(9-36)OH中のN末端グルタミン酸は9位にあり、12位はフェニルアラニンで占められ、22位はグリシンで占められている。
GLP-1化合物には、インスリン分泌促進活性を示すほど十分な相同性を、GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-37)NH2、またはGLP-1(7-37)OHもしくはGLP-1(7-37)NH2の断片に対して持っている「GLP-1アナログ」が包含される。好ましくは、GLP-1アナログは、1、2、3、4、5または6個のアミノ酸がGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OHの断片の対応する位置にあるアミノ酸とは異なるように改変されている、GLP-1(7-37)OHまたはその断片のアミノ酸配列を持つ。GLP-1化合物を指定するために本明細書で使用する命名法では、置換アミノ酸およびその位置を親構造の前に示す。例えばGlu22-GLP-1(7-37)OHは、GLP-1(7-37)OHの22位に通常見いだされるグリシンがグルタミン酸で置き換えられているGLP-1化合物を表し、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHは、GLP-1(7-37)OHの8位に通常見いだされるアラニンおよび22位に通常見いだされるグリシンがそれぞれバリンおよびグルタミン酸で置き換えられているGLP-1化合物を表す。
本発明のGLP-1化合物は、Val8-GLP-1(7-37)OHと比較して増大した効力を持っている。天然GLP-1(7-37)OHは、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV（DPP-IV）により、注射後速やかに分解され、GLP-1(7-37)OHの半減期は約5分である。8位のアラニンが異なるアミノ酸で置換されているVal8-GLP-1(7-37)OHなどのアナログが開発されている。これらのアナログはDPP-IV分解に対して耐性を持ち、その結果、半減期が長くなっているからである。しかし、これらのアナログは一般に、代替搬送技術による投与を商業的規模で実現可能にするほどには強力でない。そこで、本発明に包含される新規GLP-1化合物の増大した効力を例証するために、比較基準として、Val8-GLP-1(7-37)OHを使用する。
好ましくは、本発明のGLP-1化合物は、GLP-1アナログであって、当該アナログまたは断片の主鎖が8位にアラニン以外のアミノ酸を持っているGLP-1アナログ（8位アナログ）からなる。この主鎖は、さらにL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、または改変型ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、またはα-メチル-ヒスチジンを、7位に持ってもよい。これらの8位アナログは、天然GLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比較して、12、16、18、19、20、22、25、27、30、33、および37位に、1つまたは複数の変異を追加して持つことが好ましい。これらの8位アナログは、天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比較して、16、18、22、25および33位に、1つまたは複数の変異を追加して持つことが、より好ましい。
好ましい一態様として、GLP-1アナログは、12位のアミノ酸がトリプトファンまたはチロシンからなる群より選択されるGLP-1(7-37)OHである。12位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。12位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、16位のアミノ酸がトリプトファン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、またはチロシンからなる群より選択される、GLP-1(7-37)OHである。16位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。16位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。16位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることも、好ましい。16位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、18位のアミノ酸がトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、またはイソロイシン、好ましくはトリプトファン、チロシン、およびイソロイシンからなる群より選択される、GLP-1(7-37)OHである。18位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。18位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。18位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸が、グルタミン酸で置換されていることも、好ましい。18位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、19位のアミノ酸がトリプトファンまたはフェニルアラニンからなる群より選択される（好ましくはトリプトファンである）、GLP-1(7-37)OHである。19位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。19位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。19位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることも、好ましい。19位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、20位のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである、GLP-1(7-37)OHである。20位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。20位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。20位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることも、好ましい。20位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、25位のアミノ酸がバリン、イソロイシン、およびロイシンからなる群より選択される（好ましくはバリンである）、GLP-1(7-37)OHである。25位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。25位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。25位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることも、好ましい。25位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、27位のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンからなる群より選択される、GLP-1(7-37)OHである。27位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。27位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。27位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることも、好ましい。27位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
もう一つの好ましい態様として、GLP-1アナログは、33位のアミノ酸がイソロイシンである、GLP-1(7-37)OHである。33位での置換に加えて、8位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンで置換されていると、さらに好ましい。33位および8位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていると、より一層好ましい。33位および8位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることも、好ましい。33位および8位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることも、好ましい。
また、本発明のGLP-1化合物が、置換アミノ酸を、他の組合せで含むことも好ましい。本発明は、以下の式1（配列番号1）のアミノ酸配列を含むGLP-1化合物を包含する：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
式1（配列番号1）
［式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、またはα-メチル-ヒスチジンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrであり、
Xaa12は、Phe、Trp、またはTyrであり、
Xaa16は、Val、Trp、Ile、Leu、Phe、またはTyrであり、
Xaa18は、Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu、またはValであり、
Xaa19は、Tyr、Trp、またはPheであり、
Xaa20は、Leu、Phe、Tyr、またはTrpであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Asp、Lysであり、
Xaa25は、Ala、Val、Ile、またはLeuであり、
Xaa27は、Glu、Ile、またはAlaであり、
Xaa30は、AlaまたはGluであり、
Xaa33は、Val、またはIleであり、かつ
Xaa37は、Gly、His、もしくはNH2であるか、または存在しない。
ただし、本GLP-1化合物は、次に挙げる化合物の配列を持たないものとする：GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)-NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Lue8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr12-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Asp22-GLP-1(7-37)OH、Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Glu30-GLP-1(7-36)NH2、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、Val8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-His37-GLP-1(7-37)OH、Leu8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-His37-GLP-1(7-37)OH、Ile8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-His37-GLP-1(7-37)OH、Ser8-His37-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-His37-GLP-1(7-37)OH、Thr8-His37-GLP-1(7-36)NH2］。
本発明は、以下の式II（配列番号2）のアミノ酸配列を含むGLP-1化合物も包含する：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
式II（配列番号2）
［式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、またはα-メチル-ヒスチジンであり、
Xaa8は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrであり、
Xaa16は、Val、Phe、Tyr、またはTrpであり、
Xaa18は、Ser、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、Leu、またはValであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Asp、またはLysであり、
Xaa25は、Ala、Val、Ile、またはLeuであり、
Xaa33は、ValまたはIleであり、かつ
Xaa37は、Gly、もしくはNH2であるか、または存在しない。
ただし、本GLP-1化合物は、次に挙げる化合物の配列を持たないものとする：GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)-NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Lue8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Leu8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ile8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Ser8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Thr8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Asp22-GLP-1(7-37)OH、Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-36)NH2］。
式IまたはIIのGLP-1化合物は、天然GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と比較して、6個以下の変異を持つことが好ましい。より好ましいアナログは、天然GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と比較して5個以下の変異を持つか、または天然GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と比較して4個以下の変異を持つか、または天然GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と比較して3個以下の変異を持つ。
複数の置換を持つ式IおよびIIの好ましいGLP-1化合物として、例えば、8位がバリンまたはグリシンであり、22位がグルタミン酸であり、16位がチロシン、ロイシンまたはトリプトファンであり、18位がチロシン、トリプトファン、またはイソロイシンであり、25位がバリンであり、33位がイソロイシンであるGLP-1(7-37)OHが挙げられる。他の好ましいGLP-1化合物には、以下の化合物が含まれる：Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)OH、およびVal8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH。
本明細書に開示する位置での置換は、Val8-GLP-1(7-37)OHの効力と比較して増大した効力を持つGLP-1化合物をもたらす。本発明のGLP-1化合物は一般にVal8-GLP-1(7-37)OHよりも3〜6倍強力である。例えば、実施例4の表1に、GLP-1化合物の一覧を、Val8-GLP-1(7-37)OHのインビトロ効力と比較したインビトロ効力と共に示す。好ましくは、アナログは、Val8-GLP-1(7-37)OHよりも3倍以上強力である。表1に示すインビトロ効力は一般に、Val8-GLP-1(7-37)OHと比較したインビボ効力を表す。例えば図2、3および4は、Val8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OHのインビボ効力がVal8-GLP-1(7-37)OHよりも高いことを示している。
さらに、効力が高いこれらのアナログの多くは、凝集する傾向が低下しており、したがって安定性が増加している。GLP-1化合物は少なくとも2つの異なる形態で存在することができる。1つ目の形態は生理的に活性であり、生理的pH（7.4）の水溶液に容易に溶解する。2つ目の不活性型は、GLP-1水溶液が撹拌され、疎水表面にばく露されるか、または広い空気/水界面を持つ場合に、容易に生成する。不溶型に変換されるという傾向は、商業的な量の活性GLP-1化合物の製造をかなり難しくする。したがって、溶液中で凝集する傾向が低下していて、Val8-GLP-1(7-37)OHよりも強力なGLP-1化合物が好ましい。例えばGLP-1化合物Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、およびVal8-His37-GLP-1(7-37)OHは、Val8-GLP-1(7-37)OHと比較して、溶液中で著しく低下した凝集傾向を示す（実施例3参照）。したがって、本発明の好ましいGLP-1化合物は、12、16、18、19、20、25、27、および33位などの他の位置での置換に加えて、22位にグルタミン酸、30位にグルタミン酸、もしくは37位にヒスチジン、またはそれらの組合せを持つ。
本明細書で使用する「GLP-1化合物」という用語は、本明細書に開示する化合物の医薬的に許容できる塩も包含する。本発明のGLP-1化合物は十分に酸性な官能基、十分に塩基性な官能基、または両方の官能基を持つことができ、したがって多くの無機塩基、無機酸および有機酸のいずれとも反応して塩を形成することができる。酸付加塩を形成させるためによく使用される酸は、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、および例えばp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。そのような塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-二酸塩、ヘキシン-1,6-二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ-ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホン酸塩、ナフタレン-2-スルホン酸塩、マンデル酸塩などがある。
塩基付加塩には、例えば水酸化アンモニウム、水酸化アルカリ金属、水酸化アルカリ土類金属、炭酸塩、炭酸水素塩などの無機塩基から誘導されるものが含まれる。したがって、本発明の塩を製造するのに役立つそのような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが含まれる。
本発明のGLP-1化合物は経口投与に特に適しているが、経鼻投与、吸入または非経口投与によって搬送することもできる。非経口投与には、例えば筋肉内、静脈内、皮下または腹腔内注射などによる、全身投与を含めることができる。GLP-1化合物は、許容できる医薬担体、希釈剤または賦形剤と一緒に、上述した疾患を処置するための医薬組成物の一部として、対象に投与することができる。医薬組成物は溶液であるか、非経口投与する場合には、GLP-1化合物の懸濁液、または亜鉛などの二価金属カチオンと錯化したGLP-1化合物の懸濁液であることができる。適切な医薬担体は、本ペプチドまたはペプチド誘導体と相互作用しない不活性成分を含んでもよい。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company, ペンシルベニア州イーストン）に記載されている技術など、標準的な医薬製剤技術を使用することができる。非経口投与に適した医薬担体には、例えば滅菌水、生理食塩水、静菌食塩水（約0.9mg/mlのベンジルアルコールを含む食塩水）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液などがある。適切な賦形剤の例には、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、トレハロース、ソルビトールおよびマンニトールなどがある。
投与にあたって、GLP-1化合物は、血漿レベルが長期間にわたって有効範囲内に維持されるように、製剤化することができる。長時間作用を達成するために、さまざまな手段を使用することができる。例えば、GLP-1化合物が亜鉛と錯化していて、投与するとゆっくり溶解するようになっている懸濁した無定型または結晶性の粒子に、GLP-1化合物を組み込む。長時間作用をもたらすGLP-1粒子は、HoffmannらがEP 926 159に、またDanleyらがEP 619 322に記載している。また、生体吸着性（bioadsorbable）ポリマーを利用して徐々に持続放出させるデポー製剤も、本発明での使用に適している。
効果的な経口ペプチド薬物搬送にとっての主な障害は、酸および酵素によるペプチドの分解が起こること、上皮膜を横切る吸収は起こりにくいこと、そして消化管内の酸性pH環境にばく露されるとペプチドが不溶型に変化することに起因する低い物学的利用率である。この生物学的利用率の低下により、効力の増大したGLP-1化合物を使用する必要が生じる。ペプチド（例えば本発明に包含されるペプチド）のための経口搬送系は当技術分野では知られている。例えば、市販の生体適合性生分解性ポリマー、ポリ(ラクチド-co-グリコリド）-COOHと、充填剤としてのオリーブ油とから構成されるマイクロスフェアに、GLP-1化合物を封入することができる。Josephら（2000）Diabetologia 43:1319-1328を参照されたい。AlkermesのMedisorb（登録商標）およびProlease（登録商標）生分解性ポリマーなど、他のタイプのマイクロスフェア技術も、市販されている。Medisorb（登録商標）ポリマーは、任意のラクチド異性体を使って製造することができる。ラクチド：グリコリド比を0：100と100：0の間のさまざまな値にすることで、広範なポリマー特性を実現することができる。これにより、数週間から数ヶ月にわたる吸収期間を持つ搬送系および植え込み装置の設計が可能になる。Emishere社も、ペプチドとタンパク質のための経口搬送技術に関する論文を数多く公表している。例えば、再吸収を促進するための改変アミノ酸から構成される特殊な担体を開示しているLeone-bayらのWO 9528838を参照されたい。
本明細書に記載のGLP-1化合物は、広範囲にわたる多様な疾患および状態を持つ対象の処置に使用することができる。本発明に包含されるGLP-1化合物は、「GLP-1受容体」と呼ばれる受容体に作用することによって、その生物学的効果を発揮する（Thorrensに付与された米国特許第5,670,360号を参照されたい）。したがって、GLP-1受容体刺激またはGLP-1化合物の投与に対して有益な反応を示す疾患および/または状態を持つ対象は、本発明のGLP-1化合物で処置することができる。これらの対象を「GLP-1化合物による処置を必要としている」または「GLP-1受容体刺激を必要としている」という。
そのような対象には、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（EfendicによるWO 00/16797参照）、心筋梗塞（EfendicによるWO 98/08531参照）、肥満（EfendicによるWO 98/19698参照）、手術後の異化変化（Efendicに付与された米国特許第6,006,753号参照）、機能性消化不良および過敏性大腸症候群（EfendicによるWO 99/64060参照）を持つ対象が含まれる。また、GLP-1化合物による予防的処置を必要とする対象、例えばインスリン非依存性糖尿病を発症する危険がある対象（WO 00/07617参照）なども含まれる。耐糖能障害または空腹時グルコース異常を持つ対象、当該対象の身長および体格での正常体重より約25％重い体重を持つ対象、部分膵切除術を受けた対象、片親または両親がインスリン非依存性糖尿病である対象、妊娠糖尿病の病歴がある対象、および急性または慢性膵炎の病歴がある対象は、インスリン非依存性糖尿病を発症する危険がある。
本発明のGLP-1化合物は、血中グルコースレベルを正常化し、膵β細胞の劣化を予防し、β細胞増殖を誘導し、インスリン遺伝子転写を刺激し、IDX-1/PDX-1または他の成長因子をアップレギュレートし、β細胞機能を改善し、休止β細胞を活性化し、細胞をβ細胞に分化させ、β細胞複製を刺激し、β細胞アポトーシスを阻害し、体重を調節し、体重減少を誘発するために使用することができる。
GLP-1化合物の「有効量」とは、GLP-1受容体刺激を必要としている対象に投与したときに、許容できない副作用を引き起こすことなく、望ましい治療効果および/または予防効果をもたらす量である。「望ましい治療効果」には、以下に挙げる効果の1つまたは複数が含まれる：1）疾患または状態に関係する症状の改善、2）疾患または状態に関係する症状の発症の遅延、3）処置を行わない場合と比較した生存期間の延長、および4）処置を行わない場合と比較した生活の質の向上。例えば糖尿病の処置に関してGLP-1化合物の「有効量」とは、処置を行わない場合よりも血中グルコース濃度がより良く制御され、その結果として、網膜症、ニューロパシーまたは腎疾患などの糖尿病合併症の発症が遅延するような量である。糖尿病の予防に関してGLP-1化合物の「有効量」とは、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン類、インスリンおよび/またはビスグアニジン類などの抗低血糖薬による処置を必要とする高血中グルコースレベルの発生を、処置を行わない場合と比較して遅延させるような量である。
対象に投与されるGLP-1化合物の「有効量」は、疾患のタイプおよび重症度ならびにその対象の特徴、例えばその対象の全体的状態、年齢、性別、体重および薬物に対する忍容性などにも依存するだろう。通例、本発明のGLP-1化合物は、血漿レベルが約5ピコモル/リットル〜約200ピコモル/リットルの範囲に入るように投与される。 Val8-GLP-1(7-37)OHの至適血漿レベルは、30ピコモル/リットル〜約200ピコモル/リットルであると決定された。本発明のGLP-1化合物はVal8-GLP-1(7-37)OHよりも強力であるので、その至適血漿レベルは低くなるだろう。一般に、Val8-GLP-1(7-37)OHと比較して3倍向上したインビトロ効力またはインビボ効力を持つGLP-1化合物は、その血漿レベルがVal8-GLP-1(7-37)OHについて決定された至適レベルの3分の1になるように、投与されるだろう。
本発明のGLP-1化合物の典型的な用量範囲は、成人の場合、約0.01mg/日〜約1000mg/日になるだろう。投与量は、好ましくは約0.1mg/日〜約100mg/日、より好ましくは約1.0mg/日〜約10mg/日の範囲である。
「対象」は哺乳類、好ましくはヒトであるが、動物、例えばコンパニオン動物（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
本発明のGLP-1化合物は、固相ペプチド合成技術の標準的な方法を使って製造することができる。ペプチド合成装置は、例えばカリフォルニア州フォスターシティのApplied Biosystemsなどから市販されている。固相合成用の試薬類は、例えばMidwest Biotech（インディアナ州フィッシャーズ）などから市販されている。製造者の説明書に従って固相ペプチド合成装置を使用することにより、干渉する基をブロックし、反応させるアミノ酸を保護し、カップリングし、切断し、未反応のアミノ酸をキャッピングすることができる。
典型的には、α-N-カルバモイル保護アミノ酸と、成長中のペプチド鎖上のN-末端アミノ酸とを、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドンまたは塩化メチレンなどの不活性溶媒中、ジシクロヘキシルカルボジイミドや1-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのカップリング剤およびジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下に、室温でカップリングする。トリフルオロ酢酸またはピペリジンなどの試薬を使って、α-N-カルバモイル保護基を、得られたペプチド樹脂から除去し、ペプチド鎖に付加しようとする次のN-保護アミノ酸を使って、カップリング反応を繰り返す。適切なアミン保護基は当技術分野ではよく知られており、例えば、参考文献として本明細書の一部を構成するGreenおよびWuts「Protecting Groups in Organic Synthesis」John Wiley and Sons, 1991に記載されている。t-ブチルオキシカルボニル（tBoc）や、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）が、その一例である。
ペプチドは、適切な側鎖保護が施されたt-ブトキシカルボニル-またはフルオレニルメトキシカルボニル-α-アミノ酸を使って、標準的な自動固相合成プロトコールでも合成される。合成が完了したら、標準的なフッ化水素法を使って、ペプチドを固相支持体から切り離し、それと同時に側鎖脱保護を行う。次に、Vydac C18カラムでの逆相クロマトグラフィーにより、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）中のアセトニトリル勾配を使って、粗製ペプチドをさらに精製する。アセトニトリルを除去するために、0.1％TFA、アセトニトリルおよび水を含む溶液からペプチドを凍結乾燥する。純度は、分析用逆相クロマトグラフィーによって確かめることができる。ペプチドの素性は質量分析法によって確かめることができる。ペプチドは中性pHの水性緩衝液に溶解することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は決して限定を意図するものではない。
実施例１
固相t-Boc法による本発明のGLP-1化合物の製造
約0.5〜0.6グラム（0.38〜0.45mmol）のBoc Gly-PAM樹脂を、標準の60ml反応容器に入れ、Applied Biosystems ABI430Aペプチド合成装置で、ダブルカップリングを行った。以下の側鎖保護アミノ酸（Bocアミノ酸の2mmolカートリッジ）をMidwest Biotech（インディアナ州フィッシャーズ）から入手して、合成に使用した：
Arg-Tosyl（TOS）、Asp-δ-シクロヘキシルエステル（CHXL）、Glu-δ-シクロヘキシルエステル（CHXL）、His-ベンジルオキシメチル（BOM）、Lys-2-クロロベンジルオキシカルボニル（2Cl-Z）、Met-スルホキシド（O）、Ser-O-ベンジルエーテル（OBzl）、Thr-O-ベンジルエーテル（OBzl）、Trp-ホルミル（CHO）およびTyr-2-ブロモベンジルオキシカルボニル（2Br-Z）ならびにBoc Gly PAM樹脂。トリフルオロ酢酸（TFA）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、DMF中の0.5Mヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ジクロロメタン中の0.5Mジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）は、PE-Applied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティ）から購入した。ジメチルホルムアミド（DMF, Burdick and Jackson）およびジクロロメタン（DCM, Mallinkrodt）は、Mays Chemical Co.（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。
標準的なダブルカップリングを対称無水物またはHOBtエステル（どちらもDCCを使って形成させたもの）を使って行った。二組目のダブルカップリング（TFA脱保護なし）はTrp31、Thr13およびThr11で行った。合成が完了したら、N末端Boc基を除去し、Trp側鎖を脱ホルミル化するためにペプチジル樹脂をDMF中の20％ピペリジンで処理した。DCMで洗浄した後、樹脂をテフロン製反応容器に移し、減圧乾燥した。
Metを含むアナログの場合は、TFA/10％ジメチルスルフィド（DMS）/2％濃塩酸を使って、樹脂上での還元を行った。切断は反応容器をHF（フッ化水素酸）装置（Penninsula Laboratories）に装着することによって行った。樹脂1グラムにつき1mlのm-クレゾールを加え、10mlのHF（AGA（インディアナ州インディアナポリス）から購入）を予冷した容器に凝縮させた。メチオニンが存在する場合は樹脂1グラムにつき1mlのDMSを加えた。反応系を氷浴で1時間撹拌し、減圧下でHFを除去した。残渣をエチルエーテル中に懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを酢酸水溶液に抽出し、凍結乾燥するか、または逆相カラムに直接のせた。
精製は、緩衝液A（0.1％トリフルオロ酢酸水溶液、B：0.1％TFA/アセトニトリル）中の2.2×25cm VYDAC C18カラムで行った。120分間にわたって10ml/分の流量で20％Bから90％Bまでの勾配をHPLC（Waters）にかけ、280nmのUVをモニターし（4.0A）、1分ずつ分取した。適当な画分を合わせて凍結し、凍結乾燥した。乾燥した生成物をHPLC（0.46×15cm METASIL AQ C18）およびMALDI質量分析法で分析した。
実施例２
固相F-Moc法による本発明のGLP-1化合物の製造
約114mg（50mmol）のFMOC Gly WANG樹脂（NovaBiochem（カリフォルニア州ラホーヤ）から購入）を、96ウェル反応ブロックの所定の各ウェルに入れ、Advanced ChemTech 396ペプチド合成装置でダブルカップリングを行った。C末端アミドを持つアナログは75mg（50μmol）のRink Amide AM樹脂（NovaBiochem, カリフォルニア州ラホーヤ）を使って製造した。
以下のFMOCアミノ酸をAdvanced ChemTech（ケンタッキー州ルイビル）およびMidwet BioTech（インディアナ州インディアナポリス）から購入した：Arg-2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル（Pbf）、Asn-トリチル（Trt）、Asp-β-t-ブチルエステル（tBu）、Glu-δ-t-ブチルエステル（tBu）、Gln-トリチル（Trt）、His-トリチル（Trt）、Lys-t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、Ser-t-ブチルエーテル（OtBu）、Thr-t-ブチルエーテル（OtBu）、Trp-t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、Tyr-t-ブチルエーテル（OtBu）。
溶媒ジメチルホルムアミド（DMF, Burdick and Jackson）、N-メチルピロリドン（NMP, Burdick and Jackson）、ジクロロメタン（DCM, Mallinkrodt）はMays Chemical Co.（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。
ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）およびピペリジン（Pip）は、Aldrich Chemical Co.（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。
すべてのアミノ酸をNMP中の0.45M HOBtに溶解し、20％Pip/DMFを使って20分間脱保護した後、50分間のDIC/HOBt活性化カップリングを行った。脱保護およびカップリング後に各樹脂をDMFで洗浄した。最後のカップリングおよび脱保護後に、ペプチジル樹脂をDCMで洗浄し、反応ブロック中で減圧乾燥した。
反応/切断ブロック装置を正しく配置して、2mlの試薬Kを各ウェルに加え、切断反応系を2時間混合した［試薬K＝トリフルオロ酢酸（TFA）10mlにつき0.75gのフェノール、0.5mlのチオアニソール、0.25mlのエタンジチオール、0.5mlの水、すべてAldrich Chemical Co.（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入］。TFA濾液を40mlエチルエーテルに加え、沈殿物を2000rpmで2分間遠心分離した。上清をデカントし、40mlのエーテルにペレットを再懸濁し、再び遠心分離し、再びデカントし、窒素下で乾燥し、次に減圧乾燥した。
0.3〜0.6mgの各生成物を1mlの0.1％TEA/アセトニトリル（ACN）に溶解し、20μlをHPLCで分析した［0.46×15cm METASIL AQ C18, 1ml/分, 45℃, 214nM（0.2A）, A＝0.1％TFA, B＝0.1％TFA/50％ACN, 勾配＝30分間で50％Bから90％Bまで］
精製は、緩衝液A（0.1％トリフルオロ酢酸水溶液、B：0.1％TFA/アセトニトリル）中の2.2×25cm VYDAC C18カラムで行った。120分間にわたって10ml/分の流量で20％Bから90％Bまでの勾配をHPLC（Waters）にかけ、280nmのUVをモニターし（4.0A）、1分ずつ分取した。適当な画分を合わせて凍結し、凍結乾燥した。乾燥した生成物をHPLC（0.46×15cm METASIL AQ C18）およびMALDI質量分析法で分析した。
実施例３
GLP凝集アッセイ：
本発明のGLPペプチドを、それらが溶液中で凝集する能力について解析した。概説すると、適切な緩衝液中で、溶解した状態のペプチドを、高い温度で撹拌しつつ、350nmでの濁度を時間の関数として記録した。凝集が始まるまでの時間を測定することにより、これらの負荷条件下での、与えられたGLP分子の凝集能力を定量化した。
プロトコール：
既に凝集している物質をすべて溶解させるために、GLP-1化合物を、まずアルカリ性条件（pH10.5）で30分間溶解した。次にその溶液をpH7.4に調節し、濾過した。具体的には、4mgの凍結乾燥GLP-1化合物を3mlの10mMリン酸塩/10mMクエン酸塩に溶解した。pHを10.0〜10.5に調節し、それを30分間保った。その溶液をHClでpH7.4に調節し、適当なフィルター、例えばMillex GVシリンジフィルター（Millipore Corporation, マサチューセッツ州ベッドフォード）などを通して濾過した。次に、この溶液を、0.3mg/mLのタンパク質を含む最終試料が得られるように、10mMクエン酸塩、10mMリン酸塩、150mM NaClに希釈し、pH7.4〜7.5に調節した。試料を石英キュベットに入れて37℃でインキュベートした。AVIV Model 14DS UV-VIS分光光度計（ニュージャージー州レークウッド）を使って、5分毎に溶液の濁度を350nmで測定した。測定前の30秒間と測定中は、Starna Cells, Inc.（カリフォルニア州アタスカデロ）製の磁気撹拌子を使って、溶液を撹拌した。350nmでのODの増加は、GLP-ペプチドの凝集を表す。Drakeらの方法（Arvinte T, Cudd AおよびDrake AF（1993）J. Bio. Chem. 268, 6415-6422）に従い、前増加期と増加期の線型フィットの交点によって、凝集までの時間を概算した。
実験毎に苛性セッケン溶液（例えばContrad-70）でキュベットを洗浄した。
いくつかの本発明GLP-1化合物について、結果を、化合物が凝集するのに要した時間（単位：時間）として、表1に示す。これからわかるように、本発明の化合物は、先行技術で知られていたGLP-1化合物と比較して、著しく増加した凝集時間を示す。
Val8-GLP-1(7-37)OHの凝集時間が30℃で1時間未満であるのに対して、GLP-1化合物Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHの凝集時間は30℃で約72時間だった。GLP-1化合物Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OHの凝集時間は約30時間であり、GLP-1化合物Val8-His37-GLP-1(7-37)OHの凝集時間は30℃で40時間を超えていた。
実施例４
本発明のGLP-1化合物によるGLP-1受容体の活性化
GelfandらのEP 619,322や米国特許第5,120,712号にそれぞれ記載されているようなインビトロアッセイを使って、本発明GLP-1化合物のGLP-1受容体活性化能を評価した。これらの文献の教示する内容は参照によりすべて本明細書に組み込まれるものとする。Val8-GLP-1(7-37)OHの活性を対するこれらの化合物の相対活性を表1に示す。
Figure 0004227894
実施例５
ラットにおける経静脈的グルコース負荷試験（IVGTT）
溶液の注入と採血が容易にできるように、絶食したウィスター雄ラットにダブルカニュレーション術を施した。頸静脈カニューレを通して、ラットに10％グルコース溶液をボーラス注入した後、所定の量のGLP-1化合物を含む溶液を注入した。ラットには、0.01、0.03、0.1、0.3、1、および10μg/kgのGLP-1化合物を注入した。GLP-1化合物注入の2、4、6、10、および30分後に、頸動脈カニューレを通して血液を採取し、分析した。各試料の血漿インスリンレベルおよび血漿グルコースレベルを測定した。平均インスリンレベルよび平均グルコースレベルを図1、2および3に図示する。
ラットにさまざまな濃度のVal8-GLP-1(7-37)OHを注射した後のさまざまな時点で得られる血漿インスリン濃度および血漿グルコース濃度を表すグラフ。 ラットにさまざまな濃度のVal8-Glu22- Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OHを注射した後のさまざまな時点で得られる血漿インスリン濃度を表すグラフ。 ラットにさまざまな濃度のVal8-Glu22- Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OHおよびVal8-GLP-1(7-37)OHを注射した0分後から30分後までの血漿インスリンに関するAUC値を表すグラフ。

Claims (1)

  1. His-Val 8 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu 22 -Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile 33 -Lys-Gly-Arg-Gly-OH のアミノ酸配列を含む GLP-1 化合物。
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