CN108135981B

CN108135981B - 胰高血糖素受体激动剂

Info

Publication number: CN108135981B
Application number: CN201680062196.4A
Authority: CN
Inventors: T.科斯昆; J.阿尔西纳-费尔南德斯
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: CA3000538A1; JP2018504376A; JP6354017B2; PT3368060T; PT3368061T; EP3368061A1; HUE050859T2; AU2016344433B2; CA3003242C; CN108135981A; EP3368060A1; AR106318A1; US20170112904A1; KR20180053747A; AU2016344433A1; JP7211712B2; MX2018005132A; WO2017074714A1; JP2018508464A; NZ740644A

Abstract

本发明涉及与天然胰高血糖素相比在胰高血糖素受体处的作用持续时间延长的化合物。具体地，提供了一种胰高血糖素受体激动剂，其在天然胰高血糖素结构中引入修饰，以在延长时间段内选择性激动胰高血糖素受体。

Description

胰高血糖素受体激动剂

本发明涉及与天然胰高血糖素相比在胰高血糖素受体处的作用持续时间延长的化合物。具体地，提供了胰高血糖素受体激动剂，其在天然胰高血糖素结构中引入修饰，以在延长时间段内选择性激动胰高血糖素受体。胰高血糖素受体激动剂可以与其他治疗剂组合用于治疗病症诸如2型糖尿病(T2DM)和/或肥胖症，或可作为单药疗法来治疗奶牛中的多种病症，诸如肥胖症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症和/或夜间低血糖症以及脂肪肝综合征。

在过去的几十年间，糖尿病的流行率已持续上升。T2DM是糖尿病的最常见的形式，占所有糖尿病的约90%。T2DM的特征在于由胰岛素抗性引起的高血糖水平。T2DM的当前护理标准包括饮食和运动、和用口服药物治疗、和可注射降葡萄糖药物，包括基于肠促胰岛素的疗法，诸如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂和二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂。当用口服药物治疗和基于肠促胰岛素的疗法不足时，考虑用胰岛素治疗。疾病已进展至需要胰岛素疗法的点的患者一般开始每天单次注射长效基础胰岛素，尽管在一些情况中，可根据需要包括在进餐时间注射速效胰岛素。

尽管这些疗法可用，但许多具有T2DM的患者的血糖水平的控制仍维持不充足。不受控的糖尿病导致几种影响患者发病率和死亡率的病况。T2DM的主要风险因子之一是肥胖。大多数T2DM患者(~90%)超重或肥胖。据记载身体肥胖的减少将导致肥胖相关联的共病症(co-morbidity)(包括高血糖和心血管事件)的改善。因此，需要对葡萄糖控制和体重减轻有效的疗法以更好地管理疾病。

此外，对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(其是指一群与肝脏中脂肪累积相关联的肝病症)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)(其为NALFD的严重形式，其特征在于组织学发现诸如炎症、肝细胞损伤和纤维化)的流行和认知也持续上升。NASH是西方国家最常见的肝病，并在美国影响3-5%的成人。治疗通常包括开饮食改变和运动的处方，且可涉及肥胖外科手术、吡格列酮类、他汀类、ω3和维生素E疗法(在非糖尿病性NASH患者的情况下)以减少肝脏脂肪，但尚不存在经批准以解决与NASH相关的炎症和/或纤维化的治疗剂。因此，需要额外疗法。

可用和/或在开发中作为治疗剂的几种肽(包括胰高血糖素)衍生自前胰高血糖素原(pre-proglucagon)，其为在组织中被处理以形成几种结构相关肽的多肽。胰高血糖素是与前胰高血糖素原的氨基酸53至81对应的29-氨基酸肽，其具有以下氨基酸序列：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO: 1)。胰高血糖素通过结合并活化肝细胞上的胰高血糖素受体，引起肝脏通过称为糖原分解的过程释放以糖原形式储存的葡萄糖来帮助维持血液中葡萄糖的水平。当糖原储存物变得耗尽时，胰高血糖素刺激肝脏以通过糖异生来合成额外的葡萄糖。该葡萄糖被释放至血流中，防止发展低血糖症。胰高血糖素的施用是用于治疗急性低血糖症的确立的疗法，且紧急施用胰高血糖素可以在施用的数分钟内恢复正常葡萄糖水平。某些胰高血糖素类似物已被描述为表现出改善的溶解度和稳定性。参见，例如，WO2015094875；WO2015094876；WO2015094878。

衍生自前胰高血糖素原的其他肽包括GLP-1、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(OXM)。GLP-1是36个氨基酸的肽，其主要生物活性片段(GLP-1_7-36)被产生为与前胰高血糖素原的氨基酸98至127对应的30-氨基酸、C-端酰胺化的肽，其具有以下氨基酸序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO: 2)。尽管胰高血糖素刺激葡萄糖的释放以防止低血糖症，但GLP-1 (SEQ ID NO: 2)刺激胰岛素合成和分泌且已显示预防在糖尿病患者中的高血糖症。多种GLP-1类似物是当前可用的，包括艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、阿必鲁肽(albiglutide)和杜拉鲁肽(dulaglutide)。

OXM是由胰高血糖素的全部29个氨基酸的序列与八肽羧基端延伸(前胰高血糖素原的氨基酸82至89且称为“介入肽1”或IP-1)组成的37个氨基酸的肽，其具有以下氨基酸序列：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEQ ID NO: 3)。OXM活化胰高血糖素和GLP-1受体两者，对于胰高血糖素受体的效力略高于GLP-1受体。已描述具有双重胰高血糖素受体和GLP-1受体活性的OXM类似物。参见，例如，WO2011087672；WO2011087671。

尽管不是衍生自前胰高血糖素原，但葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)是在葡萄糖内稳态中通过刺激在葡萄糖存在的情况下从胰脏β细胞分泌胰岛素来发挥生理作用的另一种肽。GIP是42个氨基酸的肽，其具有以下氨基酸序列：YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO: 4)。某些GIP类似物已被描述为表现出GIP和GLP-1受体活性两者。参见，例如，WO2015067715；WO2011119657；WO2013164483。

此外，类似于上述OXM的双重活性，某些胰高血糖素类似物已被描述为在胰高血糖素受体和在GLP-1或GIP受体中的一者或多者处具有共激动剂活性。例如，WO2011075393和WO 2012177444旨在描述在胰高血糖素受体和GLP-1受体处都具有活性的胰高血糖素类似物。类似地，WO2013192130旨在描述在GIP受体处也具有活性的胰高血糖素类似物。另外，WO2015067716旨在描述在胰高血糖素、GLP-1和GIP受体中各自具有三重激动剂活性的类似物。

尽管存在提出作为T2DM和/或肥胖疗法的多种肽和蛋白，当前可用和/或处在开发中的疗法具有限制。具体而言，尽管可阐明上述双重或三重激动剂以提供GLP-1受体和/或GIP受体激动剂的降葡萄糖特性连同胰高血糖素受体激动剂的代谢益处，但此类肽在其所激动的各种受体各自处的活性水平是固定的，使得难以实现理想的受体活化平衡以在最小副作用下获得体内高效力。并且不涉及胰高血糖素受体激动作用的疗法缺乏这种作用机制的潜在代谢益处。

尽管胰高血糖素的伴随施用理论上能够减少此类限制，但将当前可用的胰高血糖素产品用于此类应用中是不切实际的。具体而言，胰高血糖素的血浆半衰期小于一小时，使得对于长期使用是不切实际的，尤其在涉及与可用和/或在开发中的其他疗法组合的实施方案中，因为许多此类疗法如每天一次不频繁地给药，且一些疗法提出如每周一次不频繁地给药。此外，野生型胰高血糖素在GLP-1受体处也具有一些活性，其可使在其中其他化合物具有其减低的GLP-1受体活性的组合疗法中实现胰高血糖素相对于GLP-1受体活性的适当平衡的努力复杂化。此外，当前可用的胰高血糖素产品的溶解度和化学和物理稳定性特征也不适合在此类应用中用于长期使用，且将不允许与其他治疗剂共配制。

因此，需要具有延长的作用持续时间的胰高血糖素受体激动剂，其允许如每天一次、每周三次、每周两次或每周一次不频繁地给药。还需要在胰高血糖素受体处具有有效活性和在胰高血糖素受体处的活性相对于在GLP-1受体处的活性具有高选择性的胰高血糖素受体激动剂。还需要具有与其他治疗剂共配制的合适特征的胰高血糖素受体激动剂。还需要具有允许长期储存和使用的溶解度和稳定性特征的胰高血糖素受体激动剂。

本发明的胰高血糖素受体激动剂寻求满足这些需求。因此，本发明提供具有延长作用持续时间的胰高血糖素受体激动剂，其允许如每天一次、每周三次、每周两次或每周一次不频繁地给药。本发明提供在胰高血糖素受体处与在例如GLP-1和/或GIP受体处相比具有最佳和选择性活性的胰高血糖素受体激动剂。本发明提供具有适用于长期使用和与其他治疗共配制的物理和化学特征的胰高血糖素受体激动剂。本发明提供胰高血糖素受体激动剂，当其与其他糖尿病治疗组合使用时，实现增强的葡萄糖控制、代谢效益(诸如体重减轻)和/或脂质效益(诸如PCSK9降低)。具体而言，本发明的胰高血糖素受体激动剂与GLP-1R激动剂或 GIP-GLP-1共激动剂的组合对量度诸如体重减轻和身体组成具有有益协同效应。本发明还寻求当作为单药疗法和/或与其他疗法组合使用时针对其他病症(包括肥胖症、NAFLD、 NASH、血脂异常、代谢障碍、高胰岛素血症和/或夜间低血糖症)提供有效治疗。

因此，本发明的一个实施方案提供了胰高血糖素受体激动剂，其包含式I：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇ [式I]

其中

X₁是Aib；

X₂是T或L；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1或2且b是14至24；

X_5是E或A；

X₆是T或E；

X₇不存在，或者是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；

且C-端氨基酸任选地被酰胺化(SEQ ID NO: 5)；

或其药学上可接受的盐。

本发明的另一个实施方案提供了胰高血糖素受体激动剂，其包含由式I组成的式：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇ [式I]

其中

X₁是Aib；

X₂是T或L；

X₃是Aib；

X₅是E或A；

X₆是T或E；

X₇不存在，或者是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；

且C-端氨基酸任选地被酰胺化(SEQ ID NO: 5)；

或其药学上可接受的盐。

本发明的另一个实施方案提供了胰高血糖素受体激动剂，其由式I组成：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇ [式I]

其中

X₁是Aib；

X₂是T或L；

X₃是Aib；

X₅是E或A；

X₆是T或E；

X₇不存在，或者是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；

且C-端氨基酸任选地被酰胺化(SEQ ID NO: 5)；

或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中X₂是T。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中X₂是L。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₅是E。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₅是A。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₆是T。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₆是E。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₇是GPSSGAPPPS。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₇是GPSSG。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中X₇不存在。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中b是16至20。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中b是16至18。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中b是16。在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有上述实施方案中任一者的结构，其中b是18。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是2；b是16；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSGAPPPS；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQID NO: 6)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是2；b是18；X₅是E；X₆是T；X₇是GPSSGAPPPS；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ IDNO: 7)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是L；a是2；b是16；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSGAPPPS；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQID NO: 8)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是2；b是16；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSG；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ IDNO: 9)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是2；b是18；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSG；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ IDNO: 10)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是1；b是16；X₅是A；X₆是E；且X₇不存在(SEQ ID NO: 11)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是1；b是18；X₅是A；X₆是E；且X₇不存在(SEQ ID NO: 12)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：a是2；X₅是E；X₆是T；X₇是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；且C-端氨基酸被酰胺化(SEQ ID NO: 16)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂具有式I的结构，其中：X₂是T；a是1；X₅是A；X₆是E；且X₇不存在(SEQ ID NO: 17)。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂在胰高血糖素受体处的活性是所述胰高血糖素受体激动剂在GLP-1受体处的活性的至少100倍。

本发明的另一个实施方案提供了治疗选自T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症和夜间低血糖症的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂。

本发明的另一个实施方案提供了治疗选自T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症和夜间低血糖症的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂与有效量的一种或多种额外治疗剂的组合。在某些实施方案中，所述疾病是T2DM。在某些实施方案中，所述疾病是肥胖症。在某些实施方案中，所述疾病是脂肪肝病。在某些实施方案中，所述一种或多种额外治疗剂选自GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、胰岛素受体激动剂、胃泌酸调节素、二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、二肽基肽酶-4(“DPP-4”)抑制剂和钠葡萄糖协同转运蛋白2(“SGLT2”)抑制剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是GLP-1R激动剂。在某些实施方案中，所述GLP-1R激动剂是杜拉鲁肽。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是GIP-GLP-1共激动剂。在某些实施方案中，所述GIP-GLP-1共激动剂具有SEQ ID NO: 15的结构。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是胰岛素受体激动剂。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂当与额外治疗剂诸如GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂组合使用时对体重减轻和身体组成具有协同效应。

本发明的另一个实施方案提供了本发明的胰高血糖素受体激动剂在治疗中的用途。本发明的另一个实施方案提供了本发明的胰高血糖素受体激动剂在治疗选自T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症和夜间低血糖症的疾病中的用途。在某些实施方案中，所述疾病是T2DM。在某些实施方案中，所述疾病是肥胖症。在某些实施方案中，所述疾病是脂肪肝病。

本发明的另一个实施方案提供了本发明的胰高血糖素受体激动剂，其用于与一种或多种额外治疗剂组合同时、分开或依次使用以用于治疗中。在某些实施方案中，所述一种或多种额外治疗剂选自GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、胰岛素受体激动剂、胃泌酸调节素、二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、DPP-4抑制剂和钠葡萄糖协同转运蛋白2(“SGLT2”)抑制剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是GLP-1R激动剂。在某些实施方案中，所述GLP-1R激动剂是杜拉鲁肽。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是GIP-GLP-1共激动剂。在某些实施方案中，所述GIP-GLP-1共激动剂具有SEQ ID NO: 15的结构。

本发明的另一个实施方案提供了本发明的胰高血糖素受体激动剂在制备用于治疗T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症和夜间低血糖症的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案提供了药物组合物，其包含本发明的胰高血糖素受体激动剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含额外治疗剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂选自GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、胰岛素受体激动剂、胃泌酸调节素、二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、DPP-4抑制剂和SGLT2抑制剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是GLP-1R激动剂。在某些实施方案中，所述GLP-1R激动剂是杜拉鲁肽。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是GIP-GLP-1共激动剂。在某些实施方案中，所述GIP-GLP-1共激动剂具有SEQ ID NO: 15的结构。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是胰岛素受体激动剂。

本发明的另一个实施方案提供了诱导非治疗性体重减轻的方法，其包括施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂。

本发明的另一个实施方案提供了治疗牛中的脂肪肝综合征的方法，其包括向有需要的牛施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂。

本发明的另一个实施方案提供了本发明的胰高血糖素受体激动剂，其用于治疗牛中的脂肪肝综合征。

当用于本文中时，术语“胰高血糖素受体激动剂”意指包含天然人类胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)、胰高血糖素类似物、胰高血糖素衍生物或胰高血糖素融合蛋白的氨基酸序列的化合物，其结合并活化胰高血糖素受体，且维持在胰高血糖素受体处相对于在GLP-1受体处的选择性活性，实现在作为单药疗法施用时血清葡萄糖水平增加。可使用已知的体外和体内方法，诸如描述于下文研究中的那些测量此类结合特征和药效学效应。胰高血糖素类似物是当与天然人类胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列相比时具有包括一个或多个氨基酸取代、缺失、倒置或增加的修饰的分子。胰高血糖素衍生物为具有天然人类胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)或胰高血糖素类似物的氨基酸序列，但额外具有其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基中的一种或多种的至少一个化学修饰的分子。胰高血糖素融合蛋白是包含胰高血糖素、胰高血糖素类似物或胰高血糖素衍生物和第二多肽的异种蛋白，诸如免疫球蛋白Fc区。

本发明的胰高血糖素受体激动剂对胰高血糖素受体的活性相对于GLP-1受体也是选择性的。当在本文中使用时，术语“相对于...是选择性的”、“选择性”和“针对...是选择性的”是指展现对胰高血糖素受体的效力是GLP-1受体的50倍、100倍、200倍、250倍、500倍或1000倍的化合物。可使用已知的体外方法、诸如描述于下文研究中的那些测量这种选择性。

本发明的胰高血糖素受体激动剂具有延长的时间作用曲线，其允许如每天一次、每周三次、每周两次或每周一次不频繁地给药。可使用已知的药代动力学测试方法测量胰高血糖素受体激动剂的时间作用曲线。

通过使用与在位置20的赖氨酸氨基酸的侧链的ε-氨基缀合的脂肪酸部分来实现本发明的胰高血糖素受体激动剂的延长的时间作用曲线。脂肪酸通过接头与赖氨酸的侧链的ε-氨基缀合，所述接头包含[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a，其中a是1或2。脂肪酸和接头中的γ-谷氨酸充当白蛋白结合剂，且提供生成长效化合物的潜能。通过接头的方式与在位置20的赖氨酸氨基酸的侧链的ε-氨基缀合的脂肪酸包含-CO-(CH₂)_b-CO₂H，其中b为14至24。因此，完整的接头-脂肪酸结构包含([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H，其中a是1或2且b是14或24。如下文实施例1-7的化学结构中所示，[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基的第一单元连接至赖氨酸侧链的ε-氨基。[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基的第二单元随后连接至[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基的第一单元的氨基。然后，γGlu的第一单元通过侧链的γ-羧基连接至[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基的第二单元的氨基。当a=2时，γGlu的第二单元通过侧链的γ-羧基连接至γGlu的第一单元的α-氨基。最后，脂肪酸连接至γGlu的第一(当a=1时)或第二(当a=2时)单元的α-氨基。

本发明的胰高血糖素受体激动剂被优选配制为通过肠胃外途径(例如，皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内或经皮)施用的药物组合物。此类药物组合物以及制备其的方法是本领域众所周知的。(参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B.Troy，编辑，第21版，Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。优选的施用途径是皮下的。

本发明的胰高血糖素受体激动剂可以与多种无机酸和有机酸中的任一种反应以形成药学上可接受的酸加成盐。药学上可接受的盐和用于制备它们的常见方法是本领域众所周知的。(参见，例如，P.Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties,Selection and Use, 第2修订版 (Wiley-VCH, 2011))。本发明的药学上可接受的盐包括三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。

由本发明的胰高血糖素受体激动剂对于胰高血糖素受体相对于GLP-1受体的选择性所提供的一种特定的益处是当本发明的胰高血糖素受体激动剂与额外治疗剂组合施用时提供灵活的治疗选项的能力，使得在胰高血糖素受体处的活性与在其他受体(例如，GLP-1、GIP 和/或胰岛素受体)处的活性的比率最优化。因此，在某些优选实施方案中，本发明提供治疗患者中的T2DM的方法，其包括向需要这种治疗的患者施用与额外治疗剂组合的有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述额外治疗剂选自GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂或胰岛素受体激动剂。

当用于本文中时，术语“额外治疗剂”意指已知具有有益治疗效果的其他化合物，诸如，针对T2DM和/或肥胖症的治疗，其当前可用的和/或处在开发中，包括例如GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、胰岛素受体激动剂、胃泌酸调节素类、二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、DPP-4抑制剂和SGLT2抑制剂。

当用于本文中时，术语“与…组合”意指本发明的胰高血糖素受体激动剂与一种或多种额外治疗剂同时、依次或在单一组合制剂中施用。

当用于本文中时，术语“GLP-1R激动剂”是指包含天然人类GLP-1(SEQ ID NO: 2)、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1融合蛋白的氨基酸序列的化合物，其维持在GLP-1受体处的活性。可通过本领域已知的方法，包括使用测量GLP-1受体结合活性或受体活化的体内实验和体外测定来测量GLP-1受体活性。GLP-1类似物是当与天然人类GLP-1 (SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相比时具有包括一个或多个氨基酸取代、缺失、倒置或添加的修饰的分子。GLP-1衍生物是具有天然人类GLP-1(SEQ ID NO: 2)或GLP-1类似物的氨基酸序列，但额外具有其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基中的一种或多种的至少一个化学修饰的分子。GLP-1融合蛋白是包含GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物和第二多肽的异种蛋白，诸如免疫球蛋白Fc区。当前可用和/或处在开发中的GLP-1R激动剂包括艾塞那肽、利拉鲁肽、利西拉肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽和索马鲁肽。在某些优选的实施方案中，其中本发明的胰高血糖素受体激动剂与GLP-1R激动剂组合施用，所述GLP-1R激动剂是杜拉鲁肽。参见，例如，US 7,452,966。

当用于本文中时，术语“GIP-GLP-1共激动剂”是指在GIP和GLP-1受体处具有活性的化合物。可通过本领域已知的方法，包括使用测量GIP受体和/或GLP-1受体结合活性或受体活化的体内实验和体外测定来测量GIP受体和GLP-1受体活性。尽管GIP-GLP-1共激动剂在当前不可用作T2DM治疗，但多种GIP类似物已被描述为表现出GIP和GLP-1受体活性两者，参见，例如，WO2013164483；WO 2011119657。

在其中本发明的胰高血糖素受体激动剂与GIP-GLP-1共激动剂组合施用的某些优选的实施方案中，所述GIP-GLP-1共激动剂具有以下结构：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQX₃AX₄VQWLIAGGPSSGAPPPS;

其中

X₁是Aib；

X₂是Aib；

X₃是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1或2且b是10至20；

X₄是Phe或1-萘基丙氨酸(1-Nal)；

且C-端氨基酸任选地被酰胺化(SEQ ID NO: 13)，

或其药学上可接受的盐。

在某些优选实施方案中，a是2，b是18；X₄是1-Nal；且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。(SEQ ID NO: 14)。在某些优选实施方案中，a是1，b是18；X₄是Phe；且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。(SEQ ID NO: 15)。可使用技术诸如可用于制备本发明的胰高血糖素受体激动剂的那些，如下文在肽合成实施例中所述来制备此类GIP-GLP-1共激动剂。

当用于本文中时，术语“胰岛素受体激动剂”是指人类胰岛素、或其类似物或衍生物、或能够结合并活化胰岛素受体的任何其他蛋白。可通过本领域已知的方法，包括使用测量胰岛素受体结合活性或受体活化的体内实验和体外测定来测量胰岛素受体活性。胰岛素类似物是当与其结构众所周知的天然人类胰岛素相比时具有包括一个或多个氨基酸取代、缺失、倒置或添加的修饰的分子。胰岛素衍生物是具有天然人类胰岛素或其类似物的氨基酸序列，但额外具有其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基中的一种或多种的至少一个化学修饰的分子。胰岛素融合蛋白是包含胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物部分和第二多肽的异种蛋白。尽管可考虑将任何胰岛素受体激动剂用于其中本发明的胰高血糖素受体激动剂与胰岛素受体激动剂组合施用的实施方案中，但优选的胰岛素受体激动剂是具有基础或延长的作用持续时间的那些。当前可用的具有基础活性的胰岛素受体激动剂包括甘精胰岛素(insulin glargine)、地特胰岛素(insulin detemir)和德谷胰岛素(insulin degludec)，其各自指示每天一次施用。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患者中的T2DM的方法，其包括向需要此治疗的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患者中的肥胖症的方法，其包括向需要此治疗的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患者中的脂肪肝病的方法，其包括向需要此治疗的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患者中的NASH的方法，其包括向需要此治疗的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐。

在其他实施方案中，本发明还提供了治疗患者中的T2DM的方法，其包括向需要此治疗的患者施用有效量的本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐与一种或多种额外治疗剂的组合，所述额外治疗剂诸如GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、胰岛素受体激动剂、胃泌酸调节素、二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、DPP-4抑制剂和SGLT2抑制剂。

当用于本文中时，术语“有需要的患者”是指具有需要治疗的疾病或病况(包括例如T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH和/或代谢综合征)的哺乳动物，优选人类或牛。

当用于本文中时，术语“有效量”是指本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐在单剂量或多剂量施用于患者后，在所诊断或治疗的患者中提供期望效果的量或剂量。有效量可以由本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定。在决定用于患者的有效量时，考虑许多因素，包括但不限于：哺乳动物的物种；其尺寸、年龄和总体健康；所涉及的具体疾病或病症；该疾病或病症的涉及程度或严重程度；个别患者的反应；所施用的特定胰高血糖素受体激动剂；施用模式；所施用的制剂的生物利用度特征；所选择的剂量方案；合并用药的用法；和其他相关情况。

某些本发明的胰高血糖素受体激动剂一般在宽剂量范围内有效。例如，用于每周一次施用的剂量可落在每人每周约0.01至约30mg范围内。本发明的胰高血糖素受体激动剂可每天一次、每周三次、每周两次或每周一次进行施用。每周一次施用是优选的。

如本文中所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”包括抑制、减缓、停止、或逆转现有症状或病症的进展或严重程度。

本发明的氨基酸序列含有二十种天然存在的氨基酸的标准单字母或三字母代码。另外，“Aib”是α氨基异丁酸。本发明还涵盖可用于合成本发明的胰高血糖素受体激动剂或其药学上可接受的盐的新颖中间体和方法。所述中间体和本发明的胰高血糖素受体激动剂可通过本领域已知的多种程序制备。具体而言，以下实施例中说明使用化学合成的方法。所述各途径的具体合成步骤可以不同方式进行组合来制备本发明的胰高血糖素受体激动剂。本领域普通技术人员可容易获得试剂和起始材料。

本发明由以下实施例进一步说明，所述实施例不应被解释为限制性的。

肽合成

实施例1

实施例1是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；X₂是T；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是2且b是16；X₅是E；X₆是T；X₇是GPSSGAPPPS；且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ ID NO: 6)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例1的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

通过固相肽合成使用在Symphony自动肽合成仪(PTI Protein TechnologiesInc.)上进行的Fmoc/t-Bu策略，从RAPP AM-Rink Amide树脂开始并在25℃下使用6当量用二异丙基碳二亚胺(DIC)和羟基苯并三唑(HOBt)活化的氨基酸(1：1：1摩尔比)在二甲基甲酰胺(DMF)中偶联90分钟来生成实施例1的肽。

对于Pro31 (4h)、Trp25 (4h)、Glu24 (4h)、Val23 (10h)、Glu21 (4h)、Aib16(4h)、Asp15 (4h)、Thr7 (4h)、Thr5 (4h)、Gly4 (4h)、Gln3 (4h)和Aib2(24 h)必需延长偶联来改进粗肽的质量。对于Lys20偶联使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH构建嵌段(正交保护基)以允许脂肪酸部分后来在合成方法中的位点特异性连接。采用如上所述的DIC-HOBt方案(24h偶联)并入N-端残基为Boc-Tyr(tBu)-OH。

在完成上述肽-树脂的延长之后，使用催化量的Pd(PPh₃)₄在作为清除剂的PhSiH₃存在的情况下移除Lys20中存在的Alloc保护基。使用Fmoc/t-Bu策略以延伸Lys20侧链的额外偶联/脱保护循环涉及Fmoc-NH-PEG₂-CH₂COOH (ChemPep 目录号280102)、Fmoc-Glu(OH)-OtBu (ChemPep 目录号100703)和HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu。在所有偶联中，在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)4 h。

在25℃下，在含有三氟乙酸(TFA)：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：水：苯甲硫醚90:4:2:2:2 (v/v)的溶液中同时进行从树脂裂解和侧链保护基移除2 h，随后用冷乙醚沉淀。通过反相HPLC色谱以水/乙腈(含有0.05% v/v TFA)梯度在C18柱上将粗肽纯化至>99%纯度(15至20%纯化产率)，其中将合适的级分合并并冻干，得到TFA盐。

在基本上如上所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例1的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1713.6; 计算值M+3H⁺/3 =1714.3; 观察值：M+4H⁺/4=1285.7; 计算值M+4H⁺/4 =1285.9)。

实施例2

实施例2是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中：X₁是Aib，X₂是T；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰；a是2；b是18；X₅是E；X₆是T；X₇是GPSSGAPPPS；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ ID NO: 7)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例2的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

如上文在实施例1中所述类似地合成根据实施例2的肽。在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)4 h来并入HOOC-(CH₂)₁₈-COOtBu。

在基本上如上文对于实施例1所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例2的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1723.2; 计算值M+3H⁺/3 =1723.6;观察值：M+4H⁺/4 =1292.9; 计算值M+4H⁺/4 =1293.0)。

实施例3

实施例3是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中：X₁是Aib；X₂是L；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰；a是2；b是16；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSGAPPPS；且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ ID NO:8)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例3的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

如上文对于实施例1所述类似地合成根据实施例3的肽。

在基本上如上文对于实施例1所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例3的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1717.4; 计算值M+3H⁺/3 =1718.3;观察值：M+4H⁺/4 =1288.3; 计算值M+4H⁺/4 =1289.0)。

实施例4

实施例4是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；X₂是T；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰；a是2；b是16；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSG；且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ ID NO: 9)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例4的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

如上文对于实施例1所述类似地合成根据实施例4的肽。

在基本上如上文对于实施例1所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例4的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1563.7; 计算值M+3H⁺/3 =1564.4;观察值：M+4H⁺/4 =1172.9; 计算值M+4H⁺/4 =1173.6)。

实施例5

实施例5是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；X₂是T；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰；a是2；b是18；X₅是E；X₆是T；且X₇是GPSSG; 且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺(SEQ ID NO: 10)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例5的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

如上文对于实施例1所述类似地合成根据实施例5的肽。

在基本上如上文对于实施例1和2所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例5的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1572.9; 计算值M+3H⁺/3 =1573.8;观察值：M+4H⁺/4 =1179.8; 计算值M+4H⁺/4 =1180.6)。

实施例6

实施例6是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；X₂是T；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰；a是1；b是16；X₅是A；X₆是E；且X₇不存在；且C-端氨基酸是C-端酸(SEQ ID NO: 11)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例6的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

通过固相肽合成使用在Symphony自动肽合成仪(PTI Protein TechnologiesInc.)上进行的Fmoc/t-Bu策略，从Fmoc-L-Glu(OtBu)-Wang树脂(NovaBiochem目录项#856008; 初始负载量0.51 mmol/g)开始并在25℃下使用6当量用二异丙基碳二亚胺(DIC)和羟基苯并三唑(HOBt)活化的氨基酸(1：1：1摩尔比)在二甲基甲酰胺(DMF)中偶联90分钟来生成根据实施例6的肽。

对于Trp25 (4h)、Ala24 (4h)、Val23 (10h)、Glu21 (4h)、Aib16 (4h)、Asp15(4h)、Thr7 (4h)、Thr5 (4h)、Gln3 (4h)和Aib2(24 h)必需延长偶联来改进粗肽的质量。对于Lys20偶联使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH构建嵌段(正交保护基)以允许脂肪酸部分后来在合成方法中的位点特异性连接(4 h偶联时间)。采用如上所述的DIC-HOBt方案(24 h偶联)并入N-端残基为Boc-Tyr(tBu)-OH。

在25℃下，在含有三氟乙酸(TFA)：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：水：苯甲硫醚90:4:2:2:2 (v/v)的溶液中同时进行从树脂裂解和侧链保护基移除2 h，随后用冷乙醚沉淀。通过反相HPLC色谱以水/乙腈(含有0.05% v/v TFA)梯度在C18柱上将粗肽纯化至>99%纯度(15-20%纯化产率)，其中合并和冻干合适的级分。

在基本上如上所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例6的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1382.7; 计算值M+3H⁺/3 =1383.3; 观察值：M+4H⁺/4=1036.6; 计算值M+4H⁺/4 =1037.7)。

实施例7

实施例7是由以下描述表示的胰高血糖素受体激动剂：

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；X₂是T；X₃是Aib；X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰；a是1；b是18；X₅是A；X₆是E；且X₇不存在；且C-端氨基酸是C-端酸(SEQ ID NO: 12)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例7的结构，除了残基Aib2、Aib16和K20以外，其中这些氨基酸残基的结构已被扩大：

。

如上文在实施例6中所述类似地合成根据实施例7的肽。在25℃下在DMF中使用3当量的构建嵌段与PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)4 h来并入HOOC-(CH₂)₁₈-COOtBu。

在基本上如上文在实施例6中所述进行的合成中，通过分析型反相HPLC检查实施例7的纯度，并使用LC/MS证实身份(观察值：M+3H⁺/3 =1391.8; 计算值M+3H⁺/3 =1392.6;观察值：M+4H⁺/4 =1044.3; 计算值M+4H⁺/4 =1044.7)。

体外功能

结合亲和力

测定实施例1-7的肽对重组人类胰高血糖素受体(hGcg-R)、小鼠胰高血糖素受体(mGcg-R)和大鼠胰高血糖素受体(rGcg-R)的结合亲和力。运行使用邻近闪烁测定(SPA)法和从过表达hGcg-R、mGcg-R或rGcg-R的293HEK稳定转染的细胞制备的膜的放射性配体竞争结合测定以测定实施例1-7的肽的平衡解离常数(K_i)。下文描述了实验方案和结果。

人类Gcg受体结合测定利用克隆的hGcg-R (Lok, S, 等人, Gene 140 (2), 203-209 (1994))，其从过表达重组hGcg-R的293HEK细胞分离。hGcg-R cDNA被亚克隆至表达质粒phD中(Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinanthuman protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, BW, 等人, Bio/Technology5: 1189-1192 (1987))。该质粒DNA被转染至293HEK细胞中并用200μg/mL潮霉素进行筛选。

小鼠Gcg受体结合测定利用从293HEK膜分离的克隆的小鼠胰高血糖素受体(mGcgR) (Burcelin R, Li J, Charron MJ. Gene 164 (2), 305-10 (1995) GenBank:L38613)。该mGcgR cDNA被亚克隆至表达质粒pcDNA3.1 (Promega)-ZeoR中。该质粒DNA被转染至293HEK细胞和使用100μg/mL博莱霉素(Zeocin)筛选的克隆系中。

大鼠Gcg受体结合测定利用在从瞬时表达rGcg-R的293HEK细胞分离的膜中克隆的大鼠胰高血糖素受体(rGcg-R) (Svoboda, M, Ciccarelli, E, Tastenoy, M,Robberecht, P, Christophe, J. A cDNA construct allowing the expression of rathepatic glucagon receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1), 135-142(1993), GenBank: L04796)。该rGcg-R cDNA被亚克隆至表达质粒pcDNA3.1 (Promega)-ZeoR中。该质粒DNA被转染至293HEK细胞中并瞬时表达48小时。

使用来自粘附培养物的细胞制备粗的质膜。在冰上在含有50mM Tris HCl，pH 7.5和具有EDTA的Roche Complete™蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液中裂解所述细胞。使用安装有Teflon®研杵的玻璃Potter-Elvehjem均质机破坏细胞悬浮液持续25个冲程。在4℃下以1100 x g离心匀浆物10分钟。收集上清液并储存在冰上，同时将沉淀物再悬浮于低渗缓冲液中并再均质化。将该混合物以1100 x g离心10分钟。将第二上清液与第一上清液合并并在4℃下以35000 x g离心1小时。将膜沉淀物再悬浮于含有蛋白酶抑制剂的均质化缓冲液中，在液氮中快速冷冻并作为等分样品储存在-80℃冰箱中直至使用。

通过I-125-乳过氧化酶程序将Gcg放射性碘化并通过在Perkin-Elmer (NEX207)的反相HPLC纯化。比活性为2200 Ci/mmol。通过匀相竞争或饱和结合分析进行KD测定。估计人类Gcg-R的KD为3.92nM并将其用于计算在hGcg-R测定中所测试的所有化合物的Ki值。估计小鼠Gcg-R的KD为3.52nM并将其用于计算在mGcg-R测定中所测试的所有化合物的Ki值。估计大鼠Gcg-R的KD为21.4nM并将其用于计算在rGcg-R测定中所测试的所有化合物的Ki值。

使用具有小麦胚芽凝集素(WGA)珠粒的邻近闪烁测定(SPA)格式(Perkin Elmer)进行受体结合测定。结合缓冲液含有25mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7.4)、2.5mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1%(w/v)杆菌肽(bacitracin)(Affymetrix)、0.003%(w/v)聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(TWEEN®-20)和无EDTA的Roche Complete™蛋白酶抑制剂。将Gcg (Eli Lilly and Company)溶解于3.48mg/mL(1mM)的DMSO中并以100μL等分样品冷冻储存在-20℃。稀释Gcg等分样品并在一小时内用于结合测定中。将肽类似物溶解于DMSO中并在100% DMSO中连续3倍稀释。接下来，将5μL连续稀释的化合物或DMSO转移至含有45μL测定结合缓冲液或未标记的Gcg对照(NSB最终为1μM)的Corning® 3632透明底测定板中。然后，添加50μL hGcg-R(1.5μg/孔)、mGcg-R(6.47μg/孔)或rGcg-R膜(1.5μg/孔)、50μL I-125Gcg(反应中的最终为0.15nM)和50μL WGA珠粒(150μg/孔)，将板密封并在板振荡器(设置6)上混合1分钟。在室温下12小时的沉降时间后，用 PerkinElmer Trilux MicroBeta®闪烁计数器读板。结果被计算为化合物存在的情况下特异性I-125-Gcg结合的百分比。通过I-125-Gcg的特异性结合百分比对所添加的化合物的浓度的非线性回归导出化合物的绝对IC50浓度。使用Cheng-Prusoff方程(Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol.22, 3099-3108, (1973))将IC50浓度转化为Ki。

实施例1-7的肽和人类Gcg在hGcg-R、mGcg-R和rGcg-R处的Ki在下面提供于表1中。

表 1.

这些数据指示本发明的胰高血糖素受体激动剂在三种不同物种(人类、小鼠和大鼠受体)中以类似于或大于人类胰高血糖素的亲和力结合至胰高血糖素受体。

功能活性和选择性

通过在表达人类胰高血糖素受体(hGcg-R)、人类胰高血糖素样肽-1受体(hGLP-1R)或人类胃抑制肽(也称为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体，hGIP-R)的HEK293细胞中定量细胞内cAMP来测定功能活性和选择性。实验方案和结果描述于下文中。

hGcg-R功能cAMP测定利用表达克隆的hGcg-R的293HEK细胞(Lok, S,等人, Gene140 (2), 203-209 (1994))。hGcg-R cDNA被亚克隆至表达质粒phD中(Trans- activatedexpression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, anantithrombotic factor. Grinnell, BW, 等人, Bio/Technology 5: 1189-1192(1987))。该质粒DNA被转染至293HEK细胞中并用200μg/mL潮霉素筛选细胞。

hGLP-1-R功能cAMP测定利用表达克隆的hGLP-1-R的293HEK细胞(Graziano MP,Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6, 1993)。hGLP-1R cDNA被亚克隆至表达质粒phD中(Trans-activatedexpression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, anantithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J.和Yan, S.B. Bio/Technology 5:1189-1192, 1987)。该质粒DNA被转染至293HEK细胞中并用200μg/mL潮霉素筛选细胞。

hGIP-R功能测定使用克隆至pcDNA3.1 (Promega)-NeoR质粒中的hGIP-R (Usdin,T.B., Gruber,C., Modi,W.和Bonner,T.I., GenBank: AAA84418.1)。该hGIP-R-pcDNA3.1/Neo质粒被转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO-S中，用于悬浮培养，并在500μg/mL遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen)存在的情况下筛选。

用40μL测定体积的补充有1X GlutaMAX^TM(L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽/0.85%NaCl，Gibco目录号35050)、0.1%酪蛋白(Sigma目录号C4765)、250μM IBMX (3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和20mM HEPES [N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)，HyClone目录号SH30237.01]的DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle培养基，Gibco目录号31053)中的肽处理各种受体过表达细胞系。在室温下孵育60分钟后，使用CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF测定试剂盒(CisBio 62AM4PEC)定量测定所得的细胞内cAMP(3',5'-环状单磷酸腺苷)的增加。通过在细胞裂解缓冲液(20μL)中添加cAMP-d2缀合物，随后添加抗体抗-cAMP-Eu³⁺-穴状化合物(也在细胞裂解缓冲液(20μL)中)来检测细胞中的cAMP水平。将所得的竞争性测定在室温下孵育至少60min，随后使用PerkinElmer Envision®仪器在320nm激发和在665nm和620nm发射下进行检测。Envision单位(在665nm/620nm的发射* 10,000)与存在的cAMP量成反比，并使用cAMP标准曲线转化为每孔的nM cAMP。将每个孔中所生成的cAMP的量(nM)转化为用10nM人类GLP-1(7-36)NH₂(对于hGLP-1R测定)、10nM人类Gcg (对于hGcg-R测定)或10nM人类GIP(1-42)NH₂(对于hGIP-R测定)所观察到的最大反应百分比。通过拟合至四参数逻辑方程的非线性回归分析，使用最大反应百分比相对于所添加的肽浓度，推导出相对EC50值和最大百分比（percent top）(Emax)。

实施例1-7、人类GIP(1-42)NH₂、人类GLP-1(7-36)NH₂和人类Gcg的功能数据显示于下表2中。EC50的平均值表示为几何平均值±平均值的标准误差(SEM)，圆括号中指示重复次数(n)。(>)修饰语指示%效力未达到50%，且计算的EC₅₀使用所测试的最高浓度获得。

表 2.

这些数据指示本发明的胰高血糖素受体激动剂在胰高血糖素受体处具有如人类胰高血糖素的相似效力，而相对于GLP-1受体和GIP受体的选择性增加。

药代动力学

大鼠中的药代动力学

以1mL/kg的体积向雄性Sprague Dawley大鼠施用实施例化合物于Tris缓冲液(pH8.0)中的单一皮下剂量(100nmol/kg)。在给药后1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时和240小时时从每只动物采集血液。

通过LC/MS方法测定化合物的血浆浓度。各方法测量完整肽(肽加上连接的时间延长)。对于每次测定，从100%大鼠或猴血浆(50μl)使用甲醇和0.1%甲酸萃取化合物和用作内部标准品(IS)的类似物。在离心后形成两个不同层，其中化合物和IS位于上清液中。将上清液的275μl等分样品转移至热蛋白沉淀板，在所述板中施加真空以收集通过进入96孔板中的液流。

用加热的氮气干燥样品以移除上清液。将150μl体积的30%乙腈和5%甲酸添加至孔以重构该样品。将注入的样品(20μl)上样至Supelco分析型Discovery BIO宽孔径C5-3,5cm X 0.1mm, 3μm柱上。将柱流出物引导至Thermo Q-Exactive质谱仪中用于检测和定量。

在单一100 nmol/kg皮下给药至雄性Sprague Dawley大鼠后的平均药代动力学参数提供于下表3中(对于实施例1、2和5以及对于实施例3和4的Tmax和Cmax，n=3；对于实施例3和4的T_1/2、AU_C0-inf和CL/F，n=2)。

表 3.

缩写：AUC_0-inf=从0至无穷大的曲线下面积，CL/F = 清除率/生物利用度，Tmax =至最大浓度的时间，Cmax =最大血浆浓度，T1/2 = 半衰期，ND =无数据。

这些数据显示实施例1至5相对于天然人类胰高血糖素(其具有约30分钟的T_1/2)具有延长的作用持续时间。

食蟹猴中的药代动力学

以0.25mL/kg的体积向雄性食蟹猴施用测试化合物于Tris缓冲液(pH 8.0)中的单一静脉内(50nmol/kg)或皮下(50nmol/kg)剂量。在给药后0.5小时(仅IV)、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、192小时、240小时、336小时、480小时、576小时、和672小时从每只动物采集血液。由一般如上文在Sprague dawley大鼠研究中所述的LC/MS方法来测定化合物的血浆浓度。

平均(n=2)药代动力学参数提供于下表4中。

表 4.

缩写：AUC_0-inf=从0至无穷大的曲线下面积，CL = 清除率，CL/F = 清除率/生物利用度，Tmax =至最大浓度的时间，C₀ = 外推至时间0小时的浓度，Cmax =最大血浆浓度，T1/2 = 半衰期，NA =不适用。

这些数据显示实施例1和2相对于天然人类胰高血糖素(其具有小于1小时的T_1/2)具有延长的作用持续时间。

体内研究

连续监测大鼠中的葡萄糖

将12-14周龄正常Sprague-Dawley雄性大鼠(HARLAN^TM, Indianapolis, IN)个别圈养于具有12小时光照/黑暗周期的温度受控(24℃)设施中且自由取得食物(TD2014TEKLAD GLOBAL RODENT DIET®, HARLAN^TM Labs, Indianapolis, IN)和水。在适应该设施2周后，对大鼠植入HD-XG发射器(Data Sciences International, St Paul, MN)。

在2%至3%异氟烷(2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷)麻醉下进行发射器植入手术。将发射器的葡萄糖传感器置于降主动脉中。将发射器的温度传感器与发射器本体一起置于腹腔中。在发射器植入手术后七天，将所有大鼠置于遥测接收器上以1分钟时间间隔连续记录血糖和核心体温测量值，同时所述大鼠在其家笼中自由地运动。控制数据获取并通过DATAQUEST A.R.T.^TM系统软件(Data Sciences International, St Paul, MN)分析。在手术后7天，通过腹膜内葡萄糖耐受性测试(ipGTT)实现葡萄糖传感器的初始校准且每隔一天经由通过尾部血液的葡萄糖测量值进行后续校准。从手术后第9-11天开始，通过皮下注射施用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，1mL/Kg体重)中的10 nmol/kg剂量的测试化合物一次。最长达7天监测血糖水平。

血糖数据指示实施例1-7分别导致血糖水平以剂量依赖性方式持续增加。

物理和化学特征

溶解度和稳定性

以5mg/mL在H₂O中制备实施例1-6的样品并如所述透析至缓冲液C6N (10mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 6)、C7N (10mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 7)、H6.5N (10mM组氨酸、100mM NaCl，pH 6.5)和H7.5N (10mM组氨酸、100mM NaCl，pH 7.5)中。如所述将样品浓缩至10mg/mL肽并保持在4℃持续一周。如所述目测并通过SEC-HPLC评估样品。

在4℃下一周后，所有制剂中的实施例1至6都是澄清且无色的。SEC-HPLC数据提供于表5中。未发生高分子量(HMW)聚合物的显著生长或主峰消失。对于实施例1-6，通过SEC-HPLC的回收率在5%内。

表 5.

还在三种额外制剂中评估实施例1至2的溶解度：T7 (10mM Tris-HCl, pH 7)、T7Tm (10mM Tris-HCl、0.02%聚山梨醇酯-20、29mM间甲酚，pH 7)和T7Nm (10mM Tris-HCl、100mM NaCl、29mM间甲酚，pH 7)。在T7中如所述经由透析制备化合物。如所述，以2mg/mL在T7、T7Tm或T7Nm中配制样品，然后浓缩至10mg/mL肽。将制剂在4℃下保持一周且如所述目测并通过SEC-HPLC和RP-HPLC评估。

所有制剂都保持澄清且无色。SEC-HPLC和RP-HPLC数据在表6中。对于任何制剂，HMW聚合物生长都不超过0.2%。对于所有制剂，通过RP-HPLC的峰回收率在5%内。

表 6.

这些数据指示实施例1至6在不同缓冲液条件下具有可接受的溶解度特性。

化学稳定性

在各种pH值的不同缓冲液中测定实施例1的化学稳定性。在H₂O中制备至5mg/mL浓度的样品，在4℃下使用Slide-A-Lyzer透析盒，2000 MWCO(部件号66203)透析过夜至目标缓冲液中，通过0.22μm过滤器(Millex, SLGV013SL)过滤，然后在各自缓冲液中稀释至1mg/mL。缓冲液组成为10mM Tris-HCl/H₂O pH 8 (T8)、10mM Tris-HCl/H₂O pH 7 (T7)、10mM组氨酸/H₂O pH 7 (H7)或10mM柠檬酸盐/H₂O pH 6 (C6)。将各1mg/mL样品转移至三个小瓶。将样品维持在4℃、25℃和40℃。总共四周每两周评估样品。目测评估样品的浊度和相分离。通过分析型反相HPLC(RP-HPLC)在60℃加热的Waters Symmetry Shield RP18,3.5μm, 4.6 X100mm柱(部件号18600179)上用经3min为10% B等度，经3min为30% B，经30min从30%至60%B和经2min为95% B的AB (A=0.1% TFA/H₂O，B=0.085% TFA/乙腈)梯度以流速0.9mL/min(波长为214nm)评估化合物的稳定性。还通过尺寸排除HPLC (SEC-HPLC)在胰岛素HMWP，7.8 X300mm柱(部件号WAT2015549)上用20mM磷酸钠、20%乙腈，pH 7.2的运行缓冲液以0.5mL/min的流速运行40min来评估稳定性。

物理外观是澄清至无色的，且对于实施例1，在pH 7和pH 8下无乳白色或颗粒。RP-HPLC和SEC-HPLC结果概述于下表7中。通过RP-HPLC和SEC-HPLC的回收率在5%内，这是可接受的。

表 7.

还通过液相色谱-质谱法(LC-MS)分析保持在4℃和40℃下四周的在T8缓冲液中的样品。对于实施例1，在pH 8下未鉴定到降解的主要位点。总之，实施例1的化学稳定性指示在所测试的缓冲液条件下优异的稳定性。

物理稳定性

经由在T7缓冲液中透析来制备实施例1的测试样品，然后如所述以2mg/mL肽在T7m、T7Nm和T7Tm中配制。将各制剂转移至干净玻璃小瓶并在室温下以400rpm经由特氟龙(Teflon)涂覆的磁性搅拌子(magnetic flee)搅拌6小时。取100μL的等分样品以用于在时间0、1小时、3小时和6小时时的评估。如前文目测并通过SEC-HPLC评估样品。

所有制剂保持澄清且无色，未出现乳白色或沉淀。如表8中所示，对于所有制剂，SEC-HPLC的主峰中肽的百分比保持在5%内。数据指示实施例1在所测试条件下具有良好的物理稳定性特征。

表 8.

组合研究

与GIP-GLP-1共激动剂或GLP-1R激动剂的共制剂中的活性

如下文在稳定性研究中所述制备实施例1和3与SEQ ID NO: 15的GIP-GLP-1共激动剂或杜拉鲁肽的共制剂，并使用上文所述的方法测定个别化合物和共制剂的活性。数据显示于表9和10中。(>)修饰语指示%效力未达到50%且计算的EC₅₀使用所测试的最高浓度获得。

表 9.

表 10.

这些数据指示在应激和非应激条件下和/或与GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂组合来维持实施例1和3的生物活性。

与GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂的组合的体内研究

在C57/BL6饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中测试本发明的胰高血糖素受体激动剂与长效GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂的组合的效应。GIP-GLP-1共激动剂具有如上所述的SEQ ID NO: 14的结构。GLP-1R激动剂为WO2005000892中所述的GLP-1-Fc融合体。一般如下文在共制剂稳定性研究中所述来制备共制剂。

尽管C57/BL6 DIO动物不是糖尿病性的，但在以高脂肪(60%千卡来自脂肪)饮食饲养12周后仍表现出胰岛素抗性、血脂异常、和肝脂肪变性，即代谢综合征的所有特征。因此，在这些动物中的研究可用于研究所提出的治疗剂对参数诸如体重减轻、身体组成和肝脂肪变性的效果。

使用称重为42-47g且具有范围为11.9g至17.2g的初始脂肪质量的20至21周龄雄性DIO C57/B16雄性小鼠。将动物个别地圈养在具有12小时光照/黑暗周期(22：00开灯)的温度受控(24℃)的设施中，可自由取得食物和水。适应该设施2周后，基于体重将小鼠随机分成处理组(n=5/组)，因此各个组具有相似的起始平均体重。

每三天在开始黑暗周期前30至90分钟期间通过SC注射施用媒介物、溶解于媒介物(20mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0)中的测试化合物(剂量范围为3至10nmol/kg)、GLP-1R激动剂(10nmol/kg)、GIP-GLP-1共激动剂(10nmol/kg)或其组合(剂量范围为3至10nmol/kg)至任意进食的小鼠持续15天。在第1天、第4天、第7天、第10天和第13天进行SC注射。在整个研究中测量每日体重、食物摄入和葡萄糖。通过减去同一动物在第一次注射分子前的体重来计算绝对体重变化。在第0天和第14天，通过使用Echo医学系统(Houston, TX)仪器的核磁共振(NMR)测量总脂肪质量。

用Accu-Chek血糖仪(Roche)测量来自尾静脉血的每日血糖。在研究结束时，将动物处死且取出肝脏并冷冻。从处死时所收集的肝脏匀浆测定肝脏甘油三酯，和在HitachiModular P临床分析仪上测量血浆胆固醇。使用单因子ANOVA和随后的Dunnett氏多重比较检验完成各组间的统计学比较。在GraphPad Prism中使用非线性拟合工具测定体重减轻降低的ED₅₀值。

如上文所述进行的研究的体重减轻和脂肪质量改变百分比数据提供于下表11(实施例1)和12(实施例1和2)中。表11中的结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM，表12中的结果表示为每组6只小鼠的平均值±SEM。

与单独的实施例1或2、GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂的效果相比，实施例1和2与GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂中任一者的组合对体重和脂肪质量具有协同效应(表11和12)。

表 11.

与媒介物对照组相比，*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001和****p<0.0001显著的(单因子ANOVA, Dunnett’s)。

表 12.

与媒介物对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001显著的(单因子ANOVA, Dunnett’s)。

关于对血糖、血浆胆固醇和肝脏甘油三酯的效果的数据提供于下表13(平均值±SEM，n=5)和14(平均值±SEM，n=6)中。然而，个别施用的实施例1和2以剂量依赖性方式增加血糖，此类实施例胰高血糖素受体激动剂与GLP-1R激动剂或GIP-GLP-1共激动剂中任一者的组合降低血糖、血浆胆固醇和肝脏甘油三酯。

表 13.

与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 (单因子ANOVA, Dunnett’s)。

表 14.

与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 (单因子ANOVA，Dunnett’s)。

与GIP-GLP-1共激动剂的共制剂中的稳定性

如所述制备实施例1和3的样品并针对T7透析。分别以1mg/mL肽在T7、T7m、T7N和T7Nm中配制两种实施例。还如针对实施例胰高血糖素受体激动剂所述制备SEQ ID NO: 15的GIP-GLP-1共激动剂并针对T7透析。以1mg/mL肽在T7、T7m和T7Nm中配制GIP-GLP-1共激动剂。还制备含有 1mg/mL实施例1和1mg/mL GIP-GLP-1共激动剂或1mg/mL实施例3和1mg/mLGIP-GLP-1共激动剂的共配制的样品并在T7、T7m、T7N和T7Nm中进行配制。将每种配制的样品转移至三个小瓶。将样品维持在4℃、25℃和40℃。每两周共四周评估样品。目测评估样品的浊度和相分离。通过如上文针对单一药剂制剂所述的RP-HPLC评估稳定性。所述RP-HPLC方法提供实施例化合物和GIP-GLP-1共激动剂主峰以及在pH 9和40℃下对样品施加应激（stressing）3天所产生的所有降解峰的良好分离。

通过RP-HPLC的所有样品的总峰回收率在5%内。所有制剂保持澄清且无色，未产生乳白色或沉淀。其4周后如通过RP-HPLC观察到的各自主峰中肽的百分比改变概述于表15中。在所有测试的制剂中，实施例1在配制为单一药剂时相比于与GIP-GLP-1共激动剂的共制剂而言，主峰的百分比损失无明显改变。GIP-GLP-1共激动剂在配制为单一药剂时相比于与实施例1或实施例3中任一者的共制剂而言表现出主峰百分比一致的损失。数据指示实施例1和3在配制为单一药剂或与GIP-GLP-1共激动剂共配制时具有可接受的稳定性，且实施例1和3不会不利地影响共制剂中的GIP-GLP-1共激动剂的稳定性。

表 15.

还通过LC-MS评估在4℃和40℃下孵育四周的在T7Nm中配制的实施例1、GIP-GLP-1共激动剂和其组合、和在T7中配制的实施例1和GIP-GLP-1共激动剂的组合的样品。未鉴定出降解的主要位点。对于实施例1和GIP-GLP-1共激动剂两者，对于单一药剂制剂相对于共制剂，化学修饰无明显差异。

与GLP-1R激动剂的共制剂中的稳定性

制备实施例1和3并使用如上文针对制备入T7缓冲液所述的相同方法针对C6.5(10mM柠檬酸盐，pH 6.5)透析。分别以1mg/mL肽在缓冲液C6.5、C6.5M (10mM柠檬酸盐、46.4mg/mL D-甘露醇，pH 6.5)、C6.5T (10mM柠檬酸盐、0.02%聚山梨醇酯-80，pH 6.5)和C6.5MT (10mM柠檬酸盐、46.4mg/mL D-甘露醇、0.02%聚山梨醇酯-80，pH 6.5)中配制化合物。使用储备浓度为46.5mg/mL的于C6.5中的杜拉鲁肽以配制C6.5和C6.5MT中的3mg/mL的杜拉鲁肽。制备具有3mg/mL杜拉鲁肽和1mg/mL实施例1、或3mg/mL杜拉鲁肽和1mg/mL实施例3在C6.5MT中的共制剂。将每种配制的样品转移至三个小瓶并维持在4℃、25℃和40℃。每两周共四周评估样品。目测评估样品的浊度和相分离。通过如上所述的RP-HPLC和SEC-HPLC评估稳定性。两种所述的HPLC方法提供实施例化合物和杜拉鲁肽主峰以及通过在pH 9和40℃下对样品施加应激3天所产生的所有降解峰的良好分离。

通过RP-HPLC和SEC-HPLC，所有稳定性样品的总峰回收率在5%内。所有制剂都保持澄清且无色，未产生乳白色或沉淀。其如四周后通过SEC-HPLC观察到的各自主峰中化合物的百分比改变概述于表16中。实施例1和3一般稳定且未显示主峰的明显损失。实施例1在与杜拉鲁肽共配制时相比于单一药剂制剂未表现出更低的稳定性。实施例3在与杜拉鲁肽的共制剂中相比于单一药剂制剂表现出略微更低的稳定性。GLP-1R激动剂在与实施例1或3中任一者共配制时相比于单一药剂制剂未表现出更低的稳定性。

表16.

如通过RP-HPLC所观察到的，稳定性趋势类似于通过SEC-HPLC所观察到的那些。其四周后如通过RP-HPLC观察到的各自主峰中化合物的百分比改变概述于表17中。实施例1和3一般稳定且未显示主峰明显损失。实施例1在与GLP-1R激动剂共配制时相比于单一药剂制剂未表现出更低的稳定性。实施例3在与GLP-1R激动剂的共制剂中相比于单一药剂制剂表现出略微更低的稳定性。GLP-1R激动剂在与任一实施例共配制时相比于单一药剂制剂未显示更低的稳定性。

表 17.

*数据由于仪器误差而无法获得。

序列

SEQ ID NO: 1 –人类胰高血糖素

SEQ ID NO: 2 –人类GLP-1

SEQ ID NO: 3 –人类OXM

SEQ ID NO: 4 –人类GIP

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ

SEQ ID NO: 5 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中

X₁是Aib；

X₂是T或L；

X₃是Aib；

X₅是E或A；

X₆是T或E；

X₇不存在，或者是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；

且C-端氨基酸任选地被酰胺化。

SEQ ID NO: 6 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中

X₁是Aib；

X₂是T；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是2且b是16；

X₅是E；

X₆是T；

X₇是GPSSGAPPPS；

且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 7 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中：

X₁是Aib,

X₂是T；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是2且b是18；

X₅是E；

X₆是T；

X₇是GPSSGAPPPS；

且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 8 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中：

X₁是Aib；

X₂是L；

X₃是Aib；

X₅是E；

X₆是T；且

X₇是GPSSGAPPPS；

且其中C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 9 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；

X₂是T；

X₃是Aib；

X₅是E；

X₆是T；且

X₇是GPSSG；

且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 10 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中X₁是Aib；

X₂是T；

X₃是Aib；

X₅是E；

X₆是T；且

X₇是GPSSG；

且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 11 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中

X₁是Aib；

X₂是T；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1且b是16；

X₅是A；

X₆是E；

X₇不存在；且

C-端氨基酸是C-端酸。

SEQ ID NO: 12 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中

X₁是Aib；

X₂是T；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1且b是18；

X₅是A；

X₆是E；

X₇不存在；且

C-端氨基酸是C-端酸。

SEQ ID NO: 13 – GIP-GLP共激动剂

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQX₃AX₄VQWLIAGGPSSGAPPPS；

其中

X₁是Aib；

X₂是Aib；

X₃是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，

其中a是1或2且b是10至20；

X₄是Phe或1-萘基丙氨酸(1-Nal)；

且C-端氨基酸任选地被酰胺化。

SEQ ID NO: 14 – GIP-GLP共激动剂

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQX₃AX₄VQWLIAGGPSSGAPPPS；

其中

X₁是Aib；

X₂是Aib；

X₃是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是2且b是18；

X₄是1-Nal；

且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 15 – GIP-GLP共激动剂

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQX₃AX₄VQWLIAGGPSSGAPPPS；

其中

X₁是Aib；

X₂是Aib；

X₃是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1且b是18；

X₄是Phe；

且C-端氨基酸被酰胺化为C-端伯酰胺。

SEQ ID NO: 16 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中

X₁是Aib；

X₂是T或L；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，

其中a是2且b是14至24；

X₅是E；

X₆是T；

X₇是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；

且C-端氨基酸被酰胺化。

SEQ ID NO: 17 –胰高血糖素受体激动剂

YX₁QGTFX₂SDYSKYLDX₃KKAX₄EFVX₅WLLEX₆X₇

其中

X₁是Aib；

X₂是T；

X₃是Aib；

X₄是K，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)_a-CO-(CH₂)_b-CO₂H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1且b是14至24；

X₅是A；

X₆是E；且

X₇不存在。

序列表

<110> ELI LILLY AND COMPANY

<120> 胰高血糖素受体激动剂

<130> X20416

<150> 62/246,199

<151> 2015-10-26

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn

20 25 30

Arg Asn Asn Ile Ala

35

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 位置7的Xaa是Thr或Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是Lys，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H缀合至Lys侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1或2且b是14至24

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> 位置24的Xaa是Glu或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> 位置29的Xaa是Thr或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (30)..(30)

<223> 位置30的Xaa或者不存在，或者是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽，且C-端氨基酸任选地被酰胺化

<400> 5

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Xaa Trp Leu Leu Glu Xaa Xaa

20 25 30

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是Lys，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H缀合至Lys侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是2且b是16。

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 位置39的Ser被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 6

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 7

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是Lys，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H缀合至Lys侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，

其中a是2且b是18

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 位置39的Ser被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 7

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 8

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

其中a是2且b是16

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 位置39的Ser被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 8

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Leu Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 9

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

其中a是2且b是16

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 位置34的Gly被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 9

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly

<210> 10

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

其中a是2且b是18

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 位置34的Gly被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 10

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

其中a是1且b是16

<220>

<221> MOD_RES

<222> (29)..(29)

<223> 位置29的Glu是C-端酸

<400> 11

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Ala Trp Leu Leu Glu Glu

20 25

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

其中a是1且b是18

<220>

<221> MOD_RES

<222> (29)..(29)

<223> 位置29的Glu是C-端酸。

<400> 12

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Ala Trp Leu Leu Glu Glu

20 25

<210> 13

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> 位置13的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是Lys，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H缀合至Lys侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1或2且b是10至20

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(22)

<223> 位置22的Xaa是Phe或1-萘基丙氨酸(1-Nal)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 位置39的Ser任选地被酰胺化

<400> 13

Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys

1 5 10 15

Ile Ala Gln Xaa Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 14

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> 位置13的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

其中a是2且b是18

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(22)

<223> 位置22的Xaa是1-Nal

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 位置39的Ser被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 14

Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys

1 5 10 15

Ile Ala Gln Xaa Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 15

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> 位置13的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

其中a是1且b是18

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 位置29的Ser被酰胺化为C-端伯酰胺

<400> 15

Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys

1 5 10 15

Ile Ala Gln Xaa Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 16

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 位置7的Xaa是Thr或Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是Lys，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H缀合至Lys侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是2且b是14至24

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> 位置24的Xaa是Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> 位置29的Xaa是Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (30)..(30)

<223> 位置30的Xaa是选自GPSSGAPPPS和GPSSG的肽；且C-端氨基酸被酰胺化

<400> 16

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Xaa Trp Leu Leu Glu Xaa Xaa

20 25 30

<210> 17

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 位置2的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 位置7的Xaa是Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 位置16的Xaa是α氨基异丁酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 位置20的Xaa是Lys，其通过用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H缀合至K侧链的ε-氨基基团进行化学修饰，其中a是1且b是14至24

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> 位置24的Xaa是Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> 位置29的Xaa是Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (30)..(30)

<223> 位置30的Xaa不存在

<400> 17

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Xaa Trp Leu Leu Glu Xaa Xaa

20 25 30

Claims

1.胰高血糖素受体激动剂化合物，其选自SEQ NO:6、SEQ NO:7、SEQ NO:8、SEQ NO:9、SEQ NO:10、SEQ NO:11或SEQ NO:12。

2.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物，其用于治疗中。

3.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物，其用于治疗T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NAFLD、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症或夜间低血糖症。

4.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物，其用于与一种或多种选自GLP-1R激动剂、GIP-GLP-1共激动剂和胰岛素受体激动剂的额外治疗剂同时、分开或依次组合使用以用于治疗T2DM、肥胖症、NAFLD、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症或夜间低血糖症。

5.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物，其用于与杜拉鲁肽同时、分开或依次组合使用以用于治疗T2DM、肥胖症、NAFLD、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症或夜间低血糖症。

6.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物，其用于与具有SEQ ID NO:15的结构的GIP-GLP-1共激动剂同时、分开或依次组合使用以用于治疗T2DM、肥胖症、NAFLD、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症或夜间低血糖症。

7.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物，其中所述胰高血糖素受体激动剂在胰高血糖素受体处的活性是所述胰高血糖素受体激动剂在GLP-1受体处的效力的至少100倍。

8.药物组合物，其包含权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.权利要求8的药物组合物，其进一步包含额外治疗剂。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述额外治疗剂是GLP-1R激动剂。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述GLP-1R激动剂是杜拉鲁肽。

12.权利要求9的药物组合物，其中所述额外治疗剂是GIP-GLP-1共激动剂。

13.权利要求12的药物组合物，其中所述GIP-GLP-1共激动剂具有SEQ ID NO:15的结构。

14.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物在制备用于治疗选自T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH、血脂异常、代谢综合征、高胰岛素血症和夜间低血糖症的疾病的药物中的用途。

15.权利要求14的用途，其进一步包括施用有效量的一种或多种额外治疗剂。

16.权利要求15的用途，其中所述额外治疗剂是GLP-1R激动剂。

17.权利要求16的用途，其中所述GLP-1R激动剂是杜拉鲁肽。

18.权利要求15的用途，其中所述额外治疗剂是GIP-GLP-1共激动剂。

19.权利要求18的用途，其中所述GIP-GLP-1共激动剂具有SEQ ID NO:15的结构。

20.权利要求1的胰高血糖素受体激动剂化合物在制备用于诱导非治疗性体重减轻的药物中的用途。