KR20180053747A - 글루카곤 수용체 효능제 - Google Patents

글루카곤 수용체 효능제 Download PDF

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KR20180053747A
KR20180053747A KR1020187011338A KR20187011338A KR20180053747A KR 20180053747 A KR20180053747 A KR 20180053747A KR 1020187011338 A KR1020187011338 A KR 1020187011338A KR 20187011338 A KR20187011338 A KR 20187011338A KR 20180053747 A KR20180053747 A KR 20180053747A
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glucagon receptor
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glucagon
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태머 코스쿤
조르즈 알시나-페르난데즈
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 천연 글루카곤과 비교하여 글루카곤 수용체에서 연장된 작용 지속기간을 갖는 화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 연장된 기간에 걸쳐 글루카곤 수용체에 대해 선택적으로 효능작용하도록 도입된, 천연 글루카곤의 구조에 대해 변형을 갖는 글루카곤 수용체 효능제가 제공된다.

Description

글루카곤 수용체 효능제
본 발명은 천연 글루카곤과 비교하여 글루카곤 수용체에서 연장된 작용 지속기간을 갖는 화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 연장된 기간에 걸쳐 글루카곤 수용체에 대해 선택적으로 효능작용하도록 도입된, 천연 글루카곤 구조에 대한 변형을 갖는 글루카곤 수용체 효능제가 제공된다. 글루카곤 수용체 효능제는 제2형 당뇨병 (T2DM) 및/또는 비만과 같은 장애를 치료하기 위해 다른 치료제와 조합되어, 또는 비만, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알콜성 지방간염 (NASH), 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 및/또는 야간 저혈당증, 뿐만 아니라 젖소의 지방간 증후군과 같은 다양한 장애를 치료하기 위해 단독요법으로서 유용할 수 있다.
과거 수십년에 걸쳐, 당뇨병의 유병률은 계속해서 상승하고 있다. T2DM은 당뇨병의 가장 흔한 형태로 전체 당뇨병의 대략 90%를 차지한다. T2DM은 인슐린 저항성에 의해 유발된 높은 혈액 글루코스 수준을 특징으로 한다. T2DM에 대한 현행 표준 관리는 식이 및 운동, 및 인크레틴-계 요법, 예컨대 글루카곤-유사-펩티드-1 (GLP-1) 수용체 효능제 및 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV) 억제제를 포함한, 주사가능한 글루코스 강하 약물 및 경구 의약에 의한 치료를 포함한다. 경구 의약 및 인크레틴-계 요법에 의한 치료가 불충분한 경우에, 인슐린에 의한 치료가 고려된다. 인슐린 요법이 필요한 지점까지 질환이 진행한 환자에게는, 필요에 따라, 일부 경우에 신속-작용 인슐린의 식사시간 주사가 포함될 수 있지만, 일반적으로 장기-작용, 기저 인슐린의 1일 1회 주사가 시작된다.
이들 요법의 이용가능성에도 불구하고, T2DM을 갖는 많은 환자에서 혈액 글루코스 수준은 여전히 불충분하게 제어되고 있다. 비제어 당뇨병은 환자의 이환율 및 사망률에 영향을 미치는 여러 상태를 야기한다. T2DM의 주요 위험 요인 중 하나는 비만이다. 대부분의 T2DM 환자 (~90%)는 과체중이거나 비만이다. 신체 지방증의 감소는 고혈당증 및 심혈관 사건을 포함한 비만-연관 동반이환율의 개선으로 이어질 것이라는 것이 문서화되어 있다. 따라서, 보다 우수한 질환 관리를 위해 글루코스 조절 및 체중 감소에서 효과적인 요법이 필요하다.
또한, 간에의 지방 축적과 연관된 간 장애 집단을 지칭하는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 및 염증, 간세포 손상 및 섬유증과 같은 조직학적 소견을 특징으로 하는 NALFD의 중증 형태인 비알콜성 지방간염 (NASH)의 유병률 및 인식이 또한 계속해서 상승하고 있다. NASH는 서구 국가에서 가장 흔한 간 질환이고, 미국에서 성인의 3-5%에 영향을 미친다. 치료는 전형적으로 식이 및 운동에서의 처방된 변화를 포함하고, 간 지방을 감소시키기 위해 비만치료 수술, 피오글리타존, 스타틴, 오메가 3 및 비타민 E 요법 (비-당뇨병성 NASH 환자의 경우)을 수반할 수 있지만, NASH와 연관된 염증 및/또는 섬유증을 해결하기 위해 승인된 어떠한 치료제도 존재하지 않는다. 따라서 추가의 요법이 필요하다.
글루카곤을 포함하여 치료제로서 이용가능하고/거나 개발 중인 여러 펩티드는 프리-프로글루카곤으로부터 유도되며, 이는 조직에서 프로세싱되어 여러 구조적으로 관련된 펩티드를 형성하는 폴리펩티드이다. 글루카곤은 하기 아미노산 서열: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)를 갖는 프리-프로글루카곤의 아미노산 53에서 81에 상응하는 29-아미노산 펩티드이다. 글루카곤은 간세포 상의 글루카곤 수용체에 결합하여 이를 활성화함으로써, 간이 글리코겐분해로 불리는 과정을 통해 - 글리코겐 형태로 저장되어 있는 - 글루코스를 방출하도록 하여 혈액 중 글루코스의 수준을 유지시키는 것을 돕는다. 글리코겐 저장이 고갈됨에 따라, 글루카곤은 간이 글루코스신생에 의해 추가의 글루코스를 합성하도록 자극한다. 이 글루코스는 혈류로 방출되어 저혈당증의 발생을 방지한다. 글루카곤의 투여는 급성 저혈당증을 치료하기 위한 확립된 요법이고, 응급 글루카곤 투여는 투여의 수분 내에 정상 글루코스 수준을 회복시킬 수 있다. 특정 글루카곤 유사체가 개선된 용해도 및 안정성을 나타내는 것으로 기재되어 있다. 예를 들어, WO2015094875; WO2015094876; WO2015094878을 참조한다.
프리-프로글루카곤으로부터 유도된 다른 펩티드는 GLP-1, 글루카곤-유사-펩티드-2 (GLP-2), 및 옥신토모듈린 (OXM)을 포함한다. GLP-1은 36개의 아미노산 펩티드로, 그의 주요 생물학적 활성 단편 (GLP-17- 36)은 하기 아미노산 서열: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (서열식별번호: 2)을 갖는, 프리-프로글루카곤의 아미노산 98에서 127에 상응하는 30-아미노산, C-말단 아미드화 펩티드로서 생산된다. 글루카곤은 글루코스의 방출을 자극하여 저혈당증을 방지하는 반면에, GLP-1 (서열식별번호: 2)은 인슐린 합성 및 분비를 자극하고, 당뇨병환자에서 고혈당증을 방지하는 것으로 제시된 바 있다. 엑세나티드, 리라글루티드, 알비글루티드 및 둘라글루티드를 포함한 다양한 GLP-1 유사체가 현재 이용가능하다.
OXM은 하기 아미노산 서열: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (서열식별번호: 3)를 갖는, 옥타펩티드 카르복시 말단 연장 (프리-프로글루카곤의 아미노산 82에서 89, "개재 펩티드 1" 또는 IP-1로 불림)과 함께 글루카곤의 완전한 29개의 아미노산 서열로 구성된 37개의 아미노산 펩티드이다. OXM은 글루카곤 및 GLP-1 수용체 둘 다를 활성화하며, GLP-1 수용체에 비해 글루카곤 수용체에 대해 약간 더 높은 효력을 갖는다. 이중 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체 활성을 갖는 OXM의 유사체가 기재된 바 있다. 예를 들어, WO2011087672; WO2011087671을 참조한다.
프리-프로글루카곤으로부터 유도되지 않았지만, 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 (GIP)는 글루코스의 존재 하에 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 자극함으로써 글루코스 항상성에서 생리학적 역할을 하는 또 다른 펩티드이다. GIP는 하기 아미노산 서열: YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ (서열식별번호: 4)을 갖는 42개의 아미노산 펩티드이다. GIP 및 GLP-1 수용체 활성 둘 다를 나타내는 것으로서 GIP의 특정 유사체가 기재된 바 있다. 예를 들어, WO2015067715; WO2011119657; WO2013164483을 참조한다.
또한, 상기 기재된 OXM의 이중 활성과 유사하게, 글루카곤 수용체에서 뿐만 아니라 GLP-1 또는 GIP 수용체 중 1개 이상에서 공동-효능제 활성을 갖는 것으로서 특정 글루카곤 유사체가 기재된 바 있다. 예를 들어, WO2011075393 및 WO 2012177444는 글루카곤 및 GLP-1 수용체 둘 다에서 활성을 갖는 글루카곤 유사체를 기재하는 것을 취지로 한다. 유사하게, WO2013192130은 GIP 수용체에서 또한 활성을 갖는 글루카곤 유사체를 기재하는 것을 취지로 한다. 또한, WO2015067716은 각각의 글루카곤, GLP-1 및 GIP 수용체에서 3중 효능제 활성을 갖는 유사체를 기재하는 것을 취지로 한다.
T2DM 및/또는 비만 요법으로서 제안되는 다양한 펩티드 및 단백질에도 불구하고, 현재 이용가능하고/거나 개발 중인 요법은 제한을 갖는다. 특히, 상기 기재된 이중 또는 삼중 효능제는 글루카곤 수용체 효능제의 대사 이익과 함께 GLP-1 수용체 및/또는 GIP 수용체 효능제의 글루코스-저하 특성을 제공하는 것으로 언급될 수 있지만, 이들이 효능작용하는 각각의 다양한 수용체에서의 이러한 펩티드의 활성 수준은 고정되어 있어서, 생체내에서 최소 부작용을 가지면서 높은 효능을 수득하기 위해 이상적인 수용체 활성화 균형을 달성하는 것을 어렵게 만든다. 그리고 글루카곤 수용체 효능작용을 수반하지 않는 요법은 이러한 작용 메카니즘의 잠재적 대사 이익이 결여된다.
글루카곤의 병용 투여는 이러한 제한을 이론적으로 감쇠시킬 수 있지만, 현재 이용가능한 글루카곤 제품은 이러한 적용분야에 사용하기에 비실용적이다. 특히, 글루카곤의 혈장 반감기는 1시간 미만이어서, 만성 사용에, 특히 이용가능하고/거나 개발 중인 다른 요법과의 조합을 수반하는 실시양태에서 이를 비실용적이게 만드는데, 이는 많은 이러한 요법이 1일 1회로 덜 빈번하게 투여되고, 일부는 1주-1회로 덜 빈번하게 투여할 것이 제안되기 때문이다. 또한, 야생형 글루카곤은 GLP-1 수용체에서 또한 일부 활성을 가지며, 이는 다른 화합물이 그의 다운 GLP-1 수용체 활성을 갖는 조합 요법에서 글루카곤 대 GLP-1 수용체 활성의 적절한 균형을 도출하고자 하는 노력을 복잡하게 할 수 있다. 또한, 현재 이용가능한 글루카곤 제품의 용해도 및 화학적 및 물리적 안정성 특징은 이러한 적용분야에서 만성 사용에 또한 부적절하고, 이는 다른 치료제와의 공동-제제화를 불가능하게 할 것이다.
따라서, 1일 1회, 1주-3회, 1주-2회, 또는 1주 1회의 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는 연장된 작용 지속기간을 갖는 글루카곤 수용체 효능제에 대한 필요가 존재한다. 또한, 글루카곤 수용체에서 강력한 활성을 갖고, 글루카곤 수용체 대비 GLP-1 수용체에서의 활성에 대해 높은 선택성을 갖는 글루카곤 수용체 효능제에 대한 필요가 존재한다. 또한, 다른 치료제와 공동-제제화되는데 적합한 특징을 갖는 글루카곤 수용체 효능제에 대한 필요가 존재한다. 또한, 장기간 저장 및 사용을 가능하게 하는 용해도 및 안정성 특징을 갖는 글루카곤 수용체 효능제에 대한 필요가 존재한다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제는 이들 필요를 충족시키고자 한다. 따라서, 본 발명은 1일 1회, 1주-3회, 1주-2회, 또는 1주 1회의 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는 연장된 작용 지속기간을 갖는 글루카곤 수용체 효능제를 제공한다. 본 발명은 예를 들어 GLP-1 및/또는 GIP 수용체와 비교하여 글루카곤 수용체에서 최적 및 선택적 활성을 갖는 글루카곤 수용체 효능제를 제공한다. 본 발명은 만성 사용 및 다른 치료와의 공동-제제화에 적합한 물리적 및 화학적 특징을 갖는 글루카곤 수용체 효능제를 제공한다. 본 발명은, 다른 당뇨병 치료와 조합하여 사용한 경우에 증진된 글루코스 제어, 다른 당뇨병 치료와 조합하여 사용한 경우에 대사 이익, 예컨대 체중 저하 및/또는 지질 이익, 예컨대 PCSK9 저하를 발생시키는 글루카곤 수용체 효능제를 제공한다. 특히, 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제와 GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제의 조합은 체중 감소 및 신체 조성과 같은 척도에 대해 유익한 상승작용적 효과를 갖는다. 본 발명은 또한 단독요법으로서 및/또는 다른 요법과 조합하여 사용한 경우에 비만, NAFLD, NASH, 이상지혈증, 대사 장애, 고인슐린혈증 및/또는 야간 저혈당증을 포함한 다른 장애를 위한 효과적인 치료를 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 화학식 I을 포함하는 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7 [화학식 I]
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T 또는 L이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 14 내지 24이고;
X5는 E 또는 A이고;
X6은 T 또는 E이고;
X7은 부재하거나, 또는 GPSSGAPPPS 및 GPSSG로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;
C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다 (서열식별번호: 5).
본 발명의 또 다른 실시양태는 화학식 I로 이루어진 화학식을 포함하는 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7 [화학식 I]
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T 또는 L이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 14 내지 24이고;
X5는 E 또는 A이고;
X6은 T 또는 E이고;
X7은 부재하거나, 또는 GPSSGAPPPS 및 GPSSG로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;
C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다 (서열식별번호: 5).
본 발명의 또 다른 실시양태는 화학식 I로 이루어진 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7 [화학식 I]
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T 또는 L이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 14 내지 24이고;
X5는 E 또는 A이고;
X6은 T 또는 E이고;
X7은 부재하거나, 또는 GPSSGAPPPS 및 GPSSG로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;
C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다 (서열식별번호: 5).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T인 화학식 I의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 L인 화학식 I의 구조를 갖는다.
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X5가 E인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X5가 A인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다.
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X6이 T인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X6이 E인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다.
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X7이 GPSSGAPPPS인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X7이 GPSSG인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X7이 부재하는 것인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다.
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 b가 16 내지 20인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 b가 16 내지 18인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 b가 16인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 b가 18인 임의의 상기 실시양태의 구조를 갖는다.
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 2이고; b가 16이고; X5가 E이고; X6이 T이고; X7이 GPSSGAPPPS이고; C-말단 아미노산이 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 6).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 2이고; b가 18이고; X5가 E이고; X6이 T이고; X7이 GPSSGAPPPS이고; C-말단 아미노산이 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 7).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 L이고; a가 2이고; b가 16이고; X5가 E이고; X6이 T이고; X7이 GPSSGAPPPS이고; C-말단 아미노산이 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 8).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 2이고; b가 16이고; X5가 E이고; X6이 T이고; X7이 GPSSG이고; C-말단 아미노산이 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 9).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 2이고; b가 18이고; X5가 E이고; X6이 T이고; X7이 GPSSG이고; C-말단 아미노산이 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 10).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 1이고; b가 16이고; X5가 A이고; X6가 E이고; X7이 부재하는 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 11).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 1이고; b가 18이고; X5가 A이고; X6이 E이고; X7이 부재하는 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 12).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 a가 2이고; X5가 E이고; X6이 T이고; X7이 GPSSGAPPPS 및 GPSSG로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고; C-말단 아미노산이 아미드화된 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 16).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 X2가 T이고; a가 1이고; X5가 A이고; X6이 E이고; X7이 부재하는 것인 화학식 I의 구조를 갖는다 (서열식별번호: 17).
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체에서의 글루카곤 수용체 효능제의 활성은 GLP-1 수용체에서의 글루카곤 수용체 효능제의 활성보다 적어도 100-배 더 높다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 T2DM, 비만, 지방간 질환, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 및 야간 저혈당증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 T2DM, 비만, 지방간 질환, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 및 야간 저혈당증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 1종 이상의 추가의 치료제와 조합된 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 질환은 T2DM이다. 특정 실시양태에서 질환은 비만이다. 특정 실시양태에서 질환은 지방간 질환이다. 특정 실시양태에서 1종 이상의 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제, 인슐린 수용체 효능제, 옥신토모듈린, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, 디펩티딜 펩티다제-4 ("DPP-4") 억제제, 및 나트륨 글루코스 공동-수송체 2 ("SGLT2") 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제이다. 특정 실시양태에서 GLP-1R 효능제는 둘라글루티드이다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GIP-GLP-1 공동-효능제이다. 특정 실시양태에서 GIP-GLP-1 공동-효능제는 서열식별번호: 15의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 인슐린 수용체 효능제이다.
특정 실시양태에서, 글루카곤 수용체 효능제는 추가의 치료제, 예컨대 GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제와 조합되어 사용되는 경우에 체중 감소 및 신체 조성에 대해 상승작용적 효과를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 요법에서의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 사용을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 T2DM, 비만, 지방간 질환, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 및 야간 저혈당증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료하는데 있어서의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 사용을 제공한다. 특정 실시양태에서 질환은 T2DM이다. 특정 실시양태에서 질환은 비만이다. 특정 실시양태에서 질환은 지방간 질환이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 요법에 사용하기 위한, 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 동시, 개별, 또는 순차적 사용으로 사용하기 위한 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 제공한다. 특정 실시양태에서 1종 이상의 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제, 인슐린 수용체 효능제, 옥신토모듈린, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, DPP-4 억제제, 및 나트륨 글루코스 공동-수송체 2 ("SGLT2") 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제이다. 특정 실시양태에서 GLP-1R 효능제는 둘라글루티드이다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GIP-GLP-1 공동-효능제이다. 특정 실시양태에서 GIP-GLP-1 공동-효능제는 서열식별번호: 15의 구조를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 T2DM, 비만, 지방간 질환, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 및 야간 저혈당증의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 사용을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제, 인슐린 수용체 효능제, 옥신토모듈린, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, DPP-4 억제제, 및 SGLT2 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제이다. 특정 실시양태에서 GLP-1R 효능제는 둘라글루티드이다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 GIP-GLP-1 공동-효능제이다. 특정 실시양태에서 GIP-GLP-1 공동-효능제는 서열식별번호: 15의 구조를 갖는다. 특정 실시양태에서 추가의 치료제는 인슐린 수용체 효능제이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 투여하는 것을 포함하는 비-치료 체중 감소를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 지방간 증후군의 치료를 필요로 하는 소에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 소에서 지방간 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 소의 지방간 증후군의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "글루카곤 수용체 효능제"는 글루카곤 수용체에 결합하고, 이를 활성화하고, GLP-1 수용체에 비해 글루카곤 수용체에서 선택적 활성을 유지하여, 단독요법으로 투여된 경우에 혈청 글루코스 수준의 증가를 발생시키는, 천연 인간 글루카곤 (서열식별번호: 1), 글루카곤 유사체, 글루카곤 유도체 또는 글루카곤 융합 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 화합물을 의미한다. 이러한 결합 특징 및 약역학적 효과는 공지된 시험관내 및 생체내 방법, 예컨대 하기 연구에 기재된 것을 사용하여 측정될 수 있다. 글루카곤 유사체는 천연 인간 글루카곤의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)과 비교 시, 1개 이상의 아미노산 치환, 결실, 역위 또는 부가를 포함한 변형을 갖는 분자이다. 글루카곤 유도체는 천연 인간 글루카곤 (서열식별번호: 1) 또는 글루카곤 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 추가적으로 그의 아미노산 측기, α-탄소 원자, 말단 아미노 기, 또는 말단 카르복실산 기 중 1개 이상의 적어도 1종의 화학적 변형을 갖는 분자이다. 글루카곤 융합 단백질은 글루카곤, 글루카곤 유사체 또는 글루카곤 유도체 및 제2 폴리펩티드, 예컨대 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 이종 단백질이다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 활성은 또한 GLP-1 수용체에 비해 글루카곤 수용체에 대해 선택적이다. 본원에 사용된 용어 "에 비해 선택적," "선택성" 및 "에 대해 선택적"은 GLP-1 수용체보다 글루카곤 수용체에 대해 50-, 100-, 200-, 250-, 500- 또는 1000-배 더 높은 효력을 나타내는 화합물을 지칭한다. 이러한 선택성은 공지된 시험관내 방법, 예컨대 하기 연구에 기재된 것을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제는 1일 1회, 1주-3회, 1주-2회, 또는 1주-1회의 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는 연장된 시간 작용 프로파일을 갖는다. 글루카곤 수용체 효능제의 시간 작용 프로파일은 공지된 약동학 시험 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 연장된 시간 작용 프로파일은 위치 20의 리신 아미노산의 측쇄의 엡실론-아미노 기에 접합된 지방산 모이어티의 사용을 통해 달성된다. 지방산은 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a를 포함하는 링커를 통해 리신 측쇄의 엡실론-아미노 기에 접합되며, 여기서 a는 1 또는 2이다. 지방산 및 링커 내 감마-글루탐산은 알부민 결합제로서 작용하고, 장기-작용 화합물의 생성 잠재력을 제공한다. 링커에 의해 위치 20의 리신 아미노산의 측쇄의 엡실론-아미노 기에 접합된 지방산은 -CO-(CH2)b-CO2H를 포함하고, 여기서 b는 14 내지 24이다. 따라서, 완전한 링커-지방산 구조는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H를 포함하며, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 14 내지 24이다. 하기 실시예 1-7의 화학 구조에 제시된 바와 같이, 제1 유닛 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸은 리신 측쇄의 엡실론-아미노 기에 연결된다. 이어서 제2 유닛 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸이 제1 유닛 [2-(2-아미노에톡시)-에톡시]-아세틸의 아미노-기에 부착된다. 이어서, 제1 유닛 γGlu가 측쇄의 γ-카르복실 기를 통해 제2 유닛 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸의 아미노 기에 부착된다. a = 2인 경우에, 제2 유닛 γGlu는 측쇄의 γ-카르복실 기를 통해 제1 유닛 γGlu의 α-아미노 기에 부착된다. 마지막으로, 지방산은 제1 (a = 1인 경우) 또는 제2 (a=2인 경우) 유닛 γGlu의 α-아미노 기에 부착된다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제는 바람직하게는 비경구 경로 (예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 경피)에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 이러한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006] 참조). 바람직한 투여 경로는 피하이다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제는 수많은 무기 및 유기 산 중 임의의 것과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하는 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)] 참조). 본 발명의 제약상 허용되는 염은 트리플루오로아세테이트, 히드로클로라이드, 및 아세테이트 염을 포함한다.
GLP-1 수용체보다 글루카곤 수용체에 대한 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 선택성에 의해 제공되는 하나의 특정한 이익은, 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제가 추가의 치료제와 조합되어 투여되는 경우에 글루카곤 수용체에서의 활성 대 다른 수용체(들) (예를 들어, GLP-1, GIP 및/또는 인슐린 수용체)에서의 활성의 비와 같은 유연한 치료 옵션을 제공하는 능력이다. 따라서, 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 T2DM의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 추가의 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 T2DM을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제 또는 인슐린 수용체 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "추가의 치료제(들)"는 예를 들어 GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제, 인슐린 수용체 효능제, 옥신토모듈린, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, DPP-4 억제제, 및 SGLT2 억제제를 포함하여, 현재 이용가능하고/거나 개발 중인, 예컨대 T2DM 및/또는 비만의 치료에 유익한 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 다른 화합물(들)을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "와 조합되어"는 1종 이상의 추가의 치료제와의 동시, 순차적 또는 단일 조합 제제로의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제의 투여를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "GLP-1R 효능제"는 GLP-1 수용체에서 활성을 유지하는 천연 인간 GLP-1 (서열식별번호: 2), GLP-1 유사체, GLP-1 유도체 또는 GLP-1 융합 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 화합물을 지칭한다. GLP-1 수용체 활성은 GLP-1 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화를 측정하는 생체내 실험 및 시험관내 검정을 사용하는 것을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. GLP-1 유사체는 천연 인간 GLP-1의 아미노산 서열 (서열식별번호: 2)과 비교 시, 1개 이상의 아미노산 치환, 결실, 역위 또는 부가를 포함한 변형을 갖는 분자이다. GLP-1 유도체는 천연 인간 GLP-1 (서열식별번호: 2) 또는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 추가적으로 그의 아미노산 측기, α-탄소 원자, 말단 아미노 기, 또는 말단 카르복실산 기 중 1개 이상의 적어도 1종의 화학적 변형을 갖는 분자이다. GLP-1 융합 단백질은 GLP-1, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유도체 및 제2 폴리펩티드, 예컨대 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 이종 단백질이다. 현재 이용가능하고/거나 개발 중인 GLP-1R 효능제는 엑세나티드, 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드 및 세마글루티드를 포함한다. 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제가 GLP-1R 효능제와 조합되어 투여되는 특정의 바람직한 실시양태에서, GLP-1R 효능제는 둘라글루티드이다. 예를 들어, US 7,452,966을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "GIP-GLP-1 공동-효능제"는 GIP 및 GLP-1 수용체 둘 다에서 활성을 갖는 화합물을 지칭한다. GIP 수용체 및 GLP-1 수용체 활성은 GIP 수용체 및/또는 GLP-1 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화를 측정하는 생체내 실험 및 시험관내 검정을 사용하는 것을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 어떠한 GIP-GLP-1 공동-효능제도 T2DM 치료제로서 현재 이용가능하지 않지만, GIP 및 GLP-1 수용체 활성 둘 다를 나타내는 것으로서 다중 GIP 유사체가 기재된 바 있고, 예를 들어, WO2013164483; WO 2011119657을 참조한다.
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제가 GIP-GLP-1 공동-효능제와 조합되어 투여되는 특정의 바람직한 실시양태에서, GIP-GLP-1 공동-효능제는 하기 구조를 갖는 것이거나 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQX3AX4VQWLIAGGPSSGAPPPS;
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 Aib이고;
X3은 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO (CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 10 내지 20이고;
X4는 Phe 또는 1-나프틸알라닌 (1-Nal)이고;
C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다 (서열식별번호: 13).
특정의 바람직한 실시양태에서 a는 2이고, b는 18이고; X4는 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 14). 특정의 바람직한 실시양태에서 a는 1이고, b는 18이고; X4는 Phe이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 15). 이러한 GIP-GLP-1 공동-효능제는 하기 펩티드 합성 실시예에 기재된 바와 같은, 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 제조하는데 사용될 수 있는 것과 같은 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 수용체 효능제"는 인간 인슐린, 또는 그의 유사체 또는 유도체, 또는 인슐린 수용체에 결합하고 이를 활성화할 수 있는 임의의 다른 단백질을 지칭한다. 인슐린 수용체 활성은 인슐린 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화를 측정하는 생체내 실험 및 시험관내 검정을 사용하는 것을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 인슐린 유사체는 그의 구조가 널리 공지되어 있는 천연 인간 인슐린과 비교 시, 1개 이상의 아미노산 치환, 결실, 역위 또는 부가를 포함한 변형을 갖는 분자이다. 인슐린 유도체는 천연 인간 인슐린 또는 그의 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 추가적으로 그의 아미노산 측기, α-탄소 원자, 말단 아미노 기, 또는 말단 카르복실산 기 중 1개 이상의 적어도 1종의 화학적 변형을 갖는 분자이다. 인슐린 융합 단백질은 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체 부분 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 단백질이다. 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제가 인슐린 수용체 효능제와 조합되어 투여되는 실시양태에서 임의의 인슐린 수용체 효능제가 사용에 대해 고려될 수 있지만, 바람직한 인슐린 수용체 효능제는 기본 또는 연장된 작용 지속기간을 갖는 것이다. 기본 활성을 갖는 현재 이용가능한 인슐린 수용체 효능제는 인슐린 글라진, 인슐린 데테미르, 및 인슐린 데글루덱을 포함하며, 그의 각각은 1일-1회 투여가 지시된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 T2DM의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 T2DM을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 비만의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 비만을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 지방간 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 지방간 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 NASH의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 NASH를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 T2DM의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제, 인슐린 수용체 효능제, 옥신토모듈린, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, DPP-4 억제제, 및 SGLT2 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 T2DM을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "를 필요로 하는 환자"는, 예를 들어 T2DM, 비만, 지방간 질환, NASH 및/또는 대사 증후군을 포함한, 치료를 필요로 하는 질환 또는 상태를 갖는 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시, 진단 또는 치료 하의 환자에서 목적하는 효과를 제공하는, 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다. 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 공지된 기술의 사용을 통해 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 환자에 대한 유효량을 결정하는데 있어서, 포유동물의 종; 그의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 침범된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 침범 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여된 특정한 글루카곤 수용체 효능제; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특징; 선택된 용량 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 인자가 고려된다.
본 발명의 특정 글루카곤 수용체 효능제는 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1주-1회 투여를 위한 투여량은 1주에 1인당 약 0.01 내지 약 30 mg의 범위 내에 속할 수 있다. 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제는 매일, 1주-3회, 1주-2회 또는 1주-1회 투여될 수 있다. 1주-1회 투여가 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료하기 위한"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 억제하거나, 감속시키거나, 정지시키거나, 또는 역전시키는 것을 포함한다.
본 발명의 아미노산 서열은 20개의 자연 발생 아미노산에 대한 표준 단일 문자 또는 3문자 코드를 함유한다. 추가적으로, "Aib"는 알파 아미노 이소부티르산이다. 본 발명은 또한 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제 또는 그의 제약상 허용되는 염의 합성에 유용한 신규 중간체 및 방법을 포괄한다. 본 발명의 중간체 및 글루카곤 수용체 효능제는 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있다. 특히, 화학적 합성을 사용하는 방법이 하기 실시예에 예시된다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적 합성 단계는 상이한 방식으로 조합되어 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제를 제조할 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 입수가능하다.
본 발명은 제한하는 것으로 해석되지 않는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
펩티드 합성
실시예 1
실시예 1은 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고; X2는 T이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 16이고; X5는 E이고; X6은 T이고; X7은 GPSSGAPPPS이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 6).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 1의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00001
실시예 1의 펩티드는 RAPP AM-Rink 아미드 수지에서 시작하여 25℃에서 90분 동안 디메틸포름아미드 (DMF) 중 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 히드록시벤조트리아졸 (HOBt) (1:1:1 몰비)에 의해 활성화된 6당량의 아미노산을 사용한 커플링에 의하는, 심포니 자동화 펩티드 합성기 (피티아이 프로테인 테크놀로지스 인크.(PTI Protein Technologies Inc.)) 상에서 수행되는 Fmoc/t-Bu 전략을 사용한 고체-상 펩티드 합성에 의해 생성된다.
Pro31 (4시간), Trp25 (4시간), Glu24 (4시간), Val23 (10시간), Glu21 (4시간), Aib16 (4시간), Asp15 (4시간), Thr7 (4시간), Thr5 (4시간), Gly4 (4시간), Gln3 (4시간) 및 Aib2 (24시간)에 대한 연장된 커플링은 조 펩티드의 품질을 개선시키는데 필요하다. Fmoc-Lys(Alloc)-OH 빌딩 블록은 합성 공정의 후반에 지방산 모이어티의 부위 특이적 부착을 가능하게 하기 위해 Lys20 커플링에 사용된다 (직교 보호기). N-말단 잔기는 상기 기재된 바와 같은 DIC-HOBt 절차 (24시간 커플링)를 사용하여 Boc-Tyr(tBu)-OH로서 혼입된다.
상기 기재된 펩티드-수지의 신장 종료 후, Lys20에 존재하는 Alloc 보호기는 스캐빈저로서 PhSiH3의 존재 하에 촉매량의 Pd(PPh3)4를 사용하여 제거된다. Lys20 측쇄를 연장시키기 위해 Fmoc/t-Bu 전략을 사용하는 추가의 커플링/탈보호 사이클은 Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH (켐펩(ChemPep) 카탈로그#280102), Fmoc-Glu(OH)-OtBu (켐펩 카탈로그#100703) 및 HOOC-(CH2)16-COOtBu를 수반한다. 모든 커플링에서, 3당량의 빌딩 블록이 DMF 중 PyBOP (3당량) 및 DIEA (6당량)와 함께 25℃에서 4시간 동안 사용된다.
수지로부터의 병행 절단 및 측쇄 보호기 제거는 트리플루오로아세트산 (TFA):트리이소프로필실란:1,2-에탄디티올:물:티오아니솔 90:4:2:2:2 (v/v)를 함유하는 용액 중에서 25℃에서 2시간 동안 수행되고, 이어서 저온 에테르에 의해 침전된다. 조 펩티드는 C18 칼럼 상에서의 물/아세토니트릴 (0.05% v/v TFA 함유) 구배에 의한 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 > 99% 순도 (15-20% 정제 수율)로 정제되고, 여기서 적합한 분획이 풀링되고 동결건조되어 TFA 염이 생성된다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 1의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1713.6; 계산치 M+3H+/3 =1714.3; 관찰치: M+4H+/4 =1285.7; 계산치 M+4H+/4 =1285.9).
실시예 2
실시예 2는 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고, X2는 T이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고; a는 2이고; b는 18이고; X5는 E이고; X6은 T이고; X7은 GPSSGAPPPS이고; 여기서 C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 7).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 2의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00002
실시예 2에 따른 펩티드는 상기 실시예 1에 기재된 바와 유사하게 합성된다. HOOC-(CH2)18-COOtBu는 25℃에서 4시간 동안 DMF 중 PyBOP (3당량) 및 DIEA (6당량)와 함께 3당량의 빌딩 블록을 사용하여 혼입된다.
본질적으로 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 2의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1723.2; 계산치 M+3H+/3 =1723.6; 관찰치: M+4H+/4 =1292.9; 계산치 M+4H+/4 =1293.0).
실시예 3
실시예 3은 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고; X2는 L이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고; a는 2이고; b는 16이고; X5는 E이고; X6은 T이고; X7은 GPSSGAPPPS이고; 여기서 C-말단 아미노산은 C 말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 8).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 3의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00003
실시예 3에 따른 펩티드는 상기 실시예 1에 기재된 바와 유사하게 합성된다.
본질적으로 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 3의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1717.4; 계산치 M+3H+/3 =1718.3; 관찰치: M+4H+/4 =1288.3; 계산치 M+4H+/4 =1289.0).
실시예 4
실시예 4는 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고; X2는 T이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고; a는 2이고; b는 16이고; X5는 E이고; X6은 T이고; X7은 GPSSG이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 9).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 4의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00004
실시예 4에 따른 펩티드는 상기 실시예 1에 기재된 바와 유사하게 합성된다.
본질적으로 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 4의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1563.7; 계산치 M+3H+/3 =1564.4; 관찰치: M+4H+/4 =1172.9; 계산치 M+4H+/4 =1173.6).
실시예 5
실시예 5는 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고; X2는 T이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고; a는 2이고; b는 18이고; X5는 E이고; X6은 T이고; X7은 GPSSG이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 10).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 5의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00005
실시예 5에 따른 펩티드는 상기 실시예 1에 기재된 바와 유사하게 합성된다.
본질적으로 상기 실시예 1 및 2에 대해 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 5의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1572.9; 계산치 M+3H+/3 =1573.8; 관찰치: M+4H+/4 =1179.8; 계산치 M+4H+/4 =1180.6).
실시예 6
실시예 6은 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고; X2는 T이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고; a는 1이고; b는 16이고; X5는 A이고; X6은 E이고; X7은 부재하고; C-말단 아미노산은 C-말단 산이다 (서열식별번호: 11).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 6의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00006
실시예 6에 따른 펩티드는 Fmoc-L-Glu(OtBu)-Wang 수지 (노바바이오켐(NovaBiochem) 카탈로그 아이템 # 856008; 초기 로딩 0.51 mmol/g)에서 시작하여 25℃에서 90분 동안 디메틸포름아미드 (DMF) 중 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 히드록시벤조트리아졸 (HOBt) (1:1:1 몰비)에 의해 활성화된 6당량의 아미노산을 사용한 커플링에 의하는, 심포니 자동화 펩티드 합성기 (피티아이 프로테인 테크놀로지스 인크.) 상에서 수행되는 Fmoc/t-Bu 전략을 사용한 고체-상 펩티드 합성에 의해 생성된다.
Trp25 (4시간), Ala24 (4시간), Val23 (10시간), Glu21 (4시간), Aib16 (4시간), Asp15 (4시간), Thr7 (4시간), Thr5 (4시간), Gln3 (4시간) 및 Aib2 (24시간)에 대한 연장된 커플링은 조 펩티드의 품질을 개선시키는데 필요하다. Fmoc-Lys(Alloc)-OH 빌딩 블록은 합성 공정의 후반에 지방산 모이어티의 부위 특이적 부착을 가능하게 하기 위해 Lys20 커플링에 사용된다 (직교 보호기) (4시간 커플링 시간). N-말단 잔기는 상기 기재된 바와 같은 DIC-HOBt 절차 (24시간 커플링)를 사용하여 Boc-Tyr(tBu)-OH로서 혼입된다.
상기 기재된 펩티드-수지의 신장 종료 후, Lys20에 존재하는 Alloc 보호기는 스캐빈저로서 PhSiH3의 존재 하에 촉매량의 Pd(PPh3)4를 사용하여 제거된다. Lys20 측쇄를 연장시키기 위해 Fmoc/t-Bu 전략을 사용하는 추가의 커플링/탈보호 사이클은 Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH (켐펩 카탈로그#280102), Fmoc-Glu(OH)-OtBu (켐펩 카탈로그#100703) 및 HOOC-(CH2)16-COOtBu를 수반하였다. 모든 커플링에서, 3당량의 빌딩 블록이 DMF 중 PyBOP (3당량) 및 DIEA (6당량)와 함께 25℃에서 4시간 동안 사용된다.
수지로부터의 병행 절단 및 측쇄 보호기 제거는 트리플루오로아세트산 (TFA):트리이소프로필실란:1,2-에탄디티올:물:티오아니솔 90:4:2:2:2 (v/v)를 함유하는 용액 중에서 25℃에서 2시간 동안 수행되고, 이어서 저온 에테르에 의해 침전된다. 조 펩티드는 C18 칼럼 상에서의 물/아세토니트릴 (0.05% v/v TFA 함유) 구배에 의한 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 > 99% 순도 (15-20% 정제 수율)로 정제되고, 여기서 적합한 분획이 풀링되고 동결건조된다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 6의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1382.7; 계산치 M+3H+/3 =1383.3; 관찰치: M+4H+/4 =1036.6; 계산치 M+4H+/4 =1037.7).
실시예 7
실시예 7은 하기 기재에 의해 나타내어지는 글루카곤 수용체 효능제이다:
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고; X2는 T이고; X3은 Aib이고; X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고; a는 1이고; b는 18이고; X5는 A이고; X6은 E이고; X7은 부재하고; C-말단 아미노산은 C-말단 산이다 (서열식별번호: 12).
하기는 잔기 Aib2, Aib16 및 K20을 제외하고 표준 단일 문자 아미노산 코드를 사용한 실시예 7의 구조의 도시이고, 여기서 이들 아미노산 잔기의 구조는 하기와 같이 확장된다:
Figure pct00007
실시예 7에 따른 펩티드는 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사하게 합성된다. HOOC-(CH2)18-COOtBu는 25℃에서 4시간 동안 DMF 중 PyBOP (3당량) 및 DIEA (6당량)와 함께 3당량의 빌딩 블록을 사용하여 혼입된다.
본질적으로 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 7의 순도는 분석 역상 HPLC에 의해 검사되고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인된다 (관찰치: M+3H+/3 =1391.8; 계산치 M+3H+/3 =1392.6; 관찰치: M+4H+/4 =1044.3; 계산치 M+4H+/4 =1044.7).
시험관내 기능
결합 친화도
실시예 1-7의 펩티드의 결합 친화도를 재조합 인간 글루카곤 수용체 (hGcg-R), 마우스 글루카곤 수용체 (mGcg-R) 및 래트 글루카곤 수용체 (rGcg-R)에 대해 결정하였다. 섬광 근접 검정 (SPA) 방법 및 hGcg-R, mGcg-R 또는 rGcg-R을 과다발현하는 293HEK 안정하게 형질감염된 세포로부터 제조된 막을 사용하여 방사성리간드 경쟁 결합 검정을 실행하여 실시예 1-7의 펩티드에 대한 평형 해리 상수 (Ki)를 결정하였다. 실험 프로토콜 및 결과를 하기 기재한다.
인간 Gcg 수용체 결합 검정은 재조합 hGcg-R을 과다발현하는 293HEK 세포로부터 단리된 클로닝된 hGcg-R을 사용하였다 (Lok, S, et al., Gene 140 (2), 203-209 (1994)). hGcg-R cDNA를 발현 플라스미드 phD 내로 서브클로닝하였다 (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, BW, et al., Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). 이 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 μg/mL 히그로마이신으로 선택하였다.
마우스 Gcg 수용체 결합 검정은 293HEK 막으로부터 단리된 클로닝된 마우스 글루카곤 수용체 (mGcgR)를 사용하였다 (Burcelin R, Li J, Charron MJ. Gene 164 (2), 305-10 (1995) GenBank: L38613). mGcgR cDNA를 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (프로메가(Promega))-ZeoR 내로 서브클로닝하였다. 이 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 100 μg/mL 제오신을 사용하여 클론 세포주를 선택하였다.
래트 Gcg 수용체 수용체 결합 검정은 래트 글루카곤 수용체 (rGcg-R)를 일시적으로 발현하는 293HEK 세포로부터 단리된 막의, 클로닝된 rGcg-R을 사용하였다 (Svoboda, M, Ciccarelli, E, Tastenoy, M, Robberecht, P, Christophe, J. A cDNA construct allowing the expression of rat hepatic glucagon receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1), 135-142 (1993), GenBank: L04796). rGcg-R cDNA를 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (프로메가)-ZeoR 내로 서브클로닝하였다. 이 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 48시간 동안 일시적으로 발현시켰다.
조 형질 막을 부착 배양물로부터의 세포를 사용하여 제조하였다. 세포를 50 mM 트리스 HCl, pH 7.5 및 로슈 컴플리트(Roche Complete)™ 프로테아제 억제제를 EDTA의 존재 하에 함유하는 저장성 완충제 중 빙상에서 용해시켰다. 세포 현탁액을 테플론(Teflon)® 막자가 구비된 유리 포터-엘베헴 균질화기를 사용하여 25 스트로크 동안 교란시켰다. 균질물을 4℃에서 1100 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 빙상에 저장하는 한편, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고 재균질화하였다. 혼합물을 1100 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 제2 상청액을 제1 상청액과 합하고, 4℃에서 35000 x g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 막 펠릿을 프로테아제 억제제를 함유하는 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 액체 질소 중에서 급속 동결시키고, 사용할 때까지 -80℃ 동결기에서 분취물로 저장하였다.
Gcg를 I-125-락토퍼옥시다제 절차에 의해 방사성아이오딘화하고, 퍼킨-엘머 (NEX207)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 특이적 활성은 2200 Ci/mmol이었다. KD 결정은 상동 경쟁 또는 포화 결합 분석에 의해 수행하였다. 인간 Gcg-R에 대한 KD는 3.92 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 hGcg-R 검정에서 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다. 마우스 Gcg-R에 대한 KD는 3.52 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 mGcg-R 검정에서 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다. 래트 Gcg-R에 대한 KD는 21.4 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 rGcg-R 검정에서 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.
수용체 결합 검정을 밀 배아 응집소 (WGA) 비드 (퍼킨 엘머)에 의하는 섬광 근접 검정 (SPA) 포맷을 사용하여 수행하였다. 결합 완충제는 25 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), pH 7.4, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% (w/v) 바시트라신 (아피메트릭스(Affymetrix)), 0.003% (w/v) 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 (트윈(TWEEN)®-20) 및 로슈 컴플리트™ 프로테아제 억제제를 EDTA의 부재 하에 함유하였다. Gcg (일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company))를 DMSO 중에 3.48 mg/mL (1 mM)로 용해시키고, 100 μL 분취물로 -20℃에서 동결 저장하였다. Gcg 분취물을 희석하고 1시간 내에 결합 검정에 사용하였다. 펩티드 유사체를 DMSO 중에 용해시키고, 100% DMSO 중에서 3-배 연속 희석하였다. 다음으로, 5 μL 연속 희석된 화합물 또는 DMSO를 45 μL 검정 결합 완충제 또는 비표지된 Gcg 대조군 (NSB, 최종 1 μM)을 함유하는 코닝(Corning)® 3632 투명 바닥 검정 플레이트로 옮겼다. 이어서, 50 μL hGcg-R (1.5 μg/웰), mGcg-R (6.47 μg/웰) 또는 rGcg-R 막 (1.5 μg/웰), 50 μL I-125 Gcg (반응물 중 최종 0.15 nM), 및 50 μL WGA 비드 (150 μg/웰)를 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 플레이트 진탕기 (설정 6) 상에서 1분 동안 혼합하였다. 플레이트를 실온에서 12시간의 침강 시간 후 퍼킨엘머 트리룩스 마이크로베타(Trilux MicroBeta)® 섬광 계수기로 판독하였다. 결과를 화합물의 존재 하에서의 특이적 I-125-Gcg 결합의 퍼센트로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC50 농도는 I-125-Gcg의 퍼센트 특이적 결합 vs. 첨가된 화합물의 농도의 비-선형 회귀에 의해 유도되었다. IC50 농도를 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식을 사용하여 Ki로 전환시켰다 (Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, (1973)).
hGcg-R, mGcg-R 및 rGcg-R에서의 실시예 1-7의 펩티드 및 인간 Gcg의 Ki를 하기 표 1에 제공한다.
표 1.
Figure pct00008
이들 데이터는 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제가 3종의 상이한 종 (인간, 마우스 및 래트 수용체)에서 인간 글루카곤과 유사하거나 더 큰 친화도로 글루카곤 수용체에 결합한다는 것을 나타낸다.
기능적 활성 및 선택성
기능적 활성 및 선택성은 인간 글루카곤 수용체 (hGcg-R), 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 (hGLP-1R) 또는 인간 위 억제 펩티드 (또한 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 수용체, hGIP-R로도 공지됨)를 발현하는 HEK293 세포에서 세포내 cAMP의 정량화에 의해 결정하였다. 실험 프로토콜 및 결과를 하기 기재한다.
hGcg-R 기능적 cAMP 검정은 클로닝된 hGcg-R을 발현하는 293HEK 세포를 사용하였다 (Lok, S, et al., Gene 140 (2), 203-209 (1994)). hGcg-R cDNA를 발현 플라스미드 phD 내로 서브클로닝하였다 (Trans- activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, BW, et al., Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). 이 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 μg/mL 히그로마이신으로 세포를 선택하였다.
hGLP-1-R 기능적 cAMP 검정은 클로닝된 hGLP-1-R을 발현하는 293HEK 세포를 사용하였다 (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6, 1993). hGLP-1R cDNA를 발현 플라스미드 phD 내로 서브클로닝하였다 (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5:1189-1192, 1987). 이 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 μg/mL 히그로마이신으로 세포를 선택하였다.
hGIP-R 기능적 검정은 pcDNA3.1 (프로메가)-NeoR 플라스미드 내로 클로닝된 hGIP-R을 사용하였다 (Usdin,T.B., Gruber,C., Modi,W. and Bonner,T.I., GenBank: AAA84418.1). hGIP-R-pcDNA3.1/Neo 플라스미드로 현탁 배양을 위해 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO-S를 형질감염시키고, 500 μg/mL 제네티신 (인비트로젠(Invitrogen))의 존재 하에 선택하였다.
각각의 수용체 과다-발현 세포주를 1X 글루타맥스(GlutaMAX)™ (0.85% NaCl 중 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드, 깁코(Gibco) Cat# 35050), 0.1% 카세인 (시그마(Sigma) Cat# C4765), 250 μ M IBMX (3-이소부틸-1-메틸크산틴) 및 20 mM HEPES [N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산), 하이클론 Cat# SH30237.01]가 보충된 DMEM (둘베코 변형 이글 배지, 깁코 Cat# 31053) 중의 펩티드로 40 μL 검정 부피로 처리하였다. 실온에서 60분 인큐베이션 후, 발생한 세포내 cAMP (아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트)에서의 증가를 시스바이오 cAMP 다이나믹 2 HTRF 검정 키트 (시스바이오 62AM4PEC)를 사용하여 정량적으로 결정하였다. 세포 용해 완충제 (20 μL) 중 cAMP-d2 접합체를 첨가하고 이어서 또한 세포 용해 완충제 (20 μL) 중 항체 항-cAMP-Eu3 +-크립테이트를 첨가하여 세포 내 cAMP 수준을 검출하였다. 생성된 경쟁적 검정을 실온에서 적어도 60분 동안 인큐베이션한 다음, 퍼킨엘머 엔비전(Envision)® 기기를 사용하여 320 nm에서의 여기 및 665 nm 및 620 nm에서의 방출로 검출하였다. 엔비전 단위 (방출, 665nm/620nm*10,000)는 존재하는 cAMP의 양에 반비례하였고, 이를 cAMP 표준 곡선을 사용하여 웰당 nM cAMP로 전환시켰다. 각각의 웰에서 생성된 cAMP의 양 (nM)을 10 nM 인간 GLP-1(7-36)NH2 (hGLP-1R 검정의 경우), 10 nM 인간 Gcg (hGcg-R 검정의 경우) 또는 10 nM 인간 GIP(1-42)NH2 (hGIP-R 검정의 경우)에 의해 관찰된 최대 반응의 퍼센트로 전환시켰다. 상대 EC50 값 및 최고 퍼센트 (Emax)를, 4-파라미터 로지스틱 방정식에 피팅된 퍼센트 최대 반응 vs. 첨가된 펩티드의 농도를 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 유도하였다.
실시예 1-7, 인간 GIP(1-42)NH2, 인간 GLP-1(7-36)NH2 및 인간 Gcg에 대한 기능적 데이터를 하기 표 2에 제시한다. EC50에 대한 평균을 기하 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표현하였고, 반복 횟수 (n)는 괄호 안에 나타낸다. (>) 정성자는 % 효능이 50%에 도달하지 않았다는 것을 나타내고, 계산된 EC50은 시험된 최고 농도를 사용하여 수득하였다.
표 2.
Figure pct00009
이들 데이터는 본 발명의 글루카곤 수용체 효능제가 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체에 비해 증가된 선택성으로 글루카곤 수용체에서 인간 글루카곤과 유사한 효력을 갖는다는 것을 나타낸다.
약동학
래트에서의 약동학
수컷 스프라그 돌리 래트에게 트리스 완충제 (pH 8.0) 중 실시예 화합물의 단일 피하 (100 nmole/kg) 용량을 1 mL/kg의 부피로 투여하였다. 혈액을 각각의 동물로부터 투여후 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 및 240시간째에 수집하였다.
화합물의 혈장 농도는 LC/MS 방법에 의해 결정하였다. 각각의 방법은 무손상 펩티드 (펩티드 플러스 연관 시간 연장)를 측정하였다. 각각의 검정의 경우에, 내부 표준 (IS)으로 사용된 화합물 및 유사체는 메탄올 및 0.1% 포름산을 사용하여 100% 래트 또는 원숭이 혈장 (50 μl)으로부터 추출하였다. 상청액에 위치하는 화합물 및 IS와의 원심분리 시 2개의 별개의 층이 형성되었다. 상청액 275 μl 분취물을 써모 단백질 침전 플레이트로 옮겼고, 여기서 96-웰 플레이트로의 관통물의 수집을 위해 진공을 적용하였다.
샘플을 가열된 질소 기체로 건조시켜 상청액을 제거하였다. 150 μl 부피의 30% 아세토니트릴 및 5% 포름산을 웰에 첨가하여 샘플을 재구성하였다. 주입된 샘플 (20 μl)을 슈펠코 애널리티컬 디스커버리 바이오 와이드 포어(Supelco Analytical Discovery BIO Wide Pore) C5-3, 5 cm X 0.1 mm, 3 μm 칼럼 상에 로딩하였다. 검출 및 정량화를 위해 칼럼 유출물을 써모 Q-이그잭티브(Thermo Q-Exactive) 질량 분광계로 유도하였다.
수컷 스프라그 돌리 래트에게의 단일 100 nmol/kg 피하 용량 후 평균 약동학적 파라미터를 하기 표 3에 제공한다 (실시예 1, 2 및 5의 경우 및 실시예 3 및 4에 대한 Tmax 및 Cmax의 경우 n=3; 실시예 3 및 4에 대한 T1/2, AUC0 - inf 및 CL/F의 경우 n=2).
표 3.
Figure pct00010
약어: AUC0 - inf = 0에서 무한대까지의 곡선하 면적, CL/F = 클리어런스/생체이용률, Tmax = 최대 농도까지의 시간, Cmax = 최대 혈장 농도, T1/2 = 반감기, ND = 데이터 없음.
이들 데이터는 실시예 1-5가 천연 인간 글루카곤에 비해 연장된 작용 지속기간을 갖고, T1/2가 대략 30분이라는 것을 보여준다.
시노몰구스 원숭이에서의 약동학
수컷 시노몰구스 원숭이에게 트리스 완충제 (pH 8.0) 중 시험 화합물의 단일 정맥내 (50 nmole/kg) 또는 피하 (50 nmole/kg) 용량을 0.25 mL/kg의 부피로 투여하였다. 혈액을 각각의 동물로부터 투여-후 0.5 (IV만), 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 192, 240, 336, 480, 576, 및 672시간째에 수집하였다. 화합물의 혈장 농도는 일반적으로 상기 스프라그 돌리 래트 연구에 기재된 바와 같은 LC/MS 방법에 의해 결정하였다.
평균 (n=2) 약동학적 파라미터를 하기 표 4에 제공한다.
표 4.
Figure pct00011
약어: AUC0 - inf = 0에서 무한대까지의 곡선하 면적, CL = 클리어런스, CL/F = 클리어런스/생체이용률, Tmax = 최대 농도까지의 시간, C0 = 시간 0시로 외삽된 농도, Cmax = 최대 혈장 농도, T1/2 = 반감기, NA = 적용가능하지 않음.
이들 데이터는 실시예 1 및 2가 천연 인간 글루카곤에 비해 연장된 작용 지속기간을 갖고, T1/2가 1시간 미만이라는 것을 보여준다.
생체내 연구
래트에서의 연속 글루코스 모니터링
12-14주령의 정상 스프라그-돌리 수컷 래트 (하를란(HARLAN)™, 인디애나주 인디애나폴리스)를 온도-제어되는 (24℃) 설비 내에 12시간 명/암주기로 개별적으로 수용하고, 음식물 (TD2014 테클라드 글로벌 로덴트 다이어트(TEKLAD GLOBAL RODENT DIET)®, 하를란™ 랩스, 인디애나주 인디애나폴리스) 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 설비에의 2주 순응 후, 래트에 HD-XG 트랜스미터 (데이터 사이언시스 인터내셔널(Data Sciences International), 미네소타주 세인트 폴)를 이식하였다.
트랜스미터 이식 수술은 2% 내지 3% 이소플루란 (2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로에탄) 마취 하에 수행하였다. 트랜스미터의 글루코스 센서를 하행 대동맥에 위치시켰다. 트랜스미터의 온도 센서는 트랜스미터 몸체와 함께 복강에 위치시켰다. 트랜스미터 이식 수술 7일 후, 래트가 그의 홈 케이지 내에서 자유롭게 이동하게 하면서, 모든 래트를 원격측정 수신기 상에 두어 혈액 글루코스 및 심부 체온 측정치를 1분 간격으로 연속적으로 기록하였다. 데이터 획득은 데이터퀘스트 A.R.T.(DATAQUEST A.R.T.)™ 시스템 소프트웨어 (데이터 사이언시스 인터내셔널, 미네소타주 세인트 폴)에 의해 제어하고 분석하였다. 글루코스 센서의 초기 보정은 수술 7일 후 복강내 글루코스 내성 검사 (ipGTT)를 통해 달성하였고, 후속 보정은 꼬리 혈액을 통한 글루코스 측정을 통해 격일로 행하였다. 수술 후 제9일-제11일에 시작하여, 10 nmol/kg 용량의 시험 화합물을 20 mM 트리스-HCl 완충제, pH 8.0 중 피하 주사에 의해, 1mL/Kg 체중으로 1회 투여하였다. 혈액 글루코스 수준을 최대 7일 모니터링하였다.
혈액 글루코스 데이터는 실시예 1 - 7이 각각 용량 의존성 방식으로 혈액 글루코스 수준의 지속적 증가를 발생시킨다는 것을 나타낸다.
물리적 및 화학적 특징
용해도 및 안정성
실시예 1-6의 샘플을 H2O 중 5 mg/mL로 제조하고, 완충제 C6N (10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 6), C7N (10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 7), H6.5N (10 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, pH 6.5) 및 H7.5N (10 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, pH 7.5) 내로 기재된 바와 같이 투석하였다. 샘플을 기재된 바와 같이 10 mg/mL 펩티드로 농축시키고, 1주 동안 4℃에서 유지시켰다. 샘플을 기재된 바와 같이 육안 및 SEC-HPLC에 의해 평가하였다.
모든 제제 중 실시예 1-6은 4℃에서 1주 후 투명하고 무색이었다. SEC-HPLC 데이터를 표 5에 제공한다. 고분자량 (HMW) 중합체에서의 어떠한 유의한 성장도, 또는 주요 피크의 손실도 발생하지 않았다. SEC-HPLC에 의한 회수는 실시예 1-6의 경우 5% 내였다.
표 5.
Figure pct00012
실시예 1-2의 용해도를 또한 3종의 추가의 제제에서 평가하였다: T7 (10 mM 트리스-HCl, pH 7), T7Tm (10 mM 트리스-HCl, 0.02% 폴리소르베이트-20, 29 mM m-크레졸, pH 7), 및 T7Nm (10 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, 29 mM m-크레졸, pH 7). 기재된 바와 같은 투석을 통해 화합물을 T7 중에 제조하였다. 샘플을 T7, T7Tm 또는 T7Nm 중 2 mg/mL로 제제화한 다음, 기재된 바와 같이 10 mg/mL 펩티드로 농축시켰다. 제제를 4℃에서 1주 동안 유지시키고, 기재된 바와 같이 육안 및 SEC-HPLC 및 RP-HPLC에 의해 평가하였다.
모든 제제는 투명하고 무색으로 유지되었다. SEC-HPLC 및 RP-HPLC 데이터가 표 6에 존재한다. HMW 중합체 성장은 임의의 제제의 경우에 0.2%를 초과하지 않았다. RP-HPLC에 의한 피크 회수는 모든 제제의 경우에 5% 내였다.
표 6.
Figure pct00013
이들 데이터는 실시예 1-6이 상이한 완충제 조건 하에 허용되는 용해도 특성을 갖는다는 것을 나타낸다.
화학적 안정성
실시예 1에 대한 화학적 안정성을 다양한 pH 값의 상이한 완충제 중에서 결정하였다. 샘플을 H2O 중에 5 mg/mL 농도로 제조하고, 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer) 투석 카세트, 2000 MWCO (파트 번호 66203)를 사용하여 4℃에서 밤새 관심 완충제 내로 투석하고, 0.22 μm 필터 (밀렉스(Millex), SLGV013SL)를 통해 여과한 다음, 각각의 완충제 중 1 mg/mL로 희석하였다. 완충제 조성은 H2O pH 8 중 10 mM 트리스-HCl (T8), H2O pH 7 중 10 mM 트리스-HCl (T7), H2O pH 7 중 10 mM 히스티딘 (H7), 또는 H2O pH 6 중 10 mM 시트레이트 (C6)였다. 각각의 1 mg/mL 샘플을 3개의 바이알로 옮겼다. 샘플을 4℃, 25℃ 및 40℃에서 유지시켰다. 샘플을 총 4주 동안 2주마다 평가하였다. 샘플을 탁도 및 상 분리에 대해 육안으로 평가하였다. 화합물의 안정성은 60℃에서 가열된 워터스 시메트리 쉴드(Waters Symmetry Shield) RP18, 3.5 μm, 4.6 X 100 mm 칼럼 (파트 번호 18600179) 상에서 3분에 걸쳐 10% B 등용매, 3분에 걸쳐 30% B, 30분에 걸쳐 30-60% B, 및 2분에 걸쳐 95% B의 AB (A=0.1% TFA/H2O, B=0.085% TFA/아세토니트릴) 구배로 0.9 mL/분의 유량으로 분석 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 평가하였다 (214 nm의 파장). 안정성은 또한 인슐린 HMWP, 7.8 X 300 mm 칼럼 (파트 번호 WAT2015549) 상에서 20 mM 인산나트륨, 20% 아세토니트릴, pH 7.2의 구동 완충제로 40분 동안 0.5 mL/분의 유량으로 구동시키면서 크기 배제 HPLC (SEC-HPLC)에 의해 평가하였다.
물리적 외관은 실시예 1의 경우 pH 7 및 pH 8에서 어떠한 단백광 또는 입자 없이 투명 내지 무색이었다. RP-HPLC 및 SEC-HPLC 결과를 하기 표 7에 요약한다. 회수는 RP-HPLC 및 SEC-HPLC에 의하면 5% 내였고, 허용되었다.
표 7.
Figure pct00014
4℃ 및 40℃에서 4주 동안 유지시킨 T8 완충제 중 샘플을 또한 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)에 의해 분석하였다. 실시예 1의 경우 pH 8에서 어떠한 주요 분해 부위도 확인되지 않았다. 전체적으로, 실시예 1에 대한 화학적 안정성은 시험된 완충제 조건 하에 탁월한 안정성을 나타내었다.
물리적 안정성
실시예 1의 시험 샘플을 T7 완충제에서 투석을 통해 제조한 다음, 기재된 바와 같이 T7m, T7Nm, 및 T7Tm 중 2 mg/mL 펩티드로 제제화하였다. 각각의 제제를 깨끗한 유리 바이알로 옮기고, 6시간 동안 실온에서 테플론-코팅된 자기 젓개를 통해 400 rpm으로 교반하였다. 시간 0, 1시간, 3시간 및 6시간에 평가를 위해 분취물 100 μL를 채취하였다. 샘플을 이전과 같이 육안 및 SEC-HPLC에 의해 평가하였다.
모든 제제는 어떠한 단백광 또는 침전 없이 투명하고 무색으로 유지되었다. 표 8에 제시된 바와 같이, SEC-HPLC의 주요 피크에서 펩티드의 백분율은 모든 제제의 경우에 5% 내로 유지되었다. 데이터는 실시예 1이 시험된 조건 하에 양호한 물리적 안정성 특징을 갖는다는 것을 나타낸다.
표 8.
Figure pct00015
조합물 연구
GIP-GLP-1 공동-효능제 또는 GLP-1R 효능제와의 공동-제제에서의 활성
실시예 1 및 3과 서열식별번호: 15의 GIP-GLP-1 공동-효능제 또는 둘라글루티드의 공동-제제를 하기 안정성 연구에 기재된 바와 같이 제조하고, 개별 화합물 및 공동-제제의 활성을 상기 기재된 방법을 사용하여 측정하였다. 데이터를 표 9 및 10에 제시한다. (>) 정성자는 % 효능이 50%에 도달하지 않았다는 것을 나타내고, 계산된 EC50은 시험된 최고 농도를 사용하여 수득하였다.
표 9.
Figure pct00016
표 10.
Figure pct00017
이들 데이터는 실시예 1 및 3의 생물활성이 스트레스 및 비-스트레스 조건 하에서 및/또는 GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제와의 조합물에서 유지된다는 것을 나타낸다.
GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제와의 조합물의 생체내 연구
본 발명의 글루카곤 수용체 효능제와 장기-작용 GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제의 조합물의 효과를 C57/BL6 식이 유도 비만 (DIO) 마우스에서 시험하였다. GIP-GLP-1 공동-효능제는 상기 기재된 바와 같은, 서열식별번호: 14의 구조를 갖는다. GLP-1R 효능제는 WO2005000892에 기재된 GLP-1-Fc 융합체이다. 공동-제제는 일반적으로 하기 공동-제제 안정성 연구에 기재된 바와 같이 제조하였다.
C57/BL6 DIO 동물은 12주 동안 고지방 (지방으로부터 60% Kcal) 식이에 놓인 후, 당뇨병은 아니지만, 대사 증후군의 모든 특징인 인슐린 저항성, 이상지혈증, 및 간 지방증을 나타낸다. 따라서, 이들 동물에서의 연구를 사용하여 체중 감소, 신체 조성 및 간 지방증과 같은 파라미터에 대한 제안되는 치료제(들)의 효과를 조사할 수 있다.
체중이 42-47 g이고 11.9 g 내지 17.2 g 범위의 초기 지방 질량을 갖는 20-21주령 수컷 DIO C57/Bl6 수컷 마우스를 사용하였다. 동물을 온도-제어되는 (24℃) 설비 내에 12시간 명/암주기로 개별적으로 수용하고 (22:00에 점등), 음식물 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 설비에의 2주 순응 후, 마우스를 체중에 기초하여 치료군으로 무작위화하였고 (n=5/군), 따라서 각각의 군은 유사한 출발 평균 체중을 가졌다.
비히클, 비히클 (20 mM 트리스-HCl 완충제, pH 8.0) 중에 용해된 시험 화합물 (용량 범위 3 내지 10 nmol/kg), GLP-1R 효능제 (10 nmol/kg), GIP-GLP-1 공동-효능제 (10 nmol/kg) 또는 그의 조합물 (용량 범위 3 내지 10 nmol/kg)을 15일 동안 3일마다 암주기의 개시 30-90분 전에, 자유롭게 공급된 마우스에게 SC 주사에 의해 투여하였다. SC 주사는 제1일, 제4일, 제7일, 제10일, 및 제13일에 이루어졌다. 연구 내내 매일 체중, 음식물 섭취 및 글루코스를 측정하였다. 체중에서의 절대 변화는 분자의 최초 주사 전 동일한 동물의 체중을 차감하여 계산하였다. 제0일 및 제14일에, 총 지방 질량을 에코 메디칼 시스템(Echo Medical System) (텍사스주 휴스턴) 기기를 사용하여 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 측정하였다.
매일 혈액 글루코스를 아큐-체크 혈당측정기 (로슈)를 사용하여 꼬리 정맥 혈액으로부터 측정하였다. 연구 말미에, 동물을 희생시키고, 간을 제거하여 동결시켰다. 희생 시 수집한 간의 균질물로부터 간 트리글리세리드를 결정하고, 혈장 콜레스테롤을 히타치 모듈러 P(Hitachi Modular P) 임상 분석기 상에서 측정하였다. 일원 ANOVA에 이어 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 군들 사이의 통계적 비교를 행하였다. 체중 감소 저하에 대한 ED50 값은 그래프패드 프리즘에서 비-선형 피트 툴을 사용하여 결정하였다.
상기 기재된 바와 같이 수행된 연구에 대한 체중 감소 및 퍼센트 지방 질량 변화 데이터를 하기 표 11 (실시예 1) 및 12 (실시예 1 및 2)에 제공한다. 표 11의 결과는 군당 5마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 표현되고, 표 12의 결과는 군당 6마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 표현된다.
실시예 1 및 2와 GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제의 조합물은 실시예 1 또는 2, GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제 단독의 효과와 비교하여 체중 및 지방 질량에 대해 상승작용적 효과를 갖는다 (표 11 및 12).
표 11.
Figure pct00018
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001, 비히클 대조군으로부터 유의함 (일원 ANOVA, 던넷).
표 12.
Figure pct00019
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001, 비히클 대조군으로부터 유의함 (일원 ANOVA, 던넷).
혈액 글루코스, 혈장 콜레스테롤 및 간 트리글리세리드에 대한 효과 데이터는 하기 표 13 (평균 ± SEM, n=5) 및 14 (평균 ± SEM, n=6)에 제공한다. 개별 투여된 실시예 1 및 2는 혈액 글루코스를 용량-의존성 방식으로 증가시킨 반면에, 이러한 실시예 글루카곤 수용체 효능제와 GLP-1R 효능제 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제의 조합물은 혈액 글루코스, 혈장 콜레스테롤 및 간 트리글리세리드를 감소시켰다.
표 13.
Figure pct00020
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 대조군으로부터 (일원 ANOVA, 던넷).
표 14.
Figure pct00021
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 대조군으로부터 (일원 ANOVA, 던넷).
GIP-GLP-1 공동-효능제와의 공동-제제에서의 안정성
실시예 1 및 3의 샘플을 제조하고, 기재된 바와 같이 T7에 대해 투석하였다. 둘 다의 실시예를 T7, T7m, T7N 및 T7Nm 중 개별적으로 1 mg/mL 펩티드로 제제화하였다. 서열식별번호: 15의 GIP-GLP-1 공동-효능제를 또한 제조하고, 실시예 글루카곤 수용체 효능제에 대해 기재된 바와 같이 T7에 대해 투석하였다. GIP-GLP-1 공동-효능제를 T7, T7m 및 T7Nm 중 1 mg/mL 펩티드로 제제화하였다. 1 mg/mL 실시예 1 및 1 mg/mL GIP-GLP-1 공동-효능제 또는 1 mg/mL 실시예 3 및 1 mg/mL GIP-GLP-1 공동-효능제를 함유하는 공동-제제화된 샘플을 또한 제조하고, T7, T7m, T7N 및 T7Nm 중 제제화하였다. 각각의 제제화된 샘플을 3개의 바이알로 옮겼다. 샘플을 4℃, 25℃ 및 40℃에서 유지시켰다. 샘플을 총 4주 동안 2주마다 평가하였다. 샘플을 탁도 및 상 분리에 대해 육안으로 평가하였다. 안정성은 단일 작용제 제제에 대해 상기 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 평가하였다. 기재된 RP-HPLC 방법은 실시예 화합물 및 GIP-GLP-1 공동-효능제 주요 피크, 뿐만 아니라 pH 9 및 40℃에서 3일 동안 샘플에 스트레스를 가하여 생성된 모든 분해 피크의 양호한 분리를 제공하였다.
모든 샘플에 대한 총 피크 회수는 RP-HPLC에 의하면 5% 내였다. 모든 제제는 어떠한 단백광 또는 침전 없이 투명하고 무색으로 유지되었다. 4주 후 RP-HPLC에 의해 관찰된 바와 같은 그의 각각의 주요 피크에서의 펩티드의 백분율에서의 변화를 표 15에 요약한다. 주요 피크의 백분율에서의 손실은 실시예 1의 경우, 모든 시험된 제제 중 GIP-GLP-1 공동-효능제와의 공동-제제와 비교하여 단일 작용제로서 제제화된 경우에 유의하게 변하지 않았다. GIP-GLP-1 공동-효능제는 실시예 1 또는 실시예 3과의 공동-제제 대비 단일 작용제로서 제제화된 경우에 주요 피크의 백분율에서 지속적 손실을 나타내었다. 데이터는 실시예 1 및 3이 단일 작용제로서 제제화된 경우 또는 GIP-GLP-1 공동-효능제와 공동-제제화된 경우에 허용되는 안정성을 갖고, 실시예 1 및 3이 공동-제제 중 GIP-GLP-1 공동-효능제 안정성에 유해한 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
표 15.
Figure pct00022
4℃ 및 40℃에서 4주 동안 인큐베이션된 T7Nm 중에 제제화된 실시예 1, GIP-GLP-1 공동-효능제, 및 그의 조합물, 및 T7 중에 제제화된 실시예 1 및 GIP-GLP-1 공동-효능제의 조합물의 샘플을 또한 LC-MS에 의해 평가하였다. 어떠한 주요 분해 부위도 확인되지 않았다. 실시예 1 및 GIP-GLP-1 공동-효능제 둘 다의 경우에, 화학적 변형은 단일 작용제 제제 대 공동-제제의 경우에 유의하게 상이하지 않았다.
GLP-1R 효능제와의 공동-제제에서의 안정성
실시예 1 및 3을 제조하고, T7 완충제로의 제조에 대해 상기 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 C6.5 (10 mM 시트레이트 pH 6.5)에 대해 투석하였다. 화합물을 완충제 C6.5, C6.5M (10 mM 시트레이트, 46.4 mg/mL D-만니톨, pH 6.5), C6.5T (10 mM 시트레이트, 0.02% 폴리소르베이트-80, pH 6.5), 및 C6.5MT (10 mM 시트레이트, 46.4 mg/mL D-만니톨, 0.02% 폴리소르베이트-80, pH 6.5) 중 1 mg/mL 펩티드로 개별적으로 제제화하였다. C6.5 중 둘라글루티드의 46.5 mg/mL의 원액 농도를 사용하여 둘라글루티드를 C6.5 및 C6.5MT 중 3 mg/mL로 제제화하였다. 3 mg/mL 둘라글루티드 및 1 mg/mL 실시예 1, 또는 3 mg/mL 둘라글루티드 및 1 mg/mL 실시예 3을 갖는 C6.5MT 중의 공동-제제를 제조하였다. 각각의 제제화된 샘플을 3개의 바이알로 옮기고, 4℃, 25℃ 및 40℃에서 유지시켰다. 샘플을 총 4주 동안 2주마다 평가하였다. 샘플을 탁도 및 상 분리에 대해 육안으로 평가하였다. 안정성은 상기 기재된 바와 같이 RP-HPLC 및 SEC-HPLC에 의해 평가하였다. 둘 다의 기재된 HPLC 방법은 실시예 화합물 및 둘라글루티드 주요 피크, 뿐만 아니라 pH 9 및 40℃에서 3일 동안 샘플에 스트레스를 가하여 생성된 모든 분해 피크의 양호한 분리를 제공하였다.
모든 안정성 샘플에 대한 총 피크 회수는 RP-HPLC 및 SEC-HPLC 둘 다에 의하면 5% 내였다. 모든 제제는 어떠한 단백광 또는 침전 없이 투명하고 무색으로 유지되었다. 4주 후 SEC-HPLC에 의해 관찰된 바와 같은 그의 각각의 주요 피크에서의 화합물의 백분율에서의 변화를 표 16에 요약한다. 실시예 1 및 3은 일반적으로 안정하였고, 주요 피크의 유의한 손실을 나타내지 않았다. 실시예 1은 단일 작용제 제제와 비교하여 둘라글루티드와 공동-제제화된 경우에 더 낮은 안정성을 나타내지 않았다. 실시예 3은 단일 작용제 제제와 비교하여 둘라글루티드와 공동-제제화된 경우에 약간 더 낮은 안정성을 나타내었다. GLP-1R 효능제는 단일 작용제 제제와 비교하여 실시예 1 또는 3과 공동-제제화된 경우에 더 낮은 안정성을 나타내지 않았다.
표 16.
Figure pct00023
RP-HPLC에 의해 관찰된 바와 같이, 안정성 추세는 SEC-HPLC에 의해 관찰된 것과 유사하였다. 4주 후 RP-HPLC에 의해 관찰된 바와 같은 그의 각각의 주요 피크에서의 화합물의 백분율에서의 변화를 표 17에 요약한다. 실시예 1 및 3은 일반적으로 안정하였고, 주요 피크의 유의한 손실을 나타내지 않았다. 실시예 1은 단일 작용제 제제와 비교하여 GLP-1R 효능제와 공동-제제화된 경우에 더 낮은 안정성을 나타내지 않았다. 실시예 3은 단일 작용제 제제와 비교하여 GLP-1R 효능제와 공동-제제화된 경우에 약간 더 낮은 안정성을 나타내었다. GLP-1R 효능제는 단일 작용제 제제와 비교하여 어느 하나의 실시예와 공동-제제화된 경우에 더 낮은 안정성을 나타내지 않았다.
표 17.
Figure pct00024
*데이터가 기기 오류로 인해 이용가능하지 않음
서열
서열식별번호: 1 - 인간 글루카곤
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT
서열식별번호: 2 - 인간 GLP-1
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
서열식별번호: 3 - 인간 OXM
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열식별번호: 4 - 인간 GIP
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ
서열식별번호: 5 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T 또는 L이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 14 내지 24이고;
X5는 E 또는 A이고;
X6은 T 또는 E이고;
X7은 부재하거나, 또는 GPSSGAPPPS 및 GPSSG로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고,
C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다.
서열식별번호: 6 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 16이고;
X5는 E이고;
X6은 T이고;
X7은 GPSSGAPPPS이고;
C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 7 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고,
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 18이고;
X5는 E이고;
X6은 T이고;
X7은 GPSSGAPPPS이고;
여기서 C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 8 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 L이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 16이고;
X5는 E이고;
X6은 T이고;
X7은 GPSSGAPPPS이고;
여기서 C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 9 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고;
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 16이고;
X5는 E이고;
X6은 T이고;
X7은 GPSSG이고;
C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 10 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서 X1은 Aib이고;
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 18이고;
X5는 E이고;
X6은 T이고;
X7은 GPSSG이고;
C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 11 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1이고 b는 16이고;
X5는 A이고;
X6은 E이고;
X7은 부재하고;
C-말단 아미노산은 C-말단 산이다.
서열식별번호: 12 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1이고 b는 18이고;
X5는 A이고;
X6은 E이고;
X7은 부재하고;
C-말단 아미노산은 C-말단 산이다.
서열식별번호: 13 - GIP-GLP 공동-효능제
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQX3AX4VQWLIAGGPSSGAPPPS;
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 Aib이고;
X3은 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노- 에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO (CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1 또는 2이고 b는 10 내지 20이고;
X4는 Phe 또는 1-나프틸알라닌 (1-Nal)이고;
C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다.
서열식별번호: 14 - GIP-GLP 공동-효능제
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQX3AX4VQWLIAGGPSSGAPPPS;
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 Aib이고;
X3은 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노- 에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO (CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 18이고;
X4는 1-Nal이고;
C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 15 - GIP-GLP 공동-효능제
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQX3AX4VQWLIAGGPSSGAPPPS;
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 Aib이고;
X3은 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노- 에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO (CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1이고 b는 18이고;
X4는 Phe이고;
C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 16 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T 또는 L이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 14 내지 24이고;
X5는 E이고;
X6은 T이고;
X7은 GPSSGAPPPS 및 GPSSG로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;
C-말단 아미노산은 아미드화된다.
서열식별번호: 17 - 글루카곤 수용체 효능제
YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
여기서
X1은 Aib이고;
X2는 T이고;
X3은 Aib이고;
X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 1이고 b는 14 내지 24이고;
X5는 A이고;
X6은 E이고;
X7은 부재한다.
SEQUENCE LISTING <110> ELI LILLY AND COMPANY <120> GLUCAGON RECEPTOR AGONISTS <130> X20416 <150> 62/246,199 <151> 2015-10-26 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln 35 40 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at pos. 7 is Thr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H , wherein a is 1 or 2 and b is 14 to 24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at pos. 24 is Glu or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at pos. 29 is Thr or Glu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at pos. 30 is either: absent, or a polypeptide selected from the group consisting of GPSSGAPPPS and GPSSG, and the C-terminal amino acid is optionally amidated <400> 5 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Xaa Trp Leu Leu Glu Xaa Xaa 20 25 30 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 2 and b is 16. <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at pos. 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 6 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 2 and b is 18 <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at pos. 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 7 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 2 and b is 16 <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at pos. 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 8 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Leu Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 2 and b is 16 <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> The Gly at pos. 34 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 9 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 2 and b is 18 <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Gly at pos. 34 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 10 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Glu Trp Leu Leu Glu Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 1 and b is 16 <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Glu at pos. 29 is C-terminal acid <400> 11 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Ala Trp Leu Leu Glu Glu 20 25 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 1 and b is 18 <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Glu at pos. 29 is C-terminal acid. <400> 12 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Ala Trp Leu Leu Glu Glu 20 25 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at pos. 13 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO(CH2)b-CO2H wherein a is 1 or 2 and b is 10 to 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at pos. 22 is Phe or 1-naphthylalanine (1-Nal) <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at pos. 39 is optionally amidated <400> 13 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Xaa Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at pos. 13 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO(CH2)b-CO2H wherein a is 2 and b is 18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at pos. 22 is 1-Nal <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at pos. 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 14 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Xaa Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at pos. 13 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO(CH2)b-CO2H wherein a is 1 and b is 18 <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at pos. 29 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 15 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Xaa Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at pos. 7 is Thr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa as pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the Lys side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H, wherein a is 2 and b is 14 to 24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa as pos. 24 is Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa as pos. 29 is Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa as pos. 30 is a peptide selected from the group consisting of GPSSGAPPPS and GPSSG;and the C-terminal amino acid is amidated <400> 16 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Xaa Trp Leu Leu Glu Xaa Xaa 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at pos. 2 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at pos. 7 is Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at pos. 16 is alpha Aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa as pos. 20 is Lys which is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the K side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H, wherein a is 1 and b is 14 to 24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at pos. 24 is Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at pos. 29 is Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at pos. 30 is absent <400> 17 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Xaa Glu Phe Val Xaa Trp Leu Leu Glu Xaa Xaa 20 25 30

Claims (21)

  1. 화학식:
    YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
    을 포함하는 글루카곤 수용체 효능제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    여기서
    X1은 Aib이고;
    X2는 T이고;
    X3은 Aib이고;
    X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 16이고;
    X5는 E이고;
    X6은 T이고;
    X7은 GPSSGAPPPS이고;
    C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 6).
  2. 화학식:
    YX1QGTFX2SDYSKYLDX3KKAX4EFVX5WLLEX6X7
    로 이루어진 글루카곤 수용체 효능제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    여기서
    X1은 Aib이고;
    X2는 T이고;
    X3은 Aib이고;
    X4는 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H에 의한 접합을 통해 화학적으로 변형된 K이고, 여기서 a는 2이고 b는 16이고;
    X5는 E이고;
    X6은 T이고;
    X7은 GPSSGAPPPS이고;
    C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다 (서열식별번호: 6).
  3. T2DM, 비만, 지방간 질환, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 및 야간 저혈당증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 또는 제2항의 글루카곤 수용체 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 유효량의 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 추가의 치료제가 GLP-1R 효능제인 방법.
  6. 제5항에 있어서, GLP-1R 효능제가 둘라글루티드인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 추가의 치료제가 GIP-GLP-1 공동-효능제인 방법.
  8. 제7항에 있어서, GIP-GLP-1 공동-효능제가 서열식별번호: 15의 구조를 갖는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 글루카곤 수용체 효능제.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, T2DM, 비만, 지방간 질환, NAFLD, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 또는 야간 저혈당증의 치료에 사용하기 위한 글루카곤 수용체 효능제.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, T2DM, 비만, NAFLD, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 또는 야간 저혈당증의 치료에 사용하기 위한, GLP-1R 효능제, GIP-GLP-1 공동-효능제 및 인슐린 수용체 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 동시, 개별, 또는 순차적 사용으로 사용하기 위한 글루카곤 수용체 효능제.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, T2DM, 비만, NAFLD, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 또는 야간 저혈당증의 치료에 사용하기 위한, 둘라글루티드와 조합하여 동시, 개별, 또는 순차적 사용으로 사용하기 위한 글루카곤 수용체 효능제.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, T2DM, 비만, NAFLD, NASH, 이상지혈증, 대사 증후군, 고인슐린혈증 또는 야간 저혈당증의 치료에 사용하기 위한, 서열식별번호: 15의 구조를 갖는 GIP-GLP-1 공동-효능제와 조합하여 동시, 개별, 또는 순차적 사용으로 사용하기 위한 글루카곤 수용체 효능제.
  14. 제1항 또는 제2항의 글루카곤 수용체 효능제 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 추가의 치료제가 GLP-1R 효능제인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, GLP-1R 효능제가 둘라글루티드인 제약 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 추가의 치료제가 GIP-GLP-1 공동-효능제인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, GIP-GLP-1 공동-효능제가 서열식별번호: 15의 구조를 갖는 것인 제약 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루카곤 수용체에서의 글루카곤 수용체 효능제의 활성이 GLP-1 수용체에서의 글루카곤 수용체 효능제의 효력보다 적어도 100-배 더 높은 것인 글루카곤 수용체 효능제.
  21. 유효량의 제1항 또는 제2항의 글루카곤 수용체 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 비-치료 체중 감소를 유도하는 방법.
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