CN104215707B - 栝楼桂枝汤的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了栝楼桂枝汤的质量检测方法，它是采用高效液相-串联质谱法(HPLC-MS)测定栝楼桂枝汤中瓜氨酸和γ-GABA含量的方法，其中，色谱条件：色谱柱：Ultimate？AQ-C18柱(4.6×100mm，3μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水(15:85)，流速：0.3mL/min，柱温30℃；质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，源喷射电压2500V；源温度：350°；正离子多反应监测(MRM)模式检测。本发明采用HPLC-MS法应用于复方栝楼桂枝汤中2种主要氨基酸含量测定，所建立的含量方法简便，准确，稳定，重复性好，与高效液相色谱法比较，缩短了分析的时间，灵敏度高，在一定质量浓度范围内被测物质有较好的线性关系，可作为栝楼桂枝汤中瓜氨酸与γ-氨基丁酸的含量测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及栝楼桂枝汤的质量检测方法。
背景技术
复方栝楼桂枝汤来源于东汉末年张仲景的《金匮要略》[1]，由天花粉、白芍、桂枝、生姜、甘草及大枣6味药组成。该方具有解肌调营，养营生津之功效，现代临床用于治疗颈椎病、癫痫等。目前，该复方经临床剂量增减后被批准为福建省第二人民医院院内制剂(批件号：闽2013S0001)，用于治疗太阳柔痉体强证，即脑卒中后肢体痉挛[4]，症见肢体肌肉痉挛为特征的临床病理综合征。
处方中君药天花粉富含大量氨基酸，其中瓜氨酸和γ-氨基丁酸是主要的具有生理调节作用的物质。瓜氨酸不能通过食物蛋白得到，只能通过其他氨基酸进行转化，临床上具有增强免疫力、促进血液循环、维持血糖平衡、保持胆固醇正常、维护肺功能、提高脑力清晰度、降低压力、提高男性性功能等重要作用[5]。
γ-氨基丁酸(简称γ-GABA)也是一种非蛋白氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。γ-GABA具有临时降压、缓解精神压力、对胰腺癌细胞SW1990细胞的生长及血管内皮生长因子表达的影响，以及作为哺乳动物摄食和味觉的调控因子等[6]。因此测量两种氨基酸的含量对于栝楼桂枝汤的质量控制评价有一定的意义。
近年来，2010年版中国药典仅用瓜氨酸对天花粉进行定性鉴别，并无定量鉴别方法，本文采用HPLC-MS法分别测定栝楼桂枝汤中瓜氨酸和γ-GABA的含量，为建立复方的质量评价标准提供一定的理论依据。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种栝楼桂枝汤的质量检测方法。
本发明提供了栝楼桂枝汤的质量检测方法，它是采用高效液相-串联质谱法(HPLC-MS)测定栝楼桂枝汤中瓜氨酸和γ-GABA含量的方法，其中，色谱条件：色谱柱:AQ-C18柱(4.6×100mm，3μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水(15:85)，流速：0.3mL/min，柱温30℃；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，源喷射电压2500V；源温度：350°；正离子多反应监测(MRM)模式检测。
其中，所述的质谱条件为：用于定量分析的离子瓜氨酸m/z176→m/z70，裂解电压(Fragmentor)为75V，碰撞能量(CE)为30eV；γ-氨基丁酸m/z104→m/z87，裂解电压(Fragmentor)为50V，碰撞能量(CE)为10eV。
其中，所述的栝楼桂枝汤的制备方法为：桂枝和生姜分别加10倍量水用蒸馏法提取6h，收集挥发油，将两者的药渣与天花粉、白芍、生姜、甘草、大枣混合，按处方比例量加10倍量水煎煮2次，每次1.5h，过滤合并两次药液，浓缩药液，置-4℃冰箱保存备用。
具体地，它包括如下步骤：
a、混合对照品溶液制备：分别精密称取瓜氨酸和γ-GABA适量，用超纯水溶解，定容，摇匀，配置成质量浓度为0.098mg/mL和1.060mg/mL对照品贮备液，置4℃冰箱保存；
b、供试品溶液制备：精密量取栝楼桂枝汤1mL，用超纯水定容至100mL，作为供试品储备液，临用前将供试品贮备液稀释25倍，定容，混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液混匀，作为供试品溶液；
c、采用高效液相-串联质谱法(HPLC-MS)测定栝楼桂枝汤中瓜氨酸和γ-GABA含量。
本发明采用HPLC-MS法应用于复方栝楼桂枝汤中2种主要氨基酸含量测定，所建立的含量方法简便，准确，稳定，重复性好，与高效液相色谱法比较，缩短了分析的时间，灵敏度高，在一定质量浓度范围内被测物质有较好的线性关系，可作为栝楼桂枝汤中瓜氨酸与γ-氨基丁酸的含量测定方法。
附图说明
图1混合对照品及各样品色谱图
1、混合对照品(A：γ-GABAB：瓜氨酸)2、阴性样品(桂枝汤)3、栝楼桂枝汤4、天花粉
具体实施方式
实施例1本发明栝楼桂枝汤的质量检测方法
1材料
1.1仪器Agilent6410液相色谱与串联三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent公司)、Millipore超纯水(公司)、超声仪、电子分析天平，旋转蒸发仪，涡旋仪、超声仪、电子分析天平、离心机。
1.2药品与试剂瓜氨酸对照品(批号：110875-200506)、内标物栀子苷(中国药品生物制品检定所)购自中国药品生物制品检定所；γ-GABA对照品(批号101080844A44207-5G)购自美国Sigma公司；天花粉(批号：12052301)、桂枝(批号：12042301)、大枣(批号：12042301)、生姜(批号：12042301)、甘草(批号：12042301)、白芍(批号：121218)均购自福州回春中药饮片厂有限公司；乙腈(色谱纯，Merch公司)、甲酸(色谱纯，阿拉丁)、实验用水为超纯水。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱:AQ-C18柱(4.6×100mm，3μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水(15:85)，流速：0.3mL/min，柱温30℃。
2.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)，源喷射电压2500V；源温度：350°；正离子多反应监测(MRM)模式检测。用于定量分析的离子瓜氨酸m/z176→m/z70，裂解电压(Fragmentor)为75V，碰撞能量(CE)为30eV；γ-氨基丁酸m/z104→m/z87，裂解电压(Fragmentor)为50V，碰撞能量(CE)为10eV；
2.3样品制备
2.3.1栝楼桂枝汤制备桂枝和生姜分别加10倍量水用蒸馏法提取6h，收集挥发油，将两者的药渣与天花粉、白芍、生姜、甘草、大枣混合，按处方比例量加10倍量水煎煮2次，每次1.5h，过滤合并两次药液，浓缩药液，置-4℃冰箱保存备用。
2.3.2阴性桂枝汤制备桂枝和生姜分别加10倍量水用蒸馏法提取6h，收集挥发油，将两者的药渣与白芍、生姜、甘草、大枣混合，按处方比例量加10倍量水煎煮2次，每次1.5h，过滤合并两次药液，浓缩药液，置-4℃冰箱保存备用。
2.4溶液的制备
2.4.1混合对照品溶液制备分别精密称取瓜氨酸和γ-GABA适量，用超纯水溶解，定容，摇匀，配置成质量浓度为0.098mg/mL和1.060mg/mL对照品贮备液，置4℃冰箱保存。
2.4.2供试品溶液制备精密量取栝楼桂枝汤以及桂枝汤1mL，用超纯水定容至100mL，作为供试品储备液。临用前将供试品贮备液稀释25倍，定容，混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液混匀，作为供试品溶液，进样分析。
2.5方法学考察
2.5.1专属性考察2种成分混合对照品溶液(A图)、阴性对照(B图)及供试品溶液(C图)，结果表明，阴性样品在与对照品相同保留时间的位置上，无相应的色谱峰出现，说明其它组分不干扰该2种成分的测定；见图1。
2.5.2线性关系考察分别精密吸取瓜氨酸和γ-GABA对照品溶液，进行倍比稀释，配制成浓度为0.0196～9.8μg/mL、2.06～257.5μg/mL的各浓度系列对照溶液，分别注入HPLC-MS，按上述液质条件测定峰面积，记录色谱图；同时以对照品峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3。
表2各有效成分的线性关系、相关系数、线性范围
2.5.3精密度精密吸取混合对照品溶液，按照上述液质条件，连续进样5次，结果瓜氨酸与γ-GABA的色谱峰面积平均值分别为2.85％和2.67％，结果见表3.
表3精密试验结果
2.5.4重复性实验精密吸取2.4.2项栝楼桂枝汤供试品溶液5uL在同一条件下连续进样6次，结果见表4，相对标准偏差(RSD)分别为2.76％和2.76％，RSD均小于2％，表明方法重复性良好。
表4重复性试验结果
2.5.5稳定性实验精密吸取2.4.2项栝楼桂枝汤供试品溶液5uL在同一条件下分别在0、1、2、6、8、12h进样，仍按上述液质条件进行分析，测定峰面积积分值。结果瓜氨酸与γ-氨基丁酸峰面积的RSD分别为1.89％和1.99％(n＝5)，表明被测溶液在室温条件下12h内稳定，能满足含量测定要求。
表6稳定性试验结果
2.5.6加样回收率实验
瓜氨酸、γ-GABA：精密量取已知浓度供试品溶液10mL6份，分别加入对照品溶液适量，按最终色谱条件测定；结果见表7。RSD均小于3％，表明本方法准确可靠。
表7加样回收率试验结果(n＝6)
2.6样品含量测定取栝楼桂枝汤，按照2.3和2.4.2项下的方法处理，平行6份进样分析，每个成分按2.5.2项下标准曲线计算含量(mg/g生药)，各提取物中各成分的含量见表8.
表8样品中瓜氨酸和γ-GABA含量(n＝3)
本发明采用HPLC-MS法应用于复方栝楼桂枝汤中2种主要氨基酸含量测定，所建立的含量方法简便，准确，稳定，重复性好，与高效液相色谱法比较，缩短了分析的时间，灵敏度高，在一定质量浓度范围内被测物质有较好的线性关系。
Claims (4)
1.栝楼桂枝汤的质量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相-串联质谱法HPLC-MS测定栝楼桂枝汤中瓜氨酸和γ-GABA含量的方法，其中，色谱条件：色谱柱:UltimateAQ-C18柱4.6×100mm，3μm；流动相为乙腈-0.1％甲酸水，体积比15:85，流速：0.3mL/min，柱温30℃；
质谱条件：电喷雾离子源ESI，源喷射电压2500V；源温度：350°；正离子多反应监测MRM模式检测。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的质谱条件为：用于定量分析的离子瓜氨酸m/z176→m/z70，裂解电压Fragmentor为75V，碰撞能量CE为30eV；γ-氨基丁酸m/z104→m/z87，裂解电压Fragmentor为50V，碰撞能量CE为10eV。
3.根据权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于：所述的栝楼桂枝汤的制备方法为：桂枝和生姜分别加10倍量水用蒸馏法提取6h，收集挥发油，将两者的药渣与天花粉、白芍、生姜、甘草、大枣混合，按处方比例量加10倍量水煎煮2次，每次1.5h，过滤合并两次药液，浓缩药液，置-4℃冰箱保存备用。
4.根据权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、混合对照品溶液制备：分别精密称取瓜氨酸和γ-GABA适量，用超纯水溶解，定容，摇匀，配置成质量浓度为0.098mg/mL和1.060mg/mL对照品贮备液，置4℃冰箱保存；
b、供试品溶液制备：精密量取栝楼桂枝汤1mL，用超纯水定容至100mL，作为供试品储备液，临用前将供试品贮备液稀释25倍，定容，混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液混匀，作为供试品溶液；
c、采用高效液相-串联质谱法HPLC-MS测定栝楼桂枝汤中瓜氨酸和γ-GABA含量。
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