BRPI0406057B1

BRPI0406057B1 - Sequência nucleotídica de um inibidor de proteases do tipo kunitz obtida a partir de uma biblioteca de cdna de glândulas salivarares de carrapatos amblyomma cajennese uso da proteína recombinante

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Publication number: BRPI0406057B1
Application number: BRPI0406057-1A
Authority: BR
Inventors: Ana Marisa Chudzinski Tavassi; Durvanei Augusto Maria; Isabel De Fátima Correia Batista; Paulo Lee Ho
Original assignee: União Química Farmacêutica Nacional S/A; Ana Marisa Chudzinski Tavassi; Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De São Paulo - Fapesp
Priority date: 2004-09-15
Filing date: 2004-09-15
Publication date: 2021-10-26
Also published as: WO2006029492A1; CA2581001C; CN101142232B; BRPI0406057A; CA2680759A1; AU2005284615A1; JP2008512992A; DK1799707T3; US20090042786A1; AU2005284615B2; ES2410160T3; JP4980220B2; CA2581001A1; US8440795B2; CN101142232A; EP1799707B1; EP1799707A1

Abstract

"processo de obtenção de um inibidor de proteases do tipo kunitz a partir de uma biblioteca de cdna de glândulas salivares do carrapato amblyomma cajennense: seqüência de oligonucleotídeos do clone, e seqüência de aminoácidos da proteína recombinante, proteína recombinante; processo para determinação da atividade inibitória sobre o fator x ativado, processo para determinação da atividade anticoagulante em plasma, processo para determinação da atividade apoptótica em linhagens de células tumorais humanas e murinas, processo de determinação de atividade anti-metastática em tumor de melanoma, processo de determinação da atividade anti-câncer, in vitro e in vivo, uso do recombinante em diferentes mecanismos homeostáticos (coagulação e resposta imunológica) , anti-proliferativos, anti-apoptóticos e anti-angiogênicos". trata-se a presente invenção de um inibidor recombinante do tipo kunitz que foi obtido a partir de um gene clonado de uma biblioteca de cdna das glandulas salivares do amblyomma cajennense, e o inibidor denominado amblyomin-x apresenta massa molecular da ordem de 13.500 da. o amblyomin-x quando testado sobre o fxa utilizando o substrato colorimetrico especifico para o fxa, inibe o fxa e a inibição mostrou-se dependente da presença de fosfolipideos (fosfatidilserina : fosfatidilcolina). a atividade inibitória do amblyomin-x foi verificada também nos testes de coagulação, sendo avaliados o tempo de tromboplastina parcial ativado (ttpa ), o tempo de protrombina (tp) e o teste pca - pro coagulant activity assay. a presença de 7,5 um do inibidor prolonga cerca de 3 vezes ttpa; aproximadamente 6 vezes o tp, e também prolonga cerca de 2 vezes o pca, sendo que este ensaio foi realizado tanto na presença de fosfatidilserina : fosfatidilcolina como na presença de corpos apoptóticos (produzidos a partir de células cho) como fonte de fosfolipídeos. o tratamento in vitro das linhagens tumorais b16f10, sw12a1, b3, l292, mcf7, hl60, k562, u937 e jurkat com o amblyomin-x demonstrou que o inibidor exerce um efeito apoptótico de maneira tempo e dose dependente nestas células. nenhum efeito foi observado em células normais de fibroblastos humanos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos. camundongos (c57bl/6j) portadores de melanomas dorsais que receberam amblyomin-x (1mg/kg) durante 12 dias apresentaram redução significativa da massa tumoral e do número de metastases quando comparados a um grupo de animais portadores do tumor e não tratados. além disso, camundongos (c57bl/6j) portadores de metastases no pulmão, que foram tratados com amblyomin-x (1mg/kg) durante 12 dias apresentaram redução no número de nódulos tumorais no parênquima pulmonar quando comparados a um grupo com tumor não tratado. o tratamento, por via subcutânea, de camundongos (c57bl /6j) portadores de melanoma, com 42 doses de amblyomin-x (1mg/kg), mostrou que o inibidor é capaz de fazer a remissão completa do tumor, impedir metastases e não causar alterações hematológicas nos animais, mantendo o hemograma semelhante ao de um grupo de animais sadios. a análise do ciclo celular dos tumores dorsais de animais tratados com amblyomin-x mostrou uma grande parte das células tumorais em apoptose, quiescentes e com baixa capacidade proliferativa. as células obtidas de metastases pulmonares encontram-se em grande parte na fase g2/m incapazes de se dividir. a atividade funcional de macrófagos obtidos de animais portadores de tumor dorsal e tratados com amblyomin-x mostrou que a droga aumenta a capacidade fagocitária destes macrófagos mediada por c3b e pelo receptor fc. assim, o amblyomin-x além de um inibidor do fxa, também é eficaz no tratamento alvo de neoplasias malignas.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de uma proteína recombinante, com atividade inibitória sobre o Fator X ativado da coagulação sanguínea; caracterizada como um inibidor do tipo Kunitz, obtida a partir de uma biblioteca de cDNA de glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense; ao processo de obtenção da sequência de oligonucleotídeos do clone e sequência de aminoácidos da proteína recombinante, ao processo para determinação da atividade inibitória desta proteína recombinante sobre o Fator X ativado, ao processo para determinação da atividade anti-coagulante em plasma, ao processo para determinação da atividade apoptótica em linhagens de células tumorais, ao processo de determinação de atividade anti-metastática em tumor de melanoma, ao processo de determinação da atividade anti-câncer (melanoma, colon, mama, pulmão e leucemia), in vitro e in vivo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Inibidores de proteinases são moléculas que atuam nos mecanismos naturais do controle da atividade de enzimas proteolíticas e estão envolvidos em muitos processos fisiológicos como a coagulação, fibrinólise, a digestão e também em patologias como câncer, distúrbios hemorrágicos, inflamação e regulação de pressão arterial (DECLERCK & IMREM, 1994).

[003] Um dos meios mais eficientes para o controle da coagulação é a ação dos inibidores de proteinases. Estudos têm demonstrado que as glândulas salivares da maioria das espécies de hematófagos, tais como carrapatos, produzem várias substâncias anti-coagulantes, com o objetivo de facilitar a fluidez do sangue, otimizando assim a sua alimentação (RIBEIRO, 1995).

[004] Os inibidores de Fator X ativado (FXa) são de grande interesse clínico, pois através da inibição do FXa (dentro do complexo protrombinase), tornou-se possível o controle da ativação da protrombina em trombina evitando a formação de coágulos.

[005] A inibição das proteases é desencadeada assim que o processo de coagulação tem início. O “Tissue Factor Pathway Inhibitor” (TFPI) é o principal inibidor da via extrínseca e foi classificado como um membro dos inibidores da família Kunitz do tipo BPTI (Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor) (Broze, 1998).

[006] O TFPI humano é uma proteína composta por três domínios do tipo Kunitz (K1, K2 e K3), sendo que o primeiro domínio K1 possui uma região ácida na porção N- terminal, e nele se encontra o sítio de ligação ao FVIIa. No segundo domínio encontra- se a região responsável pela ligação do FXa, e finalmente o terceiro domínio, que apresenta uma região básica na porção C-terminal, cuja função ainda não se encontra elucidada, provavelmente contém um sítio para a ligação de heparina (Rao, 1995).

[007] O mecanismo de inibição do TFPI humano envolve duas etapas, na primeira o inibidor se associa aos fatores FXa e FVIIa, sendo que a inibição propriamente dita ocorre na etapa seguinte, onde há a formação de um complexo quaternário no qual estão presentes o Fator Tecidual (TF), FXa, FVIIa e o TFPI humano (TFPI:FXa:FVIIa:TF) (Sandset & Bendz, 1997).

[008] O inibidor do fator tecidual humano do tipo-2 "tissue factor pathway inhibitor - 2" (TFPI-2), é uma proteína de 32-kDa que consiste em três domínios do tipo Kunitz (Chand et al., 2004). O TFPI-2 inibe uma variedade de serino proteases envolvidas na coagulação e fibrinólise provavelmente devido a um resíduo de arginina encontrado na posição 24 (R24) do primeiro domínio do tipo Kunitz, sendo que no segundo e terceiro domínios se encontram respectivamente resíduos de glutamina e serina. Em estudos recentes um mutante foi construído onde o resíduo de arginina foi modificado por um resíduo de glutamina (R24Q TFPI-2) e esta mutação origina cerca de 90% de perda na atividade inibitória sobre tripsina bovina, fato que demonstra a importância deste resíduo na manutenção da atividade inibitória (Kamei et al., 1999).Aspectos Gerais do Desenvolvimento de Câncer e Suas Interações com a Coagulação

[009] O risco relativo de um indivíduo desenvolver uma neoplasia é determinado por uma combinação de vários fatores genéticos e ambientais. Dessa forma, no processo de carcinogênese, a substância, denominada carcinógeno (de natureza biológica, química ou física), pode atuar como iniciadora ou mesmo como promotora do processo que se desenvolve até a formação das metástases (Ruoslahti E., 1996)

[010] Na iniciação do processo neoplásico ocorrem alterações irreversíveis em estruturas alvo do DNA, contribuindo para a transformação celular. O metabolismo do carcinógeno ocorre em duas etapas denominadas Fase I (ativação) e Fase II (detoxificação). Algumas enzimas da fase I atuam não só como catalisadoras de reações oxidativas, bem como metabolizam quantidades elevadas de carcinógenos ou xenobióticos lipofilícos (Bell et. al, 1993).

[011] A persistência dos danos ao DNA é dependente dos mecanismos de reparo e da sobrevida celular do tecido lesado, dessa forma, se o dano é persistente ou não reparado, ocorre a expansão de um clone celular mutado (Duke et al, 1996; Wainscoat e Fey, 1990).

[012] A promoção é um processo, muitas vezes longo, ocorre sobre células iniciadas, levando à diminuição do período de latência e/ou aumentando a susceptibilidade das mesmas às alterações genéticas. Geralmente os promotores não são genotóxicos, são tecido-específicos e possuem múltiplos mecanismos de ação, atuando, de maneira epigenética resultando em distúrbios da homeostasia tecidual (Hermo et al, 1987).

[013] Os mecanismos de promoção incluem, ativação de receptores de superfície celular, ativação ou inibição de enzimas citosólicas, ativação de fatores de transcrição e tradução (via Kinase), estimulação da proliferação, inibição da apoptose, e citotoxicidade direta.

[014] Na etapa de progressão, as células tumorais também apresentam a capacidade de formar novos vasos sanguíneos que as nutrirão, promoverão crescimento descontrolado, pois invadem inicialmente os tecidos vizinhos, podendo chegar ao interior de um vaso sanguíneo ou linfático e, através desses, disseminar-se, chegando a outros órgãos. (Meyer et al., 1998, Matsuda et al 2003).

[015] As células normalmente respondem a vários danos intrínsecos, gerados a partir dos produtos do metabolismo intermediário, das reações inflamatórias agudas e crônicas e nos processos que geram reativos instáveis do oxigênio e do nitrogênio. Além disso, existem os fatores lesivos extrínsecos tais como os agentes físicos, químicos e os biológicos, que são eliminados por processos homeostásicos.

[016] A última etapa, (denominada progressão tumoral), inclui a invasão e a metastatização. Nesta fase, as lesões preexistentes ou pré-neoplásicas são somadas às alterações mutacionais aleatórias que incluem aberrações sequência-específicas, duplicação, deleção e/ou perda de heterozigosidade em genes específicos, como oncogenes, genes supressores de tumor, metastageneses e os genes de reparo.

[017] Dessa forma, os oncogenes, são inativos em condições fisiológicas, e podem ser ativados pela troca de um aminoácido, ou pela amplificação de um gene em um cromossomo dando lugar às várias cópias deste gene com aumento de sua atividade, e por último, pela recombinação entre genes de distintos cromossomos. A diferença entre estes genes é que normalmente estão ativos, vigilantes, para evitar o crescimento incontrolado das células (Budillon, 1995).

[018] Embora a instabilidade genômica seja a característica principal da progressão tumoral, é a ausência do controle da duplicação celular que distingue a malignidade e que torna os cânceres letais. As células tumorais, assim como as células dos tecidos normais se duplicam através do ciclo celular (Fearon ER, 1997).

[019] O conhecimento do ciclo celular, porém, não esclareceu por completo o mecanismo de regulação da multiplicação das populações de células tumorais, e as características de crescimento dos cânceres in vivo, estes mecanismos também não estão elucidados.

[020] O caráter invasivo da progressão tumoral está associado ao aumento da mobilidade das células tumorais, da capacidade de proteólise e da perda da inibição de contato célula-célula e célula-matriz, nas quais as células metastáticas se disseminam através dos sistemas circulatório, linfático, pela extensão local ou ainda através sua implantação. Assim, os padrões de localização das metástases variam de acordo com o tipo de câncer primário, e em alguns órgãos como os músculos, a pele, o timo e o baço, raramente ocorrem metástases (Goel, et al., 2004).

[021] Alguns tipos de cânceres não tratáveis ou sem resposta terapêutica, reincidem predominantemente no local do câncer primário e em seus linfonodos regionais, e estes tumores também podem produzir metástases durante o seu tratamento.

[022] A incidência de tumores malignos representa um número expressivo sendo a segunda causa de morte da população mundial. O tratamento do câncer baseia-se, de forma geral, na remoção cirúrgica de tumores sólidos localizados in situ, radioterapia para tumores em pacientes sem condições clínicas ou possibilidades técnicas de remoção completa, e quimioterapia nos casos de tumores não sólidos ou de tumores sólidos disseminados.

[023] A quimioterapia, radioterapia e cirurgia tornaram-se métodos terapêuticos de emprego intensivo e associado a outros tratamentos, e a introdução do conceito de tratamentos adjuvantes vem sendo uma inovação no processo de controle e cura de muitos pacientes portadores de neoplasias, melhorando desta forma os resultados obtidos (Tsao, et al., 2004).

[024] Atualmente protocolos radioterapêuticos mais precisos envolvem a administração de doses elevadas na massa tumoral, e menos intensas nos tecidos normais adjacentes; tratamentos quimioterápicos com drogas eficazes contra a neoplasia e com menos efeitos colaterais, permitiram indicações oncológicas mais amplas e, consequentemente, resultados mais encorajadores em muitos casos. No entanto, a maioria dos tumores sólidos apresenta respostas modestas ou ineficazes aos quimioterápicos, limitando a indicação e a eficácia tanto do tratamento adjuvante de tumores localizados, quanto da terapêutica dos casos metastáticos (Sekire, et al., 2004).

[025] A grande incidência de metástases, que ocorre em 50% dos pacientes portadores de câncer de pulmão, na fase avançada, mostra que é necessário que se desenvolvam novas estratégias terapêuticas mais eficientes, que possam oferecer a estes pacientes oportunidades reais de controle in da proliferação e da disseminação das células neoplásicas.

[026] O século XX ofereceu um avanço extraordinário neste sentido, com a descoberta de drogas dotadas de propriedades antineoplásicas amplas, tais como a mostarda nitrogenada identificada na década de 40, e uma variedade de outras substâncias com eficácia parcial ou completa contra alguns tipos histológicos de tumores. Apesar da expansão rápida da seleção das drogas anticâncer, que poderão ser aplicadas em vários tumores sólidos como câncer de pulmão, cólon, mama e próstata, que ainda não se dispõem de tratamentos sistêmicos adequados e eficazes. Nos carcinomas de pulmão de não-pequenas células e nos melanomas cutâneos, os quais são prevalentes em países desenvolvidos, no entanto são frequentes em todo o mundo, a resposta modesta a quimioterapia é de 15% a 20% em todos os esquemas disponíveis e de 40% a 50% em outras associações terapêuticas (Sekire, et al., 2004).

[027] Assim sendo, torna-se óbvia a necessidade de se procurar novas alternativas medicamentosas para melhorar a eficácia do tratamento de doenças neoplásicas avançadas. A maioria dos quimioterápicos é conhecida pela sua capacidade de controlar a proliferação celular, e recentemente foram identificadas drogas com atividade específica contra alguns mecanismos metabólicos exclusivos da célula tumoral (tratamentos alvo). Nesses tratamentos as substâncias atuariam contra os tumores, através de alterações no ciclo celular, podendo ser mais eficientes no seu mecanismo exato de ação.

[028] A morbidade em câncer associada aos tratamentos quimioterápicos ainda é um obstáculo significativo, pois a descoberta de drogas antineoplásicas de fácil administração, com poucos ou insignificantes efeitos colaterais, e com mecanismos de ação seletivo para a célula neoplásica tem sido a meta atual.

[029] Uma das vias reguladoras envolvidas no crescimento e progressão tumoral é o sistema de coagulação sanguínea, onde primariamente essa resposta é devida a expressão de fatores pró-coagulantes como o Fator Tissular (FT), que é uma das proteínas que desencadeia o processo de coagulação levando à geração de trombina e a formação do coágulo.

[030] Numa segunda etapa, as células tumorais passam a expressar o receptor do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (u-PA), sendo que os ativadores de plasminogênio promovem a ativação do plasminogênio em plasmina. Este sistema é responsável pela coordenação e remodelagem tecidual.

[031] Em pacientes portadores de neoplasias como por exemplo nos adenocarcinomas pulmonares, carcinomas renais e em melanoma maligno, ocorre a perda da homeostasia promovendo alterações do sistema de coagulação, processo decorrente da geração de trombina e do Fator X ativado (Edward RL, 1993). Por outro lado, a ativação da coagulação sanguínea que ocorre em pacientes portadores de neoplasias primárias, ou submetidos a tratamentos quimioterapêuticos é influenciada pela biologia das células tumorais, cujos mecanismos ainda não estão esclarecidos (RicKels et.al, 1992, Schafer, et al., 2003).

[032] A avaliação laboratorial dos parâmetros da coagulação tem mostrado níveis elevados de forma significante em certos tipos de tumores, sendo possível a sua determinação na circulação como por exemplo a presença de fragmentos de protrombina, D-dímeros, do Fator XIIa e a sua correlação prognóstica (Gordon SG, 1992).

[033] O tratamento de pacientes portadores de tumores primários, metástases ou que apresentaram complicações durante o tratamento quimioterápico, com anticoagulantes, como por exemplo, as heparinas de baixo peso molecular ou inibidores da vitamina K (Hoffmal et al., 2001), mostraram-se eficientes no prolongamento da sobrevida desses pacientes (Moussa et. al., 2003; Sutherland et.al., 2003). A patogênese da trombose venosa em neoplasias malignas é multifatorial, e seu mecanismo envolve a liberação de compostos pró-coagulantes pelo próprio tumor, fatores genéticos e do próprio tratamento (Sorensen et. Al.,2003; Gouin-Thibaut e Samama MM, 2000).

[034] Estudos clínicos têm demonstrado que este quadro tromboembólico é prevenido pelo uso de heparinas de baixo peso molecular, em cânceres de mama que são removidos cirurgicamente (Bergqvist D.,2002; Lee e Levine, 2003). As evidências histológicas e funcionais da interação dos vários sistemas biológicos, como o imunológico e a coagulação em certas neoplasias, foram identificados e revelaram alterações importantes como a presença de fatores ativadores de coagulação associados ao infiltrado inflamatório, às células endoteliais e a neoangiogenese (Loreto et.al,2000; Zacharcki D, 2003; Ornstein et.al, 2000; Gale e Gordon 2001; Cotrino J, 1996).

[035] Citocinas derivadas das células tumorais como o fator de necrose tumoral (TNF), a interleucina 1 e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), são quimiotáticos e induzem a formação de vasos, porque são capazes de induzir a expressão de fatores pró-coagulantes e trombogênicos, modificando o estado pró- coagulante no microambiente tumoral (Sorensen, et.al, 2003, Fernandez et.al, 2004).

[036] A presente invenção vem constatar e comprovar que uma proteína presente na saliva do carrapato Amblyomma cajennense possui atividade apoptótica em células tumorais (de melanoma humano-SKMEL28, MEL85, MEWO, melanoma murino B16F10, leucemias: pró-mielocítica HL60, eritroleucemia K562, linfoblástica T JURKAT, leucemia T U937, linfocítica murina T, YAC-1; cânceres de pulmão H292, mama MCF-7 e MCF-10 e colon retal SW613-12A1, SW613-B3), e atividade anti-tumoral in vivo (melanoma), bem como atividade antimetastática e anti-angiogênica.

[037] A presente invenção vem demonstrar também que a proteína recombinante possui a capacidade de estimular a atividade fagocítica de macrófagos (espraiamento e índices fagocitários mediados por complemento ou anticorpo), e não possui atividade citotóxica em células normais como células endoteliais humanas derivadas de cordão umbilical, fibroblastos, plaquetas, polimorfonucleares, linfócitos e macrófagos humanos, como também em órgãos internos como rins, fígado, coração, baço e pulmão, nos quais não foi observada nenhuma alteração histopatológica após o tratamento prolongado com a proteína.

[038] De acordo com a presente invenção obtém-se uma proteína recombinante, a qual é um novo inibidor de Fator X ativado, um novo agente anti-tumoral, anti- metastático e anti-angiogênico, obtida a partir de um gene que compõe uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense.

[039] O composto obtido pela presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos determinada a partir do cDNA da glândula do Amblyomma cajennense e pode ser definido como um polipeptídeo ou proteína cuja sequência foi determinada a partir do cDNA que codifica entre as bases 1 e 505.

[040] Especificamente, o composto da presente invenção é uma proteína recombinante denominado Amblyomin-X e compreende uma proteína de dois domínios com homologia aos domínios, dos tipos Kunitz e MAP Kinase.

[041] O composto da presente invenção apresenta utilidade como anti-câncer, bem como no desenvolvimento de vacinas a partir do cDNA.

[042] Em linhas gerais, a invenção se baseia inicialmente na construção de uma biblioteca de cDNA a partir das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense e subsequente sequenciamento de genes aleatórios.

[043] Dentre as sequências obtidas identificou-se uma que apresentava homologia com inibidores de serino proteases (SERPINAS). A sequência completa do gene eleito foi analisada em banco de dados e demonstrou 17% de homologia com o TFPI humano do tipo 1 (Tissue Factor Pathway Inhibitor) e 21% de homologia com o Ixolaris (inibidor isolado do carrapato Ixodes scapularis).

[044] A proteína foi expressa em bactéria E. coli, na forma de corpúsculo de inclusão e obtida após solubilização com uréia e β-mercaptoetanol sendo posteriormente purificada em coluna de afinidade de Níquel-Sepharose.

[045] A proteína recombinante possui 13,5 kDa e é capaz de inibir o Fator X ativado em sistemas purificados, apenas quando na presença dos fosfolipídeos fosfatidilcolina e fosfatidilserina. Além disso, a proteína recombinante é capaz de prolongar o tempo de coagulação do plasma, observado em testes de coagulação globais como por exemplo, o TTPA, e o TP.

[046] A proteína recombinante não demonstrou efeito sobre células endoteliais normais (HUVECs-Human Vein Endothelial Cells), nem sobre linhagens de fibroblastos humanos normais.

[047] No entanto, produz morte celular por apoptose em várias linhagens de células tumorais entre elas de melanoma murino (B16F10).

[048] Camundongos C57BI/6J portadores de melanoma melanótico B16F10 foram tratados com a proteína recombinante por via intraperitoneal e subcutânea com diferentes doses e por diferentes espaços de tempo. Observou-se que os animais tratados apresentaram significativa redução da massa tumoral (tumor dorsal). Além disso, o índice de metástase foi altamente reduzido, quando o tratamento foi realizado durante 14 dias após o implante tumoral. Ainda, quando o tratamento foi iniciado após o terceiro dia do implante tumoral, houve remissão completa do tumor e ausência de metástases no animal. Observou-se que a proteína parece possuir atividade anti- angiogênica uma vez que inibiu a formação de vasos ao redor do tumor implantado, em relação ao controle (sem tratamento).

[049] A proteína também demonstrou ativar a atividade fagocítica de macrófagos tanto in vitro como in vivo.

[050] Foram realizados hemogramas completos do sangue dos animais controle e tratados e os resultados preliminares sugerem que o animal mantém sua capacidade coagulante. Além disso, o hematócrito e os níveis de hemoglobina encontram-se próximos ou iguais aos dos animais normais (sem tumor) demonstrando que a proteína além de proteger o animal de anemia, aparentemente também não altera a medula óssea e tampouco causa fenômenos hemorrágicos, pelo seu poder inibitório de FXa e longo tempo de tratamento.

VANTAGENS EM RELAÇÃO AOS TRATAMENTOS USUAIS

[051] A indicação é como um agente biológico e não quimioterápico. Assim, deve agir apenas em células doentes e não nas normais, e não traria os efeitos secundários de um quimioterápico.

[052] Pelo seu potencial inibitório sobre o FXa, poderia ser utilizado como um protetor de tromboembolismo (anticoagulante) em pacientes submetidos a tratamento com quimioterápicos, ou ainda em pacientes com tendências protrombóticas.

[053] Por tratar-se de um recombinante pode ser obtido em grandes quantidades.

[054] A metodologia empregada no processo de obtenção e na análise da referida proteína recombinante pode ser sintetizada através das seguintes etapas procedimentais: Ingurgitamento dos carrapatos e extração das glândulas salivares; Obtenção do RNA total pelo método do fenol isotiocianato de guanidina; Quantificação do RNA; Eletroforese Gel de agarose para DNA; Eletroforese em Gel de agarose para RNA; Purificação do mRNA em coluna de afinidade oligo (dT); Construção da Biblioteca de cDNA; Síntese da primeira fita; Síntese da segunda fita; Seleção de tamanho dos fragmentos de cDNA em gel agarose; Ligação do cDNA aos Adaptadores Eco RI; Digestão com Not I; Seleção de tamanho do cDNA em gel de agarose; Ligação do cDNA ao vetor; Transformação de bactérias competentes; Preparação do DNA plasmidial pelo método da lise alcalina; Preparo das amostras para o sequenciamento; Buscas de sequências; Amplificação do clone selecionado; Síntese do oligonucleotídeo iniciador na reação de PCR; Reação em cadeia da polimerase (PCR); Seleção dos plasmídios recombinantes em gel de agarose; Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição; Ligação ao vetor de expressão; Indução da expressão em pequena escala; Expressão de proteínas; Estudos estruturais; Análise da estrutura secundária do recombinante; Análise da estrutura primária e modelagem da estrutura terciária; Ensaios bioquímicos; Inibição de FXa na presença de fosfolipídeos; Testes de coagulação; Cultura das Linhagens Tumorais Humanas e Murinas; Tratamento das Células Tumorais com a Proteína Recombinante Amblyomin-X; Determinação do Conteúdo de DNA por Citometria de Fluxo; Determinação das Fases do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo; Cultura das linhagens Tumorais e Implantação Tumoral em Animais; Observação do Crescimento Tumoral; Determinação da Atividade Citotóxica; Obtenção dos Macrófagos Peritoneais; Cultura de Fibroblastos da Pele Humana e Análise Estatística.

[055] Para a realização da presente invenção foram preferencialmente empregados os seguintes materiais:linhagem: Escherichia coli;1) Cepa DH5a: 080 dlacZΔM15, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+) SupE44, relAl, deoR Δ(lac ZYA - arg I) u169.2) Cepa BL21 (DE3): F’, ampT, hsdSB(r8-, m8-), dcm, gal (DE3). O bacteriófago DE3 contém o gene da RNA polimerase do fago T7 sob o controle do promotor Lac UV5, indutível com isopropil-tio-β-galactosideo (IPTG).Plasmídeos:1) pGEM-11Zf(+): vetor digerido com EcoR I e Not I usado na construção de biblioteca plasmidial. Manual técnico da PROMEGA, 1999.2) pGEM-T “easy”: O plasmídeo pGEM-T “easy” contém os promotores T7 e SP6 flanqueando a região MCS (“multiple cloning site”), para a subclonagem de produtos de PCR. Manual técnico da PROMEGA, 1999. 3) pAE: vetor de expressão derivado do pRSETA (Invitrogen) e do pET3-His (Chen, 1994) construído no Laboratório de Biotecnologia Molecular do Instituto Butantan (Ramos et al, 2003).

[056] O pAE é um vetor de alta expressão que combina a eficiência do promotor T7 e o alto número de cópias do plasmídeo pRSETA, com uma fusão N-terminal de seis histidinas não removíveis do pET3-His, que permite a purificação de proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (“Immobilized Metal Affinity Chromatografy”, IMAC). A adição desta pequena fusão não interfere na atividade da maioria de proteínas recombinantes estudadas.

[057] Para a Síntese dos oligonucleotídeos iniciadores nas reações de PCR o processo inicia-se da seguinte maneira:

[058] Os oligonucleotídeos “sense” (P1 e P2) foram desenhados a partir da sequência N-terminal da proteína. A estes oligonucleotídeos foi acrescentado preferencialmente um sítio de restrição para subseqüente clonagem unidirecional. Os oligonucletídeos “sense” e “anti-sense” também foram utilizados. Todos foram diluídos em tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM) para uma concentração final de 10 pmol/μl (100 μM).

[059] No que se refere ao preparo do mRNA as etapas procedimentais são definidas como se seguem abaixo:

[060] Coelhos domésticos (Oryctolagus cuniculus), foram infestados com carrapatos Amblyomma cajennense e após o período de infestação (1 semana) as fêmeas ingurgitadas eram retiradas, a saliva coletada e as glândulas salivares extraídas lândulas salivares utilizando-se materiais cirúrgicos esterilizados. Os complexos salivares de carrapatos foram dissecados e depositados em “cryo-tubes” e imediatamente congelados em Nitrogênio líquido, e armazenadas em freezer -80°C.Extração do RNA total

[061] As glândulas salivares foram mergulhadas em reagente de fenol isotiocianato de guanidina conforme a metodologia descrita no manual do fabricante.Perfil eletroforético do RNA total

[062] Os acessórios do sistema de eletroforese foram tratados com peróxido de hidrogênio (H2O2) 3% para eliminar RNAase e foram enxaguados com água tratada com DEPC autoclavada. Um gel de agarose 1,5% em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0, foi depositado na bandeja do sistema. Duas amostras contendo 10 ou 15 μl de RNA total (16,7 ng/μl), 5 μl de tampão de amostra e H2O tratada com DEPC para um volume final de 25 μl, foram aplicadas no gel. A migração das amostras foi feita a 5 V/cm até o bromofenol atingir 2/3 do gel.Purificação do mRNA em coluna de afinidade oligo (dT) celulose

[063] O mRNA foi purificado em coluna de afinidade de oligo dT celulose lavada com NaOH 0,1 N e equilibrada com 1 ml de tampão de ligação Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 300 mM, SDS 0,1%, pH 7,0.

[064] Ao RNA total foram adicionados 3 ml do tampão de ligação, seguido da incubação a 70°C por 5 minutos, resfriamento em gelo por mais 5 minutos e aplicação na coluna de afinidade. A coluna foi drenada por gravidade e lavada com mais 4 ml de tampão de ligação para eliminar todo RNA que não fosse o mRNA.

[065] O mRNA foi eluído com 1,5 ml de tampão Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, SDS 0,1%, pH 7,0 e coletado em tubo limpo tratado, aquecido a 70°C por 5 minutos e resfriado em gelo por 5 minutos. Após incubação por 20 minutos a temperatura ambiente, o material foi adicionado de 90 μl de NaCl 5 M e aplicado novamente na coluna reequilibrada com tampão de ligação. Após nova lavagem com 4 ml do tampão de ligação e eluição com 1,5 ml do tampão de eluição, o material coletado foi precipitado com 90 μl de NaCl 5 M e 3 ml de álcool etílico absoluto a -80°C " overnight". O material foi então centrifugado a 7000 g por 20 minutos a 4°C e o sobrenadante descartado.

[066] O mRNA foi lavado com 1 ml de álcool etílico 75% e centrifugado a 7000 g por 2 minutos a 4°C. Após a secagem o precipitado de mRNA foi ressuspendido em 20 μl de H2O tratada com DEPC e estocado a -80°C.Quantificação do mRNA

[067] Para um volume final de 500 μl foram adicionados 2 μl do mRNA em 498 μl de H2O milli-Q autoclavada. As leituras de densidade óptica foram feitas em 260 e 280 nm em cubetas de quartzo de 500 μl. A concentração do mRNA foi calculada a partir da fórmula:[RNA] = A260 x D x 40 μg/ml

[068] Onde, D=fator de diluição.

[069] No que se refere à construção da biblioteca de cDNA segue-se os seguintes procedimentos:

[070] A biblioteca de cDNA foi construída a partir de 5,0 μg de mRNA isolado utilizando preferencialmente o kit SuperScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies) modificado.

Síntese da Primeira Fita

[071] Foram diluídos 5,0 μg de mRNA em 6 μl de H2O tratada com DEPC ao qual foram adicionados 1,5 μl de primer adaptador NotI e aquecidos a 70 oC por 10 minutos, resfriados em banho de gelo e centrifugados rapidamente. Ao tubo foram acrescentados 4 μl de tampão de primeira fita 5x, 2 μl de DTT 0,1 M, 1 μl de mistura de dNTP 10 mM e 0,5 μl de H2O. A reação foi homogeneizada, centrifugada rapidamente e equilibrada a 44 oC por 2 minutos. Foram adicionados 5 μl da enzima Super Script II RT, e a mistura foi incubada a 44 oC por mais 90 minutos. A reação foi interrompida pelo resfriamento a 4 oC.

Síntese da Segunda fita

[072] Foram acrescentados à mistura de reação da primeira fita, 91 μl de H2O, 30 μl de tampão da segunda fita, 3 μl de mistura dNTP 10 mM, 1 μl de E. coli DNA ligase 10 U/μl, 4 μl de E.coli DNA polimerase I 10 U/ml e 1 μl de E coli RNAase H (2 U/μl). Após ser agitada levemente, a mistura foi incubada a 16°C por 2 horas e acrescida de 2 μl de T4 DNA polimerase I com mais 5 minutos de incubação na mesma temperatura. A reação foi interrompida pelo resfriamento em gelo e pela adição de 10 μl de EDTA 0,5 M.

Seleção de tamanhos dos fragmentos em gel agarose

[073] Toda a reação da segunda fita acrescida de 17 μl de Ficoll isento de xileno cianol foi aplicada em gel agarose a 1% e após 1 cm de migração da amostra a 80 V em sistema de eletroforese foram recortados do gel duas faixas; uma contendo fragmentos entre 400 e 800 pb (baixo peso que foi estocada em freezer -80 oC) e outra com fragmentos acima de 1000 pb (alto peso que foi utilizada na continuidade desta invenção).

[074] O DNA foi purificado do gel utilizando-se preferencialmente o kit Concert Gel Extraction Systems (Life Technologies), e o cDNA eluído com 50 μl de H2O aquecida a 65 oC e concentrado para 30 μl em concentrador a vácuo.Ligação do cDNA aos Adaptadores EcoR I

[075] Ao tubo de reação foram adicionados 10 μl de tampão T4 DNA ligase 5X, 5 μl de adaptadores Eco RI e 5 μl de T4 DNA ligase com posterior incubação a 16 oC por 16 horas. Em seguida a reação foi aquecida a 65 oC por 10 minutos e resfriada em gelo. Após a adição de 2 μl de solução de ATP e 2 μl da T4 polimerase quinase a reação foi incubada por 30 minutos a 37 oC.

[076] O cDNA foi extraído com 55 μl de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), agitado e centrifugado a 14000g por 5 minutos a temperatura ambiente. A fase aquosa superior foi transferida para outro tubo e acrescida de 2 volumes de etanol absoluto e 1 volume de acetato de sódio 3 M e resfriado a -80 oC por 1 hora. Após centrifugação a 14000 g por 20 minutos e lavagem com 500 μl de etanol 70%, o cDNA foi seco em fluxo por cerca de 5 minutos.

Digestão com NotI

[077] Ao precipitado adicionou-se 41 μl de H2O, 5 μl de tampão de reação específico, 4 μl de NotI, gentilmente homogeneizados e seguidos de incubação por 2 horas a 37 oC.

Segunda seleção de tamanhos em gel agarose

[078] 50 μl da reação do fragmento de alto peso molecular foram aplicadas em gel de agarose 1% e após eletroforese as bandas foram recortadas do gel e o cDNA de alto peso foi purificado e eluído com 50 μl de H2O conforme descrito na primeira seleção de tamanhos (Seleção de tamanhos dos fragmentos em gel agarose).

Ligação unidirecional do cDNA ao vetor pGEM11Zf(+)

[079] A fração de alto peso (14 μl), foi acrescida de 4 μl de tampão T4 DNA ligase, 1 μl de vetor de clonagem, preferencialmente o pGEM11Zf(+) (digerido previamente com as enzimas EcoR I- Not I) e 1 μl de T4 DNA ligase e incubadas a 16 oC por 18 horas.

[080] O processo de transformação bacteriana da presente invenção segue o seguinte procedimento:

Transformação de E. coli DH5α competente

[081] DNA de alto peso (2 μl) foi adicionado a 50μl de bactérias cálcio competentes (DH5α) armazenadas a -80°C e previamente descongeladas em gelo por 15 minutos. As soluções foram incubadas por 30 minutos em gelo e submetidas, a seguir, a choque térmico a 42 oC por 2 minutos e novamente ao gelo por 5 minutos.

[082] Às bactérias transformadas foram adicionados 350 μl de meio SOC e transferidas para tubos aerados sendo incubadas a 37 oC sob agitação (220 rpm/min) por 90 minutos. O cDNA foi plaqueado (200 μl de cDNA de alto peso molecular) com meio 2YT- ampicilina e as placas foram incubadas por 18 horas a 37 oC. 20 colônias contendo insertos foram incubadas em duas placas a 37 oC em 2,5 ml de meio 2YT- ampicilina 100 μg/ml por 18 horas sob agitação de 200 rpm. Os cDNAs foram purificados utilizando preferencialmente o kit de mini-prep - Concert Rapid Plasmid (Life Technologies) eluídos com 50 μl de TE a 65 oC.

[083] Para a análise da biblioteca em plasmídios o seguinte procedimento foi adotado:

[084] Os plamídios (4μl) foram digeridos a 37°C por 2 horas na presença de 1 μl de tampão de reação específico, 4 μl de água, 0,5 μl de enzima EcoRI (10U/μl. Os 0,5 μl de HindIII (10U/μl e os fragmentos gerados foram analisados em gel de agarose a 1% com brometo de etídio. Todos os plasmídios analisados foram submetidos ao sequenciamento.

[085] Visando obter a amplificação da biblioteca, misturas contendo 50μl de bactérias cálcio- competentes DH5α e 5μl do DNA de alto peso molecular ligados ao vetor de clonagem, foram incubadas 30 min em gelo, por 2 min a 42 oC e novamente em gelo por mais 5 min. Em seguida foram adicionados 10 ml de meio 2YT/ampicilina 100 μg/ml. As soluções foram gentilmente homogeneizadas e alíquotas de 2,5 ml foram pipetadas em tubos deaerados e incubados a 37 0C por 18 h. A seguir o DNA plasmidial foi extraído utilizando colunas de mini-preps e eluído com 50 μl de H2O a 65 oC e estocado a -20 0C.

A Reação em cadeia da polimerase (PCR)

[086] As reações de PCR “Polymerase Chain Reaction” preparadas para um volume final de 50 μl continham 1 μl de dNTPs 10 mM, 5 μl do Tampão para Taq DNA Polimerase 10x, 1,5 μl de MgSO4 50 mM, 0,5 μl de TaqDNA polimerase 2,5 U. Para amplificar o cDNA que codifica para o inibidor, foram utilizados 4μl do DNA plasmidial amplificado,4μl do oligonucleotídio P1 10 pM e 2 μl do oligonucleotídio SP6 10 pM. A reação foi incubada num termociclador o qual executou uma programação de desnaturação inicial a 94°C por 3 min, 30 ciclos de desnaturação (94°C por 45 segundos), anelamento (50 oC por 25 segundos), extensão (72 oC por 4 min) e uma extensão final a 72 oC por 15 min. Em seguida, as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1%. Após 2 h de migração eletroforética a 80 V, as bandas correspondentes aos produtos de amplificação esperado foram recortadas do gel e o DNA foi extraído e eluído em 30 μl de H2O para ligação a um segundo vetor de clonagem, preferencialmente o “pGEM-T Easy Vector Systems” (Promega).

[087] Para proceder a ligação do DNA ao plasmídio optou-se pela seguinte metodologia:

[088] As ligações foram feitas para um volume final de 10 μl contendo 6 μl do produto de PCR (1700 pb), 1 μl do vetor pGEM-T, 2 μl do tampão T4 DNA ligase 5x e 1 μl da T4 DNA Ligase 1U/μl a 16oC por 18 horas.

[089] Cepas de E. coli DH5a foram incubadas com 5 μl da reação de ligação vetor- inserto e plaqueadas. Das colônias formadas, 20 foram coletadas para pré-inóculo e “mini-prep”, exatamente de acordo com o protocolo descrito para a transformação de E. coli DH5a competente.

A Seleção dos plasmídios recombinantes em gel de agarose

[090] Antes de processar as reações de “mini-preps”, 300 μl de cada pré inóculo foram submetidos a um rápido processo de purificação fenol:clorofórmio. Em seguida, 20 μl de cada amostra foram aplicados num gel de agarose 1%, em tampão TAE 1X. Após a corrida eletroforética o gel foi corado com uma solução de Brometo de etídio 0,1 μg/ml para selecionar os maiores plasmídeos recombinantes, sob a luz UV. Os clones positivos do ítem anterior foram submetidos às mini-preps, e eluídos com 60 μl de água.

A Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição

[091] Os DNAs dos clones purificados que foram amplificados por PCR utilizando tanto o primer P1 quanto P2, foram digeridos a 37°C por 2 h numa solução contendo 5 μl do DNA plasmidial, 2 μl de tampão de reação específico, 0,5 μl de EcoRI (10 U/μl), 0,5 de Xho I (10 U/μl) e 12 μl de H2O para um volume final de 20 μl.

[092] Os mesmos DNAs plasmidiais (5 μl) foram incubados nas mesmas condições com 1 μl de tampão de reação específico 1 μl de EcoR I (10 U/μl) e 12 μl de água.

[093] Os produtos da digestão foram analisados em gel de agarose 1%. Os clones da biblioteca e os DNAs subclonados em pGEM-T “easy” foram seqüenciados.

[094] Para executar os seqüenciamentos dos DNAs optou-se pelo método de terminação de cadeia por dideoxinucleotídeo, adaptado para o seqüenciador automático. Foram preparados 400 ng do DNA plasmidial, através de purificação por mini-preps, que foram usados como molde na reação de seqüenciamento. Foram usados nas reações os oligonucleotídeos descritos, T7 e SP6. Depois da termociclagem, os produtos de amplificação foram separados no gel de seqüenciamento de DNA de 36 cm de comprimento (4,25% acrilamida:bis-acrilamida na proporção de 19:1, em 1X TBE e 7 M Uréia). O sistema de detecção desse aparelho consiste em uma fonte de laser e um detector de fluorescência, localizados na parte inferior do gel de sequenciamento. Cada dNTP emite uma fluorescência específica que é captada pelo detector, e este por sua vez envia a informação a um computador que automaticamente registra a posição do nucleotídeo no eletroferograma. A corrida foi feita por 7 horas. Todos os DNAs sequenciados foram comparados com sequências do “GenBank” através dos sites www.ncbi.nlm.nih.gov/, baseados no algoritmo dos programas BLASTx e BLASTn ou, www.ebi.ac.uk/ para o programa FASTA.

[095] O processo de expressão da proteína recombinante preferencialmente em E. coli cepa BL21(DES) empregado na presente invenção segue a seguinte linha de procedimento:

Ligação ao vetor pAE

[096] Os clones positivos cujos insertos seqüenciados confirmaram a sequência do Amblyomin-X foram incubados em 7 ml de LB/ampicilina a 37 oC por 18 horas, sendo posteriormente submetidos à mini-preps e, eluídos com 50 μl de água.

[097] Os DNAs purificados foram digeridos a 37 oC por 5 h numa solução contendo 20 μl do DNA plasmidial, 5 μl de tampão de reação específico, 1,0 μl de EcoR I (10 U/μl), 1,0 μl de Xho I (10 U/μl) e 23 μl de H2O para um volume final de 50 μl.

[098] Após eletroforese em gel agarose 1% preparativa, as bandas com cerca de 1000 pb foram purificadas do gel e eluídos com 30 μl de H2O e secos em vácuo a 45 oC por 1 hora.

[099] O plasmídio foi ressuspendido em 10 μl de H2O e 3,5 μl do mesmo foi incubado a 16 oC por 18 h com 3,5 μl do vetor de expressão pAE (figura 4), 2 μl de tampão 5x para DNA ligase e 1 μl de DNA ligase. Os clones subclonados em vetor pAE foram também sequenciados.

Indução da expressão de Amblyomin-X

[100] Visando obter grandes quantidades da proteína recombinante solúvel, utilizou- se preferencialmente a cepa BL21(DE3) da bactéria E. coli, para expressão desta proteína, por ser uma cepa de rápido crescimento, fácil cultivo e manutenção e alto rendimento da proteína recombinante. Esta cepa de E. coli é lisogênica e não possui os sistemas de modificação pós-tradução.

[101] Culturas de E. coli transformadas preferencialmente com o vetor de expressão recombinante (pAE-clone 14.16) (Figura 4) foram inoculadas em 3 ml de meio LB/ampicilina (100 μg/μl) e incubadas a 37 °C até obtenção de uma DO6oo nm de 0,5. Para o controle não induzido 1 ml do pré-inóculo foi estocado a 40C. Ao volume restante foi adicionado IPTG para 0,5 mM e a incubação foi mantida por mais 3h. Para cada 40 μl de cultura foram adicionados 10 μl de tampão de aplicação SDS-PAGE com β-mercaptoetanol 0,1 M. As amostras foram fervidas por 12 min e aplicadas em gel de poliacrilamida 12,5%. Posteriormente o gel foi corado com 0,25% de “Coomassie Blue Brillant” em 50% metanol por 18 h e descorado com ácido acético 10% em água por 3 h em temperatura ambiente.

[102] Para se obter a Expressão da proteína (Lopap) da presente invenção, os seguintes procedimentos foram adotados:

[103] Culturas de E.coli transformadas com o vetor de expressão foram inoculadas em 100 ml de meio LB/ampicilina (100 μg/μl) e incubadas a 37 °C até obtenção de uma DO600 nm de 0,5. Alíquotas de 25 ml foram incubadas em 4 frascos diferentes com 500 ml de LB/ampicilina (100 μg/μl) por 90 min. à 37 oC. Foi então adicionado IPTG para concentração final de 1 mM e a incubação foi mantida por mais 4 h. O meio foi então centrifugado a 12000 rpm e congelado a -70 oC por 18 h. As células dos 4 frascos foram então ressuspendidas em 70 ml de tampão de lise NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM e submetidas a uma prensa francesa a 2000 GAGE por três vezes e centrifugadas a 5000 rpm por 15 min. a 4 oC.

[104] O sobrenadante que continha a proteína expressa solúvel foi centrifugado a 15000 rpm por 30 min para clarificação e aplicado em coluna de afinidade de níquel- sepharose previamente equilibrada com tampão de lise. A coluna foi lavada com tampão imidazol 80 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, NaCl 500 mM, Tris HCl 50 mM pH 6,8 e o volume de lavagem coletado. A proteína foi eluída usando Tris-HCl 50 mM pH 8.0, imidazol 1M, NaCl 100 mM com fluxo de 1ml/ 5 min.

[105] O "pellet" (corpúsculos) do meio submetido à prensa francesa e centrifugado, foi ressuspendido em 20 ml de tampão de Tris-HCl 50 mM, Uréia 1 M, Triton X-100 1%, pH 8,0 para eliminar componentes hidrofóbicos e centrifugado a 5000 rpm por 15 min a 4 oC. O precipitado separado foi incubado à temperatura ambiente durante a noite com 10 ml de tampão Tris-HCl 50 mM , NaCl 500 mM, Uréia 8 M, β-mercaptoetanol 10 mM pH 8,0 para solubilização dos corpúsculos.

[106] Este material foi então novamente centrifugado a 4000 rpm por 20 min a 4°C e o sobrenadante foi adicionado gota a gota ao tampão de "refolding" Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, Imidazol 5 mM e β-mercaptoetanol 5 mM pH 8,0 (como alternativa para se obter a proteína com estrutura correta, tentou-se também realizar esta etapa utilizando o tampão acrescido de CaCl2 100 mM) com agitação constante a temperatura ambiente por 18 h. O material foi filtrado e aplicado em uma coluna de níquel-sepharose previamente equilibrada com o tampão de lise. A coluna foi lavada com 180 ml de tampão Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, Imidazol 20 mM pH 6,8 e eluída com Tris-HCl 50 mM pH 8.0, imidazol 1M, NaCl 100 mM com fluxo de 1ml/ 5 min.

[107] A proteína recombinante obtida foi testada quanto sua capacidade inibitória sobre o Fator Xa, testes de coagulação e controle de células tumorais.

[108] Foi feito o depósito da sequência em bancos de dados com acesso restrito até abril de 2005 BANKIT 608848.

[109] Os ensaios bioquímicos para determinar a inibição de FXa foram realizados na presença de fosfolipídeos. As membranas fosfolipidicas foram preparadas segundo Barenholz et al., 1977.

[110] A inibição do FXa na presença da membrana fosfolipídica foi determinada pela medida da atividade enzimática residual sobre o substrato aminometilcumárico com sítio de hidrolise para o FXa, ou substrato cromogenico comercial.

[111] As reações de hidrólise realizadas a 37 °C, em tampão Tris/HCl 50 mM, pH 7.5 - 8,0 foram monitoradas pela fluorescência nos comprimentos de onda 380 nm (excitação) e 460 nm (emissão), em um espectrofluorímetro ou espectrofotometro em comprimento de onda de 405 nm no caso de substratos cromogênicos.

[112] A proteína recombinante da presente invenção quando usada em doses de 5 - 10 uM inibe a atividade amidolítica do Fator X ativado humano, em condições purificadas, na presença de fosfatidilserina/fosfatidilcolina, e no plasma.

[113] Em doses de 0,3 a 1,2 uM a proteína induz apoptose (morte celular programada) em células de linhagem tumoral (B16F10, SKMEL28), com parada no ciclo celular em G2/M.

[114] Nas mesmas concentrações a proteína não induz efeitos apoptóticos em células normais (HUVECs, leucócitos polimorfonucleares, fibroblastos humanos, plaquetas e macrófagos).

[115] O tratamento de camundongos isogênicos C57BL/6J implantados com tumor melonótico B16F10( com volume tumoral de aproximadamente 0,5mm3 ao 12° dia), com dose de 1,0 mg/Kg por via intradérmica, por 14 dias, mostraram que a proteína recombinante Amblyomin-X é capaz de redução significante da massa e volume tumoral, como também reduzir o número de metástases pulmonares, hepáticas e esplênicas.

[116] O tratamento com a proteína recombinante Amblyomin-X na dose de 0,5mg/Kg administrado pela via intraperitoneal durante 42 dias e iniciados após o 3° dia da implantação das células tumorais B16F10, pela via endovenosa, em camundongos C57BL/6J. O Amblyomin-X é capaz de ocasionar remissão completa da massa e volume tumoral e impedir significativamente a formação de metástases. Análises anatomopatológicas dos tumores e lesões metastáticas presentes no pulmão, fígado e baço dos animais portadores de tumor e que foram tratados com Amblyomin-X e comparados aos animais que não receberam tratamento, demonstraram que a proteína recombinante promoveu reconhecimento seletivo de células tumorais inibindo a capacidade proliferativa das vias sinalizadoras do sistema MAP Kinase, e a neoangiogênese levando a morte celular. A análise microscópica dos parênquimas dos órgãos internos, como fígado, baço e pulmão não apresentaram alterações citológicas dignas de nota, mesmo após 42 doses de tratamento.

[117] Análises hematológicas dos animais portadores de tumor que receberam tratamento, demonstraram que a proteína recombinante melhora sensivelmente o quadro hematológico, mantendo o hematócrito, hemoglobina e celularidade dentro da normalidade em relação aos não tratados que desenvolveram uma grave anemia.

[118] De acordo com a presente invenção obtém-se um composto que contém uma sequência determinada a partir do cDNA da glândula do Amblyomma cajennense. Este composto compreende um polipeptídeo ou proteína cuja sequência foi determinada a partir do cDNA que codifica entre as bases 1 e 505.

[119] A proteína recombinante obtida a partir do composto foi denominada Amblyomin-X. Ela é uma proteína de dois domínios, dos tipos Kunitz e MAP Kinase e apresenta utilidade no tratamento de tumores bem como no desenvolvimento de vacinas a partir do cDNA. Apresenta também atividade biológica para as proteínas Fator Xa, X, e VIIa e também no complexo Fator VIIa/TF sendo um potencial candidato a modulação da função anti-coagulante.

[120] A administração do peptídeo, polipeptídeo ou proteína melhora doenças relacionadas a complicações cardiovasculares e tromboembóticas; diminui metástases de tumores malignos; diminui o crescimento e disseminação de tumores malignos; inibe de metástases de tumores malignos; apresentação anti-coagulante pré e pós cirúrgico, pode ser utilizada para previnir tromboemboelismo em condições que geram corpos apoptóticos (moléculas ricas em fosfolípides), nas doenças degenerativas e tumores malignos, pode ser utilizada para melhorar a resposta imunológica; pode ser utilizada como coadjuvante no tratamento quimioterápico de tumores malignos; pode ser utilizada como coadjuvante no tratamento radioterapêutico de tumores malignos; pode ser utilizada como coadjuvante no tratamento quimioterápico de tumores malignos com complicações tromboembólicas; pode ser utilizada como coadjuvante no tratamento radioterapêutico de tumores malignos com complicações tromboembólicas; modula a morte celular programada (apoptose); pode modular a formação de novos vasos sanguíneos no tumor e como um agente para uso como terapia alvo.

A Modelagem da estrutura terciária do Amblyomin-X

[121] A partir da sequência obtida por cDNA, foi realizado uma tentativa de estudo de modelagem do Amblyomin-X utilizando o programa Swiss PDB Viewer 3.7 (b2) program e Swiss Model Server.

[122] A presente invenção tem seu campo de aplicabilidade voltado ao setor médico e veterinário.

[123] Figura 1: Eletroforese em gel de agarose. Amostra: RNA total extraído das glândulas salivares do A. cajennense pelo método do Fenol isotiocianato de guanidina.

[124] Figura 2: Eletroforese em gel de agarose. 1 e 2. mRNA purificado pela coluna de oligo (dT); 3. Material não retido na coluna de oligo (dT); 4. RNA total.

[125] Figura 3: Insertos de cDNA de biblioteca em plasmídio. Eletroforese em gel de agarose 1 -2 % mostrando os fragmentos obtidos por 16 clones aleatórios da biblioteca em plasmídios, após a incubação por 2 horas com EcoR I e Hind III. De 1 a 16: produtos das clivagens dos clones aleatórios, 17 marcador.

[126] Figura 4: Sequência completa do clone eleito.

[127] Figura 5: Tradução da sequência de nucleotídeos do clone eleito para a sequência protéica.

[128] Figura 6: Sequência da proteína madura.

[129] Figura 7: Sequência 5’-3’ do “primer” construído para a amplificação do clone eleito para a expressão.

[130] Figura 8: SDS-PAGE 15%. Purificação do inibidor recombinante em coluna Ni- Sepharose. 1) marcador de massa molecular, 2) Material de entrada na cromatografia, 3 a 8) frações eluídas na purificação.

[131] Figura 9: Comparação das estruturas primárias do Amblyomin-X e do Ixodes.

[132] Figura 10: Curva de inibição do FXa na presença de fosfolipídeos e concentrações crescentes do inibidor recombinante.

[133] Figura 11a: Curva de prolongamento tempo de tromboplastina parcialmente ativado na ausência e na presença de concentrações crescentes do inibidor recombinante.

[134] Figura 11b: Curva de inibição do tempo de protrombina (TP) na ausência (controle) e concentrações crescentes do inibidor recombinante.

[135] Figura 12: Tempo de coagulação utilizando-se PS:PC ou corpos apoptóticos na presença e na ausência de Amblyomin-X.

[136] Figura 13: Aspectos citológicos das alterações provocados pelo tratamento com Amblyomin-X (0,3 uM) em células B16F10, após 6 horas.

[137] Figura 14: Aspectos das alterações citológicas provocadas pelo Amblyomin-X (0,3 uM) em células B16F10 após 12 horas de tratamento.

[138] Figura 15: Aspectos das alterações citológicas provocadas pelo tratamento Amblyomin-X (0,3 uM) em células B16F10 após 24 horas de exposição.

[139] Figura 16: Análise da inibição da adesão celular de células de melanoma B16F10, tratadas com diferentes concentrações de Amblyomin-X.

[140] Figura 17: Efeito do Amblyomin-X sobre a viabilidade das células de melanoma B16F10.

[141] Figura 18: Análise do crescimento do melanoma dorsal - B16F10, tratado com AMBLYOMIN-X, durante 14 Dias

[142] Figura 19: Aspecto macroscópico dos tumores dorsais produzidos após a implantação de células de melanoma B16F10, e tratados com 1mg/Kg de Amblyomin - X durante 14 dias.

[143] Figura 20: Curva de crescimento do peso tumoral após o tratamento com Amblyomin-X.

[144] Figura 21: Número de nódulos tumorais presentes no parênquima pulmonar após o tratamento com Amblyomin-X por 14 dias.

[145] Figura 22: Distribuição do tamanho das lesões pulmonares após o tratamento com Amblyomin-X.

[146] Figura 23: Análise da taxa de sobrevida dos animais portadores de metastases do parênquima pulmonar tratados com Amblyomin-X.

[147] Figura 24: Aspecto macroscópico dos tumores dorsais de melanoma B16F10, tratados por 42 dias com Amblyomin-X.

[148] Figura 25 A: Aspecto macroscópico do melanoma dorsal B16F10 de camundongos C57BL/6J do grupo controle tratado por 42 dias com solução salina.

[149] Figura 25 B: Aspecto macroscópico do tumor melanoma dorsal B16F10 de camundongos C57BL/6J tratado por 42 dias com Amblyomin-X.

[150] Figura 26: Análise das fases do ciclo celular dos tumores dorsais de melanoma B16F10, tratados com Amblyomin-X.

[151] Figura 27: Análise das fases do ciclo celular das metastases pulmonares dos animais, tratados com Amblyomin-X.

[152] Figura 28: Determinação da citotoxicidade de linfócitos humanos normais tratados com diferentes concentrações de Amblyomin-X.

[153] Figura 29: Determinação dos efeitos citotóxicos da heparina de baixo peso molecular em células B16F10 e SKMEL-28.

[154] Figura 30: Espraiamento de macrófagos peritoneais após 1 h de tratamento com 0,3 uM de Amblyomin-X.

[155] Figura 31: Índice de fagocitose de macráfagos peritoneais após 1 h de tratamento com 0,3 uM de Amblyomin-X, mediada por C3b do complemento.

[156] Figura 32: Indice de fagocitose de macrófagos peritoneais após 1 hora de tratamento com Amblyomin-X mediado pela porção Fc do anticorpo.

EXEMPLO 1OBTENÇÃO DO mRNA

[157] A integridade do RNA total extraído das glândulas salivares do carrapato A. cajennese foi verificada em gel de agarose na presença de formaldeído (figura 1).

EXEMPLO 2O ISOLAMENTO DO mRNA

[158] Para o isolamento do mRNA, 48 ul do RNA total foram diluídos em 500 ul de tampão 10mM Tris na presença de 1mM EDTA e submetidos à coluna de afinidade oligo (dT) celulose. Foram obtidos 17,28 ug de mRNA. A razão A260/280 para o mRNA foi de 1,71 (ug/ul). O mRNA extraído, livre de produtos de degradação, foi utilizado na construção da biblioteca de cDNA (Figura 2).

EXEMPLO 3CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE cDNA

[159] Por seleção em gel de agarose, a partir da biblioteca de cDNA com insertos maiores que 800 pb.

[160] Alguns clones foram selecionados ao acaso e digeridos com Eco RI e Hind III e apresentaram uma variedade de insertos de diferentes tamanhos (figura 3).

EXEMPLO 4SEQUENCIAMENTO DE CLONES PARA O MAPEAMENTO DOS TRANSCRITOS MAIS EXPRESSOS NA GLÂNDULA SALIVAR DO CARRAPATO

[161] A partir do plaqueamento da biblioteca de alto peso, 6 placas com orifícios foram preparadas pelo método da lise alcalina, e dessa forma, 576 clones aleatórios foram sequenciados.

EXEMPLO 5SEQUENCIAMENTO DO CLONE E DESENHO DO “PRIMER”

[162] Dentre as sequências obtidas, alguns clones apresentavam alta homologia com “Serpinas” e dentre esses clones um deles apresentava características de massa molecular semelhante a um inibidor de serino proteases que havia sido previamente purificado no Laboratório de Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan a partir da saliva do carrapato A. cajennense. Este clone tem sua sequência completa apresentada na figura 4.

EXEMPLO 6TRADUÇÃO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO CLONE PARA A SEQUÊNCIA PROTÉICA

[163] Utilizando-se um programa disponível no web-site “http://us.expasy.org/tools/dna.html”, foi feita a tradução da sequência de nucleotídeos do clone eleito para a sequência de aminoácidos, sequência obtida esta representada na figura 5.

EXEMPLO 7SEQUÊNCIA DA PROTEÍNA MADURA

[164] A sequência obtida refere-se à proteína com o peptídeo sinal, e através do web-site http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ foi possível a determinação teórica deste peptídeo, o qual encontra-se entre as posições 1 e 28 desta sequência de aminoácidos. Dessa forma, a sequência da proteína madura contém 108 aminoácidos, com massa molecular teórica de 12,295,6 Da e ponto isoéletrico (pI) teórico de 4,67. A sequência da proteína madura está representada na figura 6.

EXEMPLO 8SEQUÊNCIA 5’-3’ DO “PRIMER” CONSTRUÍDO PARA A AMPLIFICAÇÃO DO CLONE

[165] A partir da sequência da proteína madura foi desenhado um “primer” para a amplificação do inibidor de interesse o qual também continha a sequência CTCGAG que é um sítio para a enzima Xho I, como mostra a figura 7.

EXEMPLO 9AMPLIFICAÇÃO DO cDNA QUE CODIFICA O INIBIDOR

[166] O produto de amplificação obtido com o “primer” construído e o “primer” SP6 apresentou uma banda de aproximadamente 400 pb, esta banda foi recortada do gel e purificada.

[167] O cDNA purificado foi subclonado em vetor e transformado em bactérias competentes DH5α, o produto foi plaqueado, e a partir do plaqueamento, 20 clones aleatórios foram isolados e submetidos ao processo de extração por fenol-clorofórmio, para a avaliação da presença dos insertos.

[168] Dentre os clones positivos, 3 foram selecionados para serem amplificados, purificados e submetidos aos ensaios de restrição com as enzimas Xho I e Eco RI.

[169] A sequência dos clones foi confirmada e o inserto liberado pela digestão foi subclonado no vetor de expressão, o qual insere uma cauda com seis resíduos de histidinas na porção N-terminal da proteína recombinante, que foi expressa após a indução com IPTG.

[170] A proteína de interesse foi encontrada como corpúsculo de inclusão, a qual após a solubilização com ureia e β-mercaptoeanol, foi purificada em coluna de afinidade em Níquel, como demonstra o SDS-PAGE que pode ser visto na figura 8.

[171] O material eluído da cromatografia em Ni-Sepharose foi dialisado contra soluções com concentrações decrescentes de uréia (até a ausência da mesma). O material após diálise foi utilizado nos ensaios estruturais e nos ensaios bioquímicos que serão apresentados a seguir.

EXEMPLO 10EXEMPLO COMPARATIVO DAS ESTRUTURAS PRIMÁRIAS DO AMBLYOMIN-X E DO IXODES

[172] A partir da estrutura primária do Amblyomin-X (deduzida a partir da sequência de DNA), iniciou-se o estudo estrutural teórico da molécula.

[173] O Amblyomin-X apresenta cerca de 17% de homologia quando comparado ao TFPI-1 e aproximadamente 18 % ao TFPI-2, ambos humanos. Além disso, estudos estruturais demonstraram que o Amblyomin-X apresenta cerca de 21 % de homologia com o Ixolaris, que é uma proteína recombinante que foi clonada a partir das glândulas salivares do carrapato Ixodes scapularis.

[174] Quando as estruturas primárias do Amblyomin-X e do Ixolaris são comparadas (GeneStream align) verifica-se que o Amblyomin-X apresenta uma depleção tanto na porção N-terminal entre os resíduos 3 e 13 (numeração de acordo com a molécula do Ixolaris) quanto na porção C-terminal entre os resíduos, 121 e 131 (11 aminoácidos), além disso, ocorrem depleções de resíduos na porção interna da molécula (18 aminoácidos), dados que estão apresentados na figura 9.

[175] O TFPI humano, conforme citado anteriormente, apresenta 3 domínios, o D1 que compreende os resíduos 53 ao 103, o D2 que compreende os resíduos 124 ao 174 e finalmente o domínio D3 que compreende os resíduos 222 ao 273, assim, a estrutura primária do Amblyomin-X (que possui apenas 2 domínios) foi comparado com cada um dos domínios da molécula do TFPI-1 humano.

[176] Além disso, submeteu-se ao banco de dados, as estruturas parciais do Amblyomin-X e verificamos que altos "hits" de homologia com inibidores do tipo Kunitz são altamente conservados para a porção N-terminal (resíduos 1-61: ANSKAVCNLP KLAGDETCSN KTEIRWYYNG TACEAFIFKG CGGNDNNFDRV DDCQRLCEEQ), no entanto, a porção C-terminal (resíduos 62-108: THFHFESPKLI CFKVQDYWIL NDIMKKNLTGI SLKSEEEDAD SGEID) apresenta homologia com o tipo Fosfatase 2C, Proteínas do Sistema Quinase, Alfa-Amilase 3 e das vias ativadoras da MAP-Quinase, dados obtidos através de um programa de alinhamentos múltiplos.

[177] Ao analisar a estrutura tridimensional do Amblyomin-X, obtida por modelagem molecular, verificou-se que a mesma apresentou homologia estrutural apenas com o primeiro dos domínios dos inibidores do tipo Kunitz que são encontrados nesta família de Serpinas (Resíduos 1-61).

[178] Dando continuidade aos estudos estruturais do Amblyomin-X, a sua estrutura secundária mais provável foi analisada através de experimentos de dicroísmo circular, e verificou-se que o Amblyomin-X apresenta de 55% de estruturas desordenadas, 10 % de alfa hélices e aproximadamente 35% de beta-estruturas, dados que corroboram com a modelagem desta proteína.

EXEMPLO 11DOSAGEM DA ATIVIDADE INIBITÓRIA SOBRE O FXa

[179] No ensaio utilizando-se uma mistura fosfolipídica e também um substrato fluorogênico, foi possível verificar-se a inibição do FXa e o efeito de dose-dependência, que pode ser visualizado na figura 10.

EXEMPLO 12ENSAIOS DE PROLONGAMENTO DO TEMPO DE COAGULAÇÃO

[180] Verificou-se que o inibidor recombinante é capaz de prolongar o tempo de coagulação tanto o tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA), quanto o tempo de protrombina (TP). A figura 11a mostra o prolongamento do TTPA que foi de 43,4 segundos (controle) para 137,5 segundos na presença de 50 ug do inibidor recombinante, o que reflete uma inibição de 60%, e a figura 11b mostra o prolongamento do TP que foi de 14,3 segundos na ausência do inibidor para 89,3 segundos na presença de 50 ug do inibidor recombinante, o que reflete uma inibição, teórica de aproximadamente 85%.

EXEMPLO 13AÇÃO DO AMBLYOMIN-X NO TEMPO DE COAGULAÇÃO NA PRESENÇA DE FOSFOLÍPIDEOS

[181] Constatou-se também que em ensaios de coagulação onde os fosfolipídeos foram substituídos por corpos apoptóticos produzidos em células CHO (Chinese Hamster Ovarian), o tempo de coagulação passou de 129 segundos (controle) para 210 segundos na presença de 2,5 uM de Amblyomin-X, como demonstra a figura 12, o que demonstra a capacidade do Amblyomin-X em inibir o efeito pró-coagulante de corpos apoptóticos.

EXEMPLO 14ASPECTOS CITOLÓGICOS PROVOCADOS PELO AMBLYOMIN-X EM CÉLULAS B16F10, 6 HORAS APÓS O TRATAMENTO: ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E CITOTOXICIDADE

[182] As células tumorais de melanoma B16F10 tratadas com diferentes concentrações do Amblyomin-X foram cultivadas em placas de 96 orifícios de fundo chato. As alterações citotóxicas e a perda de adesão foram observadas inicialmente citologicamente, e as imagens foram adquiridas em Sistema de Captura.

[183] O tratamento de culturas celulares de melanoma murino B16F10, com o Amblyomin-X apresenta efeito citotóxico de maneira tempo e dose dependentes. Os cultivos das células B16F10 tratadas com 0,5uM de Amblyomin-X após 6 horas mostraram pequenas e discretas alterações citoplasmáticas, como vacuolização e contrações dos prolongamentos intercelulares, sem ocorrência o descolamento das células tumorais. Não foi observada perda significativa da adesão celular. Dados apresentados na figura 13.

EXEMPLO 15ASPECTOS DAS ALTERAÇÕES CITOLÓGICAS PROVOCADAS EM CÉLULAS B16F10, 12 HORAS APÓS O TRATAMENTO PELO AMBLYOMIN-X

[184] Após 12 horas de exposição das células de melanoma a 0,5uM de Amblyomin-X, foram observadas moderadas alterações na contração dos prolongamentos intercelulares com a formação de agregados celulares dispersos no sobrenadante da cultura, figura 14.

EXEMPLO 16ASPECTOS DAS ALTERAÇÕES CITOLÓGICAS PROVOCADAS EM CÉLULAS B16F10, 24 HORAS APÓS O TRATAMENTO PELO AMBLYOMIN-X

[185] Após 24 horas de tratamento das células tumorais B16F10 com 0,5uM de Amblyomin-X, as células apresentaram acentuadas alterações na contração e na adesão, bem como vários agregados celulares foram reduzidos, figura 15.

EXEMPLO 17ANÁLISE DA INIBIÇÃO DA ADESÃO CELULAR DE CÉLULAS DE MELANOMA B16F10, TRATADAS COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE AMBLYOMIN-X

[186] Após 24 horas de cultivo das células B16F10 na presença de diferentes concentrações de Amblyomin-X (0,3 uM a 0,1 nM) em placas de cultura de 96 orifícios de fundo chato, observou-se que ocorre uma perda de 55% na adesão ao substrato das células, e este efeito é dependente da dose (figura 16).E

XEMPLO 18EFEITO DO AMBLYOMIN-X SOBRE A VIABILIDADE DAS CÉLULAS DE MELANOMA B16F10

[187] A perda de viabilidade foi observada nas concentrações de 0,3 uM a 0,1 nM. O sobrenadante foi recolhido, o número e viabilidade celular foram determinados pelo teste de exclusão com Azul Tripan. A concentração celular foi determinada em Câmara hemocitométrica de Mallassez. Nestas concentrações a viabilidade foi também dose dependente, mantendo-se superior a 75% a partir da dose de 5ug onde ocorreu a maior porcentagem de desprendimento celular, figura 17.

EXEMPLO 19ANÁLISE DO CRESCIMENTO DO MELANOMA DORSAL - B16F10, EM CAMUNDONGOS C57BL/6J TRATADOS COM AMBLYOMIN-X

[188] Camundongos foram injetados com 2,5x105 células tumorais B16F10 pela via s.c., e após o 12° dia os animais portadores de tumor dorsal receberam por via subcutânea até o 14° dia 1mg/kg de Amblyomin-X. O grupo controle, após o 12° dia da inoculação das células tumorais, recebeu pela mesma via igual volume de solução salina.

[189] Os animais foram observados diariamente e o diâmetro do tumor determinado com o auxílio de um paquímetro. Os animais tratados com Amblyomin-X apresentaram diminuição significante do volume tumoral dorsal comparado ao grupo controle (figura 18).

[190] Nos animais tratados, macroscopicamente, os tumores dorsais foram menores em seu volume médio e pigmentados, por outro lado, os tumores do grupo controle apresentaram-se extremamente volumosos, nodulares, ulcerados, com extensa área de necrose. Os animais injetados com células tumorais e não tratados apresentaram graus elevados de caquexia, durante o tratamento (Figuras 19). A taxa de sobrevida (% acumulativa) do grupo tratado em relação ao não (controle) foi em média de 13 dias. Enquanto aqueles tratados com Amblyomin-X apresentaram aspecto normal (Figura 20).

EXEMPLO 20NÚMERO DE NÓDULOS TUMORAIS PRESENTES NO PARÊNQUIMA PULMONAR APÓS O TRATAMENTO COM AMBLYOMIN-X

[191] Grupos de camundongos C57BL/6J foram injetados com 5x104 células tumorais pela via endovenosa e após o 12° dia da injeção receberam o tratamento com 0,5mg/Kg Amblyomin-X. Este tratamento foi administrado diariamente pela via intraperitoneal por 14° dia, e os animais foram observados diariamente.

[192] Após a necrópsia, os animais tratados com Amblyomin-X, apresentaram redução altamente significativa no número de nódulos tumorais presentes no parênquima pulmonar comparado ao grupo controle (figura 21).

EXEMPLO 21DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DAS LESÕES PULMONARES APÓS O TRATAMENTO COM AMBLYOMIN-X

[193] A análise macroscópica do parênquima pulmonar revelou que o diâmetro médio dos nódulos presentes no grupo controle variou de 0,1 a 0,3 cm, enquanto nos animais tratados com Amblyomin-X além do número reduzido (baixa multiplicidade), este grupo não apresentou lesões maiores que 0,3 cm sendo que o diâmetro variou entre 0,1 e 0,2 cm, sem características de invasão ou disseminação (Figura 22).

EXEMPLO 22ANÁLISE DA TAXA DE SOBREVIDA DOS ANIMAIS PORTADORES DE METÁSTASES NO PARÊNQUIMA PULMONAR TRATADOS COM AMBLYOMIN- X

[194] A taxa de sobrevida (expressa em % acumulativa) dos animais com metástases pulmonares tratados com Amblyomin-X em relação ao grupo controle (não tratado) foi de 15 dias. (Figura 23).

[195] Durante o protocolo terapêutico não foi observado perda do peso corpóreo dos animais tratados com Amblyomin-X, como também não ocorreu aumento da massa tumoral após o período observado.

EXEMPLO 23 ASPECTO MACROSCÓPICO DOS TUMORES DORSAIS DE MELANOMA EM CAMUNDONGOS B16F10, TRATADOS POR 42 DIAS COM AMBLYOMIN-X

[196] Os animais B16F10 portadores de tumor dorsal, receberam tratamento diário com 1 ou 0,5 mg/Kg de Amblyomin-X, a partir do 3° dia após a injeção das células tumorais. Os animais portadores do tumor foram tratados diariamente por via subcutânea por 42 dias consecutivos.

[197] Os resultados mostraram que o tratamento é eficaz, com redução significante do volume e massa tumoral dos animais tratados em relação ao grupo controle.

[198] Foi observado que os animais que haviam recebido células tumorais não apresentaram crescimento tumoral ou mesmo ocorreu o desaparecimento da massa tumoral, provavelmente pela indução de remissão do tumor Um grupo de animais foram necropsiados e revelou que os tumores presentes, macroscopicamente eram pequenos, pigmentados, não nodulares não apresentando áreas de necrose, não ocorrendo aumento da irrigação do tumor nem havendo o recrutamento do sistema de vasos periféricos adjacentes a lesão e também não ocorrendo neo-angiogenese (figura 24).

EXEMPLO 24ASPECTO MACROSCÓPICO DO TUMOR DORSAL DE MELANOMA B16F10 DE CAMUNDONGOS C57BL/6J (GRUPO CONTROLE E TRATADO POR 42 DIAS

[199] Os aspectos histopatológicos dos tumores dorsais do grupo controle, que receberam solução salina durante o protocolo terapêutico revelaram massa tumoral com grande celularidade, semelhante a massa sinsicial, com extensa área irrigada por vasos de médio e pequeno calibre como também vasos capilares. Ao redor da massa tumoral, observou-se discreto infiltrado inflamatório de leucócitos monomorfonucleares.

[200] Os tumores dos grupos tratados com Amblyomin-X (1mg/Kg), que foram retirados após o 14° dia de tratamento, revelaram massa tumoral com pouca atividade proliferativa, baixo conteúdo de elementos fibrilares de sustentação (pouco tecido conjuntivo /estroma), sem a ocorrência de infiltrado inflamatório peritumoral. As lesões metastáticas pulmonares deste grupo, mostraram-se como pequenos tumores com baixa celularidade, presentes no parênquima pulmonar, espessamento dos alvéolos e deposição de pigmento acastanhado do tipo melânico. Não foi observado nestas lesões infiltrado inflamatório intraseptal bronquial.

[201] Os tumores dorsais obtidos dos animais tratados com AMBLYOMIN-X durante 42, mostraram que as células tumorais estão organizadas em ilhas permeadas por extensas áreas de necrose dias (figura 25B), de forma diferente do controle (Figura 25a). Pela técnica de coloração Hematoxilina/Eosina, não foram detectados vasos sanguíneos neo-formados. Os demais órgãos internos analisados, como rins, fígado, baço e coração, não apresentaram alterações histológicas, não foram detectados efeitos na perda funcional ou toxicidade direta desses órgão decorrentes do tratamento crônico com Amblyomin-X.

[202] Foi observada a formação de pequena coleção de material de aspecto fibrinilar ou exudativo ao redor da massa tumoral.

EXEMPLO 25ANÁLISE DAS FASES DO CICLO CELULAR DAS CÉLULAS DOS TUMORES DORSAIS DE MELANOMA B16F10, DE CAMUNDONGOS TRATADOS COM AMBLYOMIN-X

[203] Avaliação das fases do ciclo celular: Após a necropsia dos animais portadores do tumor dorsal ou de metástases pulmonares tratados por 14 dias com Amblyomin-X e do grupo dos animais controle que recebeu solução salina, foram avaliadas as fases do ciclo celular dos tumores por citometria de fluxo e determinadas as porcentagens das células nas seguintes fases: sub G1 ou apoptóticas, G0/G1, Fase S e G2/M.

[204] Os resultados mostraram que as células tumorais obtidas do tumor dorsal de animais que receberam tratamento com Amblyomin-X apresentam-se em grande parte nas fases de apoptose (sub-G1) e quiescente (G0/G1) e com baixa atividade proliferativa (G2/M) (figura 26)

EXEMPLO 26ANÁLISE DAS FASES DO CICLO CELULAR DAS LESÕES METASTÁTICAS DE MELANOMA B16F10, DE ANIMAIS TRATADOS COM AMBLYOMIN-X

[205] As células obtidas das lesões das metástases pulmonares analisadas por citometria de fluxo encontram-se em número significativo na fase G2/M, do ciclo celular o que representa um bloqueio da capacidade proliferativa dessas células e a eficácia do tratamento (Figura 27).

EXEMPLO 27DETERMINAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE AMBLYOMIN-X PARA CÉLULAS HUMANAS NORMAIS

[206] A exposição de células normais murinas e humanas a diferentes concentrações de Amblyomin-X, por 24 horas mostrou que para fibroblastos da pele, linfócitos, macrófagos e neutrófilos o Amblyomin-X não mostrou efeitos citotóxicos, não sendo observada morte celular nem o desprendimento das células na placa de cultura (Figura 28), comparados ao tratamento com heparina (Figura 29).

EXEMPLO 28A AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FUNCIONAL DOS MACRÓFAGOS, DOS ANIMAIS PORTADORES DE MELANOMA B16F10 E TRATADOS COM AMBLYOMIN-X

[207] A avaliação da atividade funcional dos macrófagos, dos animais portadores de melanoma B16F10 e tratados com Amblyomin-X e do grupo controle, mostrou que o tratamento aumenta a atividade fagocitária dos macrófagos e esta atividade é dependente do fragmento C3b do sistema complemento ou do receptor Fc da imunoglobulina (Figura 30, 31 e 32).

EXEMPLO 29TESTES DE COAGULAÇÃO

[208] Foram avaliados na presença e na ausência-do Amblyomin-X, o tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA) e o tempo de protrombina (TP). Para a realização destes testes foram utilizados “kits” de coagulação comercialmente disponíveis no mercado.

[209] O TTPA é o teste pelo qual a via intrínseca da coagulação é avaliada, ou seja, neste caso são monitorados a calicreína plasmática, e os fatores XII, IX, XI e X.

[210] O controle do ensaio foi realizado na ausência do Amblyomin-X e consistiu em uma incubação durante 3 min a 37°C de 100 ul de plasma humano normal, 100 ul de cefalina e 100 ul de tampão tris HCl 0.1 M pH 8,0, em seguida recalcificação do meio pela adição de 100 ul de CaCl2 0,025 M.

[211] O tempo de formação do coágulo foi medido, em um coagulômetro semi- automatizado. No caso dos experimentos de inibição, ao invés do tampão foram utilizados 100 ul de solução do Amblyomin-X preparado em tampão tris HCl 0.1 M pH 8,0.

[212] Para o outro teste de coagulação TP também utilizou-se o mesmo equipamento. O TP verifica a via extrínseca da coagulação, ou seja, monitora os fatores II, V, VII e X.

[213] O controle do ensaio foi feito incubando-se por 2 min a 37°C, 100 ul do plasma com 100 ul de tampão tris-HCl 0.1 M pH 8,0, e adição posterior de 100 ul do reagente. Verificou-se o tempo de formação do coágulo como no teste anterior. Para avaliar a inibição, ao invés do tampão foram incubados 100 ul de solução do Amblyomin-X preparado em tampão tris HCl 0.1 M pH 8,0.

[214] Ainda foi verificado o efeito o Amblyomin-X no tempo de coagulação usando-se corpos apoptóticos produzidos em células CHO como fonte de fosfolipídeos.

EXEMPLO 30AÇÃO DO AMBLYOMIN-X SOBRE O EFEITO PRÓ-COAGULANTE DOS CORPOS APOPTÓTICOS

[215] Foi construída uma curva para a padronização do teste de coagulação denominado PCA "Pro Coagulant Activity", para tal foram pré-incubados durante 3 minutos a 37°C num volume final de 60 ul: Fator VII ativado (FVIIa) 1 nM, com Fator X humano (FX) 0,25 e CaCl2 8,3 mM com diferentes concentrações de Fator tecidual recombinante (r-TF) (1,56 - 12,5 ng/ml) em tampão Hepes 250 mM contendo albumina bovina (BSA) (1%). Em seguida, 100 ul de uma mistura contendo plasma humano normal (87,5 ul), fosfatidil serina: fosfatidil colina PS 30:PC 70 (7,5 ul) e Hepes (50 mM) foram adicionados e a mistura foi incubada por 3 minutos. A reação iniciada pela adição de 20 ul de CaCl2 250 mM.

[216] O Amblyomin-X foi pré-incubado com corpos apoptóticos produzidos em células CHO, e foi verificado que o tempo de coagulação induzido pelos corpos apoptóticos foi prolongado (Sorensen et al., 2003).

EXEMPLO 31AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTI-TUMORAL AMBLYOMIN-X SOBRE CULTURA DE LINHAGENS TUMORAIS HUMANAS E MURINAS

[217] As linhagens tumorais: HL-60, K562, U937, YAC-1, JURKAT, Mel-85, Mewo, MCF- 7, SW613-12A1, SW613-B3, e as linhagens de câncer de colon SW613-12A1 e SW613, e a linhagem do melanoma murino B16F10, foram cultivadas em frascos de cultura de 75cm3 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM L- glutamina, 1 mM piruvato de sódio, e antibióticos estreptomicina 0,1 mg/ml e ampicilina 0,1 mg/ml. Antes de atingirem confluência (células aderentes), as células foram cultivadas para ampliação e manutenção das linhagens, sendo congeladas em meio de cultura RPMI-1640 contendo 10% dimetil-sulfóxido e mantidas em nitrogênio líquido.

[218] As suspensões de celulas aderentes (B16F10, SW613-12A1, SW613-B3 e MCF- 7), para todos os procedimentos experimentais foram obtidas pelo tratamento dos frascos de cultura com tripsina 0,2% por 5 minutos e inativação com 10% soro fetal bovino. As células desprendidas foram centrifugadas duas vezes, ressuspendidas em meio RPMI-1640 suplementado. A contagem das células foi realizada em câmara de Malassez, e a concentração celular foi ajustada em 5x105 células/ml, em meio RPMI- 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 7ug de Polimixina-B.

[219] A viabilidade celular foi determinada pelo teste de exclusão do Azul Tripan, sendo superior a 95% de células viáveis.

EXEMPLO 32TRATAMENTO DAS CÉLULAS TUMORAIS COM AMBLYOMIN-X

[220] As células na concentração de 2x105 foram cultivadas em placas de 96 orifícios de fundo chato, , mantidas por 24 horas em estufa de CO2, à 37°C. Após este período, as placas foram centrifugadas por 5 minutos, a 2000 rpm a 4°C, o sobrenadante foi desprezado e adicionado diferentes concentrações Amblyomin-X de 0,3 uM a 0,3 nM diluído em meio de cultura RPMI-1640, suplementado e acrescido de 7ug de Polimixina -B. Após 6, 12 e 24 horas as alterações citológicas foram observadas e foto- documentadas em sistema de captura de imagem.Ciclo Celular

[221] A citometria de fluxo aplicada no estudo do ciclo celular, registra os parâmetros cinéticos da população celular, revelando o índice de DNA, a ploidia, a fração de proliferação celular, e a porcentagem de células encontradas nas fases S e G2/M, indicando parâmetros uni ou multivariáveis prognósticos e possíveis rumos terapêuticos. A análise da porcentagem de células fornece o percentual de células que estão sintetizando DNA (“labeling index”), a duração da fase S (Ts) e o tempo de duplicação potencial (Tpot).

EXEMPLO 33DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA

[222] Alíquotas das suspensões das células tumorais tratadas e não tratadas com Amblyomin-X, foram imediatamente congeladas em tampão citrato (2mM), sucrose 25 mM e dimetil sulfóxido, 0,05% e mantidas em nitrogênio líquido até o momento de sua utilização.

[223] Após o descongelamento das amostras em banho de gelo, as células foram incubadas com 375 μl de tripsina 0,03 g/l por 10 minutos à temperatura ambiente e neutralizadas com o inibidor de tripsina 0,5 g/l, ribonuclease A 0,1 g/l e espermina 1,2 g/l. As amostras foram transferidas para tubos de citometria de fluxo e a quantidade de células nas diferentes fases do ciclo, o nível de apoptose (Sub-G1) e o conteúdo de DNA na fase S foram analisados.

EXEMPLO 34DETERMINAÇÃO DAS FASES DO CICLO CELULAR

[224] Suspensões celulares (106/ml)células normais e das linhagens tumorais foram centrifugadas duas vezes por 3000 rpm a 4°C com solução PBS e ressuspensas em 200 μl solução de iodeto de propidium (20 μl/ml), contendo 20 μl Triton X-100 e 4 mg RNAse-A, por trinta minutos, a temperatura ambiente, protegidas da luz. Após este período as amostras foram transferidas para tubos de citometria, e as imagens foram capturadas em citômetro de Fluxo e analisadas as fases do ciclo celular pré e pós- mitóticas (G0-G1, fase S e G2-M) foram analisadas.

EXEMPLO 35CULTURA DAS LINHAGENS TUMORAIS E IMPLANTAÇÃO TUMORAL EM ANIMAIS (CAMUNDONGOS)

[225] As suspensões celulares aderentes (B16F10), que foram utilizadas para a implantação no flanco dorsal dos animais foram obtidas após o tratamento dos frascos de cultura com tripsina 0,2% por 5 minutos e inativada com soro fetal bovino 10%. As células desprendidas foram centrifugadas (2.000 rpm) por duas vezes e ressuspendidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% soro bovino fetal inativado a 56°C por 1 h, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, e antibióticos estreptomicina 0,1 mg/ml e ampicilina 0,1 mg/ml. A contagem de células foi realizada em câmara de Malassez, e a concentração celular ajustada para 5x104 células/ml.

EXEMPLO 36CRESCIMENTO DE TUMORES DORSAIS PRIMÁRIOS E AVALIAÇÃO DAS METÁSTASES INTERNAS

[226] Foram utilizados grupos de 10 camundongos da linhagem C57BL/6J mantidos em Biotério. Os animais foram mantidos com ciclo de luz claro / escuro de 12 horas, temperatura constante de 20° C, água filtrada e esterilizada, e ração "ad libidum".

[227] Para os experimentos de crescimento de tumores primários dorsais, os camundongos (grupos de 10 animais) foram injetados subcutaneamente no dorso com 2,5x104 células tumorais de melanoma murino B16F10.

[228] Para a avaliação das metástases internas, grupos de camundongos C57BL/6J, foram injetados com 5x104 células tumorais B16F10 pela via endovenosa, pelo plexo venoso retro-orbital ocular. Após o 12° dia da inoculação este grupo de animais foi tratado e com 0,5mg/Kg de Amblyomin-X, administrado pela via intraperitoneal e observados até o 14° dia de tratamento.

[229] Os animais que receberam as células tumorais pela via subcutânea e que apresentavam tumores dorsais, após o 12o dia foram tratados com 1mg/Kg de Amblyomin-X. Foram observados diariamente até o momento do sacrifício e seus tumores medidos com o auxílio de um paquímetro. Os tumores em média apresentaram diâmetro de 0,5 cm, foi iniciado o tratamento com a Amblyomin-X.

[230] Como grupo controle os animais receberam solução salina pelas mesmas vias de tratamento, e após o 14° dia de tratamento. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Foi realizada a necropsia e os tumores dorsais foram analisados, lesões internas macroscópicas identificadas, medidas e foto- documentadas. Amostras dos tumores dos diferentes grupos de tratamento e grupo controle, não tratado, foram processados para análises do conteúdo de DNA, ciclo celular e anatomopatológico.

Exemplo 37OBSERVAÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL

[231] Após a injeção de células B16F10, o crescimento tumoral foi medido com o auxílio de um paquímetro e foto-documentado diariamente. Foram feitas medições longitudinais e transversais do tumor (duas medidas para cada parâmetro). Foram calculadas a área e o volume médio do tumor, através das seguintes fórmulas A=πR2 e V=4/3πR3. Os animais que receberam as células tumorais pela via endovenosa foram sacrificados a cada etapa de tratamento e necropsiados. Os nódulos tumorais macroscópicos presentes nos órgãos internos, foram contados e medidos.

Exemplo 38DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA

[232] A viabilidade celular das linhagens celulares e das células dos tumores tratados com diferentes concentrações do Amblyomin-X de 0,03 nM a 0,3 uM Heparina Sódica de 80 até 0,0015ug, foram determinadas pelo método colorimétrico do MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenil tetrazolium bromide). O método é baseado na redução do MTT à formazan pelas células vivas. A determinação da sensibilidade às diferentes doses de Amblyomin-X foi otimizada de acordo com as normas estabelecidas pelo Instituto Nacional de Câncer, USA (NCI). Foi determinada a atividade citotóxica Amblyomin-X nas suspensões das linhagens celulares e das células tumorais ("ex-vivo"), retiradas cirurgicamente e em condições estéreis que foram incubadas em placas de 96 orifícios de fundo chato. A estas células foram adicionados 10 μl de MTT (5mg/ml) que foram incubadas por 3 horas em estufa contendo 5% de CO2 a 37°C. Após este período, o meio foi removido e foram acrescentados 100 μl de dimetil sulfóxido para a dissolução dos cristais de formazan que se formaram e se apresentaram como precipitado, a absorbância foi monitorada em 540 nm.

Exemplo 39OBTENÇÃO DOS MACRÓFAGOS PERITONEAIS

[233] Após o tratamento com Amblyomin-X dos camundongos portadores de melanoma B16F10 e do grupo controle (que recebeu solução salina), os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. A cavidade abdominal dos animais tratados e controle foi aberta, exposta, e 2 ml de solução salina contendo 5000 U heparina gelada, foram injetados. A cavidade foi massageada e em seguida recolhido o lavado peritoneal, foi centrifugado a 2000 rpm por 10 minutos a 4°C. A suspensão celular foi ressuspendida em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino 10% e o número de células ajustada para 106/ml em câmara hemocitométrica de Mallassez.

[234] Alíquotas de suspensão macrófagos foram cultivadas em lamínulas esféricas, previamente esterilizadas, imersas em meio de cultura RPMI-1640 e mantidas em placas de 12 orifícios, que foram incubadas na presença e na ausência de 105 Candida albicans, 105 eritrócitos de carneiro ou tratados com C3Bb ou com a porção Fc da imunoglobulina. Após 24 horas as lamínulas foram fixadas, coradas e o número de células aderentes e o número de partículas fagocitadas foram contadas.

EXEMPLO 40CULTURA DE FIBROBLASTOS DA PELE HUMANA

[235] Fragmentos de pele humana (de aproximadamente 1 cm X 1 cm) previamente selecionados foram coletados de forma asséptica e imediatamente colocados em um tubo cônico estéril contendo meio de cultura Ham-F12 contendo 20% soro fetal bovino. Cada fragmento foi transferido para uma placa de Petri 35 mm contendo meio de cultura para lavagem e retirada do excesso de sangue. Com o auxílio de uma pinças e tesoura foram retiradas a gordura e o tecido degenerativo. O fragmento já “limpo” foi cortado em fragmentos menores que foram então distribuídos em 3 placas de Petri (± 15 pedaços em cada) contendo meio de cultura Ham-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino.

[236] As placas foram mantidas em estufa umidificada à 37°C e 5% de C02 e examinadas ao microscópio invertido 3 vezes por semana, o meio de cultura foi trocado neste mesmo intervalo de tempo. Ao atingirem a subconfluência, as células foram tripsinizadas (Tripsina 0,2%) por 5 minutos, e a inativação feita com soro fetal bovino 10, as células foram centrifugadas por 10 minutos a 2000 rpm à 4 oC e plaqueadas em garrafas de 25 cm2.

[237] Após o crescimento e expansão celular 105 fibroblastos foram cultivados em placas de 96 orifícios fundo chato, por 24 horas. Em seguida a cultura foi tratada com Amblyomin-X diluído em RPMI-1640 contendo soro fetal bovino 10% e 7ug/ml de polimixina-B. Como controle foram utilizados o tratamento com Heparina Sódica nas mesmas concentrações ou com meio de cultura completo.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[238] A análise estatística foi realizada pelo método de Variância ANOVA seguido do teste comparativo múltiplo de TUKEY-KRAMER.

[239] Os valores foram expressos em média ± desvio padrão, considerando-se como valores significantes *p<0,05.BIBLIOGRAFIAAvailable from:www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/network/netblast www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbroser.cgiwww.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.htmlwww.expasy.orgwww.cbs.dtu.dk/services/signalP/Barenholz Y, Gibbes D, Litman BJ, Goll J, Thompson TE Carlson RD. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry; 16(12):2806-10, 1977.BELL, D.A.; TAYLOR, J.A.; PAULISON, D.F.; ROBERTSON, C.N.; LUCIER, G.W. Genetic risk and carcinogen exposure: A common inherited defect of the carcinogen-metabolism gene glutanione S-tranferase M1 (GSTM1) that increases susceptibly to bladder cancer. J. Natl. Cancer Inst. 85: 1159-1164, 1993.Bergqvist D. Venous thromboembolism in cancer patients: expanding horizons Semin Thromb Hemost.; 28 Suppl 3:19-23,2002.Broze GJ Jr.Tissue factor pathway inhibitor gene disruption. Blood Coagul. Fibrinolysis Suppl. 1:S89-92, 1998.Budillon A. Molecular genetics of cancer. Oncogenes and tumor suppressor genes. Cancer., 76(10): 1869-73, 1995.Chand HS, Schmidt AE, Bajaj SP, Kisiel W. Structure function analysis of the reactive site in the first kunitz-type domain of human tissue factor pathway inhibitor-2. J Biol Chem. 23; 279 (17): 17500-7. Epub Erratum in: J Biol Chem4; 279 (23):24906, 2004Cotrino J In situ detection of expression of tissue factor in vascular endotelial cells: correlation with the malignant phenotype of human breast disease. Nature Medicine, 2: 210-492, 1996.DECLERCK, Y.A. & IMREM, S. - Protease inhibitors: role and potential therapeutic use in human cancer. Eur. J. Cancer, 30A: 2170-80, 1994.DUKE, R.C.; OJCIUS, D.M.; YOUNG, J. D.-E. Cell suicide in health and disease. Scientific American, 275(6): 48-55, 1996.Edward RL, Human Tumor Procoagulation. Thromb Haemost 69: 205-131; 1993.FEARON, E.R. Human cancer syndromes: clues to the origin and nature of cancer. Science, 278: 1043-50, 1997.Fernandez PM, Patierno SR, Rickles FR. Tissue factor and fibrin in tumor angiogenesis. Semin Thromb Hemost; 30(1): 31-44 , 2004Gale AJ, Gordon SG. Update on tumor cell procoagulant factors. Acta Haematol; 106 (1-2):25- 32, 2001Goel HL, Languino LR. Integrin signaling in cancer. Cancer Treat Res.;119:15-31, 2004.Gordon SG: Cancer cell pro coagulants and their implications. Hematol Oncol Clin North Am. 6: 1539-74,1992Gouin-Thibaut I, Samama MM. Venous thrombosis and cancer. Ann Biol Clin 58(6):675- 82,2000.GREAVES,M. Dying for a living. In: Cancer the evolutionary legacy. Oxford University Press, 196203,2000.Hermo H Jr. ,Chemical carcinogenesis: tumor initiation and promotion. Occup Med., 2(1): 1-25, 1987.Hoffman R, Haim N, Brenner B. Cancer and thrombosis revisited. Blood Rev.; 15 (2): 61-7, 2001.Kamei S, Petersen LC, Sprecher CA, Foster DC, Kisiel W. Inhibitory properties of human recombinant Arg24-->Gln type-2 tissue factor pathway inhibitor (R24Q TFPI-2). Thromb Res. 1; 94(3):147-52, 1999.Lee AY, Levine MN. Venous thromboembolism and cancer: risks and outcomes.Circulation 17; 107(23 Suppl 1):I17-21,2003.Loreto MF, De Martinis M, Corsi MP, Modesti M, Ginaldi L. Coagulation and cancer: implications for diagnosis and management. Pathol Oncol Res; 6(4):301-12,2000.Matsuda A, Suzuki Y, Honda G, Muramatsu S, Matsuzaki O, Nagano Y, Doi T, Shimotohno K, Harada T, Nishida E, Hayashi H, Sugano S. Large-scale identification and characterization of human genes that activate NF-kappaB and MAPK signaling pathways. Oncogene; 22(21): 3307-18, 2003.MEYER,T.; HART,I.R. Mechanisms of tumor metastasis. European Journal of Cancer, 34(2):214- 221,1998.Moussa SA. Antithrombotics in thrombosis and cancer., Expert Rev Cardiovasc Ther.,1(2): 283-91,2003Ornstein DL, Zacharski LR Cancer, thrombosis, and anticoagulants. Curr Opin Pulm Med.,6(4):301-8,2000Rao LV, Ruf W. Tissue factor residues Lys165 and Lys166 are essential for rapid formation of the quaternary complex of tissue factor.VIIa with Xa.tissue factor pathway inhibitor. Biochemistry; 34(34):10867-71, 1995.Ribeiro, J.M.C. Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate pharmacologists? Infect Agents Dis.; 4(3):143-52, 1995.Rickels F: Hemostatic alterations in cancer pacients. Cancer Metat. Rev 11: 239; 1992. RUOSLAHTI, E. How cancer spreads. Scientific American , 275 (3): 72-77, 1996.Sandset PM, Bendz B. Tissue factor pathway inhibitor: clinical deficiency states. Thromb Haemost; 78(1):467-70, 1997Schafer AI, Levine MN, Konkle BA, Kearon C. Thrombotic disorders: diagnosis and treatment Hematology (Am Soc Hematol Educ Program); 520-39, 2003Sekine I, Yamamoto N, Kunitoh H, Ohe Y, Tamura T, Kodama T, Saijo N.Cancer Treatment of small cell lung cancer in the elderly based on a critical literature review of clinical trials. Cancer Treat Rev.;30 (4): 359-68, 2004Sorensen BB, Rao LV, Tornehave D, Gammeltoft S, Petersen LC. Antiapoptotic effect of coagulation factor VIIa. Blood. 102(5): 1708-15, 2003. Sorensen HT, Johnsen SP, Norgard B, Zacharski LR, Baron JA. Cancer and venous thromboembolism: a multidisciplinary approach. Clin Lab.; 49(11-12):615-23, 2003.Sutherland DE, Weitz IC, Liebman HA.Thromboembolic complications of cancer: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and treatment. Am J Hematol; 72(1):43-52,2003.Tsao AS, Kim ES, Hong WK.CA Chemoprevention of cancer. CA Cancer J Clin.; 54(3): 150-80,2004Wainscoat JS, Fey MF. Assessment of clonality in human tumors: a review. Cancer Res.50(5):1355-60,1990.Zacharski LR, Pathways of coagulation, fibrinolisis activation in malignancy. Semin Thromb Hemostasis 18: 104; 1992.Zacharski LR. Malignancy as a solid-phase coagulopathy: implications for the etiology, pathogenesis, and treatment of cancer. Semin Thromb Hemost. 29(3) 317-320, 2003.

Claims

1. “SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA” de um inibidor de proteases do tipo Kunitz obtida a partir de uma biblioteca de cDNA de glândulas salivares de carrapatos Amblyomma cajennense, caracterizado por ser a SEQ ID NO: 1.

2. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2, caracterizado por ser no preparo de um medicamento empregado como agente anti-trombótico.

3. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2, caracterizada por ser no preparo de um medicamento empregado para reduzir a coagulação do sangue em um paciente.

4. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2, caracterizada por ser no preparo de um medicamento empregado no tratamento de câncer em um paciente.

5. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2 de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser administrada com quimioterapia.

6. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2 de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser administrada com radioterapia.

7. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2 de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser para suprimir a progressão de tumores em um paciente.

8. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2 de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser para suprimir metástases tumorais em um paciente.

9. “USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE” da SEQ ID NO: 2 de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser para suprimir a angiogênese tumoral em um paciente.