CN101142232A

CN101142232A - Kunitz型重组抑制剂

Info

Publication number: CN101142232A
Application number: CNA2005800389926A
Authority: CN
Inventors: 安娜·玛丽莎·朱德津斯基-塔瓦西; D·A·玛丽亚; I·d·F·C·巴蒂斯塔; P·L·何
Original assignee: UNIAO QUIMICA FARMACEUTICA NAC; BIOSINTETICA FARMACEUTICA Ltda
Current assignee: UNIAO QUIMICA FARMACEUTICA NAC; BIOSINTETICA FARMACEUTICA Ltda
Priority date: 2004-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2025-09-15
Also published as: CN101142232B; JP4980220B2; CA2581001A1; ES2410160T3; WO2006029492A1; US8440795B2; BRPI0406057A; EP1799707A1; BRPI0406057B1; CA2581001C; JP2008512992A; CA2680759A1; EP1799707B1; US20090042786A1; DK1799707T3; AU2005284615A1; AU2005284615B2

Abstract

本发明提供了获自从卡延钝眼蜱的唾液腺的cDNA文库克隆的基因的Kunitz型重组抑制剂，该抑制剂命名为Amblyomin－X，分子量是13,500Da。

Description

KUNITZ型重组抑制剂

本发明涉及获得对激活的凝血因子X具有抑制活性的重组蛋白的方法，所述重组蛋白表征为Kunitz型抑制剂，获自卡延钝眼蜱(Amblyomma cajennense)的唾液腺的cDNA文库；涉及获得该重组蛋白的克隆寡核苷酸序列和氨基酸序列的方法；涉及确定该重组蛋白对激活的因子X的抑制活性的方法；涉及确定血浆中的抗凝活性的方法；涉及确定肿瘤细胞系中的凋亡活性的方法；涉及确定黑素瘤中的抗转移活性的方法；涉及确定抗癌活性(黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌和白血病)的方法，上述方法是体外和体内进行的。

发明背景

蛋白酶抑制剂是以蛋白水解酶活性的正常控制机理起作用的分子，并且与很多生理过程相关，例如凝血、纤维蛋白溶解、消化，并且也在许多病理中起作用，如癌症、造血障碍、炎症和血压平衡(DECLERCK&IMREM，1994)。

控制凝血的最有效方法之一是蛋白酶抑制剂的作用。研究证明了大多数食血动物物种，如蜱的唾液腺产生一些抗凝物质，其目的是使血液的流动性更强，然后便于其吸食(RIBEIRO，1995)。

激活的因子X(FXa)的抑制剂具有显著的临床意义，因为通过Fxa抑制(在凝血酶原酶复合物中)，可以控制凝血酶原激活为凝血酶，从而避免血凝块形成。

凝血过程一开始，蛋白酶的抑制就立即引发。“组织因子途径抑制剂”(TFPI)是外源途径的重要抑制剂，分类为BPTI(牛胰蛋白酶抑制剂)型的Kunitz家族抑制剂的成员(Broze，1998)。

人TFPI是一种包含三个Kunitz型结构域(K1、K2和K3)的蛋白，第一个结构域K1在N末端部分具有酸性区域，其中包含了FVIIa的结合位点。在第二个结构域中，存在负责Fxa结合的区域。最后，在第三个结构域的C末端部分存在碱性区域，其功能目前还没有阐明，但是可能含有肝素结合位点(Rao，1995)。

人TFPI抑制机制包含两个阶段。在第一个阶段中，抑制剂自身与因子FXa和FVIIa缔合，但抑制实际上将发生在随后的除段，其中观察到四价复合物的形成，存在组织因子(TF)、FXa、FVIIa和人TFPI(TFPI：FXa：FVIIa：TF)(Sandset&Bendz，1997)。

2型人组织因子抑制剂“组织因子途径抑制剂-2”(TFPI-2)是一种由三个Kunitz型结构域组成的32-kDa的蛋白(Chand et.al.，2004)。TFPI-2抑制多种参与凝血和纤维蛋白溶解的丝氨酸蛋白酶，这可能由于第一个Kunitz型结构域的24位的精氨酸残基(R24)。在第二和第三个结构域中，分别存在谷氨酰胺和丝氨酸残基。在最近的研究中，制备了突变体，其中的精氨酸残基被谷氨酰胺残基修饰(R24Q TFPI-2)，并且该突变引起了对牛胰蛋白酶的抑制活性损失大约90％。这一事实证明了该残基在保持抑制活性中的重要性(Kamei et.al.，1999)。

癌症发展及其与凝血的相互作用的一般方面

通过一些遗传和环境因素的组合，确定受试者发生肿瘤的风险。因此，在癌症发生过程中，称作致癌物(其具有生物、化学或物理性质)的物质可以作为发展到形成转移的过程的起始物或甚至促进剂(Ruoslahti E.，1996)。

在肿瘤过程的起始中，DNA的靶结构发生不可逆改变，导致细胞转化。致癌物代谢示于两个阶段，称作阶段I(激活)和阶段II(解毒)。一些阶段I的酶不仅仅是氧化反应的催化剂，也代谢大量的致癌物或亲脂性异生素(Bell et.al，1993)。

DNA破坏的持续性依赖于修复机制，并且依赖于破坏的组织的细胞寿命持续，这样，如果破坏持续或不修复，突变的细胞克隆会扩充(Duke et al，1996；Wainscoat e Fey，1990)。

在起始的细胞发生一个过程，很多时候该过程很长，其减少潜伏期和/或增加它们对遗传改变的易感性。通常促进剂不是基因毒性的。它们是组织特异性，并且具有以外遗传形成起作用的多种作用机制，导致组织平衡的扰乱(Hermo et al，1987)。

促进机制包括细胞表面受体的激活、胞质溶胶酶的激活或抑制、转录和翻译因子的激活(通过激酶)、增殖刺激、凋亡抑制和直接细胞毒性。

在进展阶段，肿瘤细胞也显示出形成新血管的能力，所述血管将供应肿瘤，促进不受控制的增加，因为它们首先侵入围绕它们的组织，并且可以到达淋巴管或血管内部，通过它们播散到其它器官中。(Meyeret.al.，1998，Matsuda et al 2003)。

细胞通常反应于一些内部损伤，所述损伤来自中间代谢产物、来自严重或慢性炎症反应和来自导致氧气和氮气不稳定性反应代谢物的过程。此外，存在外部破坏因子，如通过平衡过程消除的物理、化学和生物试剂。

最后一个阶段(称作肿瘤进展)包括侵入和转移。在此阶段，将预先存在的或肿瘤前病变加入随机突变改变，包括特定基因中的序列特异性错误、复制、缺失和/或杂合性消失，所述基因如癌基因、肿瘤阻抑基因、转移基因和修复基因。

癌基因在生理状况下是无活性的，并且可以通过以下过程激活：改变氨基酸，或通过在该基因的染色体来源的一些拷贝中扩增基因同时增加活性，最后通过在不同染色体的基因之间重组。这些基因的差异是它们通常是无活性的、警惕的，以避免细胞的不受控制的生长(Budillon，1995)。

尽管基因组不稳定性是肿瘤进展的主要特征，但缺乏细胞复制的控制是区别恶性水平并且将它们转变成致死性癌症的原因。肿瘤细胞和正常组织的细胞通过细胞周期进行复制(Fearon ER，1997)。

但是，为了理解细胞周期，没有完全澄清肿瘤细胞的细胞复制的调节机制，并且没有阐明癌症的体内生长特征。

肿瘤进展的侵入特性与肿瘤细胞的迁移性增加相关，与蛋白水解能力相关，并且与细胞-细胞和细胞-基质接触的抑制丧失相关。转移细胞然后通过局部扩展或甚至通过种植过程经循环、淋巴系统播散。因此，转移位置的标准将根据原发癌症和器官的种类而改变，因为其中的一些，如肌肉、皮肤、胸腺和脾，很少存在转移(Goel，et al.，2004)。

一些被认为是无法治疗或不具有治疗反应的癌症主要重复原发癌症的位置，并且存在于其区域淋巴结中。这些肿瘤在治疗中会产生转移。

恶性肿瘤的发病率具有显著的数量，在全世界排列为死亡的第二原因。总体上，癌症治疗是基于手术切除原位的实体瘤，在不具有完全切除的临床条件或技术可能性的患者中对肿瘤进行放疗，或在非实体瘤或实体瘤扩散的情况下进行化疗。

化疗、放疗和手术是与其它治疗相关的加强给药的治疗方法，并且，在控制和治愈很多患病的患者的过程中，引入辅助治疗的概念是一种创新，改善了他们的结果(Tsao，et.al.，2004)。

目前，更准确的放疗方案涉及在肿瘤团块中给予更高剂量，并且在健康的邻近组织中强度较低；对于很多病例，采用对肿瘤有效和较小副作用的药物的化疗允许更广泛的肿瘤学操作，并且随后带来更好的结果。但是，大多数实体瘤对化疗具有中等的反应或无反应，限制了对局部肿瘤的辅助治疗和转移病例的治疗(Sekire，et al.，2004)。

存在于50％晚期肺癌患者中的高转移率显示出了开发目的在于给这些患者提供控制肿瘤细胞增殖和播散的真正机会的新的和更有效治疗策略的必要性。

在20世纪，当发明了与40年代鉴定的氮芥一样含有广泛抗肿瘤特征的新药和对一些组织学类型的肿瘤具有部分或完全效力的多种其它物质时，我们获得了显著的进步。尽管存在能够治疗一些实体瘤，如肺、结肠、乳腺和前列腺癌的实体瘤的抗癌药物选择的快速发展，仍然没有证明对其足够和有效的系统治疗。在发达国家普遍存在，在全世界也是频繁发生的非小细胞肺癌和皮肤黑素瘤中，在所有可获得的方案中，进行化疗的中度反应是15％-20％，在其它治疗联合中是40％-50％(Sekire，et al.，2004)。

因此，寻找用于改进对晚期肿瘤的疗效的新药替代疗法是关键的。已知大多数化疗剂具有控制细胞增殖的能力，并且最近鉴定了对肿瘤细胞专有的一些代谢机制具有特异性活性的药物(靶治疗)。在这些治疗中，这些物质通过细胞周期改变作用于肿瘤细胞，使它们的作用机制更有效。

与化疗相关的癌症病态仍然是一个显著的障碍，因此，发现容易给药、具有少或不显著副作用以及对肿瘤细胞的选择作用机制的抗肿瘤药物似乎是目前的目标。

参与肿瘤生长和进展的调节途径之一是凝血系统，其中该反应主要是由诸如组织因子(TF)的促凝因子的表达导致的，TF是诱导导致凝血酶产生和血凝块形成的凝血过程的蛋白之一。

在第二阶段，肿瘤细胞开始表达尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的受体和促进纤溶酶原激活为纤溶酶的纤溶酶原激活剂。该系统负责组织协调和重塑。

在具有例如肺腺癌、肾癌和恶性黑素瘤的肿瘤患者中，丧失了平衡，促进凝血系统改变，所述平衡来自凝血酶产生和激活的因子X(Edward RL，1993)。另一方面，肿瘤细胞的生物学影响了发生在具有原发性肿瘤或进行化疗的患者中的凝血激活，其生物学机制还没有被理解(RicKels et.al.，1992，Schafer，et al.，2003)。

凝血参数的实验室评估在某些类型的肿瘤中显示了显著高水平，使得能够确定其在循环中的存在，例如，凝血酶原片段的存在、D-二聚体的存在、因子XIIa的存在，及其预后关联(Gordon SG，1992)。

在化疗期间用诸如低分子量肝素或维生素K抑制剂治疗原发肿瘤、转移或存在损伤的患者(Hoffmal et al.，2001)，显示出了延长患者寿命的效力(Moussa et.al.，2003；Sutherland et.al.，2003)。恶性肿瘤中静脉血栓形成的发病是多因素的，其机理涉及由肿瘤因素释放促凝成分、遗传因素，以及甚至治疗本身(Sorensen et.al.，2003；Gouin-Thibaute Samama MM，2000)。

临床研究证明，通过在手术切除的乳腺癌中使用低分子量肝素，可以防止该血栓栓塞特征(Bergqvist D.，2002；Lee e Levine，2003)。鉴定了某些肿瘤中一些作为免疫系统的生物系统和凝血之间的相互作用的组织学和功能表现。它们揭示了重要改变，如存在与炎症浸润、内皮细胞和新血管发生相关的凝血激活因子(Loreto et.al，2000；ZacharckiD，2003；Ornstein et.al，2000；Gale e Gordon 2001；Cotrino J，1996)。

来源于于肿瘤细胞的细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素1和血管内皮生长因子(VEGF)是趋化性的，并且诱导血管形成，因为它们能够诱导促凝因子和致血栓因子的表达，改变肿瘤微环境中的促凝状态(Sorensen，et.al，2003，Fernandez et.al，2004)。

本发明确认并证明了存在于卡延钝眼蜱的唾液中的蛋白在肿瘤细胞(人黑素瘤-SKMEL28、MEL85、MEWO、鼠黑素瘤B16F10，白血病：前髓细胞HL60、红白血病K562、成淋巴细胞T JURKAT、白血病T U937、鼠淋巴细胞T、YAC-I；肺癌H292、乳腺癌MCF-7和MCF-IO以及直肠结肠癌SW613-12A1、SW613-B3的肿瘤细胞)中具有抗凋亡活性、体内抗肿瘤活性(黑素瘤)，以及抗转移和抗血管发生活性。

本发明也显示了重组蛋白能够刺激巨噬细胞的吞噬活性(由补体或抗体介导的播散和吞噬速度)，并且在诸如来源于脐带的人内皮细胞、成纤维细胞、血小板、多形核细胞、淋巴细胞和人巨噬细胞的正常细胞，以及诸如肾、肝、心脏、脾和肺的内脏中不具有细胞毒性活性，其中在长期用所述蛋白治疗后没有观察到组织病理改变。

根据本发明，获得了重组蛋白，即新的激活的因子X的抑制剂、新的抗肿瘤、抗转移和抗凝剂，其获自卡延钝眼蜱的唾液腺的cDNA文库。

通过本发明获得的重组蛋白包含从卡延钝眼蜱唾液腺的cDNA确定的氨基酸的序列，并且可以定义为这样的多肽或蛋白：其序列从编码碱基1-505的cDNA确定。

具体地，它包含称作Amblyomin-X的重组蛋白，并且具有两个与Kunitz型和MAP激酶型结构域同源的结构域蛋白。

本发明提供了抗癌用途，并且使得能够从cDNA开发疫苗。

总体上，本发明基于从卡延钝眼蜱的唾液腺建立的cDNA文库和随后对随机基因的测序。

在获得的序列中，鉴定出一个序列与丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINS)具有同源性。在数据库中分析选择的基因的完整序列，显示与人的1型TFPI(组织因子途径抑制剂)具有17％的同源性，与Ixolaris(从肩突硬蜱(Ixodes scapularis)分离的抑制剂)具有21％的同源性。

该蛋白在大肠杆菌中以包含体的形式表达，并且在用脲和β-巯基乙醇溶解并且随后在Ni-Sepharose亲和柱中纯化而获得。

重组蛋白是13.5kDa，仅仅当存在磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸磷脂时能够抑制纯化的系统中的激活的因子X。此外，重组蛋白能够延长在总体凝血测试如TTPA和TP中观察到的血浆凝集时间。

重组蛋白对正常内皮细胞(HUVECs-人静脉内皮细胞)或正常的人成纤维细胞系不起作用。

但是，它在一些肿瘤细胞系中引起细胞通过凋亡作用的死亡；其中包括鼠黑素瘤(B16F10)。

采用不同的剂量和不同的时间间隔，通过腹膜内和皮下途径用重组蛋白治疗具有B16F10黑素瘤的小鼠C57BI/6J。观察到经过治疗的动物表现出肿瘤团块(背部肿瘤)的显著缩小。此外，当种植肿瘤后的14天中进行治疗时，转移率显著降低。当在肿瘤种植后第三天进行治疗时，观察到肿瘤的完全消退和转移的不存在。该蛋白似乎具有抗血管发生活性，因为当与对照相比(未治疗)时，抑制了植入的肿瘤周围的血管形成。

也证明了该蛋白在体外和体内激活巨噬细胞的吞噬活性。

进行了对照和治疗的动物的完整血相观察，初步结果表明该蛋白抑制具有肿瘤的动物中存在的促凝状态。此外，血细胞计数和血红蛋白水平与健康动物(无肿瘤)接近或相同，表明该蛋白不仅仅保护动物抗贫血，也明显不由于其Fxa抑制能力和长期治疗而改变骨髓或导致出血现象。

与常规治疗相比的优点：

它是一种生物试剂而不是化疗。因此，它应该仅仅作用于患病细胞，而不是健康细胞，避免了化疗的副作用。

由于其FXa抑制潜能，它可以用作进行化疗的患者或具有促凝特征的患者中的血栓栓塞保护剂(抗凝剂)。

作为重组蛋白，它可以更大量获得。

提到的重组蛋白的获得过程和分析中用到的方法可以概括为以下步骤：饲养蜱，并且提取它们的唾液腺；通过苯基异硫氰酸胍方法获得总RNA；RNA定量；DNA的琼脂糖凝胶电泳；RNA的琼脂糖凝胶电泳；在寡聚物亲和柱(dT)上纯化mRNA；构建cDNA文库；合成第一链；合成第二链；在琼脂糖凝胶中进行cDNA片段的大小筛选；与Eco RI衔接子的cDNA结合；用Not I消化；在琼脂糖凝胶中进行cDNA的大小筛选；与载体的cDNA结合；转化感受态细菌；通过碱裂解方法制备质粒DNA；制备用于测序的样品；检索序列；扩增选择的克隆；在PCR反应中合成抑制剂寡核苷酸；聚合酶链反应(PCR)；在琼脂糖凝胶中选择重组质粒；用限制酶消化质粒DNA；结合于表达载体；诱导以小规模表达；蛋白表达；结构分析；分析重组体的二级结构；分析一级结构和三级结构模型；生化测定；在磷脂存在下抑制FXa；凝血测试；人和鼠肿瘤细胞系培养；用Amblyomin-X重组蛋白处理肿瘤细胞；通过流式细胞术确定DNA含量；通过流式细胞术确定细胞周期阶段；肿瘤细胞系培养和将肿瘤植入动物；观察肿瘤生长；确定细胞毒性活性；获得腹膜巨噬细胞；培养人皮肤成纤维细胞和统计学分析。

为了完成本发明，优选使用以下材料：

细胞系：大肠杆菌

1)菌株DH5α：80dlacZΔM15，recAl，endAl，gyrA96，thi-1，hsdR17(r_k ^-，m_k ⁺)，SupE44，relAl，deoRΔ(lac ZYA-arg I)ul69。

2)菌株BL21(DE3)：F′，ampT，hsdSB(r₈ ^-，m₈ ^-)，，dcm，gal(DE3)。噬菌体DE3含有启动子Lac UV5控制下的噬菌体T7的RNA聚合酶基因，所述启动子用异丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导。

质粒：

1)pGEM-llZf(+)：用EcoR I和Not I消化的载体，用于建立质粒文库。PROMEGA，1999的技术手册。

2)″easy″pGEM-T：″easy″pGEM-T质粒含有MCS(″多克隆位点″)侧翼的T7和SP6启动子，用于PCR产物的亚克隆。PROMEGA，1999的技术手册。

3)pAE：在Butantan学院的分子生物技术实验室构建的来自pRSETA(Invitrogen)和pET3-His(Chen，1994)的表达载体(Ramos et al，2003)。

PAE是一种组合了启动子T7的效力和大量pRSETA质粒拷贝，以及pET3-His的六个不可除去的组氨酸的N末端融合体的高表达载体，其使得能够用固定的金属，通过亲和层析(″固定的金属亲和层析″，IMAC)纯化重组蛋白。添加该小融合体不干扰研究的大多数重组蛋白的活性。

在PCR反应中合成起始寡核苷酸的方法如下开始：

基于蛋白N末端序列获得“有义”寡核苷酸(P1和P2)。优选在这些寡核苷酸中加入限制位点，以便随后进行单方向克隆。也使用“有义”和“反义”寡核苷酸。将它们全部在TE缓冲液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM)中稀释，达到10pmol/μl(100μM)的终浓度。

在制备mRNA的过程中，进行了以下步骤：

用卡延钝眼蜱感染家兔(Oryctolagus cuniculus)，在饲养时间后，取出雌性蜱，用无菌手术材料收集它们的唾液和唾液腺。解剖蜱的唾液腺复合体，保存在“冷冻试管”中，立即在液氮中冷冻，-80℃下在冰箱中储存。

总RNA提取

根据制造商手册推荐的方法，将唾液腺浸入苯基异硫氰酸胍试剂中。

总RNA电泳图谱

用3％的过氧化氢(H₂O₂)处理电泳系统的配件，以除去RNA酶，并且用DEPC高压灭菌的水清洗。将溶于磷酸钠缓冲液10mM，pH7.0中的1.5％的琼脂糖凝胶铺于平板中。在凝胶中加入两个样品，其中含有10或15μl总RNA(16.7ng/μl)、5μl样品缓冲液和DEPC处理的H₂O，终体积是25μl。在5V/cm进行样品的迁移，直到溴苯酚达到凝胶的2/3。

在寡聚物(dT)纤维素亲和柱中进行mRNA纯化

在用NaOH 0.1N洗涤并且用1ml结合缓冲液Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM、NaCl 300mM、SDS 0.1％、pH7.0平衡的寡dT纤维素亲和柱中纯化mRNA。

将3ml结合缓冲液加入总RNA中，然后70℃下温育5分钟，将其在冰上再冷却5分钟，加入亲和柱。通过重力引流柱子，再用4ml结合缓冲液洗涤，以除去所有不是mRNA的RNA。

用1.5ml缓冲液Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM、SDS 0.1％、pH7.0洗脱mRNA，收集在洁净的经过处理的试管中，70℃下加热5分钟，在冰上再冷却5分钟。室温下温育20分钟后，将90μl NaCl 5M加入上述材料，再次加入用结合缓冲液重新平衡的柱子中。用4ml结合缓冲液重新洗涤，并且用1.5ml洗脱缓冲液洗脱后，用90μl NaCl 5M和3ml无水乙醇在-80℃下将收集的材料沉淀“过夜”。然后4℃下将材料以7000g离心20分钟，除去上清液。

用1ml 75％的乙醇洗涤mRNA，4℃下以7000g离心2分钟。干燥后，将沉淀的mRNA重悬于20μl DEPC处理的H₂O，并且在-80℃保存。

mRNA定量

为了得到500-μl的终体积，将2μl mRNA加入milli-Q高压灭菌的498μl H₂O中。在500μl的石英杯中在260和280nm进行光密度读数。基于以下公式计算mRNA浓度：

[RNA]＝A_26O×D×40μg/ml

其中，D＝稀释因数。

在cDNA文库的建立中，采用以下步骤：

优选采用改进的用于cDNA和质粒克隆的Superscript^TM PlasmidSystem(Life Technologies)试剂盒，基于5.0μg分离的mRNA建立cDNA文库。

第一链的合成

将5.0μg mRNA稀释于6μl DEPC处理的H₂O中，在其中加入1.5μl NotI衔接引物，70℃下加热10分钟，在冰浴中冷却，迅速离心。将4μl 第一链缓冲液5x、2μl DTT 0.1M、1μl dNTP 10mM混合物和0.5μl H₂O加入试管。将反应物匀浆，迅速离心，44℃下平衡2分钟。加入5μl Super Script II RT酶，将混合物在44℃再温育90分钟。4℃下的冷却过程阻断了反应。

第二链的合成

将91μl H₂O、30μl第二链缓冲液、3μl dNTP 10mM混合物、1μl大肠杆菌DNA连接酶10U/μl、4μl大肠杆菌DNA聚合酶I 10U/ml和1μl大肠杆菌RNA酶H(2U/μl)加入第一链反应混合物。轻柔搅拌混合物后，将其在16℃温育2小时，加入2μl T4DNA聚合酶I，在相同温度下再温育5分钟。在冰中冷却，加入10μl EDTA 0.5M，阻断了反应。

在琼脂糖凝胶中筛选片段大小

将添加了17μl不含二甲苯腈蓝的Ficoll的完整第二链反应物加入1％的琼脂糖凝胶，在80V的电泳系统中使样品迁移1cm后，从凝胶切下两个条带；一个含有400-800pb的片段(低分子量，-80℃在冰箱中储存)，另一个含有超过1000pb的片段(高分子量，用于继续进行本发明)。

优选用Concert Gel Extraction Systems(Life Technologies)试剂盒从凝胶纯化DNA，用65℃下加热的50μl H₂O洗脱cDNA，在真空浓缩装置中浓缩为30μl。

cDNA与EcoR I衔接子的结合

将10μl缓冲液T4DNA连接酶5X、5μl Eco RI衔接子和5μl T4DNA连接酶加入反应试管，随后在16℃下温育16小时。此后，将反应在65℃下加热10分钟，在冰中冷却。加入2μl ATP溶液和2μl T4聚合酶激酶后，将反应在37℃下温育30分钟。

用55μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取cDNA，搅拌，室温下以14000g离心5分钟。将上层水相转移到另一个试管中，加入2体积的无水乙醇和1体积的3M的醋酸钠，在-80℃冷却1小时。14000g离心20分钟，并且用500μl 70％的乙醇洗涤后，流动干燥cDNA大约5分钟。

用NotI消化

将41μl H₂O、5μl特定反应缓冲液、4μl NotI加入沉淀中，轻柔匀浆，37℃下温育2小时。

在琼脂糖凝胶中进行第二次大小筛选

将50μl高分子量片段的反应物加入1％的琼脂糖凝胶中，电泳后，从凝胶上切下条带，纯化高分子量cDNA，按照第一次大小筛选中的描述用50μl H₂O洗脱(在琼脂糖凝胶中筛选片段大小)。

cDNA与pGEM11Zf(+)载体的单向结合

在高分子量级分(14μl)中加入4μl T4DNA连接酶缓冲液、1μl克隆载体，优选pGEM11Zf(+)(事先用EcoR I-Not I酶消化)和1μlT4DNA连接酶中，在16℃温育18小时。

按照以下步骤进行本发明的细菌转化过程：

转化感受态大肠杆菌DH5α

将高分子量DNA(2μl)加入50μl在-80℃保存并且预先在冰上解冻15分钟的钙感受态细菌(DH5α)。在冰上将溶液温育30分钟，随后立即在42℃下热激2分钟，再次在冰上温育5分钟。

将350μl SOC培养基加入转化的细菌中，转移到暴露于空气的试管中，在搅拌条件下(220rpm/min)37℃下温育90分钟。用2YT-氨苄青霉素培养基对cDNA进行铺板(200μl高分子量cDNA)，37℃下将平板温育18小时。37℃下在两个平板中将20个含有插入片段的菌落进行温育，温育是在200rpm搅拌下在2.5ml 2YT-氨苄青霉素100μg/ml培养基中进行18小时。优选用mini-prep-Concert Rapid Plasmid(LifeTechnologies)试剂盒纯化cDNAs，在65℃下用50μl TE洗脱。

为了分析质粒文库，采用以下步骤：

37℃下在1μl 特定反应缓冲液、4μl水、0.5μl EcoRI(10U/μl)酶存在下将质粒(4μl)消化2小时。在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中分析0.5μl HindIII(10U/μl)和产生的片段。对所有分析的质粒进行测序。

为了获得文库扩增，将含有0μl钙感受态细菌DH5α和5μl与克隆载体结合的高分子量DNA的混合物在冰上温育30分钟，在42℃下2分钟，然后再次在冰上5分钟。此后，加入10ml 2YT/氨苄青霉素100μg/ml培养基。轻柔将溶液匀浆，通过移液管将2.5ml等分物转移到除去空气的试管中，37℃下温育18小时。用微量制备柱提取质粒DNA，65℃下用50μl H₂O洗脱，在-20℃下保存。

聚合酶链反应(PCR)

制备为50μl终体积的PCR“聚合酶链反应”含有1μl dNTPs 10mM、5μl Taq DNA聚合酶缓冲液10x、1.5μl MgSO4 50mM、0.5μlTaqDNA聚合酶2.5U。为了扩增编码抑制剂的cDNA，扩增4μl的质粒DNA，使用4μl寡核苷酸Pl 10pM和2μl寡核苷酸SP6 10pM。在热循环仪中温育反应物，其中进行以下程序：最初在94℃下变性3分钟，30个循环的变性(94℃下45秒)、退火(50℃下25秒)、延伸(72℃下4分钟)，最后72℃下延伸15分钟。此后，将样品加入1％的琼脂糖凝胶。80V下进行2小时的电泳迁移后，从凝胶切下相应于预期扩增产物的条带，提取DNA，在30μl H₂O中洗脱，以便与第二克隆载体结合，所述第二克隆载体优选″pGEM-T Easy Vector Systems″(Promega)。

为了进行与质粒的DNA结合，采用了以下方法：

16℃下对含有6μl PCR产物(1700pb)、1μl pGEM-T载体、2μl缓冲液T4DNA连接酶5x和1μl T4DNA连接酶1U/μl的10μl终体积进行结合18小时。

与5μl结合反应载体-插入片段一起温育大肠杆菌DH5α的菌株，并且铺板。在形成的菌落中，收集20个菌落进行预先接种和“微量制备”，其完全根据关于转化DH5α感受态大肠杆菌描述的方案。

在琼脂糖凝胶中选择重组质粒

在进行“微量制备”反应前，对300μl每种预先接种物进行快速苯酚：氯仿纯化过程。此后，将20μl每种样品加入TAE IX缓冲液中的1％琼脂糖凝胶中。电泳后，用0.1μg/ml溴化乙锭溶液对凝胶进行染色，以选择暴露于紫外线的更大重组质粒。对上文提到的阳性克隆进行微量制备，用60μl水洗脱。

用限制酶消化质粒DNA

在终体积为20μl的溶液中，消化采用P1和P2引物通过PCR扩增的纯化克隆的DNA，所述溶液含有5μl质粒DNA、2μl特定反应缓冲液、0.5μl EcoRI(10U/μl)、0.5 Xho I(10U/μl)和12μl H₂O。

在采用1μl特定反应缓冲液、1μl EcoR I(10U/μl)和12μl水的相同条件下温育相同的质粒DNAs(5μl)。

在1％的琼脂糖凝胶中分析消化产物。对文库克隆和在″easy″pGEM-T中亚克隆的DNA进行测序。

为了进行DNA测序，进行了通过双脱氧核苷酸的链终止法，使其适于自动化测序仪。通过在测序反应中用作模型的微量制备物，经过纯化制备400ng质粒DNA。在反应中使用描述的寡核苷酸T7和SP6。热循环后，在长度为36cm的DNA测序凝胶(4.25％比例为19∶1的丙烯酰胺：二丙烯酰胺，在IX TBE和7M脲中)中分离扩增产物。该装置的检测系统包含激光源和置于测序凝胶下部的荧光检测仪。每种dNTP发射可以通过检测器捕获的特定荧光，其将信息传递到计算机，计算机自动将核苷酸位置记录到电泳图中。电泳进行7小时。将所有测序的DNA与″GenBank″序列进行比较，该比较是通过网站www.ncbi.nlm.nih.gov/，基于BLASTx和BLASTn程序的算法，或经过www.ebi.ac.uk/，基于FASTA程序。

本发明采用的优选在大肠杆菌的BL21(DES)菌株中进行的重组蛋白表达过程按照以下步骤：

与pAE载体结合

37℃下将阳性克隆在7ml LB/氨苄青霉素中温育18小时，然后进行微量制备，并且用50μl水洗脱，所述阳性克隆中测序的插入片段证实了Amblyomin-X序列。

37℃下将纯化的DNA在终体积为50μl的溶液中消化5小时，所述溶液含有20μl质粒DNA、5μl特定反应缓冲液、1.0μl EcoR I(10U/μl)、1.0μl Xho I(10U/μl)和23μl H₂O。

在1％的琼脂糖凝胶中进行制备电泳后，从凝胶纯化大约1000pb的条带，用30μl H₂O洗脱，真空下在45℃干燥1小时。

将质粒重悬于10μl H₂O中，将3.5μl质粒在16℃下与3.5μl pAE表达载体(图4)、2μl DNA连接酶的缓冲液5x和1μl DNA连接酶一起温育18小时。也对在pAE载体中亚克隆的克隆进行测序。

诱导Amblyomin-X表达

为了获得大肠杆菌BL21(DE3)菌株的大量可溶性重组蛋白，优选将大肠杆菌用于该蛋白的表达，因为它是一种表现为生长迅速、容易培养和维持、并且产生大量重组蛋白的菌株。大肠杆菌的该菌株是溶原性的，并且不具有翻译后修饰系统。

将优选用重组表达载体(pAE-克隆14.16)(图4)转化的大肠杆菌培养物接种在3ml LB/氨苄青霉素(100μg/μl)培养基中，在37℃下温育，直到获得0.5的DO_600nm。对于未诱导的对照，将1ml预接种物在4℃下保存。将0.5mM IPTG加入剩余的体积，再维持温育3h。将含有0.1M β-巯基乙醇的10μl加样缓冲液SDS-PAGE加入每个40μl的培养物。将样品煮沸12分钟，加入12.5％的聚丙烯酰胺凝胶。此后，用溶于50％甲醇的0.25％的“考马斯亮蓝”对凝胶染色18小时，室温下用溶于水的10％乙酸脱染色3小时。

为了获得本发明的蛋白表达(Lopap)，采用了以下步骤：

将用表达载体转化的大肠杆菌的培养物接种在100ml LB/氨苄青霉素(100μg/μl)培养基中，在37℃下温育，直到获得0.5的DO_600nm。37℃下在4个不同的装有500ml LB/氨苄青霉素(100μg/μl)的瓶子中温育25ml的等分物90分钟。然后加入终浓度为1mM的IPTG，再维持温育4小时。然后以12000rpm离心培养基，在-70℃冷冻18小时。然后将4瓶细胞重悬于70ml的裂解缓冲液NaH₂PO₄ 50mM、NaCl 300mM、咪唑10mM，并且通过2000GAGE的弗氏压碎器三次，4℃下5000rpm离心15分钟。

将具有可溶性表达蛋白的上清液在15000rpm离心30分钟，使溶液澄清，加入预先用裂解缓冲液平衡的Ni-sepharose亲和柱。用缓冲液咪唑80mM、β-巯基乙醇5mM、NaCl 500mM、Tris HCl 50mM pH6.8洗涤柱子，收集洗涤体积。用Tris-HCl 50mM pH8.0、咪唑1M、NaCl 100mM，以1ml/5分钟的流速洗脱蛋白。

通过弗氏压碎器并且离心的培养基的“沉淀物”(小球)重悬于20ml的缓冲液Tris-HCl 50mM、脲1M、Triton X-100 1％，pH8.0中，以除去疏水成分，并且4℃下以5000rpm离心15分钟。室温下用10ml的缓冲液Tris-HCl 50mM、NaCl 500mM、脲8M、β-巯基乙醇10mM pH8.0温育过夜，以溶解小球。

然后将该材料4℃下再次以4000rpm离心20分钟，在“重折叠”缓冲液Tris-HCl 50mM、NaCl 500mM、咪唑5mM和β-巯基乙醇5mMpH8,0(作为获得具有正确结构的蛋白的替代方法。达到该阶段的另一方法是使用添加了CaCl₂100mM的缓冲液)中逐滴加入上清液，同时室温下连续搅拌18小时。过滤该材料，加入预先用裂解缓冲液平衡的Ni-sepharose柱。用180ml缓冲液Tris-HCl 50mM、NaCl 500mM、咪唑20mM pH6.8洗涤柱子，用Tris-HCl 50mM pH8.0、咪唑1M、NaCl 100mM，以1ml/5分钟的流速洗脱。

检测获得的重组蛋白对因子Xa的抑制能力、凝血测试和肿瘤细胞的控制。

序列保存在数据库中，获取的限制最多到2005年4月，获取号是BANKIT 608848。

在磷脂存在下进行确定FXa抑制的生化测定。按照Barenholz et al.，1977的描述制备磷脂膜。

通过测量具有FXa的水解位点的氨基-甲基-香豆素底物或商购的发色底物上残留的酶活性而确定磷脂膜存在下的FXa抑制。

通过用分光荧光计在380nm(激发)和460nm(激发)波长的荧光下或用分光光度计在405nm波长(发色底物的情况下)下监测37℃下在缓冲液Tris/HCl 50mM，pH7.5-8.0中进行的水解反应。

当以5-10uM剂量使用时，在纯化的条件下，在磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱存在下和在血浆中，本发明的重组蛋白抑制激活的人因子X的酰胺裂解活性。

在0.3-1.2uM的剂量，该蛋白诱导肿瘤细胞系细胞(B16F10、SKMEL28)的凋亡(程序化细胞死亡)，其细胞周期停止在G2/M。

在这些浓度下，蛋白不诱导正常细胞的凋亡作用(HUVECs、多形核白细胞、人成纤维细胞、血小板和巨噬细胞)。

通过皮内途径用1.0mg/Kg的剂量治疗种植了B16F10黑素瘤(在第12天，肿瘤体积是大约0.5mm³)的C57BL/6J同基因小鼠14天，显示出Amblyomin-X重组蛋白能够显著减少肿瘤团块和体积。其也可以减少肺、肝和脾转移的数目。

在C57BL/6J小鼠中通过腹膜内途径以0.5mg/Kg剂量，用Amblyomin-X重组蛋白治疗42天，并且是在通过静脉内途径植入B16F10肿瘤细胞3天后开始的。Amblyomin-X能够导致肿瘤团块和体积完全消退，并且显著阻断转移的形成。用Amblyomin-X治疗的患有肿瘤的动物的肺、肝和脾中肿瘤和转移病变的解剖病理分析，以及与未治疗动物的比较，表明重组蛋白促进肿瘤细胞的选择性识别，抑制MAP激酶系统的信号途径的增殖能力和新血管发生，导致细胞死亡。甚至在42剂治疗后，诸如肝、脾和肺的内脏的实质的显微镜分析没有显示显著的细胞学改变。

进行治疗的患有肿瘤的动物的血液学分析表明，与患有严重贫血的未治疗动物相比，重组蛋白显著改进了血液学状况，将血小板计数、血红蛋白和细胞性维持在正常水平。

根据本发明，获得了含有来自卡延钝眼蜱唾液腺的cDNA的序列的组合物。该组合物包含多肽或蛋白，它们的序列是从编码碱基1-碱基505的cDNA确定的。

获自组合物的重组蛋白命名为Amblyomin-X。它是两个结构域，即Kunitz型和MAP激酶型结构域组成的蛋白，并且它可以用于肿瘤治疗和开发cDNA疫苗。它也存在对因子Xa、X和VII蛋白以及因子VIIa/TF复合物的生物活性，表明是调节抗凝功能的潜在候选物。

肽、多肽或蛋白的施用改进患有与心血管和血栓栓塞合并症相关的疾病的患者的状况；减少恶性肿瘤的转移；减少恶性肿瘤生长和播散；抑制恶性肿瘤的转移；在手术前和手术后状况中的抗凝性能使其可以用于预防产生凋亡体(富含磷脂的分子)的状况中的血栓栓塞，在退化性疾病和恶性肿瘤中，它可以用于改进免疫应答。它可以用作恶性肿瘤化疗中的联合疗法；作为恶性肿瘤放疗中的联合疗法；作为具有血栓栓塞合并症的恶性肿瘤的化疗中的联合疗法。它也可以用作具有血栓栓塞合并症的恶性肿瘤的放疗的联合疗法；能够调节程序化的细胞死亡(凋亡)；能够调节肿瘤中的新血管形成，并且可以用作目标治疗剂。

Amblyomin-X三级结构的模拟

根据通过cDNA获得的序列，用Swiss PDB Viewer 3.7(b2)程序和Swiss Model Server进行了模拟Amblyomin-X的研究方法。

本发明具有医学和兽医学方面的应用领域。

图1：琼脂糖凝胶电泳。样品：通过苯基异硫氰酸胍方法从卡延钝眼蜱唾液腺提取的总RNA。

图2：琼脂糖凝胶电泳。1和2.通过寡聚物(dT)柱纯化的mRNA。3.不保留在寡聚物(dT)柱中的材料；4.总RNA。

图3：质粒文库的cDNA插入片段。在1-2％的琼脂糖凝胶电泳中的电泳显示了与EcoR I和Hind III一起温育2小时后通过质粒文库的16个随机克隆获得的片段。从1-16：随机克隆的切割产物，17：标记物。

图4：选定的克隆的完整序列(SEQ ID No.1)。

图5：针对蛋白序列(SEQ ID No.2)选定的克隆的核苷酸序列的翻译。

图6：成熟蛋白的序列(SEQ ID No.3)。

图7：构建用于扩增选择用于表达的克隆的“引物”的5′-3′序列(SEQ ID No.4)。

图8：SDS-PAGE 15％。在Ni-Sepharose柱中纯化重组抑制剂。1)分子量标记物，2)层析入口材料，3-8)纯化中洗脱的级分。

图9：Amblyomin-X和硬蜱的一级结构的比较。

图10：磷脂存在下FXa抑制的曲线和重组抑制剂的渐增浓度。

图11a：在不存在和存在渐增浓度的重组抑制剂的条件下部分激活的促凝血酶原激酶时间的延长曲线。

图11b：不存在(对照)和存在渐增浓度的重组抑制剂的条件下凝血酶时间(TP)的抑制曲线。

图12：存在和不存在Amblyomin-X的条件下使用PS：PC或凋亡体的凝血时间。

图13：治疗6小时后，B16F10细胞中通过Amblyomin-X(0.3uM)治疗引起的细胞学改变。

图14：治疗12小时后，B16F10细胞中通过Amblyomin-X(0.3uM)治疗引起的细胞学改变。

图15：治疗24小时后，B16F10细胞中通过Amblyomin-X(0.3uM)治疗引起的细胞学改变。

图16：用不同浓度的Amblyomin-X治疗的B16F10黑素瘤细胞的细胞粘附抑制的分析。

图17：Amblyomin-X对B16F10黑素瘤细胞存活力的影响。

图18：用Amblyomin-X治疗的B16F10背部黑素瘤在14天中的生长的分析。

图19：植B16F10黑素瘤细胞和用1mg/Kg Amblyomin-X治疗14天后产生的背部肿瘤的显微镜下表现。

图20：用Amblyomin-X治疗后肿瘤重量的生长曲线。

图21：用Amblyomin-X治疗14天后肺实质中存在的肿瘤结节数。

图22：用Amblyomin-X治疗后肺病变的大小分布。

图23：关于用Amblyomin-X治疗的具有肺实质转移的动物的寿命持续率的分析。

图24：用Amblyomin-X治疗的42天中，治疗的B16F10背部黑素瘤的显微镜下表现。

图25A：用盐水溶液治疗的42天中，治疗的对照组的C57BL/6J小鼠中B16F10背部黑素瘤的显微镜下表现。

图25B：用Amblyomin-X治疗的42天中，治疗的C57BL/6J小鼠中B16F10背部黑素瘤的显微镜下表现。

图26：用Amblyomin-X治疗的B16F10背部黑素瘤的细胞周期的阶段分析。

图27：用Amblyomin-X治疗的动物的肺转移瘤的细胞周期的阶段分析。

图28：用不同浓度的Amblyomin-X治疗的健康人淋巴细胞的细胞毒性测定。

图29：测定低分子量肝素在B16F10细胞和SKMEL-28中的细胞毒性作用。

图30：用0.3uM Amblyomin-X治疗1小时后腹膜巨噬细胞的散布。

图31：用0.3uM Amblyomin-X治疗1小时后腹膜巨噬细胞的吞噬指数，该指数是通过补体的C3b 测量的。

图32：用Amblyomin-X治疗1小时后腹膜巨噬细胞的吞噬指数，该吞噬是通过抗体的Fc部分介导的。

实施例1

获得mRNA

在甲醛存在下，在琼脂糖凝胶中证实提取自卡延钝眼蜱唾液腺的总RNA的完整性(图1)。

实施例2

mRNA分离

为了分离mRNA，在1mM EDTA存在下将48ul总RNA稀释于500ul 10mM Tris缓冲液中，加入寡聚物(dT)纤维素亲和柱。获得了17.28ug mRNA。mRNA的比值A_260/280是1.71(ug/ul)。将不含降解产物的提取的mRNA用于构建eDNA文库(图2)。

实施例3

构建cDNA文库

在琼脂糖凝胶中从具有大于800pb的插入片段的cDNA文库选择。

选择了一些随机克隆，用Eco RI和Hind III消化，存在很多不同大小的插入片段(图3)。

实施例4

进行克隆测序，以便对蜱的唾液腺中的大多数表达的转录物进行作图

基于高分子量文库的铺板，通过碱裂解方法制备6孔平板，通过它对576个随机克隆进行测序。

实施例5

克隆测序和“引物”概述

在获得的序列中，一些克隆与“Serpins”具有高度同源性，其中一个表现出与丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的分子量特征，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂以前由Butantan学院的生化和生物物理实验室从卡延钝眼蜱的唾液腺纯化。该克隆具有图4示出的完整序列。

实施例6

将克隆核苷酸序列翻译为蛋白序列

采用可以从″http://us.expasy.org/tools/dna.html″网站获得的程序，将选择的克隆的核苷酸序列翻译为氨基酸序列。获得的序列示于图5。

实施例7

成熟蛋白的序列

获得的序列是指具有信号肽的蛋白，通过http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/网站，可以理论确定该肽，该肽存在于该氨基酸序列的1-28位之间。成熟蛋白的序列含有108个氨基酸，理论分子量是12,295,6Da，理论等电点(pI)是4.67。成熟蛋白序列示于图6。

实施例8

构建用于克隆扩增的“引物”的5′-3′序列

基于成熟蛋白序列，概括了用于扩增感兴趣的抑制剂的“引物”，其也具有作为Xho I酶的位点的CTCGAG序列，如图7所示。

实施例9

扩增编码抑制剂的cDNA

用构建的“引物”获得的扩增产物和SP6“引物”表现出大约400pb的条带。从凝胶上切下该条带并且纯化。

将纯化的cDNA亚克隆到载体中，转化到DH5α感受态细菌中。将产物铺板，从该步骤分离了20个随机选择的克隆，并且通过苯酚-氯仿提取，以评估插入片段的存在。

在阳性克隆中，选择了3个用于扩增、纯化，并且用Xho I和EcoRI酶进行限制分析。

证实了克隆序列，将通过消化释放的插入片段亚克隆到表达载体中，该载体在用IPTG诱导后表达的重组蛋白的N末端部分插入了六个组氨酸残基组成的末端。

目的蛋白作为包含体存在，在脲和β-巯基乙醇溶解后将其在Ni-亲和柱中纯化，如图8的SDS-PAGE所证明。

用具有浓度递减的脲(直到不存在)的溶液对通过Ni-Sepharose层析洗脱的材料进行透析。透析后的材料用于下文描述的结构测定和生化测定中。

实施例10

AMBLYOMIN-X和Ixolaris一级结构的比较实施例

基于Amblyomin-X一级结构(从DNA序列推断)，进行了分子的理论结构研究。

当与TFPI-1相比时，Amblyomin-X表现出大约17％的同源性，与TFPI-2相比时，表现出大约18％的同源性(都是人的情况下)。此外，结构研究表明Amblyomin-X与Ixolaris具有大约21％的同源性，Ixolaris是一种从肩突硬蜱的唾液腺克隆的重组蛋白。

当比较Amblyomin-X和Ixolaris的一级结构时(GeneStream比对)，证明了Amblyomin-X在N末端部分的残基3-13之间(根据Ixolaris分子的编号)和C末端部分的残基121-131之间(11个氨基酸)存在缺失。此外，分子内部存在残基缺失(18个氨基酸)，如图9所示。

如已经提到的，人TFPI存在3个结构域，D1由残基53-103组成，D2由残基124-174组成，最后，D3结构域由残基222-273组成。因此，将Amblyomin-X一级结构(仅仅具有2个结构域)与人TFPI-1分子的每个结构域进行比较。

此外，将Amblyomin-X部分结构在数据库中进行检索，证明了与Kunitz型抑制剂的高同源性“命中”对于N末端部分是高度保守的(残基1-61：ANSKAVCNLP KLAGDETCSN KTEIRWYYNGTACEAFIFKG CGGNDNNFDRV DDCQRLCEEQ)，但是，C末端部分(残基62-108：THFHFESPKLI CFKVQDYWILB NDIMKKNLTGISLKSEEEDAD SGEID)与2型磷酸酶、激酶系统的蛋白、α-淀粉酶3和MAP激酶途径的激活剂的蛋白具有同源性，数据是通过多重比对程序获得的。

当分析通过分子模拟获得的Amblyomin-X的三维结构时，其仅仅与该Serpins家族中存在的Kunitz型抑制剂的第一个结构域(残基1-61)具有结构同源性。

继续进行Amblyomin-X的结构研究，通过循环二分实验分析最可能的二级结构，可以发现除55％的无序结构外，Amblyomin-X存在10％的α螺旋和大约35％的β折叠结构，该数据符合该蛋白的模拟。

实施例11

对FXa的抑制活性的剂量

在采用磷脂混合物和发荧光底物的测定中，可以证实FXa的抑制和剂量依赖性的效果，如图10所示。

实施例12

延长凝血时间的测定

重组抑制剂能够延长凝血时间，即部分激活的促凝血酶原激酶时间(TTPA)和凝血酶原时间(TP)。图11a显示在50ug重组抑制剂存在下，TTPA从43.4秒(对照)延长到137.5秒，这反映了60％的抑制。图11b显示TP从不存在抑制剂条件下的14.3秒延长到存在50ug重组抑制剂条件下的89.3秒，反映了大约85％的理论抑制。

实施例13

磷脂存在下Amblyomin-X对凝血时间的作用

也可以观察到，在用CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中产生的凋亡体代替磷脂的凝血测定中，在2.5uM Amblyomin-X存在下，凝血时间从129秒(对照)改变为210秒，如图12所示。我们观察到Amblyomin-X抑制凋亡体的促凝作用的能力。

实施例14

处理6小时后，Amblyomin-X在B16F10细胞中导致的细胞学改变：分析形态学改变和细胞毒性

在96孔板中培养用不同浓度Amblyomin-X处理的B16F10黑素瘤的肿瘤细胞。首先对细胞毒性改变和粘附丧失进行了细胞学观察，通过捕获系统获得了图像。

用Amblyomin-X处理B16F10鼠黑素瘤的细胞培养物，以时间和剂量依赖性方式产生了细胞毒性作用。用0.5uM Amblyomin-X处理的B16F10细胞的培养物在处理6小时后显示了小的和分散的细胞质改变，它们是空泡形成和细胞内延长物的收缩，而不产生肿瘤细胞的脱离。没有观察到显著的细胞粘附丧失。数据示于图13。

实施例15

用Amblyomin-X处理12小时后，B16F10细胞中的细胞学改变

使肿瘤细胞暴露于0.5uM Amblyomin-X 12小时后，观察到了中度改变，该改变涉及细胞内延长物的收缩，并且形成分散在培养物上清液中的细胞聚集体，如图14所示。

实施例16

用Amblyomin-X处理24小时后，B16F10细胞中的细胞学改变

用0.5uM Amblyomin-X处理B16F10肿瘤细胞24小时后，显示出收缩和粘附的显著改变以及一些细胞聚集体的细胞减少，如图15所示。

实施例17

分析用不同浓度的Amblyomin-X处理的B16F10黑素瘤细胞的细胞粘附的抑制

在不同浓度的Amblyomin-X(0.3uM-0.1nM)存在下，在96孔培养板上培养B16F10细胞24小时后，观察到细胞与基质的粘附丧失了55％，并且显示这是剂量依赖性的(图16)。

实施例18

Amblyomin-X对B16F10黑素瘤细胞存活力的影响

在0.3uM-0.1nM的浓度观察到了存活力的丧失。收集上清液；通过台盼蓝排除测试，确定细胞数目和存活力。在Mallassez血细胞技术室中确定细胞浓度。在这些浓度下，存活力也是剂量依赖性的，当使用5ug时超过75％。它显示出最高的细胞脱离百分比，如图17所示。

实施例19

分析Amblyomin-X处理的C57BL/6J小鼠中B16F10背部黑素瘤生长

通过皮下途径将2.5×10⁵个肿瘤细胞注射到小鼠中，第12天后，将1mg/kg的Amblyomin-X通过皮下施用注射到动物中，直到第14天。在接种肿瘤细胞12天后，通过相同途径将相同体积的盐水溶液施用于对照组的动物。

每日观察动物，通过厚度计确定肿瘤的直径。与对照组相比，用Amblyomin-X治疗的动物表现出背部肿瘤体积的显著减少(图18)。

在肉眼评估的治疗的动物中，背部肿瘤色素减少，平均体积减小。相反，对照组的肿瘤非常大、有结节、有溃疡，并且有广泛的坏死区。注射了肿瘤细胞并且没有经过治疗的动物在治疗中表现出高水平的恶病质(图19)。与未治疗的动物(对照)相比，治疗组的寿命持续率(累积百分比)是平均13天。用Amblyomin-X治疗的动物表现出正常表现(图20)。

实施例20

用Amblyomin-X治疗后肺实质中存在的肿瘤结节数目

通过静脉内途径，给C57BL/6J小鼠组施用5×10⁴个肿瘤细胞，注射12天后，给它们进行0.5mg/Kg的Amblyomin-X治疗。在14天中每天通过腹膜内途径施用该治疗，每天观察动物。

尸检后，与对照组相比，用Amblyomin-X治疗的动物表现出肺实质中肿瘤结节数目的高度显著的减少(图21)。

实施例21

用Amblyomin-X治疗后肺病变的大小分布

肺实质的肉眼分析发现，对照组中存在的结节平均直径是0.1-0.3cm。在用Amblyomin-X治疗的动物中，它们不仅显示病变数目减少(低多样性)，而且它们也不存在大于0.3cm的病变。也可以观察到直径是0.1-0.2cm，而不表现侵入或播散特征(图22)。

实施例22

分析Amblyomin-X治疗的肺实质中具有转移的动物的寿命持续率

与对照组(未治疗)相比，用Amblyomin-X治疗的具有肺转移的动物的寿命持续率(以累积百分比表示)是15天(图23)。

在治疗过程中没有观察到Amblyomin-X治疗的动物的体重减轻，也没有观察到该阶段后的肿瘤团块增大。

实施例23

用Amblyomin-X治疗42天过程中，B16F10小鼠中背部黑素瘤的肉眼表现

在注射肿瘤细胞3天后，用1或0.5mg/Kg的Amblyomin-X每日治疗具有背部肿瘤的B16F10动物。通过皮下施用每日治疗具有肿瘤的动物，连续治疗42天。

结果表明，治疗是有效的，与对照组相比，治疗的动物中肿瘤团块和体积都显著缩小。

观察到注射了肿瘤细胞的动物不表现肿瘤生长，或者甚至可能通过诱导肿瘤消退，观察到肿瘤团块消失。解剖了一组动物，存在的肿瘤肉眼观察是小的、有色素沉着的、非结节的，并且不存在坏死区。也可以观察到肿瘤血管供应没有增加，它不存在邻近于病变的外周血管的系统募集。也没有观察到新血管发生(图24)。

实施例24

C57BL/6J小鼠的背部B16F10黑素瘤的肉眼表现(对照组和治疗24天)

在治疗过程中接受盐水溶液的对照组的背部肿瘤的组织病理表现显示了与sincicial团块相似的高度细胞化的肿瘤团块，其具有扩大的由中等和小血管以及毛细血管供应的区域。在肿瘤团块周围，观察到单核白细胞的分散的炎症浸润。

在治疗14天后取出的Amblyomin-X(1mg/Kg)治疗组的肿瘤显示出具有低增殖活性、低量支持纤维元件(很少结缔组织/基质)，同时不存在肿瘤周围炎症浸润的肿瘤团块。该组的肺部转移病变显示出是肺实质中的具有低细胞性的小肿瘤，表现出肺泡厚度和黑色素型的沉积和褐色色素。在这些病变中没有观察到支气管的隔内炎症浸润。

获自Amblyomin-X治疗42天的动物的背部肿瘤表现出肿瘤细胞组织成岛状，弥散着广泛的坏死区(图25B)，与对照组不同(图25A)。通过苏木精/伊红染色技术，没有检测到新形成的血管。分析的其它内脏，如肾、肝、脾和心脏，没有表现组织学改变。没有观察到由于Amblyomin-X长期治疗导致的这些器官中的功能丧失或直接毒性作用。

观察到了肿瘤团块周围少量显示纤维或渗出的物质的形成。

实施例25

分析Amblyomin-X治疗的小鼠的背部B16F10黑素瘤的肿瘤细胞的细胞周期阶段

评估细胞周期阶段：在用Amblyomin-X治疗14天的具有背部肿瘤或肺转移的动物和接受盐水溶液的对照组动物尸检后，通过流式细胞术评估肿瘤的细胞周期阶段，在亚G1或凋亡阶段、G0/G1、S阶段和G2/M确定细胞的百分比。

结果显示获自接受Amblyomin-X治疗的动物的背部肿瘤的肿瘤细胞表现出大多数存在于凋亡阶段(亚G1)和静息阶段(G0/G1)，增殖活性很低(G2/M)(图26)。

实施例26

分析Amblyomin-X治疗的动物的B16F10黑素瘤的转移病变的细胞周期阶段

通过流式细胞术分析的获自肺转移病变的细胞大多数存在于细胞周期的G2/M阶段，表明这些细胞增殖能力的阻断和疗效(图27)。

实施例27

健康人细胞中不同浓度的Amblyomin-X的细胞毒性测定

将健康鼠和人细胞暴露于不同浓度的Amblyomin-X 24小时，显示出对于皮肤成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，Amblyomin-X没有表现出细胞毒性作用，与肝素处理相比(图29)，在培养板中没有观察到细胞死亡或细胞脱离(图28)。

实施例28

评估具有B16F10黑素瘤并且用Amblyomin-X治疗的动物的巨噬细胞功能活性

用Amblyomin-X治疗的具有B16F10黑素瘤的动物和对照组中巨噬细胞的功能活性评估表明，该治疗增加了巨噬细胞的吞噬活性，该活性依赖于补体系统的C3b片段或免疫球蛋白的Fc受体(图30、31和32)。

实施例29

凝血测试

在存在和不存在Amblyomin-X的条件下评估部分激活的促凝血酶原激酶时间(TTPA)和凝血酶原时间(TP)。为了进行这些测试，采用了商购的凝血“试剂盒”。

TTPA是评估内源性凝血途径的测试，即，监测血浆callicrein和因子XII、IX、XI和X。

在不存在Amblyomin-X的条件下进行测试对照，其由以下步骤组成：37℃下将100ul健康人血浆、100ul cefaline和100ul tris HCl 0.1M pH8.0缓冲液温育3分钟，然后通过加入100ul CaCl₂ 0.025M使培养基重新钙化。

通过半自动化的凝血测量仪测量血凝块的形成时间。在抑制实验中，不使用缓冲液，而是使用在tris HCl 0.1M pH8.0缓冲液中制备的100ul Amblyomin-X。

为了进行另一种凝血测试，即TP，采用了相同的设备。TP证明了外源凝血途径，即，它监测因子II、V、VII和X。

该测定的对照是如下进行的：37℃下将100ul血浆与100ul tris-HCl 0.1M pH8.0缓冲液一起温育2分钟，然后加入100ul试剂。如同上文所述测试，证明血凝块形成时间。为了评估抑制作用，不使用缓冲液，而是使用在tris HCl 0.1M pH8.0缓冲液中制备的100ulAmblyomin-X。

采用CHO细胞中产生的凋亡体作为磷脂来源，也证明了Amblyomin-X对凝血时间的影响。

实施例30

Amblyomin-X对凋亡体的促凝作用的影响

绘制了用于对凝血测试进行标准化的理想曲线，该测试称作PCA“促凝活性”。为了进行该测试，将终体积为60ul的1nM的激活的因子VII(FVIIa)与人因子X(FX)0.25和CaCl₂ 8.3mM与含有牛血清白蛋白(BSA)(1％)的Hepes 250mM缓冲液中的不同浓度的重组组织因子(r-TF)(1.56-12.5ng/ml)在37℃下预先温育3分钟。此后，加入100ul含有正常人血浆(87.5ul)、磷脂酰丝氨酸∶磷脂酰胆碱PS 30∶PC 70(7.5ul)和Hepes(50nM)的混合物，将混合物再温育3分钟。通过加入20ulCaCl₂ 250mM开始反应。

将Amblyomin-X与CHO细胞产生的凋亡体一起预先温育，观察到凋亡体诱导的凝血时间延长(Sorensen et al.，2003)。

实施例31

评估Amblyomin-X在人和鼠肿瘤细胞系培养物上的抗肿瘤能力

在75cm3的培养瓶中，在补加了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和链霉素0.1mg/ml以及氨苄青霉素0.1mg/ml的RPMI-1640培养基中培养肿瘤细胞系HL-60、K562、U937、YAC-1、JURKAT、Mel-85、Mewo、MCF-7、SW613-12A1、SW613-B3、SW613-12A1和SW613结肠癌细胞系和B6F10鼠黑素瘤细胞系。培养细胞以扩增和维持细胞系，达到汇合(贴壁细胞)，在含有10％二甲亚砜的RPMI-1640培养基中冷冻，在液氮中保存。

用0.2％的胰蛋白酶处理培养瓶5分钟，获得所有实验步骤的贴壁细胞(B16F10、SW613-12A1、SW613-B3和MCF-7)悬浮液，用10％胎牛血清灭活。将脱离的细胞离心两次，重悬于RPMI-1640补充培养基中。在Malassez室中进行细胞计数，在补加了10％胎牛血清和7ugPolymixine-B的RPMI-1640培养基中将细胞浓度调节为5×10⁵个细胞/ml。

通过台盼蓝排除测试确定细胞存活力，显示出95％是存活细胞。

实施例32

用Amblyomin-X处理肿瘤细胞

在96孔板中培养2×10⁵浓度的细胞，37℃下在CO2灭菌器中维持24小时。此阶段后，将96孔板在4℃下以2000rpm离心5分钟，排出上清液，加入0.3uM-0.3nM的不同浓度的Amblyomin-X，其是在补充和添加了7ug Polymixine-B的RPMI-1640培养基中稀释的。6、12和24小时后，观察细胞学改变，在图像捕获系统中进行光记录。

细胞周期

在细胞周期研究中采用的流式细胞术记录了细胞的动力学参数，示出了DNA指数、倍性、细胞增殖比例和处于S和G2/M阶段的细胞百分比，表明预后的单变量或多变量参数和可能的治疗步骤。细胞百分比的分析提供了正在合成DNA的细胞百分比(“标记指数”)、S阶段的持续时间(Ts)和可能的复制时间(Tpot)。

实施例33

确定DNA含量

将用Amblyomin-X处理或未处理的肿瘤细胞悬浮液的等分物立即冷冻在含有柠檬酸盐(2mM)、蔗糖25mM和0.05％二甲亚砜的缓冲液中，在液氮中保存备用。

将样品在冰浴中解冻后，室温下将细胞与375μl 0.03g/l的胰蛋白酶一起温育10分钟，用胰蛋白酶抑制剂0.5g/l、核糖核酸酶A 0.1g/l和精胺1.2g/l中和。将样品转移到流式细胞术管中，分析细胞周期不同阶段的细胞数、凋亡水平(亚G1)和S阶段的DNA含量。

实施例34

确定细胞周期阶段

4℃下以3000rpm将正常细胞和肿瘤细胞系的细胞的细胞悬浮液(10⁶/ml)与PBS溶液一起离心两次，室温下重悬于含有20μl Triton X-100和4mg RNA酶-A的200μl 氧化丙锭(20μl/ml)溶液中，避光的条件下持续30分钟。该阶段后，将样品转移到流式细胞术管中，在流式细胞仪上捕获图像。分析有丝分裂前和后的细胞周期阶段(G0-G1、S阶段和G2-M)。

实施例35

培养肿瘤细胞系并且将肿瘤细胞植入动物(小鼠)

用0.2％的胰蛋白酶处理培养瓶5分钟，并且用10％胎牛血清灭活，然后获得用于植入动物背侧胁腹的贴壁细胞悬浮液(B16F10)。将脱离的细胞离心(2.000rpm)两次，重悬于补加了56℃灭活1小时的10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.1mg/ml链霉素以及0.1mg/ml氨苄青霉素抗生素的RPMI-1640培养基中。在Malassez室中进行细胞计数，将细胞浓度调节到5×10⁴个细胞/ml。

实施例36

原代背部肿瘤的生长和内脏转移的评估

在实验动物管理设施中维持各组小鼠，每组10只，其属于C57BL/6J品系。使动物处于光/暗12小时循环，处于20℃的恒定温度，任意摄入过滤和灭菌的水和食物。

为了进行原代背部肿瘤的生长实验，通过皮下途径将2.5×10⁴个B16F10鼠黑素瘤肿瘤细胞注射到小鼠背部(10个动物组成一组)。

为了评估内脏转移，各组C57BL/6J小鼠通过静脉内途径，经眼部眶后静脉从接受5×10⁴个B16F10肿瘤细胞。接种12天后，通过腹膜内途径用0.5mg/Kg Amblyomin-X治疗各组动物，并且观察，直到治疗的第14天。

用1mg/Kg Amblyomin-X治疗通过皮下途径接受肿瘤细胞的、在12天后表现出背部肿瘤的动物。每天对它们进行观察，直到麻醉并处死，用厚度计测量它们的肿瘤。肿瘤的平均直径是0.5cm。开始用Amblyomin-X治疗。

对照动物通过相同的治疗途径接受盐水溶液。在治疗14天后，麻醉动物，并且通过颈椎错位处死。进行尸检，并且分析背部肿瘤，肉眼鉴定、测量内脏病变，并且进行光记录。加工不同治疗组和未治疗的对照组的肿瘤样品，以分析DNA含量、细胞周期和解剖病理。

实施例37

观察肿瘤生长

注射B16F10细胞后，用厚度计测量肿瘤生长，并且每日进行光记录。进行了肿瘤纵向和横向测量(每个参数测量两次)。通过以下公式计算肿瘤面积和平均体积：A＝πR²和V＝4/3πR³。在治疗的每个阶段麻醉并处死通过静脉途径接受肿瘤细胞的动物，并且进行尸检。对内脏中存在的肉眼可见的肿瘤结节进行计数和测量。

实施例38

确定细胞毒性活性

通过MTT比色法(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-溴化二苯基四唑)确定用0.03nM-0,3uM的不同浓度的Amblyomin-X和80-0.0015ug肝素钠处理的细胞系和肿瘤细胞的细胞存活力。该方法基于活细胞将MTT还原为甲

。根据国家癌症研究会，USA(NCI)建立的标准，对不同剂量Amblyomin-X的敏感性确定进行优化。在通过手术分离并且在96孔板中无菌条件下温育的肿瘤细胞的细胞系悬浮液中确定Amblyomin-X细胞毒性(“离体”)。在这些细胞中，加入10μl MTT(5mg/ml)，然后37℃下将细胞在含有5％CO₂的灭菌器中温育3小时。该阶段后，除去培养基，加入100μl二甲亚砜，用于溶解形成并以沉淀物形式存在的甲

晶体。在540nm下监测吸光度。

实施例39

获得腹膜巨噬细胞

用Amblyomin-X治疗具有B16F10黑素瘤的小鼠和对照组(接受了盐水溶液)后，麻醉动物，并且通过颈椎错位处死。将经过治疗的动物和对照动物的腹腔暴露，注射2ml含有5000U冷肝素的盐水溶液。按摩腹腔，在收集腹膜洗液后，在4℃下以2000rpm离心10分钟。将细胞悬浮液重悬于补加了10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，将细胞数目在Mallassez血小板计数室中调节为10⁶/ml。

在预先灭菌的球形板中培养巨噬细胞悬浮液的等分物，浸入RPMI-1640培养基，在12孔板中维持，在存在和不存在10⁵个白色假丝酵母、10⁵个绵羊红细胞的条件下温育，或用C3Bb或免疫球蛋白的Fc部分处理。24小时后，固定平板，染色，对贴壁细胞和吞噬细胞颗粒的数目进行计数。

实施例40

培养人皮肤成纤维细胞

在无菌条件下收集预先选择的人皮肤碎片(约1cm×1cm)，立即置于含有补加了20％胎牛血清的Ham-F12培养基的无菌锥形管。将每个碎片转移到含有培养基的35mm的Petri培养皿中，以便洗涤和除去过量的血。用剪刀和钳子取出脂肪和退化组织。将“洁净的”碎片切成更小的碎片，然后将它们分布在含有补加了10％胎牛血清的Ham-F12培养基的3个Petri培养皿(每个±15个碎片)。

将平板在37℃下存在5％CO₂的条件下维持在湿化的灭菌器中，每周在倒置显微镜下检查3次。以相同的时间间隔更换培养基。当达到亚汇合状态时，将细胞暴露于胰蛋白酶(0.2％的胰蛋白酶)5分钟，用10％的胎牛血清进行灭活，4℃下以2000rpm将细胞离心10分钟，并且装入25cm²的瓶子。

细胞生长和扩增后，将10⁵个成纤维细胞在96孔板中培养24小时。此后，用在含有10％的牛血清白蛋白和7ug/ml polymixine-B的RPMI-1640中稀释的Amblyomin-X处理培养物。作为对照，以相同浓度使用肝素钠或使用完全培养基处理。

统计学分析

通过ANOVA方差方法和随后的TUKEY-KRAMER多重比较检验进行统计学分析。

用平均值±标准差表示统计值，将^＊p＜0.05作为显著值。

参考文献：

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序列表

<110>Uniao Quimica Farmaceutica Nacional SA；et al.

<120>KUNITZ型重组抑制剂

<130>PI0406057-1

<150>BR PI0406057-1

<151>2004-09-15

<160>4

<170>Microsoft Word 2000

<210>1

<211>504

<212>PRT

<213>卡延钝眼蜱

<220>

<223>基于卡延钝眼蜱的唾液腺的cDNA文库的Kunitz型蛋白酶抑制剂的核苷酸序列。

选择的克隆的完整序列。

<400>1

caggaaaacg ttgcactcag aaatgcgcca acttgccgtt ctagcgctcg taatcttcac 60

gggcatgtgt gttgaatcac agtcggcgaa cagcaaggca gtttgcaact tgcccaagct 120

tgcgggagac gaaacatgca gcaacaaaac tgagattcgc tggtattaca acggaacggc 180

ttgcgaagct ttcatattca agggctgtgg tggaaacgac aataatttcg acagggtcga 240

cgactgccaa aggctgtgtg aggagcaaac acactttcac ttcgagtcac cgaaattgat 300

ttgtttcaaa gtacaggact attggatact aaacgatatt atgaagaaaa acctcactgg 360

aatttcccta aaaagtgagg aagaggatgc agattctgga gaaattgatt gagtttgaag 420

caattgattg agtttgaaga atgtacttta ataaacttct ttaaaatcaa aaaaaaaaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 504

<210>2

<211>129

<212>PRT

<213>卡延钝眼蜱

<220>

<223>基于卡延钝眼蜱的唾液腺的cDNA文库的Kunitz型蛋白酶抑制剂的核苷酸序列翻译为蛋白序列。

<400>2

Met Arg Gln Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Ile Phe Thr Gly Met Cys

5 10 15

Val Glu Ser Gln Ser Ala Asn Ser Lys Ala Val Cys Asn Leu Pro Lys

20 25 30

Leu Ala Gly Asp Glu Thr Cys Ser Asn Lys Thr Glu Ile Arg Trp Tyr

35 40 45

Tyr Asn Gly Thr Ala Cys Glu Ala Phe Ile Phe Lys Gly Cys Gly Gly

50 55 60

Asn Asp Asn Asn Phe Asp Arg Val Asp Asp Cys Gln Arg Leu Cys Glu

65 70 75 80

Glu Gln Thr His Phe His Phe Glu Ser Pro Lys Leu Ile Cys Phe Lys

85 90 95

Val Gln Asp Tyr Trp Ile Leu Asn Asp Ile Met Lys Lys Asn Leu Thr

100 105 110

Gly Ile Ser Leu Lys Ser Glu Glu Glu Asp Ala Asp Ser Gly Glu Ile

115 120 125

Asp

<210>3

<211>108

<212>PRT

<213>卡延钝眼蜱

<220>

<223>成熟蛋白的序列

<400>3

Ala Asn Ser Lys Ala Val Cys Asn Leu Pro Lys Leu Ala Gly Asp Glu

5 10 15

Thr Cys Ser Asn Lys Thr Glu Ile Arg Trp Tyr Tyr Asn Gly Thr Ala

20 25 30

Cys Glu Ala Phe Ile Phe Lys Gly Cys Gly Gly Asn Asp Asn Asn Phe

35 40 45

Asp Arg Val Asp Asp Cys Gln Arg Leu Cys Glu Glu Gln Thr His Phe

50 55 60

His Phe Glu Ser Pro Lys Leu Ile Cys Phe Lys Val Gln Asp Tyr Trp

65 70 75 80

Ile Leu Asn Asp Ile Met Lys Lys Asn Leu Thr Gly Ile Ser Leu Lys

85 90 95

Ser Glu Glu Glu Asp Ala Asp Ser Gly Glu Ile Asp

100 105

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>卡延钝眼蜱

<220>

<223>构建用于扩增选择用于表达的克隆的引物的5′-3′序列

<400>4

Cys Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala

5 10 15

Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys

20 25

Claims

1.基于卡延钝眼蜱的唾液腺的cDNA文库的Kunitz型蛋白酶抑制剂的核苷酸序列，其特征在于包含SEQ ID No.1：

Caggaaaacgttgcactcagaaatgcgccaacttgccgttctagc 45

Gctcgtaatcttcacgggcatgtgtgttgaatcacagtcggcgaa 90

Cagcaaggcagtttgcaacttgcccaagcttgcgggagacgaaac 135

Atgcagcaacaaaactgagattcgctggtattacaacggaacggc 180

Ttgcgaagctttcatattcaagggctgtggtggaaacgacaataa 225

tttcgacagggtcgacgactgccaaaggctgtgtgaggagcaaac 270

Acactttcacttcgagtcaccgaaattgatttgtttcaaagtaca 315

Ggactattggatactaaacgatattatgaagaaaaacctcactgg 360

AatttccctaaaaagtgaGgaagaggatgcagattctggagaaat 405

TgattgagtttgaagcaattgattgagTttgaagaatgtacttta 450

Ataaacttctttaaaatcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 495

Aaaaaaaaa 504

2.基于卡延钝眼蜱的唾液腺的cDNA文库的Kunitz型蛋白酶抑制剂的序列，其特征在于包含以下SEQ ID N0.2的肽：

MRQLAVLALVIFTGMCVESQSANSKAVCNLPKLAGDETCSNKTEIRWYYNGTACEAFIFK

GCGGNDNNFDRVDDCQRLCEEQTHFHFESPKLICFKVQDYWILNDIMKKNLTGISLKSEE

EDADSGEID

3.权利要求1的序列，特征在于代表了寡核苷酸序列(46)和终止密码子(408)。

4.权利要求1-3的序列，特征在于示出了与Kunitz型家族的抑制剂的一些蛋白具有大约20％同一性。

5.权利要求2的蛋白，特征在于信号肽存在于氨基酸序列的1-28位之间。

6.权利要求2的蛋白，特征在于含有108个氨基酸，理论分子量是12，295，6Da，并且理论等电点是(pI)4.67。

7.权利要求2的蛋白，特征在于存在两个结构域，即Kunitz型和MAP激酶型结构域。

8.权利要求2的蛋白，特征在于存在蛋白因子Xa、X和VIIa的生物活性，并且存在因子VIIa/TF的生物活性。

9.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于治疗肿瘤团块和体积的完全消退，显著阻止转移形成。

10.权利要求1的重组蛋白的用途，特征在于它可以用于改进血液学状况，将血细胞计数、血红蛋白和细胞数目保持在正常水平。

11.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于获得抗心血管和血栓栓塞疾病的药物。

12.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于获得抑制恶性肿瘤生长的药物。

13.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于获得抑制恶性肿瘤转移的药物。

14.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于获得手术前和手术后的抗凝剂。

15.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于产生凋亡体的状况，作为抗血栓剂、用于退化性疾病和恶性肿瘤。

16.权利要求15的用途，特征在于它可以用作抗血栓剂。

17.权利要求15的用途，特征在于凋亡体是富含磷脂的分子。

18.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于调节实体瘤中的新血管形成。

19.重组蛋白的用途，特征在于它作为用作目标治疗剂。

20.重组蛋白的用途，特征在于它可用于开发疫苗。

21.重组蛋白的用途，特征在于它用于完全消退肿瘤团块和体积，显著阻止转移形成。

22.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于显著改进恶性肿瘤患者的血液学状况，将血细胞计数、血红蛋白和细胞数目保持在正常水平。

23.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于改进心血管和血栓栓塞疾病。

24.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于抑制人和动物恶性肿瘤的生长。

25.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于抑制人和动物恶性肿瘤的转移。

26.重组蛋白的用途，特征在于它可以用作手术前和手术后抗凝剂。

27.重组蛋白的用途，特征在于它可以在人和动物的产生凋亡体(富含磷脂的分子)的状况、退化性疾病和恶性肿瘤的状况中用作抗凝剂。

28.重组蛋白的用途，特征在于它可以用于调节新血管的形成。

29.重组蛋白的用途，特征在于它可以用作细胞周期蛋白系统的抑制剂，作为目标治疗剂。