JP2002524076A - ＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドＺＫＵＮ６ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Kunitzドメインを含むプロテイナーゼインヒビターを開示する。Kunitzドメインは、配列が配列番号２の残基６から56に少なくとも80％同一である配列番号３に示すアミノ酸残基の配列を含む。また、プロテイナーゼインヒビターの作製方法、本法にて有用である発現ベクター及び培養細胞も開示される。プロテイナーゼインヒビターは、細胞培地の成分として、蛋白質精製及び特定の治療及び診断応用に利用できるだろう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 動物では、プロテイナーゼは創傷治癒、細胞外マトリックス分解、組織再生及
び血液凝固、線溶、及び補体活性化をもたらすカスケード反応に於いて重要であ
る。プロテイナーゼは病原菌又は異物の破壊の為に炎症細胞より放出され、そし
て正常細胞及び癌細胞からはその周辺を貫通し移動する時に放出される。

【０００２】 プロテイナーゼの活性はインヒビターにより制御されている；血清中の蛋白質
の１０％はプロテイナーゼインヒビターである（Robertsら、Critical Reviews
in Eukaryotic Gene Expression 5: 385-436, 1995）。プロテイナーゼ阻害因子
のファミリーの一つ、Kunitzインヒビターは、トリプシン、キモトリプシン、エ
ラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、凝固因子Xia及びIXa、ならびにカテプ
シンＧのインヒビターを含む。即ちこれらインヒビターは血液凝固、線溶及び炎
症を含む各種生理学的プロセスを制御している。

【０００３】 プロテイナーゼインヒビターは、活性部位を占有し、それによって正常基質に
よる占有を妨害することで標的プロテイナーゼの蛋白質分解活性を制御する。プ
ロテイナーゼインヒビターは、複数の独立した構造クラスに分けられるが、それ
らは全て結合ループ右に隣接する残基と蛋白質コア間の分子間相互作用によって
安定化される露出したループ（”インヒビターループ”、”反応性コア””反応
部位”又は”結合ループ”と様々に呼ばれる）を有している（BodeとHuber、Eur
.J.Biochem. 204:433-451, 1992）。

【０００４】 インヒビターと酵素間の相互作用は、きわめてゆっくりと解離し、安定した複
合体を生じ、これはバージン（未切断）インヒビター又は結合ループの易切断部
位で切断された修飾インヒビターを放出する。プロテイナーゼインヒビターの１
クラスであるKunitzインヒビターは、一般には１またはそれ以上の阻害ドメイン
（”Kunitzドメイン”）を有する塩基性の低分子蛋白質である。Kunitzドメイン
は、約50〜60残基のたたみ込みドメインであり、中央部の逆平行ベータシート構
造と短いＣ末端の螺旋構造を形成する。この特徴的ドメインは６個のシステイン
を含み、これが３個のジスルフィド結合を形成して二重ループ構造を生ずる。

【０００５】 Ｎ−末端域と第１ベータ鎖間には、活性を持つ阻害結合ループがある。この結
合ループはP2Cys残基を介し、最後２本のベータ鎖間に形成されるヘアピンルー
プにジスルフィド結合する。各種プロテイナーゼインヒビターより単離されたKu
nitzドメインは阻害活性を有することが示されている（例えばPetersenら、Eur.
J. Biochem. 125:310-316, 1996; Wagnerら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 1
86: 1138-1145, 1992; Dennisら、J. Biol .Chem. 270:25411-25417, 1995)。

【０００６】 １又はそれ以上のKunitzドメインを含むプロテイナーゼインヒビターは、組織
因子経路前駆体（TEPI）、組織因子経路阻害剤２(TFPI-2）、アミロイドβ蛋白
質前駆体（AβPP）、アプロチニン及び胎盤ビクニンを含む。TFPIは外因性経路
阻害剤であり、天然の抗凝固因子であり、３つの前後に連結したKunitzインヒビ
タードメインを含む。アミノ末端のKunitzドメインは第VIIa因子、プラスミン及
びカテプシンＧを阻害し；第２ドメインは第Xa因子、トリプシン及びキモトリプ
シンを阻害し；そして第３ドメインは活性を認められていない（Petersenら、上
記）。

【０００７】 TFPI-2はヒト第VIIa組織因子複合体、第XIa因子、血漿カリクレイン及びプラ
スミンのアミロイド分解活性、及び蛋白質分解活性を阻害することが示されてい
る（Sprecherら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3353-3357, 1994; Petersen
ら、Biochem, 35:266-272, 1996）。RFPI-2が第VIIa因子−組織因子複合体を阻
害できること、及び臍帯血管内皮細胞、胎盤ならびに肝臓でその転写活性が比較
的高いことは、止血に於ける本蛋白質に関する特別な役割を示唆している（Spre
cherら、上記）。

【０００８】 アプロチニン（ウシ胎盤トリプシンインヒビター）は、凝固カスケードの活性
化を阻害することが示されている広スペクトルKunitz型セリンプロテイナーゼイ
ンヒビターである。アプロチニンは血漿カリクレイン及びプラスミンの弱いイン
ヒビターであり、そして開心術中にアプロチニンを投与された患者では線溶及び
体外循環凝固が阻害されることが示されている（DavisとWhittington、Drugs 49
:954-983, 1995; Dietrichら、Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 92-98, 1989）
。

【０００９】 アプロチニンは敗血症ショック、成人呼吸困難症候群、急性膵炎、出血性ショ
ック及びその他疾患の治療にも利用されている（Westaby, Ann. Thorac. Surg. 55 : 1033-1041, 1993; Wachtfogelら、J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106: 1-1
0, 1993）。アプロチニンの臨床利用は、血漿カリクレイン又はプラスミンに対
するその阻害活性に起因すると信じられている（Dennisら、上記）。胎盤ビクニ
ンは２つのKunitzドメインを含むセリンプロテイナーゼインヒビターである（De
lariaら、J. Biol. Cehm. 272:12209-12214, 1997）。ビクニンの個Kunitzドメ
インは個別に発現し、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、第XIa因子及
び、組織ならびに血漿カリクレインの強力なインヒビターである（Delariaら、
上記）。

【００１０】 既知Kunitz型インヒビターは特性を欠いており、有効性は低いだろう。特性の
欠如は高用量のアプロチニンを繰り返し注射した後に起こる腎臓毒性の様な不要
の副作用をもたらすだろう。この様な制限は、従来の抗凝固剤に比べ副作用の少
ない単離されたKunitzドメインを調製することで克服されるだろう。この様なこ
とから、当分野では追加のKunitz型プロテイナーゼインヒビターに関する需要が
ある。

【００１１】 発明の要約 本発明の目的は、新規Kunitzインヒビター蛋白質及びその蛋白質を含む組成物
を提供することである。本発明の別の目的は、Kunitzインヒビター蛋白質を創る
のに適した材料及び方法を提供することである。発明の更に別の目的は、Kunitz
インヒビター蛋白質に特異的に結合する抗体を提供することである。

【００１２】 １つの観点では、発明は配列番号２の残基６から56に少なくとも80％同一であ
る配列番号３に示されるアミノ酸残基の配列を具備する単離された蛋白質を提供
する。１つの実施態様では、蛋白質は51ないし81アミノ酸残基長である。別の実
施態様では、配列は配列番号２の残基６から56に少なくとも90％同一である。別
の実施態様では、配列は配列番号２の残基６から56より成る。別の実施態様では
、蛋白質は51ないし67残基長であり、好ましくは55ないし62残基長である。別の
実施態様では、蛋白質は更にアフィニティータグを含む。好適なアフィニティー
タグには、マルトース結合蛋白質、ポリヒスチジン及びGlu-Tyr-Met-Pro-Met-Gl
u（配列番号６）が含まれる。

【００１３】 第２の観点では、発明は以下の作用可能に結合された要素を含む発現ベクター
を提供する：(a)転写プロモーター；(b)上記の蛋白質をコードするcDNA；及び(c
)転写ターミネーター。１つの実施態様では、発現ベクターは更にDNA断片に作用
可能に連結された分泌シグナル配列を含む。 第３の観点では、発明は細胞がDNA断片を発現する上記発現ベクターを含む培
養細胞を提供する。発明の特定の実施態様では、細胞は酵母細胞又は哺乳動物細
胞である。

【００１４】 発明の第４の観点では、DNA断片が発現する条件の下に上記細胞を培養するこ
と、及びDNA断片によりコードされた蛋白質を回収することを含む、蛋白質を作
製する方法を提供する。 発明の第５の観点では、その配列が配列番号２の残基６から56に少なくとも80
％同一である配列番号３に示されるアミノ酸残基の配列を含む51ないし81アミノ
酸残基の蛋白質に特異的に結合する抗体を提供する。 以下詳細な説明及び添付の図面を参照すれば、発明のこれら及びその他の観点
が明らかになるだろう。

【００１５】 発明の詳細な説明 発明の詳細な説明を記す前に、以下の用語の定義を理解することは役立つだろ
う： “アフィニティータグ”という用語は、ここでは第２ポリペプチドの精製又は
検出の為に提供される、又は基質に対する第２のポリペプチドの結合に適した部
位を提供する、第２ポリペプチドに結合することができるポリペプチド断片を表
すために用いられる。原則として、抗体又はその他の特異的結合作用物質が利用
可能なペプチド又は蛋白質がアフィニティータグとして利用できる。

【００１６】 アフィニティータグには、ポリ−ヒスチジントラクト、蛋白質Ａ（Nilssonら
、EMBO J, 4: 1075, 1985; Nilssonら、Mehtods Enzymol. 198: 3, 1991）、グ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ（SmithとJohnson, Gene 67: 31, 1988）、Gl
u Gluアフィニティ−タグ（Glu-Tyr-Met^Pro-Met-Glu; 配列番号６）（Grussenm
eyerら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）、サブスタンスＰ、
Flag^TMペプチド（Hoppら、Biotechnology 6: 1204-10, 1988）、ストレプトアビ
ジン結合蛋白質、又はその他の抗原性エピトープ、又は結合ドメインが含まれる
。一般には、Fordら、Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991
を参照。アフィニティータグをコードするDNAsは販売会社（例えばPharmacia Bi
otech, Piscataway, NJ）より入手できる。

【００１７】 “対立遺伝子変異体”という用語は、ここでは同一染色体座を占める遺伝子の
２またはそれ以上の変化形を表すために用いられている。対立遺伝子変異体は自
然界では突然変異により生じ、そして集団内に多形をもたらす。遺伝子変異はサ
イレント（コードされたポリペプチド内に変化が無い）でもよく、又は変化した
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするだろう。対立遺伝子変異体とい
う用語は、ここでは更に遺伝子の対立変異遺伝子によりコードされた蛋白質を表
すときにも用いられる。

【００１８】 “アミノ末端”及び”カルボキシル末端”という用語は、ここではポリペプチ
ド内の位置を表すために利用されている。その関係がある場合には、これら用語
を特定のポリペプチドの配列又は位置の参照と共に用いて、近接又は相対位置を
表す。例えば、ポリペプチド内の参考配列に対しカルボキシル末端に位置するあ
る特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接し局在するが、完全なポリ
ペプチドのカルボキシル末端である必要はない。

【００１９】 ポリヌクレオチド配列の“相補体”は、相補的な塩基配列を有し、また参照配
列に対し逆方向であるポリヌクレオチド分子である。例えば、5'ATGCACGGG3'は5
'CCCGTGCAT3'に対し相補的である。 “変性ヌクレオチド配列”という用語は、１またはそれ以上の変性コドン（ポ
リペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列と比較して）を含むヌクレオ
チド配列を意味する。変性コドンは異なるヌクレオチドトリプレットを含むが、
同一アミノ酸残基をコードする（例えばGAUとGACトリプレットはそれぞれAspを
コードする）。

【００２０】 “DNA断片”とは、特定属性を有するより大きなDNA分子の一部である。例えば
、特定ポリペプチドをコードするDNA断片は、5'から3'方向に読んだ場合に、特
定ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするプラスミド又はプラスミド断片の様
な、より長いDNA分子の一部である。

【００２１】 “発現ベクター”という用語は、その転写のために提供される追加断片と作用
可能に連結された所望ポリペプチドをコードする断片を含む、直鎖状又は環状の
DNA分子を意味するのに用いられる。この様な追加断片はプロモーター及びター
ミネーター配列を含み、更に１又はそれ以上の複製基点、１又はそれ以上の選択
マーカー、エンハンサー、ポリアデニレーションシグナル等を含む。発現ベクタ
ーは、一般には、プラスミド又はウイルスDNAに由来するか、又は両方の要素を
含むだろう。

【００２２】 “単離された”という用語は、ポリヌクレオチドの場合には、天然の遺伝的環
境より取り出されたポリヌクレオチド、即ちその他の外因性又は不溶のコーディ
ング配列を持たず、遺伝子的に加工された蛋白質生産系内での利用に好適な形状
にあるポリヌクレオチドを意味する。この様な単離された分子は、それらの自然
環境から単離されたものであり、cDNA及びゲノムクローンを含む。本発明の単離
されたDNA分子は、通常付随するその他遺伝子を有さないが、プロモーターやタ
ーミネーターの様な天然に存在する5'及び3'非翻訳域は含むだろう。付随する領
域の特定は当業者にとって明瞭であろう（例えば、DynanとTijan、Nature 316:
774-78, 1985参照）。

【００２３】 “単離された”ポリペプチド又は蛋白質は、血液又は動物組織より離れた様な
、その天然の状態以外の状態に見いだされるポリペプチド又は蛋白質である。好
ましい形状では、単離されたポリペプチドは本質的にはその他のポリペプチド、
特に動物起源のその他のポリペプチドを含まない。高度に精製された形状のポリ
ペプチド、即ち純度95％以上、より好ましくは純度99％以上のポリペプチドを提
供することが好ましい。上記関係にて用いられる場合、“単離された”という用
語は、ダイマー又の様な別の物理形状にある同一ポリペプチド、又は別にグリコ
シル化された、あるいは誘導体化された形状にある同一ポリペプチドを排除しな
い。

【００２４】 “作用可能に連結された”という用語は、DNA断片を参照する場合には、その
断片がその意図する目的に関し機能する様に、例えばプロモーターにて転写を開
始し、ターミネーターに向かってコード断片を進む様に配置されることを意味す
る。 “オルトログ”とは、別腫より得られるポリペプチド又は蛋白質の機能的相対
物である、ある種より得たポリペプチド又は蛋白質である。

【００２５】 “ポリヌクレオチド”は、5'から3'末端にむかって読まれるデオキシリボヌク
レオチド又はリボヌクレオチド塩基の単鎖又は２本鎖ポリマーである。ポリヌク
レオチドにはRNA及びDNAが含まれ、天然供給源から単離されたされ、インビトロ
で合成され、又は天然および合成分子の組合せより調製される。ポリヌクレオチ
ドの大きさは、塩基対（略語、"bp"）、ヌクレオチド（"nt)、又はキロベース（
"kb")で表される。

【００２６】 前後関係が許す場合には、後者２用語は単鎖、又は二本鎖であるポリヌクレオ
チドを表す。これら用語を２本鎖分子に用いる場合、それらは全長を意味し、“
塩基対”と同義であると理解すべきである。当業者は、２本鎖ポリヌクレオチド
の２本の鎖は若干長さが異なること、そしてその末端は酵素切断の結果食い違い
になっていることを理解するだろう；即ち、２本鎖ポリヌクレオチド分子内の全
てのヌクレオチドが対を形成しないだろう。この様な対を成さない末端の長さは
一般に20ntを越えない。

【００２７】 “ポリペプチド”とは、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基のポリマ
ーであり、天然又は合成により作られる。約10アミノ酸残基以下のポリペプチド
は、一般に“ペプチド”と呼ばれる。 “プロモーター”とは、ここではRNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提
供するDNA配列を含む遺伝子の一部を意味する、当分野公知の意味に用いられて
いる。プロモーター配列は一般には遺伝子の5'-非コーディング域内に見いださ
れるが、必ずはない。

【００２８】 “蛋白質”は１またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。蛋白質
は炭水化物基の様な非ペプチド性成分も含む。炭水化物及びその他の非ペプチド
性置換基は、蛋白質が生産される細胞により蛋白質に付加されるものであり、ま
た細胞のタイプによって変わるだろう。蛋白質は、ここではそのアミノ酸主鎖構
造を表す用語として規定される；炭水化物基の様な置換基は一般に特異的ではな
いが、それでも存在するだろう。

【００２９】 “分泌性シグナル配列”という用語は、より大きなポリペプチドの成分として
、より大きなポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路に向かわせるポリ
ペプチド（”分泌ポリペプチド”）をコードするDNA配列を意味する。一般に、
より大きなポリペプチドは分泌経路を移動する間に切断され、分泌ペプチドは除
去される。

【００３０】 “スプライス変異体”という用語は、ここでは遺伝子より転写されるRNAの別
の形を表す。スプライス変異体は転写されたRNA分子内にある別のスプライシン
グ部位、又は別に転写された分子のより一般的でない部位を利用することで自然
に発生し、その結果同一遺伝子より複数の種類のmRNAが生まれるだろう。スプラ
イス変異体は別のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするだろう。ここ
ではスプライス変異体という用語は、遺伝子より転写されたmRNAのスプライス変
異体によりコードされた蛋白質を表す場合にも用いられる。

【００３１】 不精密な分析法（例えばゲル電気泳動）で決定されたポリマーの分子量及び長
さは、おおよその値と理解しなければならない。これらの値が“約Ｘ”又は“お
よそ”Ｘと表現された場合、Ｘの規定値は10％の正確性であると理解すべきであ
る。 本発明は、一部はKunitzドメインを含む新規セリンプロテイナーゼを提供する
。その変異配列を含むこのKunitzドメイン、及びそれを含む蛋白質は、ここでは
“zkun6”と呼ばれる。配列番号２に示すzkun6ポリペプチド配列は、それぞれ位
置６及び56にあるシステイン残基によってアミノ末端及びカルボキシル末端に結
合されるこのKunitzドメインを含む。

【００３２】 Zkun6はヒトアルファ３型VIコラーゲン（配列番号５）内の51残基のKunitzド
メインと45％の残基一致率を有する。後者ドメインの構造はＸ線結晶分析及びNM
Rにより解明されている（Amouxら、J. Mol. Biol. 246:609-617, 1995; Sorense
nら、Biochemistry 36: 10439-10450, 1997）。zkun6とコラーゲンのKunitzドメ
インのアラインメント（図面参照）をＸ線構造を基にしたzkun6の相同性モデル
と組合せると、zkun6内の特定残基の機能を推測することができる。配列番号２
を参照すると、ジスルフィド結合が対を成すシステイン残基Cys6-Cys56；Cys15-
Cys39；及びCys31-Cys52により形成されると推測される。プロテイナーゼ結合ル
ープ（P3-P4'）は、配列番号２の残基14-20（Pro-Cys-Arg-Gly-Trp-Glu-Pro）を
含み、P1残基はArg16であり、P1'残基はGly17であると推測される。

【００３３】 １またはそれ以上のアミノ酸欠損、置換、挿入又は付加により特徴付けられる
zkun6配列の機能的誘導体も本発明の範囲内である。この様なアミノ酸の変化は
、保存されたシステイン残基が保持され、より高次の構造が破壊されない限りに
於いてzkun6配列内に作ることができる。他のKunitzドメインの配列を参考にし
ながらzkun6 Kunitzドメイン内に置換基を作ることが好ましい。配列番号３は一
般化したKunitzドメイン配列であり、この様なアラインメントを基にして可能な
アミノ酸置換を示している。配列番号３に示す51残基配列は次のパターンを取る
：

【００３４】 C-X(8)-C-X(15)-C-X(7)-C-X(12)-C-X(3)-C この中のＣはシステインを；Ｘが天然に存在するアミノ酸残基のいずれかを示し
、配列番号３について添付した配列表内に記載された制限に従い；そして数字が
これら可変残基の番号を表す。第２システイン残基はP2位置にある。

【００３５】 本発明では、得られた置換配列が配列番号３に開示された配列の一つであると
いう制限の下、zkun6 Kunitzドメイン内（配列番号２の残基６から56）のアミノ
酸残基の20％までは、他のアミノ酸残基に置換できる。即ち、本発明は、その配
列が配列番号２の残基６から残基56に少なくとも80％同一である、配列番号３に
示すようなアミノ酸残基の配列を含む蛋白質ファミリーを提供する。本発明の蛋
白質は、配列番号２の残基６から残基56に少なくとも85％、より好ましくは90％
。最も好ましくは95％同一である様な配列を含むことが好ましい。

【００３６】 配列の同一性の％は通常の方法によって決定される；例えばAltschulら、Bull
. Math. Bio. 48:603-616, 1986, HenikoffとHenikoff. Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 89:10915-10919, 1992を参照せよ。簡単に述べると、２つのアミノ酸配列
を、ギャップオープニングペナルティー10、ギャップエクステンションペナルテ
ィー１、そして表１（アミノ酸は通常の１文字コードで示している）に示すHeni
koffとHenikoff（上記）のか“BLOSUM62”スコアリングマトリックスを用い、ア
ラインメントスコアが最適になるよう整列させる。次に同一性％を：

【００３７】

【数１】 より計算する。

【００３８】

【表１】 アミノ酸間の同一性のレベルはPearsonとLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 85:2444, 1988）及びPearson（Meth. Enzymol. 183:63, 1990）により開示さ
れた"FAST"類似性検索アルゴリズムを利用し、決定できる。簡単に述べると、FA
STAはまず保存的なアミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を考慮せずに同一体（ktu
p変数が１の場合）、あるいは同一ペア（ktup=2の場合）の密度が最大になる様
に、対象配列（例えば配列番号２）と試験配列間に共有される領域を特定して配
列の類似性を特徴付ける。

【００３９】 次にアミノ酸置換マトリックスを用いて対合する全てのアミノ酸の類似性を比
較し、最高のスコアになる様に残基を切断し領域端部を“切りそろえ”、最高の
同一性密度を示す10カ所の領域を記録する。“カットオフ”値（配列の長さとkt
up値より前もって定めれられた式に従い計算された）よりも大きなスコアを示す
領域が複数ある場合には、続いて切りそろえられた最初の領域を再度検討、領域
を連結してギャップを持つ適当なアラインメントができるか調べる。

【００４０】 最後に、アミノ酸挿入と欠失を考慮したNeedlema-Wunsh-Sellersのアルゴリズ
ム（NeedlemanとWuncsch, J. Mo;. Biol. 48:444, 1970; Sellers, SIAM J. App
l. Math. 26: 787, 1974）の改良版を利用し、２アミノ酸配列の最高のスコア域
を揃え並べる。FASTA分析の好適パラメータは：ktup=1、ギャップオープニング
ペナルティー＝10、ギャップエクステンションペナルティー＝１、置換マトリッ
クス＝BLOSUM62である。

【００４１】 これらパラメータは、Pearson、1990（上記）の付録２内に説明されているス
コア化マトリックスファイル（"SMATRIX"）を改良することで、FASTAプログラム
内に導入することができる。 FASTAは、上記同様に比率を利用した核酸分子の配列同一性決定にも利用でき
る。ヌクレオチド配列の比較では、ktup値は１から６の間の範囲であり、好まし
くは３から６、最も好ましくは３であり、その他のパラメータはデフォルトであ
る。

【００４２】 本発明の蛋白質は非天然に生ずるアミン酸残基も含むことができる。非天然に
生ずるアミノ酸には、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-
4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、
アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキ
シエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、
チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジ
メチルプロリン、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフ
ェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが含
まれるが、これに限定されるものではない。

【００４３】 当分野では蛋白質内に非天然に生ずるアミノ酸残基を取り込ませるための複数
の方法が知られており、細胞をベースとした方法、無細胞法、及びインビトロ修
飾法が含まれる。例としてはRobertsonら、J. Am, Chem. Soc. 113:2722, 1991;
Ellmanら、Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chungら、Science 259; 806-9,
1993: Chungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993; Turcattiら
、J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996; Koideら、Biochem. 33: 7470-6, 1994;
及びWynnとRichards、Protein Sci. 2: 395-403, 1993を見よ。

【００４４】 追加のポリペプチドは、zkun6 Kunitzドメイン（配列番号２の残基６-56）の
、又は上記のzkun6 Kunitzドメインの誘導体のアミノ末端及び／又はカルボキシ
ル末端に連結されるだろう。この観点に於いて特に好ましい蛋白質は、配列番号
２の残基１−59を含む。zkun6 Kunitzドメインのアミノ及びカルボキシル延長部
は、例えばKunitzドメインを蛋白質の内部右に埋め込むことにより蛋白質のプロ
テイナーゼ阻害活性が破壊され、あるいはマスクされない様に選択されるだろう
。

【００４５】 その結果より短い延長部が好ましく、典型的には10-15残基長、好ましくは８
残基長を越えない。Kunitzドメイン自体に近接したシステイン残基の付加を避け
ることが好ましいが、広範囲の延長部が許される。例えば、zkun6蛋白質は、ジ
ペプチドの個々のアミノ酸残基がシステイン以外の何れかのアミノ酸残基である
アミノ末端又はカルボキシル末端ジペプチドを持つ配列番号２の残基6-56を含む
ことができる。

【００４６】 本発明の蛋白質に含むことができるその他のアミノ−及びカルボキシル−末端
延長部には、例えばアミノ末端メチオニン残基、約20-25残基までの小リンカー
ペプチド、又は上記のアフィニティータグが含まれる。この様な延長部をを含む
蛋白質は、さらにzkun6部分とアフィニティータグの間にポリペプチドリンカー
及び／又は蛋白質分解性切断部を含むだろう。好ましい切断部位には、トロンビ
ン切断部位及び第Xa因子切断部位が含まれる。

【００４７】 例えば、59アミノ酸残基のzkun6ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ
ル末端に向かって：マルトース結合蛋白質（約370残基）--ポリヒスチジン（６
残基）--トロンビン切断部位（Leu-Val-Pro-Arg；配列番号７）--zkun6を含む融
合体として発現することができ、その結果約439残基のポリペプチドが生ずる。
２番目の例では、81残基のzkun6ポリペプチドは大腸菌βガラクトシダーゼ（1.0
21残基；Gasadabanら、J. Bactreiol. 143:971-980, 1980参照）、10塩基スペー
サー、及び４残基の第Xa因子切断部位を優等することができ、その結果1,116残
基のポリペプチドを得る。

【００４８】 リンカーペプチド及びアフィニティータグは、基質、抗体、結合蛋白質等への
結合といった付加機能を提供し、zkun6蛋白質の精製、検出及び供給を促進する
。別の例では、zkun6 Kunitzドメインは、細胞表面へのKunitzドメインの提示を
可能にする、カルボキシル末端受容体膜貫通ドメインを含む分泌蛋白質として発
現することができる。細胞膜の脂質二重層を貫通するには、最低約20アミノ酸の
膜貫通ドメインが必要である；これらは主に疎水性アミノ酸でなければならない
。

【００４９】 Kunitzドメインはスペーサーポリペプチドによって膜貫通ドメインから単離さ
れたすることができ、そしてカルボキシル末端膜貫通ドメイン--スペーサーポリ
ペプチド--Kunitzドメイン--アミノ末端ポリペプチドを含む延長されたポリペプ
チド内に含むことができる。多くの受容体膜貫通ドメイン及びそれらをコードす
るポリヌクレオチドが当分野で知られている。スペーサーポリペプチドは一般に
少なくとも約50アミノ酸残基長であり、200-300まで、またはそれ以上の残基を
持つ。アミノ末端ポリペプチドは300又はそれ以上の残基長であろう。

【００５０】 ここでは、zkun6蛋白質をコードするDNA及びRNA分子を含むポリヌクレオチド
分子も開示される。これらポリヌクレオチドはセンス鎖；アンチセンス鎖；及び
対応する水素結合によって１つにアニーリングしたセンス及びアンチセンスを有
する二本鎖であるDNAを含む。zkun6蛋白質をコードする代表的なDNA配列は配列
番号１に記載されている。その他のzkun6蛋白質をコードするDNA配列は、この遺
伝子コードを基に当業者により容易に作ることができる。対応するRNA配列はＴ
をＵに置換することで作製することができる。zkun6蛋白質をコードするポリヌ
クレオチド、及び相補的ポリヌクレオチドは、zkun6蛋白質の製造、ならびに診
断及び研究目的に有用である。

【００５１】 当業者は遺伝子コードの縮重性の観点より、これらポリヌクレオチドに相当の
配列多様性が可能であることを容易に認識するだろう。配列番号４は、配列番号
２のzkun6ポリペプチドをコードする全てのDNAsを包含する、縮重DNA配列である
。当業者は、ＴをＵに変えれば配列番号４の縮重配列が配列番号２をコードする
全RNA配列をも提供することを容易に認識するだろう。即ち、配列番号４のヌク
レオチド１ないしヌクレオチド177を含むzkun6ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド、及びそれに対応するRNAは、本発明により意図するものである。

【００５２】 表２は、配列番号４内で縮重ヌクレオチド位置を表すためにに用いられた１文
字コードを示している。“リソリューション”は一文字で示されるヌクレオチド
である。“相補体”は、相補性ヌクレオチドのコードを表す。例えば、コードＹ
はＣ又はＴの何れかを表し、その相補体ＲはＡ又はＧを表し、ＡはＴに相補的で
あり、ＧはＣに相補的である。

【００５３】

【表２】 特定のアミノ酸を表すための考え得る全てのコドンを包含する、配列番号４に
用いられた縮重コドンを表３に示す。

【００５４】

【表３】

【００５５】 当業熟練者は、各アミノ酸をコードする考え得る全てのコドンの代表する縮重
コドンの決定には若干の多義性が導入されていることを認識するだろう。例えば
、セリン（WSN）の縮重コドンは、ある条件ではアルギニン（AGR）をコードでき
、アルギニン(MGM)の縮重コドンはある場合にはセリン（AGY）をコードできる。
同様の県警は、フェニルアラニンとロイシンをコードするコドンの間にも存在す
る。即ち、縮重コドンにより包含される幾つかのポリヌクレオチドは変形アミノ
酸配列コードすることがあるが、当業者は配列番号２に示すアミノ酸配列を参照
することで、この様の変形配列を特定することができる。変形配列はここに記す
機能性に関し容易に試験することができる。

【００５６】 当業熟練者は、別種も好ましいコドンの利用が可能であると理解するだろう。
一般にはGranthamら、Nuc. Acids Res. 8:1393-912, 1980; Gassら、 Curr. Bio
l. 6:315-24, 1996; Wain-Hobsonら、Gene 13: 355-64, 1981; GrosjeanとFiers
, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986;ならび
にIkemura, J. Mol. Biol. 158:573-97;1982を見よ。特定の種に好ましいコドン
は、当分野既知の各種方法により、本発明のポリペプチド内に取り込むことがで
きる。

【００５７】 組換え体DNAに好適コドン配列を導入することで、例えば特定のタイプ又は種
の細胞に於ける蛋白質の翻訳をより効率化することにより、蛋白質の産生を促進
する。配列番号４に開示の縮重コドン配列は、当分野によく利用され、また個々
に開示されている各種タイプ及び種類の細胞に於けるポリヌクレオチド発現を最
適化するための鋳型として機能する。好ましいコドンを含む配列は、各種宿主細
胞での発現に関し試験し、最適化することができ、又ここに開示された様な機能
に関しても試験できる。

【００５８】 zkun6ポリヌクレオチドは、厳密条件の下に配列番号１またはその相補的配列
の同様の大きさの領域にハイブリダイズできる。一般に、厳密条件は、所定のイ
オン強度及びpHに於ける特定配列に関する熱融解点（Tm）より約５℃引くなる様
選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合するプローブにハイブリダイ
ズする温度（所定イオン強度とpHに於いて）である。典型的な厳密条件は、塩濃
度はpH7に於いて約0.03Mまであり、温度が少なくとも約60℃である条件である。

【００５９】 前記の如く、zkun6-をコードするポリヌクレオチドはDNA及びRNAを含む。DNA
及びRNAの調整方法は当分野公知である。一般にRNAは大量のzkun6RNAを産生する
組織又は細胞から単離されたされる。これら組織及び細胞はノーザンブロッティ
ング（Thomas、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77.5201,1980）の様な通常の方法
により特定される。

【００６０】 全NAは、グアニジン-HCl抽出と、それに続くCsCl勾配中での遠心単離されたに
より調整できる（Chirgwinら、Biochemistry 18:52-94, 1979）。ポリ(A)+RNAは
、AvivとLederの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972）を利用
し全RNAより調整される。相補的DNA（cDNA）はポリ(A)+RNAより既知方法を利用
し調整される。あるいは、ゲノムDNAが単離されたできる。次にzkun6ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドが特定され、例えばハイブリダイゼーション又
はPCRのために単離されたされる。

【００６１】 zkun6をコードする完全長クローンは、通常のクローニング法により得ること
ができる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、幾つかの方法（例えばト
ランスジェニック動物での発現）に関してはゲノムクローンを利用するか、又は
cDNAクローンを少なくとも１つのゲノムイントロインを含むように改良すること
が好ましいだろう。cDNA及びゲノムクローンを調整する方法は既知且つ当業熟練
者のレベルの範囲であり、そしてライブラリーのプロービング又はプライミング
に関するここに開示された配列又はその一部の利用を含む。発現ライブラリーは
、zkun6、受容体断片、又はその他特異結合の相手に対する抗体にて探索できる
。

【００６２】 本発明のポリヌクレオチドは自動装置を使い合成することもできる。今回選択
した方法はフォスファミダイト法である。遺伝子又は遺伝子断片の合成の様な応
用に、化学的に合成された２本鎖DNAが必要な場合、各相補鎖は別々に作られる
。短い遺伝子（60ないし80bp）の産生は技術的には簡便であり、相補鎖を合成し
、続いてそれらをアニーリングすることで達成できる。しかしより長い遺伝子（
＞300bp）を作成する場合には、化学的DNA合成中の各サイクルの結合効率が100
％にであることは殆どないことから、特別な方策が必要となる。

【００６３】 この問題を解決するために、合成遺伝子（２本鎖）を20ないし100ヌクレオチ
ド長の単鎖断片からモジュラー型に組立てる。遺伝子合成法は当分野公知である
。例えばGlickとPasternak、 Molecular Biotechnology, Principles & Applica
tions of Recombinant DNA, ASM Pres, Washington, D.C., 1994; Itakuraら、A
nnu. Rev. Biochem, 53: 323-356, 1984;及びClimieら、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 87: 633-637, 1990を見よ。

【００６４】 ここに開示されたzkun6ポリヌクレオチド配列は、他種（オルトログ）からの
相手ポリヌクレオチドの単離されたに利用できる。これらオルトログポリヌクレ
オチドは、とりわけ各オルトログタンパク質の調整に利用できる。これら他種に
は哺乳動物、鳥類、両生類、は虫類、魚類、昆虫及びその他脊椎動物、並びに無
脊椎動物が含まれるが、これに限定されない。特に興味深いものは、ネズミ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ及びその他霊長類ポリペプチドを含む、他
哺乳動物種由来のヌクレオチド及びポリペプチドである。

【００６５】 ヒトzkun6のオルトログは、本発明により提供される情報と組成物を、通常の
クローニング技術と組み合わせることでクローン化できる。例えば、cDNAはここ
に開示されるzkun6を発現するタイプの組織又は細胞より得たmRNAを用い、クロ
ーン化できる。mRNAの好適供給源はここに開示された配列より設計されるプロー
ブを用いたノーザンブロットをプロービングすることで特定できる。次に、陽性
となった組織または細胞株のmRNAからライブラリーが調整できる。

【００６６】 zkun6をコードするcDNAは、完全又は部分ヒトcDNAを用いたプロービング、又
は開示配列に基づく１またはそれ以上の変性プローブのセットを用いたプロービ
ングのような各種方法により単離されたできる。cDNAもここに開示された代表的
ヒトzkun6配列より設計されたプライマーを利用するポリメラーゼチェインリア
クション又はPCR（Mullis、米国特許第4,683,202号）を用いクローンかできる。
その他の方法では、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換又はトランス
フェクトすることができ、また所望cDNAの発現をzkun6ポリペプチドに対する抗
体により検出することができる。

【００６７】 当業者は配列番号１に開示されている配列がヒトzkun6の単一対立遺伝子を表
すものであること、対立遺伝子へにや別スプライシングを含む自然変異が起こる
ことが想定されるこを理解するだろう。これら配列の対立遺伝子変異は、cDNA又
は各種個体より通常法によって得たゲノムライブラリーをプロービングすること
でクローン化できる。サイレント変異及びアミノ酸配列を変化させる突然変異を
含む配列番号１に示すDNA配列の対立遺伝子変異は、そのタンパク質が配列番号
２の対立遺伝子変異体であることから本発明の範囲である。

【００６８】 zkun6のプロテイナーゼ阻害活性を保持する、別の形にスプライシングされたm
RNAより生じたcDNAは、これらcDNA及びmRNAによりポリペプチドがコードされる
ことから、本発明の範囲である。これら配列の対立遺伝子変異及びスプライス変
異は、当分野公知の標準的方法により各種個体又は組織より得たcDNA又はゲノム
ライブラリーをプロービングすることで、クローンかできる。

【００６９】 野生型zkun6の変異体を含むZkun6タンパク質は、当分野公知である各種プロテ
アーゼ阻害アッセイにて活性が試験される。好ましいアッセイには、トリプシン
、キモトリプシン、プラスミン、カテプシンＧ及びヒト白血球エラスターゼの阻
害を測定するアッセイが含まれる。例えばPetersenら、Eur. J. Biochem. 235:
310-316, 1996参照。典型的な方法では、試験化合物の阻害活性は、試験化合物
をプロテイナーゼとインキュベーションし、次に適当な基質、典型的には発色性
ペプチド基質を加える。例えばNorrisら、（Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371:37-
42, 1990）を見よ。

【００７０】 概略すると、各種濃度のインヒビターを低塩緩衝液中、pH7.4、25℃にてトリ
プシン、プラスミン、及び血漿カリクレイン存在下にインキュベーションする。
30分後、発色基質（例えば、カビ社、ストックホルム、スウェーデン（Kabi、St
ockholm、Sweden）より入手できるS2251（D-Val-Leu-Lys-Nan）またはS2302（D-
Pro-Phe-Arg-Nan）を加え、30分間インキュベーションし、残存酵素活性を測定
する。酵素活性の阻害は、405nmの吸光、あるいは460nmの蛍光発光の減少により
示される。結果より、見かけ上の阻害係数Kiを計算する。凝固因子（例えば第VI
Ia因子、第Xa因子）は発色基質、又は通常の凝固アッセイ（例えば正常ヒト血漿
の凝固時間；Dennisら、上記）を利用し、測定できる。

【００７１】 Zkun6蛋白質は、疾患の動物モデル、特に腫瘍モデル、線溶モデル及び恒常性
不均衡モデルで試験できる。好適モデルは当分野公知である。例えば、腫瘍転移
の阻害は、移植または注射により癌細胞又は腫瘍組織が導入されたマウスにて評
価できる（例えば、Brown, Advan. Enzyme Regul. 35:293-301, 1995; Conwayら
、Clin. Exp. Metastasis 14: 115-124, 1996）。

【００７２】 線溶に及ぼす作用は、酵素バトロキソビン及び放射性標識されたフィブリノー
ゲンが試験動物に投与されるラットモデルで測定できる。試験化合物によるフィ
ブリノーゲン活性化の阻害は、試験化合物を投与されなかった動物と比較した標
識体の血中レベル低下として示される。LenforsとGustafsson、Semin、Thromb．
Hemost. 22:335-342,1996参照。Zkun6蛋白質は、注射、又は注入により試験動物
に供給でき、又は例えばウイルスを利用した、あるいは裸のDNAの供給システム
、あるいはトランスジェニック発現の様な方法により、インビボに産生すること
ができる。

【００７３】 ウイルスを利用した供給システムには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、
ワクシニアウイルス、及びアデノ関連ウイルス（AAV）が含まれる。アデノウイ
ルスは２本鎖DNAウイルスで、異種核酸の供給に適した現在最も良く研究されて
いる遺伝子転移ベクターである（レビューとしては、Beckerら、Meth. Cell Bio
l. 43: 161-189, 1994;及びDouglasとGuriel、Sciuence & Medicine 4: 44-53,
1997を見よ）。

【００７４】 アデノウイルスシステムは、幾つかの利点を有する：アデノウイルスは(i)比
較的大きなDNA挿入体に適合しており；(ii)高力価まで増殖し、(iii)広範囲の哺
乳動物細胞に感染し、そしてIiV)各種プロモーターを含む数多くの入手可能なベ
クターに利用できる。また、アデノウイルスは血液中で安定であることから、そ
れらは静脈注射により投与することができる。アデノウイルスゲノムの一部を欠
失させることで、より大きな異種DNA挿入体（7kbまで）に適合できる。これら挿
入体は、直接接続、又はコトランスフェクトしたプラスミドとの相同的組み換え
によってウイルスDNA内に取り込ませることができる。

【００７５】 例示的システムでは、必須E1遺伝子をウイルスベクターより欠失させると、E1
遺伝子が宿主細胞（例えばヒト293細胞株）から提供されるまでウイルスは複製
しなくなる。無償の動物に静脈投与した場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的
とする。アデノウイルス供給システムがE1遺伝子を欠失している場合、ウイルス
は宿主細胞内では複製できない。しかし、宿主組織（例えば肝臓）は異種蛋白質
を発現し、また加工（ならびにシグナル配列がある場合には分泌し）するだろう
。分泌された蛋白質は高度に血管形成された肝臓内の血流に入り、そして感染動
物に対する作用を決定することができる。

【００７６】 遺伝子供給の別の方法は、細胞を体部から採りだし、ベクターを細胞内に裸の
DNAプラスミドの形で導入するものである。次に形質転換した細胞を体内に再移
植する。裸のDNAベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション
、微量注射法、トランスダクション、細胞融合法、DEAEデキストラン法、リン酸
カルシウム沈殿法、遺伝子ガンの利用、又はDNAベクタートランスポーターの利
用といった当分野既知の方法により宿主細胞に導入される。Wuら、J. Biol. Che
m. 263: 14621-14624, 1988; Wuら、J. Biol. Chem. 267: 963-967, 1992;及びJ
ohnstonとTang. Meth. Cell Biol. 43:353-365, 1994を見よ。

【００７７】 zkun6遺伝子を発現するよう工夫されたトランスジェニックマウス、及び“ノ
ックアウトマウス”（Snouwaertら、Science 257:1083, 1992）と呼ばれるzkun6
遺伝子の機能を完全に消失しているマウスも作ることができる（Lowellら、Natu
re 366:740-742, 1993）。これらマウスは、zkun6遺伝子とコードされる蛋白質
のインビボ系研究に利用される。トランスジェニックマウスは、特定因子の過剰
又は過小発現の結果として生ずる発生異常又は阻止を特定することができること
から、特に初期発生に於けるzkun6蛋白質の役割の研究に有用である。

【００７８】 全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片、及び融合ポリペプチドを含む本発
明のzkun6ポリペプチドは、通常技術を用い遺伝的に作られた宿主細胞内にて産
生させることができる。好適宿主細胞は、外因性DNAで形質転換又はトランスフ
ェクションでき、培地中にて増殖できる細胞であり、そして細菌、真菌細胞なら
びに培養高等真核細胞を含む。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい
。クローン化DNA分子を取り扱い、外因性DNAを各種宿主細胞に導入するための技
術は、Sambrookら、Molecular Clonign: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,及びAusubel
ら、編集、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, I
nc., NY, 1987に開示されている。

【００７９】 一般に、zkun6ポリペプチドをコードしているDNA配列は、一般には転写プロモ
ーター及びターミネーターを含む、発現ベクター内でのその発現に必要なその他
の遺伝的要素に作用可能に連結されている。ベクターはまた通常１またはそれ以
上の選択可能なマーカー、及び１又はそれ以上の複製起点を有しているが、当業
者はあるシステム内では選択可能マーカーが別のベクター上に供給され、そして
外因性DNAの複製が宿主ゲノム内への組み込みによって提供されることを認識す
るだろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクター及びそ
の他要素の選択は、当分野通常技術の範囲にある通常設計の問題である。多くの
これら要素は文献中に記載されており、また販売会社を通じ入手できる。

【００８０】 zkun6ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に乗せる為には、分泌シグナル配列
（リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる）が発現ベクタ
ー内に供給される。分泌シグナル配列はzkun6の分泌シグナル配列、又はその他
の分泌蛋白質（例えばt-PA）に由来する、又は新たに合成された分泌シグナル配
列である。分泌シグナル配列は、zkun6DNA配列と作用可能に連結し、即ち２配列
は正しい読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞内の
分泌経路内に向かわせる位置に配置される。分泌シグナル配列は通常所望するポ
リペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置するが、特定のシグナル配列は所
望するDNA配列内の何れかの場所に位置することもある（Welchら、米国特許第5,
037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照せよ）。

【００８１】 培養された哺乳動物細胞は本発明での利用に好適な宿主である。外因性DNAを
哺乳動物細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム伝達トランスフェクショ
ン法（Wiglerら、Cell 14:725, 1978; CorsaroとPearson, Somatic Cell Geneti
cs 7:603, 1981: GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロ
ポレーション法（Neumannら、EMBO J. 1:841-845, 1982）、DEAE-デキストラン
伝達トランスフェクション法（Ausubelら、上記）、及びリポソーム伝達トラン
スフェクション法（Hawley-Nelsonら、Foucs 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus
15:80, 1993）が含まれる。

【００８２】 培養哺乳動物細胞内での組換え体ポリペプチドの産生は、例えばLevinsonら、
米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国
特許第4,579,821号；及びRingold、米国特許第4,656,134号にて考察されている
。好適培養哺乳動物細胞にはCOS-1（ATCC No.CRL 1650), COS-7(ATCC No. CRL 1
651), BHK(ATCC No. CRL 1632), BHK 570(ATCC No.CRL 10314)293(ATCC No. CRL
1573; Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72,1977）及びチャイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO-K1；ATCC No. CCl61）細胞株が含まれる。追加の好適細胞株は当分
野既知であり、米国標準培養体コレクション、10801ボールバード大学、マナサ
ス、バージニア州、米国（American Type Culture Collection, 10801 Universi
ty Boulevard, Manassas, VA USA）の様な好適供託機関より入手することができ
る。

【００８３】 一般に、SV-40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターの様な強い転
写プロモーターが好まれる。米国特許4,956,268号参照。その他好適プロモータ
ーには、メタロチオネン遺伝子（米国特許第4,579,821号及び、4,601,978号）及
びアデノウイルス主後期プロモーターが含まれる。哺乳動物細胞での利用に好適
な発現ベクターには、共に米国標準培養体コレクション10801ボールバード大学
、マナサス、バージニア州、米国（American Type Culture Collection, 10801
University Boulevard, Manassas, VA USA）に、それぞれ受付番号98669及び986
68で寄託されているpZP-1及びpZP-6が含まれる。

【００８４】 外来DNAが挿入された培養哺乳細胞に関しては、薬物選択を用い選別が行われ
る。この様な細胞は一般には“トランスフェクタント”と呼ばれる。選択薬剤存
在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝達することができる細胞は、“安定
トランスフェクタント”と呼ばれる。好適選択マーカーは抗生物質であるネオマ
イシンに対する耐性をコードしている遺伝子である。選択は、G-418等のネオマ
イシン型薬物の存在下に行われる。

【００８５】 選択システムは所望遺伝子の発現レベルの増加にも利用でき、この工程は”増
幅”と呼ばれている。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選択薬剤存在下
に培養し、続いて選択薬剤の量を増加し、導入遺伝子の産物を高レベルに産生す
る細胞を選択することで、実施される。好ましい増幅可能な選択マーカーはジヒ
ドロ葉酸還元酵素であり、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬
剤耐性遺伝子（例えばヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチ
ルトランスフェラーゼ）も利用できる。

【００８６】 昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として利用で
きる。植物細胞での遺伝子発現に関するベクターとしてのAgrobacterium rhizog
enesの利用はSinkarら, J. Biosci. (Bangalore)11:47-58,1987にレビューされ
ている。昆虫細胞も、一般にAutographa californica多核性ポリヘドロシスウイ
ルス（AcMNPV）に由来する組換え体バキュロウイルスベクターを使って感染させ
ることができる。

【００８７】 無傷の、野生型AcMNPVに感染させられ、且つポリヘドリン遺伝子プロモーター
、ターミネーター及び近接配列に作用可能に連結されたクローン化遺伝子を含む
トランスファーベクターによりトランスフェクションされた細胞内では、相同的
組み換えによって所望ポリペプチドをコードするDNAはポリヘドリン遺伝子をコ
ードする配列位置のウイルスゲノムの中に挿入される。得られた組換え体ウイル
スは宿主細胞、典型的にはアワヨトウムシであるSpodoptera frugiperdan由来の
細胞株の感染に利用される。一般にはGlick及びPasternak, Molecular Miotechn
ology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washin
gton, D.C., 1994を見よ。

【００８８】 酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に利用できる。この観点において特に興味あ
る酵母種には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）,ピ
チア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ（Pichia methan
olica）が含まれる。サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）細胞を外因
性DNAにて形質変換し、それより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、例え
ばKawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Br
ake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；及びMurrayら
、米国特許第4,845,075号により開示されている。

【００８９】 形質転換細胞は選択可能マーカー、一般的には薬剤耐性、あるいは特定栄養素
（例えばロイシン）欠損状態での増殖能によって決定される表現形により選別さ
れる。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）での利用に適
した好適ベクターシステムはKawasakiらにより開示されている（米国特許第4,93
1,373号）、グルコース含有培地中の増殖により形質変換細胞が選択できるPCT1
ベクターシステムである。酵母での利用に適した好適プロモーター及びターミネ
ーターには、糖分解酵素遺伝子由来（例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号
；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；及びBitter、米国特許第4,977,092号を
見よ）及びアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが含まれる。

【００９０】 米国特許第4,990,446号、5,063,154号、第5,139,936号及び第4,661,454号も参
照せよ。当分野ではハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）,シゾ
サッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）,クルイベロミセス・ラ
クチス（Kluyveromyces lactis）,クロイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyc
es fragillis）,ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）,ピチア・パスト
リス（Pichia pastoris）,ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）,ピチア
・グイレルモンディ（Pichia guillermondii）及びキャンディダ・マルトサ（Ca
ndida maltosa）を含むその他酵母に適した形質変換システムが知られている。
例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol, 132: 3459-3465, 1986及びCregg、米
国特許第4,882,279号を参照せよ。

【００９１】 アスペルギルス細胞はMcKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従い利用
されるだろう。Acremonium chrysogenumを形質変換する方法は、Suminoら、米国
特許第5,162,228号により開示されている。ニューロスポラを形質転換する方法
はLambowitz、米国特許第4,486,533号により開示されている。ピチア・メタノリ
カ（Pichia methanolica）での組換え体蛋白質の産生は、米国特許第5,716,808
号、第5,736,383号、第5,854,039号、及び第5,888,768号に開示されている。

【００９２】 大腸菌（Escherichia coli）,バチルス（Bacillus）及びその他の属の細菌株
を含む前核生物宿主細胞も、本発明での有用な宿主細胞である。これら宿主を形
質転換し、その中にクローン化された外来性DNA配列を発現させる技術はあ当分
野公知である（Sambrookら、上記参照）。大腸菌（E.coli）の様な細菌に於いて
zkun6ポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性の顆粒
球として細胞質内に保持されるか、細菌由来の分泌配列によって細胞周辺腔内に
送られる。

【００９３】 前者の場合、細胞は溶解され、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシア
ネート又は尿素により変性させられる。次に尿素及び還元型ならびに酸化型グル
タチオンの溶液に透析し、続いて緩衝生理食塩水に対し透析する様にし、変性剤
を希釈して変性したポリペプチドを再度折り畳ませ、ダイマー化させる。後者の
場合、細胞を破壊し（例えば超音波処理、又は浸透圧ショックにより）細胞周辺
腔含有物を放出させ、蛋白質を回収することでポリペプチドを可溶性及び機能的
な形で回収することができるため、変性や再折りたたみの必要がない。

【００９４】 形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は、通常の方法に従い栄養素及
び選択した細胞の増殖に必要とされるその他成分とを含む培地中にて培養される
。限定培地や複合培地を含む各種好適培地が当分野既知であり、一般には炭素源
、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルが含まれる。培地は更に成長因
子又は血清の様な成分を随意含むだろう。

【００９５】 一般に増殖培地は、例えば薬剤選択により、あるいは発現ベクター上に乗せら
れ、又は宿主細胞にコトランスフェクトされた選択マーカーによって補償されて
いる必須栄養素の欠失により、外来性に加えられたDNAを含む細胞を選別する。P
.methanolica細胞は適当な炭素源、窒素源、微量栄養素源を含む培地中、約25℃
ないし50℃の温度にて培養される。液体培地には、小型フラスコの振盪、又はフ
ァーメンターの噴霧散布の様な通常の方法によって十分な通気が行われる。

【００９６】 本発明の蛋白質は純度≧80％、より好ましくは≧90％、さらにより好ましくは
≧95％に精製することが好ましく、そして特に汚染高分子、特に他種蛋白質及び
核酸に関しての純度が99.9％以上であり、感染及び発熱物質を含まない、医薬品
としての純粋状態が特に好ましい。好ましくは、精製蛋白質は他種蛋白質、特に
動物起源の他種蛋白質を実質上含まない。

【００９７】 Zkun6蛋白質は通常の蛋白質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組
合せにより精製される。ポリヒスチジンアフィニティータグを含むポリペプチド
（典型的には約６ヒスチジン残基）は、ニッケルキレート樹脂を使ったアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製される。例えば、Houchuliら、Bio/Techno
l. 6: 1321-1325, 1988参照。 当分野既知の方法を用いることで、zkun6蛋白質は糖化又は非糖化状態；ペギ
ル化又は非ペギル化状態；及び開始メチオニンアミノ酸残基を含む、あるいは含
まない状態で産生することができる。

【００９８】 zkun6蛋白質は、過剰なプロテイナーゼ活性、特にトリプシン、プラスミン、
カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ−３、トロンビン
、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、第XIIa因子、又はマトリック
スメタロチオプロテイナーゼの過剰活性に関連する状態の治療又は予防での利用
が想定される。この様な状態には急性膵炎、心肺バイパス（CPB）誘導肺傷害、
アレルギー誘導プロテアーゼ放出、深部静脈血栓、心筋梗塞、ショック（敗血症
ショックを含む）、線溶亢進性出血、肺気腫、リューマチ関節炎、成人性呼吸困
難症候群、慢性炎症性腸疾患、乾癬その他の炎症状態が含まれるが、これに限定
されるものではない。Zkun6蛋白質は、血小板機能の保存、臓器保存、創傷治癒
での利用も想定される。

【００９９】 Zkun6蛋白質は、後天性凝固異常症、一次線溶及び硬変を原因とする線溶、及
び高用量血栓溶解治療の合併症を含む、恒常性不均衡より生ずる状態の治療に有
用であろう。後天性凝固異常は、肝臓疾患、尿毒症、急性播種性血管内凝固症、
心肺バイパス後、大量輸血、又はワーファリン過剰投与によって生ずる（Humphr
ies, Transfusion Medicine 1: 1181-1201, 1994）。前凝固メカニズムの何れか
の欠損又は機能不全により、患者は自然出血または外傷あるいは手術に伴う大量
失血を起こす。後天性凝固異常は通常は、複数の凝固因子の、及び／又は血小板
機能の欠損といった欠失の組合せを含む。

【０１００】 更に、肝臓疾患を持つ患者は一般に、α₂−アンチプラスミンの正常レベルが
維持できないこと、及び／又はプラスミノーゲンの肝臓での排除の低下すること
を原因とする線溶の亢進を経験する（Shuman, Hemorrhagic Disorders, in Benn
et and Plum, 編集 Cecil Textbook of Medicine, 20th ed., W.B. Saunders Co
., 1996）。一次線溶はあ、プラスミノーゲン活性化因子の大量放出の結果であ
る。一次線溶に関連する状態には、前立腺癌、急性前骨髄細胞性白血病、血管腫
及び蛇毒による内皮細胞からのプラスミノーゲン活性化因子の持続放出が含まれ
る。

【０１０１】 α2-アンチプラスミンの血中レベルを枯渇させるのに十分な量のプラスミンが
活性化されると、これら状態は重大になる（Shuman、上記）。データは、血栓に
対する高用量血栓溶解治療を行っている患者に見られる出血又は血栓再形成の病
理生理学は、内皮細胞上のプラスミンが関係する可能性を示唆している。プラス
ミンは更に血栓溶解後血管表面に於けるトロンボゲン形成を傷害し、これが血栓
の再形成をもたらすだろう（Okajima, J. Lab. Clin. Med. 126:1377-1364, 199
5）。

【０１０２】 zkun6蛋白質の別の抗血栓利用には、深部静脈血栓、肺気腫及び手術後出血の
治療、又は予防が含まれる。 Zkun6蛋白質は更に、播種性血管内凝固症の治療様な哺乳動物に於ける血液凝
固を阻害する方法の中で利用できるだろう。従ってZkun6蛋白質はヘパリン、ク
マリン、アンチトロンビンIIIの様な既知抗凝固剤の替わりに利用できるだろう
。この様な方法は、一般に血液凝固の臨床上有意な阻害を生ずるのに十分な量の
蛋白質の投与を含むだろう。この様な量は、治療する状態の性質により変化する
が、既知アッセイ及び実験動物モデルを基に推測することができ、そして一般に
は以下開示の範囲内に入るだろう。

【０１０３】 Zkun6蛋白質は蛋白質分解性の組織崩壊の防止にも治療応用できるだろう。多
くの病気に於いて細胞外マトリックス、結合組織、及びその他の組織ならびに器
官の蛋白質分解が要素になっている。この組織崩壊はプラスミンが１またはそれ
以上のメタロプロテイナーゼ（例えばコラゲナーゼ及びメタロ−エラスターゼ）
を活性化することで開始される。従ってzkun6蛋白質によるプラスミンの阻害は
、これら状態の治療に有用であろう。

【０１０４】 マトリックスメタロプレテイナーゼ（MMPs)は、癌転移、腹部大動脈瘤、多発
性硬化症、リューマチ関節炎、骨関節炎、外傷性及び出血性ショック、ならびに
角膜潰瘍に於いてある役割を果たしていると信じられている。腫瘍細胞により産
生されたMMPsは転移拡大のプロセスの中で組織マトリックス崩壊し、再構築する
。MMP阻害剤がこの活性を遮断するらしいことを示唆する証拠がある（Brown, Ad
van. Enzyme Regul. 35: 293-301, 1995）。腹部大動脈瘤は、細胞外マトリック
スの崩壊と大動脈壁の構造健全性の消失を特徴とする。データは大動脈マトリッ
クスの崩壊をもたらす一連の事象にプラスミンが重要であることを示唆している
（Jean-Claudeら、Surgery 116:472-478, 1994）。

【０１０５】 蛋白質分解酵素は多発性硬化症の炎症性組織損傷にも関係すると信じられてい
る（Gijbels, J. Clin. Invest. 94:2177-2182, 1994）。リューマチ性関節炎は
主に関節ならびにその他結合組織を侵す慢性、全身性の炎症性疾患であり、増殖
性の炎症組織（非可能性リンパ節炎）が関節の変形と機能不全をもたらす（Arne
tt, Cecil Textbook of Medicine内、上記を参照）。骨関節炎は、関節軟骨及び
他関節組織の変質、ならびに関節周囲での新生骨（骨棘）形成をもたらす病気で
ある。MMPsは骨関節性の関節軟骨のマトリックスのコラーゲンの崩壊に関係する
ことを示す証拠がある。

【０１０６】 MMPsの阻害は、軟骨マトリックスからコラーゲン除去を阻害する（Spirito, I
nflam. Res. 44(supp.2): S131-S132, 1995; O'Byme, Inflam. Res. 44(supp.2)
: S117-S118, 1995; Karran, Ann. Rheumatic Disease 54:662-669, 1995)。Zku
n6蛋白質は外傷性及び出血性ショックの治療にも有用であろう。データは、出血
後のMMP阻害剤投与は心臓血管反応、肝細胞機能及び各種器官に於ける微小血管
血流を改善することを示している（Wang, Schok 6:377-382, 1996）。

【０１０７】 失明に至ることがある角膜潰瘍はコラーゲン性の間質組織の崩壊として現れる
。熱又は化学的傷害による角膜表面の損傷は、しばしば慢性の損傷−治癒状態を
もたらす。角膜及び皮膚内に於ける再上皮形成の失敗に関係している基底膜欠失
に、MMPsが機能している直接的な証拠がある。 本発明のzkun6蛋白質はその他治療薬と組合せられ、それら薬物の活性（例え
ば抗血栓又は抗凝固活性）を増強するだろう。例えば、zkun6蛋白質は、血栓溶
解治療に於いて組織プラスミノーゲンアクチベイターと組合せ利用されるだろう
。

【０１０８】 zkun6蛋白質の投与量は、治療対象の状態の重篤度によって変化し、その量は
約10μg/kgないし10mg/kg体重の範囲であり、好ましくは100μg/kgないし5mg/kg
、より好ましくは100μg/kgないし1mg/kgであろう。蛋白質は医薬品として受け
入れ可能なキャリアー又は賦形剤中に処方される。それらは滅菌水、等張生理食
塩水、又はグルコース液、又は同様の賦形剤による希釈等により、注射又は注入
に好適な形状に調製されることが好ましい。

【０１０９】 あるいは、蛋白質は凍結乾燥粉末として、随意前もって測量された希釈液と組
合せ包装され、使用直前に再懸濁される。医薬品組成物は更に１又はそれ以上の
賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面への蛋白質消失を防止するア
ルブミン等も含むだろう。製剤法は当業熟練者のレベル内である。Remington; T
he Science and Practice of Pharmacy. Gennaro, ed., Mack Publishing Co.,
Easton, PA. 19th ed., 1995参照。

【０１１０】 遺伝子治療は、zkun6蛋白質の供給に関する別の治療方法を提供する。哺乳動
物が変異したzkun6を持つか、あるいはそれを欠損している場合、zkun6蛋白質を
コードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入することができる。実施態
様の一つでは、zkun6蛋白質をコードする遺伝子がインビボにてウイルスベクタ
ー内に導入される。この様なベクターには、単純ヘルペスウイルス（HSV）、パ
ピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデ
ノ関連ウイルス（AAV）等の様な弱毒化された又は欠損型DNAウイルスが含まれる
。

【０１１１】 ウイルス遺伝子の全て、又は殆ど全てを欠く欠損型ウイルスが好ましい。欠損
型ウイルスは細胞導入後、非感染性である。欠損型ウイルスベクターの利用する
と、ベクターがその他の細胞に関することを危惧することなく特定局在域内の細
胞に投与することができる。具体的なベクターの例には、欠損型単純ヘルペスウ
イルス１型（HSV1）ベクター（Kplittら、Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1
991）；Stratford-Perricaudetら、J.Clin. Invest. 90:626-30, 1992記載のベ
クターの様な弱毒化アデノウイルスベクター；及び欠損型アデノ関連ウイルスベ
クター（Sarnulskiら、J. Virol. 61:3096-101, 1987; Samulskiら、 J.Virol. 63 :3822-8, 1989）が含まれる。

【０１１２】 別の実施態様では、例えばAndersonら、米国特許第5,399,346号；Mannら、Cel
l 33:153, 1983; Teminら、米国特許第4,650,764号、Teminら、米国特許第4,980
,289号；Markowitzら、J. Virol. 62:1120, 1988; Teminら、米国特許第5,124,2
63号；Doughertyら、WIPO Publication No. WO/95/07358;及びKuoら、Blood 82:
845, 1993に記載の如く、zkun6ポリヌクレオチドはレトロウイルスベクター内
に導入される。あるいは、ベクターはインビボにてリポソームを利用したリフォ
フェクションにより導入することができる。合成陽イオン性脂質を利用し、マー
カーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションに適したリポゾームを
調製することができる（Felngerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7, 1
987; Mackeyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988）。

【０１１３】 別の実施態様では、標的細胞は体部より取り出され、ベクターは裸のDNAプラ
スミドとして細胞内に導入される。次に形質転換細胞が体部に再移植される。遺
伝子治療に適した裸のDNAベクターは当分野既知の方法、例えばトランスフェク
ション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクシ
ョン、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子ガンの利
用、あるいはDNAベクタートランスポーターの利用により、所望宿主細胞に導入
される。例えば、Wuら、 J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wuら、 J. Biol. C
hem. 263:14621-4, 1988を見よ。

【０１１４】 Zkun6蛋白質はzkun6蛋白質に特異的に結合する抗体の調製にも利用できる。こ
こで使用される場合、“抗体”という用語にはポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体、F(ab')2やFab断片の様なその抗原結合性断片、単鎖抗体等を含み、さ
らに遺伝的に加工された抗体も含む。非ヒト抗体は、非ヒト型CDRsだけをヒト型
フレームワーク及び定常域に移植するか、又は全非ヒト型可変ドメイン（随意露
出残基を地下してヒト型の表面で“覆い”、“化粧”した抗体とする）を取り込
むことによ、ヒト化することができる。

【０１１５】 幾つかの例では、ヒト化抗体はヒト型可変域フレームワークドメイン中に非ヒ
ト化残基を保持することで、適当な結合特性を増強するだろう。抗体のヒト化を
通じて、生物学的半減期が延長し、ヒトへの投与に関する有害免疫反応の可能性
が減る。当業者は特定及び各種定常ドメイン（即ち各種Igサブクラス）を使い、
特定の抗体定常ドメインに関連する各種免疫機能を促進、又は阻害するヒト化抗
体を作製することができる。ここで有用な抗体を作製し、又は選別するための別
の技術には、リンパ細胞のzkun6蛋白質へのインビトロ曝露や、ファージ又は同
様ベクター中の抗体ディスプレーライブラリーの選別（例えば、固定化された、
又は標識されたzkun6ポリペプチドを利用した）が含まれる。

【０１１６】 抗体がコントロール（非zkun6）ポリペプチドに対する結合親和性に比べ、少
なくとも10倍以上の親和性を持ってzkun6蛋白質に結合した時、抗体は特異的に
結合するとされる。抗体が10⁶/M以上、好ましくは107/M以上、より好ましくは10
8/M以上、最も好ましくは10⁹/M以上の結合親和性（Ka）を持つことが好ましい。
モノクローナル抗体の親和性は、当業者により容易に決定できる（例えば、Scat
chard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949参照）。

【０１１７】 ポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製方法は当分野公知である（例え
ばHurell, J. G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and
Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982）。当業者に明らかな
ように、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、
ウサギ、マウス及びラットの様な各種温血動物から作製できる。zkun6蛋白質の
免疫原性は、アルム（水酸化アルミニウム）又はフレンドの完全又は不完全アジ
ュバントの様なアジュバントを利用することで、高められるだろう。

【０１１８】 免疫化に有用なポリペプチドには、zkun6蛋白質又はその一部と免疫グロブリ
ンポリペプチドとの、あるいはマルトース結合蛋白質との融合体の様な融合ポリ
ペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫源は完全長分子又はその部分であろう。
ポリペプチド部分が“ハプテン様”部分である場合、それら部分は免疫化に適し
た高分子キャリアー（スカシガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（B
SA）又は破傷風毒素）に有利に結合、あるいは連結されるだろう。

【０１１９】 免疫原性zkun6ポリペプチドは最小５残基であろう。疎水性である、又は疎水
性領域を含むポリペプチドを利用することが好ましい。配列番号２でのこれら好
ましい領域は、残基44（Asn）−54（Asp）を含む。 当業者既知の各種アッセイを利用し、zkun6蛋白質に特異的に結合する抗体を
検出できる。アッセイ例は、Antibodies: A Laboratory Manual, HarlowとLane(
編集）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳細記載されている。
この様なアッセイの代表例には、対抗免疫電気泳動法、放射−免疫アッセイ、放
射−免疫沈降法、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ドットブロットアッ
セイ、ウエスタンブロットアッセイ、阻害又は競合アッセイ、及びサンドイッチ
アッセイが含まれる。

【０１２０】 zkun6６に対する抗体は、zkun6蛋白質の親和性精製；zkun6蛋白質の血中レベ
ルを決定するための診断アッセイ；基礎病理又は疾患のマーカーとしての可溶性
zkun6蛋白質の検出、又は定量；免疫診断的応用を含む動物の全身又は組織切片
中の免疫局在；免疫組織学；発現ライブラリーのスクリーニング；及び当業者に
明らかなその他の利用に関し利用されるだろう。インビトロ及びインビボ診断利
用を含む特定の応用に関しては、標識抗体の利用が有益である。好適な直接タグ
、又は標識体には放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光
マーカー、化学発光マーカー、磁性ビーズ等が含まれる；間接タグ又は標識体は
、ビオチン−アビジン又はその他補体／抗補体のペアを中間体として利用するこ
とを特徴とするだろう。

【０１２１】 Zkun6蛋白質は、培養細胞由来の研究室又は市販の蛋白質標本が利用されるだ
ろう。蛋白質は単独で使用して特定の蛋白質分解を阻害でき、又はその他のプロ
テイナーゼ阻害剤と組合せ利用し、広範な活性を持つ“カクテル”を提供できる
。特に興味深いことは、細胞溶解中に放出される細胞質プロテアーゼの阻害であ
る。蛋白質は細胞剥離を防ぐための組織培養添加物として研究室にて利用するこ
ともできる。

【０１２２】 以下非限定的実施例により発明をさらに例示する。 実施例 Zkun6のcDNAクローンを調製するために、市販キット(クローンテック社、パロ
アルト、カリフォルニア州（Clonthech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)製
Marathon（商標）cDNA Amplification kit）及びオリゴ（dT）プライマーを使い
、胃よりcDNAを調製する。zkun6DNAを増幅するために、1/100に希釈されたcDNAs
各５μl、配列番号１より設計された２種類のオリゴヌクレオチドプライマー各2
0pmole、及びExTaqTMDNAポリメラーゼ（タカラバイオメディカルス（TaKaRa Bio
medicals)）及びPfuDNAポリメラーゼ（ストラタジーン社、ラジョラ、カリフォ
ルニア州（Stratagene、La Jolla, CA）)の2:1の混合体（ExTaq/Pfu）1Uを25μl
の反応混合液中に利用した。

【０１２３】 反応混合液は94℃にて２分間；94℃、15秒、66℃、20秒、及び72℃、30秒を25
サイクル；そして72℃１分間インキュベーションされる。第１PCR産物の1/100希
釈体１μｌはネステッドPCRの鋳型として使用される。２種類の追加オリゴヌク
レオチドプライマー、各20pmoles及び1UのExTaq/Pfuを25μlの反応混合液中に使
用する。混合液は94℃にて２分間；94℃、15秒、64℃、20秒、及び72℃、30秒を
25サイクル；そして72℃１分間インキュベーションされる。PCR産物はゲル精製
、及び配列決定され、その同一性が確認される。

【０１２４】 zkun6 Kunitzドメインに適した発現ベクターを構築するために、上記の胃から
調製されたcDNAについてPCRを実施する。プライマーは、発現ベクター内へのサ
ブクローニングを容易にするために、PCR産物がセンスプライマーの場合には制
限酵素部位BamHIを、アンチセンスプライマーの場合にはXhoIを持つ無傷のKunit
zドメインをコードするように設計される。５μlの1/100に希釈されたcDNA、各
オリゴヌクレオチドプライマー20pmoles及び1UのExTaq/Pfuを25μlの反応混合液
中に使用する。混合液は94℃にて２分間；94℃、30秒、50℃、30秒、及び72℃、
30秒を３サイクル；94℃、30秒、68℃、30秒、及び68℃、30秒を35サイクル；そ
して72℃で７分間インキュベーションされる。PCR産物はゲル精製、BamHI及びXh
oIにて一晩制限酵素消化される。

【０１２５】 哺乳動物用発現ベクターpZP-9は、SV40初期プロモーターコントロール下にあ
る選択マーカージヒドロ葉酸勧化酵素遺伝子、SV40ポリアデニレーション部位、
マウスメタロチオネイン１（MT-1）プロモーターコントロール下にある所望遺伝
子を挿入するクローニング部位、及びhGHポリアデニレーション部位より構築さ
れた。

【０１２６】 蛋白精製を容易にするために、組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA）
分泌シグナル配列（米国特許第5,641,655参照）及びGluGluタグ配列（配列番号
６）をMT-1プロモーターとhGHターミネータの間に挿入しpZP9ベクターを改良し
た。t-PA分泌シグナル配列は、このベクター内に挿入される所望ポリペプチドを
コードするDNAsに適した無傷の分泌シグナル配列に交換されており、発現により
N-末端にタグの付いた蛋白質が得られる。N末端にタグの付いたベクターはpZP9N
EEと命名された。ベクターZPNEEはBamHI及びXhoIにより消化され、zkun6断片が
挿入される。得られた構築体は、配列決定により確認される。

【０１２７】 上記より、ここでは例示を目的に発明の特異的実施態様が記載されているが、
発明の精神及び範囲から逸脱することなく各種変更が可能であることは明らかで
あろう。従って、発明は添付されるクレーム以外により限定されるものではない
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

添付の図面は、"1KNT"と命名されたヒトアルファ３型VIコラーゲン（配列番号
５）を伴う“ZKUN6”と命名された本発明（配列番号２）の代表的ポリペプチド
と、のアミノ酸配列アラインメントを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 9/10 9/10 11/00 11/00 13/02 13/02 17/06 17/06 19/02 19/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/04 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/81 Ｃ０７Ｋ 14/81 16/38 16/38 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/99 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/99 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 FA07 FA10 GA11 HA01 HA12 HA15 4B064 AG23 CA10 CA19 CC24 CE12 DA01 4B065 AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BD14 CA24 CA44 4C084 AA01 AA07 DC50 ZA362 ZA542 ZA592 ZA662 ZA752 ZA812 ZA892 ZA962 ZB152 ZC202 4H045 AA11 AA20 AA30 BA20 BA21 CA40 DA55 DA76 DA86 EA23 EA24 EA50 FA74 GA26

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 その配列が配列番号２の残基６ないし56に少なくとも80％同
   一である、配列番号３に示されるアミノ酸残基の配列を含む単離された蛋白質。
2. 【請求項２】 該蛋白質が51ないし81アミノ酸残基長である、請求項１の単
   離された蛋白質。
3. 【請求項３】 該配列が配列番号２の残基６から56に少なくとも90％同一で
   ある、請求項１又は２の単離された蛋白質。
4. 【請求項４】 該配列が配列番号２の残基６から56に一致する、請求項１ま
   たは２の単離された蛋白質。
5. 【請求項５】 該蛋白質が51ないし59残基長である、請求項１〜４何れか１
   項に記載の単離された蛋白質。
6. 【請求項６】 更にアフィニティータグを含む請求項１〜５何れか１項に記
   載の単離された蛋白質。
7. 【請求項７】 該アフィニティータグがマルトース結合蛋白質、ポリヒスチ
   ジン、またはGlu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu（配列番号６）である、請求項６の単離
   された蛋白質。
8. 【請求項８】 以下の作用可能に連結された要素を含む発現ベクター。 （ａ）転写プロモーター； （ｂ）請求項１〜７の何れかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ断片；及び （ｃ）転写ターミネーター。
9. 【請求項９】 ＤＮＡ断片に作用可能に連結された分泌シグナル配列を更に
   含む、請求項８の発現ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項８又は請求項９に記載の発現ベクターを含む培養細
    胞であって、ＤＮＡ断片を発現する培養細胞。
11. 【請求項１１】 請求項１０による細胞を、ＤＮＡ断片が発現する条件の下
    に培養し；そして 前記ＤＮＡ断片によりコードされた蛋白質を回収する； ことを含む蛋白質作製方法。
12. 【請求項１２】 配列番号３に示すアミノ酸残基の配列を含む51ないし81ア
    ミノ酸残基の蛋白質であり、該配列が配列番号２の残基６から56に少なくとも80
    ％同一である蛋白質に特異的に結合する抗体。