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Homologe des Aprotinin mit anderen Aminosäuren in
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Position 15 anstelle von Lysin, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie
ihre Verwendung als Arzneimittel Aprotinin ist ein bekannter Kallikrein-Trypsin-Inhibitor
aus Rinderorganen. Seine Struktur ist ebenfalls bekannt (Formel (I). Im reaktiven
Zentrum der Peptidkette befindet sich in Position 15 ein Lysinrest, der für die
Spezifität des Inhibitors entscheidend ist.
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Die vorliegende Erfindung-betrifft nun neue Homologe des Aprotinin
in welchen dieser Lysinrest ausgetauscht ist gegen Glycin, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin,
L;Isoleucin, L-Methionin, L-Arginin oder L-Norleucin, L-Norvalin, L- 0c-Aminobuttersäure,
Dehydroalanin oder L-Homoserin. Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur
Herstellung dieser Homologen, dabei auftretende Zwischenprodukte sowie ihre Verwendung
als Arzneimittel.
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Aus H. Jering und H. Tschesche, Europ. J. Biochem. 61, 443 (1976)
ist bekannt, daß in das durch eine Folge von chemischen und enzymatischen Reaktionen
darstellbare Des-Lys15-Aprotinin* anstelle des fehlenden Lysins mit Hilfe von Enzymen
basische und aromatische Aminosäuren eingebaut werden können während auf diesem
Wege die Inkorporation anderer Aminosäuren in Pos. 15 nicht möglich war. Als Aprotinin*
wird im folgenden Aprotinin bezeichnet, bei dem die Peptidbindung zwischen Lysin
15 und Alanin 16 hydrolysiert ist.
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Das als enzymatische Mutation bezeichnete Verfahren, nach dem die
Aprotinin-Homologen mit Phenylalanin, Tryptophan und Arginin hergestellt wurden,
liefert nur für die Homologen mit Phenylalanin und Tryptophan Ein-15 kettenproteine.
Das Arginin -derivat wird nur als Zweikettenprotein mit einer Spaltung der Bindung
Arginin 39 - Alanin 40 und Verlust des Arginin 39 gewonnen.
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Bei der als chemische Mutation bezeichneten und mit Hilfe von wasserlöslichen
Carbodiimiden durchgeführten Kondensation von Des-Lys15-Aprotinin* mit den Estern
der Aminosäuren Glycin, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin, L-Methionin und L-Arginin werden
Aprotinin*-Derivate erhalten, die in Pos. 15 teilweise den betreffenden Aminosäureester
tragen, bei denen sich dieser Aminosäureester aber gleichzeitig an alle oder einen
Teil der peripheren Carboxylgruppen in den Seitenketten der Asparaginsäurereste
(Pos. 3 und 50) sowie der Glutaminsäurereste (Pos. 7 und 49) und des terminalen
Alanin (Pos. 58) unter Bildung von Amidbindungen ankondensiert /H.R. Wenzel und
H. Tschesche, Angw. Chem. 93, 292 (1981)7. Außerdem entstehen während der Umsetzungen
durch Anlagerungen der Carbodiimide an die Carboxylgruppen unerwünschte Acylharnstoffe.
Nach enzymatischer Resynthese der Peptidbindung zwischen dem Aminosäureester in
Pos. 15 und Alanin 16 werden daher gemäß dieser Literaturstelle keine reinen Aprotinin-Homologen
erhalten, sondern Gemische von Derivaten dieser Homologen. Reine Aprotinin-Homologe,
die in Pos. 15 andere Aminosäuren als Phenylalanin und Trytophan enthalten, sind
daher noch nicht bekannt.
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Die vorliegende Erfindung stellt nun solche Homologen zur Verfügung.
Diese Homologen unterscheiden sich vom Aprotinin allein dadurch, daß sie anstelle
von Lysin in Pos. 15 Glycin, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Methionin,
L-Arginin, L- CG -Aminobuttersäure, L-Norvalin, L-Norleucin, Dehydroalanin oder
L-Homoserin
tragen. Diese Homologen können in einer Folge geeigneter
chemischer und enzymatischer Reaktionsschritte in guten Ausbeuten hergestellt werden.
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Dazu wird zunächst modifiziertes Aprotinin mit der zwischen Lysin15
und Alanin16 gespaltenen Peptidbindung (= Aprotinin*) in an sich bekannter Weise
hergestellt. Die Herstellung von Aprotinin* kann auch ohne vorherige Reduktion der
Disulfidbrücke Cysl4-Cys38 mit den Enzymen Plasmin oder Seesterntrypsin Dermasterias
imbricata durchgeführt werden. Dann werden die sechs freien Carboxylgruppen des
Moleküls in bekannter Weise mit Hilfe von methanolischer Salzsäure verestert unter
Bildung des Aprotinin*-hexamethylesters. Die Veresterung kann aber auch in Analogie
zu bekannten Verfahren mit Trialkyloxoniumfluoroborat vorgenommen werden. Des weiteren
eignet sich die Umsetzung von Aprotinin* mit Methanol-Thionylchlorid zur Herstellung
von Aprotinin*-hexamethylester. Zur Veresterung sind anstelle von Methanol auch
andere Alkohole mit geringer proteindenaturierender Wirkung geeignet wie beispielsweise
Ethanol sowie aliphatische Alkohole mit bis zu 6 C-Atomen, die gegebenenfalls auch
Substituenten tragen können. Bevorzugt wird jedoch der Hexamethylester von Aprotinin*
für die weiteren Umsetzungen verwendet.
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Ausgehend vom Aprotinin* ist beispielhaft die Synthese von Valin-15-Aprotinin
in Fig. 1 schematisch wiedergegeben.
In dem dargestellten Syntheseschema
beschränkt sich die Wiedergabe der Reaktionsschritte auf den das aktive Zentrum
(Pos. 15) betreffenden Teil des Aprotininmoleküls. Alle die peripheren Carboxylgruppen
erfassenden Reaktionen (Veresterungen und Verseifungen) werden im Formelschema nicht
berücksichtigt.
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Die Substanzen werden wie folgt bezeichnet: 1) Aprotinin* 2) Aprotinin*-hexamethylester
3) Di-Cysteinyl-14, 38-Aprotinin*-hexamethylester 4) Di-Cysteinyl-14, 38-Aprotinin*-pentamethylester
5) Aprotinin*-pentamethylester 6) Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester 7) L-Valin-15-Aprotinin*-hexamethylester
8) L-Valin-15-Aprotinin Im Di-Cysteinyl-14,38-Aprotinin*-hexamethylester und im
Di-Cysteinyl-14, 38-Aprotinin*-pentamethylester sind die zwischen Pos. 15 und 16
gespaltenen Peptidketten noch kovalent über die Disulfidbrücken der Halbcystine
5/55 bzw. 30/51 verknüpft, was in dem Formelschema nicht erkennbar ist.
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Zur selektiven Freisetzung der Carboxylgruppe von Lysin 15 wird im
Aprotinin*-hexamethylester zunächst in einem ersten Reaktionsschritt mit Mercaptoethanol
oder vorzugsweise mit Dithioerythrit in an sich bekannter Weise die exponierte Disulfidbrücke
zwischen den Cysteinresten in den Pos. 14 und 38 selektiv reduziert.
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Dazu können 5-100 Mole Dithioerythrit je Mol Aprotinin*-hexamethylester
eingesetzt werden, vorzugsweise etwa 15 Mole.
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Die Reduktion wird bei pH-Werten von 3 bis 7,5, vorzugsweise bei pH
4,0-6,5 in wäßrigen Pufferlösungen durchgeführt. Bevorzugte Puffer sind beispielsweise
Succinat-, Phosphat- oder Acetat-Puffer, die 0,005-0,5 M sein können, vorzugsweise
jedoch 0,1 M. Zum Abtrennen von überschüssigem Dithioerythrit wird die Reaktionslösung
direkt oder nach dem Einengen über eine mit einem geeigneten Molekularsieb gefüllte
Chromatographiesäule filtriert. Als Elutionsmittel sind flüchtige Puffer mit pH-Werten
von 2-6,5 brauchbar, vorzugsweise wird jedoch 0,05-0,1 M Essigsäure als Lösungsmittel
verwendet. Man kann aber die Freisetzung der Carboxylgruppe des Lysinrestes 15 auch
ohne vorherige Abtrennung des Dithioerythrit vornehmen.
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Die selektive Verseifung des Hexamethylesters ist auch ohne vorherige
Reduktion der Disulfidbrücke Cys 14-38 möglich. Allerdings verläuft die enzymatische
Hydrolyse dann etwas langsamer, es entfällt jedoch der Oxidationsschritt vor der
Zugabe der Carboxypeptidase. Zur selektiven Verseifung der Estergruppe am Lysinrest
15 des reduzierten Aprotinin*-hexamethylester wird mit an den Tryptophanresten formyliertem
Trypsin umgesetzt, das keine amidolytische wohl aber nach entsprechender Aktivierung
noch hohe esterolytische Aktivität mit Trypsinspezifität besitzt. Die selektive
Verseifung wird in geeigneten Pufferlösungen durchgeführt. Geeignete
Puffer
hierfür sind insbesondere Phosphat-, Succinat-, Acetat- oder Citrat-Puffer. Sie
können 0,01-0,5 M sein, vorzugsweise 0,1 M. Die bevorzugte Umsetzungstemperatur
ist 25-370C, jedoch ist die Hydrolyse allgemein bei Temperaturen von 4-500C durchführbar.
Die Reaktionszeiten liegen zwischen 1 und 48 Stunden, vorzugsweise 2 - 10 Stunden.
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Die selektive Hydrolyse des Lysin 15-Esters ist bei Zusatz von organischen
Lösungsmitteln zu der Reaktionslösung auch mit unmodifiziertem Trpysin möglich,
da dieproteolytische Aktivität von Trypsin durch organische Lösungsmittel wie Dioxan
oder Formamid und 2-Chlorethanol ebenfalls unterdrückt wird. Für die Umsetzungen
eignen sich insbesondere wässrige Pufferlösungen, die mit Dioxan verdünnt werden.
Dabei wird ein Dioxangehalt zwischen 30 und 75 Vol-prozent, vorzugsweise 40-66 Vol-prozent
gewählt. Als bevorzugte Pufferlösungen seien insbesondere Acetat-, Succinat- oder
Phosphatpuffer genannt. Ihre Molarität kann 0,01-0,5 betragen, vorzugsweise 0,05-0,2
M, und ihr pH-Wert zwischen 2 und 7, vorzugsweise zwischen 3,0 und 6,5 liegen.
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Für die selektive Esterhydrolyse werden 0,1-30 Molprozent Trypsin
verwendet, vorzugsweise 0,5-5 Molprozent. Je nach Enzymeinsatz und dem pH-Wert der
Pufferlösung beträgt die Reaktionszeit 0,1-10 Stunden. Für die selektive Verseifung
kann der Aprotinin*-hexamethylester direkt oder nach Reduktion der Cys-14-38-Disulfidbrücke
verwendet werden.
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In Fig. 2 ist der Syntheseweg für den Einbau von Valin in Pos. 15
bei Verwendung von Aprotinin*-hexamethylester schematisch wiedergegeben. Wie in
Abb. 1 beschränkt sich die Wiedergabe auf den das aktive Zentrum (Pos. 15) betreffenden
Teil des Aprotininmoleküls; die die peripheren Carboxylgruppen betreffenden Umsetzungen
werden im Formelschema nicht berücksichtigt.
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Die Substanzen werden wie folgt bezeichnet: 1. Aprotinin* 2. Aprotinin*-hexamethylester
3. Aprotinin*-pentamethylester 4. Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester 5. L-Valin-15-Aprotinin*-hexamethylester
6. L-Valin-15-Aprotinin Nach der selektiven Verseifung am Lysin 15 werden der Cys
14-38 reduzierte Aprotinin*-pentamethylester bzw.
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Aprotinin*-pentamethylester und modifiziertes Trypsin bzw. Trypsin
nach in der Proteinchemie üblichen Methode getrennt. Als derartige Verfahren seien
hier die Fällung von Trypsin bzw. modifiziertem Trypsin mit Perchlorsäure oder vorzugsweise
Trichloressigsäure erwähnt sowie die Filtration über mit geeigneten Molekularsieben
gefüllte Chromatographiesäulen, wobei wegen der noch vorhandenen antitryptischen
Aktivität des Aprotinin*-Derivates als Elutionsmittel Lösungen mit pH-Werten unterhalb
7,0 vorzugsweise zwischen pH 1,5 und 3,5 verwendet werden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel
ist 0,05-0,1 M Essigsäure, deren pH-Wert mit Salzsäure auf den gewünschten Wert
eingestellt wird.
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Beim Einsatz von Aprotinin*-hexamethylester mit reduziertem Cys 14-38-Disulfid
wird vor dem Abspalten des Lysinrestes 15 mit Carboxypeptidase die Disulfidbrücke
zwischen Cystein 14 und 38 oxidativ geschlossen. Diese Oxidation wird bei pH-Werten
von 3,0-9,0, vorzugsweise bei pH 4,5-7,0 durch Oxidation im Luftstrom durchgeführt
und der Reaktionsverlauf anhand der SH-Werte nach Ellman kontrolliert.
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Die Abspaltung von Lysin 15 aus dem Aprotinin*-pentamethylester gelingt
glatt mit Carboxypeptidasen, wie z.B. Carboxypeptidase Y, besonders bequem jedoch
mit Carboxypeptidase B in gepufferten Lösungen bei pH-Werten zwischen 3 und 7,5,
vorzugsweise bei pH 4,0-7,0. Car-15 boxypeptidase und Des-Lys -Aprotinin*-pentamethylester
werden nach dem Ansäuern der Reaktionslösung in an sich bekannter Weise durch Filtration
über Molekularsiebsäulen unter Verwendung von Puffern mit pH-Werten von 1-7, vorzugsweise
2-5, insbesondere jedoch verdünnter Essigsäure als Elutionsmittel getrennt. Der
Des-Lysin Aprotinin*-pentamethylester ist die Ausgangssubstanz für die Synthese
der Aprotinin-Homologen und wird beim Gefriertrocknen der betreffenden Filtrate
als farblose Substanz erhalten.
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Die Einführung der den Lysinrest 15 ersetzenden neuen Aminosäure erfolgt
durch Carbodiimid-vermittelte Kondensation des Des-Lysin15-Aprotinin*-pentamethylesters
mit
einem Ester der betreffenden Aminosäure in wäßrigen Lösungen,
die jedoch auch Zusätze von organischen Lösungsmitteln wie Alkohole, Dimethylformamid
oder Dimethylsulfoxid und/oder Salze enthalten können.
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Für die Kondensation sind insbesondere wasserlösliche Carbodiimide
geeignet wie: N-Cyclohexyl-N'-2- (4-morpholinyl) -ethyl-carbodiimidmethyl-toluol-4-sulfonat,
N-tert.-Butyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'
-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid-hydrochlorid, N-Isopropyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
oder vorzugsweise N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid sowie
Gemische von zwei oder mehr der aufgeführten Carbodiimide.
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Die Umsetzungen mit den Carbodiimiden werden bei Temperaturen von
-100C bis +350C durchgeführt, insbesondere zwischen OOC und 250C. Dabei wird in
der Reaktionslösung durch Zugabe von verdünnter Mineralsäure während der Umsetzung
ein pH-Wert aufrechterhalten, der zwischen 4,0 und 7,5 liegt.
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In den für die Synthese der Aprotinin-Homologen verwendeten Aminosäurealkylestern
kann die Esteralkylgruppe geradkettig, verzweigt oder auch cyclisch sein und bis
zu 6 C-Atomen enthalten. Auch Thioester und Phenylester sind brauchbar, doch werden
vorzugsweise die Methylester der betreffenden Aminosäuren eingesetzt.
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Bei den Kondensationen werden je Mol Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester
etwa 10-1000 Mole Aminosäureester und etwa 8-800 Mole Carbodiimid eingesetzt.
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Dabei entstehen durch Addition der Carbodiimide an die freie Carboxylgruppe
des Halbcystinrestes in Pos. 14 als Nebenprodukte wechselnde Mengen an Acylharnstoff
15 14 (Des-Lys1 -Cys1 -Ureido-Aprotinin*-pentamethylester).
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Außerdem entstehen infolge Addition der Carbodiimide an die phenolischen
Hydroxylgruppen der Tyrosinreste 0-Arylisoharnstoffderivate. Diese Verbindungen
werden gemeinsam mit den Aminosäure-15-Aprotinin*-hexamethylestern bei der Gelfiltration
der Reaktionsgemische erhalten und, wie später beschrieben, aus dem Gemisch abgetrennt
bzw.
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freigesetzt.
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Die Aminosäure-15-Aprotinin*-hexamethylester sind inhibitorisch aktiv.
Sie werden mit 50-95 % Ausbeute gebildet. Diese Ester sind ein weiterer Gegenstand
der Erfindung.
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Die enzymatisch gesteuerte intramolekulare Amidsynthese wird bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren dadurch begünstigt, daß die Carboxylgruppe der Aminosäure
in Pos. 15 durch die Veresterung aktiviert ist und nicht dissoziiert vorliegt. Die
der Resynthese vorgeschaltete Bildung des Acylenzyms wird durch eine Umesterung
erreicht, die energetisch günstiger ist und vollständiger und ca. 103-fach rascher
verläuft als die enzymtische Kondensation mit den in Pos. 15 eine freie Carboxylgruppe
enthaltenden Homologen. Für die Synthese ist weiterhin wichtig, daß durch die Bildung
des Enzym-Inhibitor-Komplexes an der Aminosäure in Pos. 15 durch
eine
gewisse tetraedrische Deformation die sterischen Voraussetzungen für eine intramolekulare
Resynthese der Peptidbindung geschaffen werden.
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Für die enzymatische Knüpfung der Peptidbindung zwischen der neu eingeführten
Aminosäure in Pos. 15 und Alanin in Pos. 16 sind insbesondere diejenigen Proteasen
brauchbar, in deren Spezifitätstasche die Seitenkette des Aminosäurerestes in Pos.
15 paßt. Für das L-Methionin-enthaltende Homologe sind dies z.B. entweder Chymotrypsin
oder Kathepsin G; für die Homologen mit L-Leucin und L-Norleucin sowie L-Norvalin,
Chymotrypsin, Kathepsin G oder Elastase aus Granulozyten bzw. Pankreas, für die
Homologen mit L-Valin und L- OC-AminobuttersEure Granulozytenelastase und überraschenderweise
auch Trypsin. Analog gelingt die Knüpfung der kovalenten Amidbindung bei den Homologen
mit L-Alanin durch Pankreaselastase oder Trypsin. Trypsin eignet sich auch für die
Synthese der Aprotinin-Homologen, die in Pos. 15 L-Arginin oder überraschenderweise
Glycin enthalten.
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Die enzymkatalysierte Synthese der Peptidbindung bietet gegenüber
den peptidchemischen Verfahren den Vorteil, daß die Bildung unerwünschter Nebenprodukte
durch intra-oder intermolekulare Kondensation vermieden wird. Sie kann entweder
mit den gelösten Enzymen oder vorteilhaft mit trägergebundenen Enzymen in heterogener
Phase vorgenommen werden.
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Geeignete Medien für die enzymatische Kondensation sind Pufferlösungen
mit pH-Werten zwischen 2 und 10. Vorzugsweise werden Phosphat-, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-,
Borat-Puffer oder Ethanolamin-Puffer mit pH-Werten zwischen 5 und 8,5 verwendet.
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Anstelle der kinetischen determinierten Synthesen mit stöchiometrischen
Mengen an Proteinasen unter Ausbildung der 1:1-Komplexe und ihrer raschen anschließenden
Dissoziation zu Enzym und Aprotinin-Homologen, kann die Synthese auch thermodynamisch
kontrolliert mit katalytischen Mengen an Enzym durchgeführt werden.
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Die Ausbeuten an den so synthetisierten Aprotinin-Homologen können
durch Zusatz von organischen mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie beispielsweise
Glycerin, Butandiol-1,4 und Dimethylformamid gesteigert werden.
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Bei der enzymatischen Knüpfung der Bindung zwischen den Aminosäuren
in Pos. 15 und 16 wird in alkalischer Lösung ein Teil der noch vorhandenen Estergruppen
hydrolysiert. Vollständige Hydrolyse erfolgt beim Stehen in 0,001 N - 1,0 N Alkalimetallhydroxidlösungen
sowohl bei +40C wie auch bei Raumtemperatur.
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Insbesondere wenn die Knüpfung der Peptidbindung zwischen den Aminosäuren
in den Pos. 15 und 16 mit trägergebundenen Enzymen durchgeführt wird, ist es nicht
notwendig, die Aprotinin-Homologen vor der Verseifung zu reinigen. Begleitsubstanzen,
wie unveränderte Ausgangssubstanz und gegebenenfalls gebildete höhermolekulare
Aggregate,
vor allem aber die bei der Carbodiimidkondensation gebildeten Acylharnstoffe am
Halbcystinrest 14 sind inhibitorisch unwirksam und können durch Filtration abgetrennt
werden.
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Bei der Carbodiimidkondensation teilweise gebildete Tyrosin-O-isoharnstoffderivate
lassen sich durch Behandeln mit 0,5 M Hydroxylamin bei pH 7,0 und einer Inkubationszeit
von 2 - 6 Stunden wieder in underivatisierte Tyrosinreste zurückverwandeln /dgl.
K. L. Carraway und D.E. Koshland, Jr., Biochim. Biophys. Acta 160, 272 (1968)?.
Beim Ansäuern der Suspension auf pH-Werte von 1,5-3 werden die Aprotinin-Homologen
aus ihren Komplexen freigesetzt und treten in das Filtrat über.
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Wird die 15-16-Bindung dagegen mit löslichen Enzymen geknüpft, so
empfiehlt es sich, die Enzyme in an sich bekannter Weise durch Säurefällung oder
Gelchromatographie abzutrennen.
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Die Resynthese der Peptidbindung 15/16 im reaktiven Zentrum gelingt
auch weitgehend mit Hilfe wasserlöslicher Carbodiimide bei pH-Werten von 3-7, vorzugsweise
bei pH 4,5-5 und besonders gut in Gegenwart von Hydroxysuccinimid. Hierzu müssen
allerdings die Estergruppen, vorzugsweise die an der neu eingeführten Aminosäure
15 verseift werden, was wie oben beschrieben mit Natronlauge oder wegen ihrer esterolytischen
Aktivität mit geeigneten Proteinasen durchgeführt werden kann.
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Nachteil der peptidchemisch durchgeführten Resynthese sind im Gegensatz
zu der enzymatisch katalysierten Resynthese die niedrigere Ausbeute an gewünschtem
Homologen
und die Bildung unerwünschter Nebenprodukte durch intra- und intermolekulare Kondensationsreaktionen
sowie Addition des Carbodiimids an die Carboxylgruppen zu Acylharnstoffen.
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Bequem gelingt die Trennung von inhibitorisch wirksamen und inhibitorisch
unwirksamen Substanzen auch, wenn man die bei der enzymatischen Kondensation anfallende
Reaktionslösung zunächst unter neutralen bzw. alkalischen Bedingungen durch Gelfiltration
fraktioniert. Das Aprotinin-Homologe wird nur in den den Komplex enthaltenden Fraktionen
eluiert. Nach dem Einstellen des pH-Werten der Lösung auf Werte zwischen pH 1 und
4 dissoziert der Enzyminhibitorkomplex und Enzym und Inhibitor können durch eine
nochmalige Gelfiltration unter sauren Bedingungen getrennt werden.
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Bevorzugte Lösungsmittel für diese Filtrationen sind Essigsäure, Ameisensäure
oder auch wäßrige Mineralsäuren oder Gemische dieser Lösungsmittel.
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Es ist besonders vorteilhaft, für die Isolierung und Reinigung der
erfindungsgemäßen Inhibitoren ihre große Affinität zu den Proteinasen auszunutzen.
Dies geschieht zweckmäßigerweise entweder nach dem ersten, dem chemischen Kondensationsschritt,
oder aber nach der zweiten, enzymatischen Umsetzung durch Fraktionierung unter Verwendung
von affinitätschromatographischen Verfahren.
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Als Affinitätsadsorbentien werden zumeist feste inerte Substanzen
(Träger) verwendet, auf deren Oberfläche die betreffenden Enzyme nach an sich bekannten
Verfahren fixiert sind. Beim Auftrag und der anschließenden
Elution
der Reaktionsgemische werden die inhibitorisch unwirksamen Substanzen sofort, inhibitorisch
wirksame Substanzen dagegen verzögert eluiert oder ganz zurückgehalten. Die Bindungen
zwischen dem trägergebundenen Enzym und den Inhibitoren können dann durch Variation
von pH-Wert und/oder der Salzkonzentration des Elutionsmittels aufgehoben werden,
so daß schließlich die inhibitorisch aktiven Komponenten der Mischung im Eluat erhalten
werden.
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Neben der Gelfiltration und der Affinitätschromatographie eignet sich
insbesondere die Ionenaustauschchromatographie für die Entsalzung und Fraktionierung
der Reaktionsgemische.
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Die neuen erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen, die sich vom Aprotinin
nur durch den Austausch des Aminosäurerestes in Pos. 15 unterscheiden, sind wertvolle
Proteinaseninhibitoren mit veränderten Wirkungen und Wirksamkeiten, die auf die
veränderten Hemmspektren zurückzuführen sind.
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Diese Anderungen des Hemmspektrums der erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen
ist bedingt durch den Aus-15 tausch von Lys im aktiven Zentrum des Aprotinin gegen
Aminosäuren, deren Seitenketten besser in die Spezifitätstaschen der betreffenden
Proteinasen passen.
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Nach den Ergebnissen der Arbeitsgruppen von Powers und Zimmerman bei
Untersuchungen über die Affinität von synthetischen Substraten und Inhibitoren für
Granulozytenelas
tase, Pankreaselastase, Chymotrypsin und Kathepsin G überrascht die gute Hemmwirkung
des 15 15 Leu -Aprotinin und ebenso des Norleucin -Aprotinin für alle diese Enzyme
und die relativ große Selektivität des Homologen mit Val in Pos. 15 für die Granulozytenelastase
sowie dessen Collagenasehemmung. Außerdem über-Ala15 rascht, daß das Ala -Aprotinin
beide Elastasen nur schwach hemmt. Bemerkenswert ist auch die hervorragende antitryptische
Wirkung von Gly15-Aprotinin und die überraschende Hemmung von Gewebs-Kininogenase
(Kallikrein).
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren haben gegenüber dem Aprotinin überlegene
biologische Eigenschaften. Von besonderem Vorteil sind ihre inhibitorischen Wirkungen
auf die Elastasen aus Pankreas und Granulozyten sowie auf Kathepsin G und die Granulozytencollagenase,
die neue therapeutische Einsatzmöglichkeiten eröffnen.
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Pankreas-Elastase spielt eine wichtige Rolle bei der Pankreatitis;
Serumelastase bei der Atherosklerose und Granulozytenelastase bei akuten und chronischen
Entzündungen mit Bindegewebeschädigung, bei Gefäßwandschädigungen sowie bei nekrotisierenden
Erkrankungen und Degeneration von Lungengewebe, z.B. beim Emphysem.
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Ebenso wichtig ist die Rolle von lysosomalen Enzymen und insbesondere
der Granulozytenelastase bei immunologisch bedingten Entzündungsreaktionen, z.B.
der rheumatoiden Arthritis.
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Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von Aprotinin und einigen Homologen
nach Spackman, Stein und Moore, 1958, Anal. Chem. 30, 1190 1)
| a Aprotinin z uz Gly'0-A rotinin Va115-Aprotinin |
| k |
| pc |
| B |
| a |
| r M QI a\ o o\ c( o \o -r co a rn u> |
| o aO o c* ao o LC b a\ tc M O Ln a0 a a\ |
| Ser 1 1,36 O H CU n 1 1,o4 1 |
| . - |
| Pro 4 0S m 3,81 4 3,81 4 |
| 4X zu 6 6,oo 6 7,02 6,oo 6 |
| 0S z ~ |
| o .~ ~ . |
| Pc, |
| Cys 6 au wo 6 « O aa 6 u, In 6 |
| Val 1 m o\ aD 1 o zu a U,95 1 1,94 |
| hQ) 5 C L C 5 |
| Met 1 o,65 N U,55 1 o,7o t0 tr 1 |
| Ile 20 1,15 2 1,18 2 1,36 2 |
| Llk I I |
| Tyr 4 UE «\ 4 zu U) 3,37 W \0 o1- rI N 3,58 4 |
| Q> |
| h v ~ |
| l |
| r 6,So E37 n 5,74 6 5,96 6 |
| bOQ O o n o F O a) H sD W H a W o uo |
| < bß tN N H CV 0 1 1 0 0 ~I vI tA + N 0 |
| 4JR O |
| < P |
| | |
| O ID |
| H < P h z n O b 6 X H 9 @ n s Z M |
| :d X S ,« S H ,« t « e H b b b h |
1) Die Molverhältnisse sind bezogen auf Gly = 6,0 bzw.
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15 Ala = 6,0 beim Gly -Aprotinin o) Die Isoleucinwerte werden wegen
einer Ile-Ile-Bindung im Molekül nach 18 Stunden Hydrolyse zu niedrig gefunden.
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren lassen sich durch chemische, physikalisch-chemische,
biochemische sowie biologische Eigenschaften charakterisieren. Es werden folgende
Kriterien herangezogen:
1. Aminosäurezus ammensetzung Die Aminosäurezusammensetzung
wurde nach S. Moore, D.H. Spackman, W.H. Stein anal. Chem. 30, 1185 (1958)7 bestimmt.
Für einige der erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologe sind in Tabelle 1 beispielhaft
die Werte der Aminosäureanalysen zusammengestellt.
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2. flochdruckflüssigkeitschromatographie Die HPLC wurde mit dem Hewlett-Packard
(HP) Modell 1084B durchgeführt unter Einsatz einer Bio-Sil TSK IEX 530 CM-Säule
4 x 300 mm (Bio-Rad Labs, Richmond, USA). Die Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/min
unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 0,15 M Natriumsulfat und 0,6 M Natriumsulfat
enthaltenden pH 7,0-Puffern (Fixanal 38746 Riedel de Haen) bei einer Säulentemperatur
von 400C und einem Druck von ca. 50 bar. Je Lauf wurden 20 pl einer Lösung von 1
mg Aprotinin-Derivat in 1 ml Wasser aufgegeben, die Detektion erfolgte bei 215 nm
und bei 280 nm. Als interner Standard wurde Aprotinin verwendet; die angegebenen
Retentionszeiten beziehen sich auf Aprotinin.
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3. Elektrophoresen Die Elektrophoresen wurden unter den von Jering
und H. Tschesche LEur. J. Biochem. 61, 443 (1967)7 angegebenen Bedingungen durchgeführt.
Anstelle von 10 % Acrylamid wurde jedoch 7 % Acrylamid verwendet.
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Die elektrophoretischen Beweglichkeiten der Aprotinin-Homologen wurden
bezogen auf die von Aprotinin als Standard.
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4. Proteasen-Inhibitionsspektrum a) Elastase-Inhibition «) Pankreas-Elastase-Inhibition
Für die Hemmversuche mit den erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen wurde kristallisierte
Pankreas-Elastase (Schwein) der Fa. Nutritional Biochemicals Corp. verwendet. Als
Substrat wurde Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid /J. Bieth, et al,
Biochem. Med. 11, 350 (1974)7 eingesetzt. Die Spaltung wurde durch kontinuierliche
Messung der Extinktion des freigesetzten p-Nitroanilins bei 405 nm bestimmt. Um
maximale Komplexbildung sicherzustellen, wurden Enzym und Inhibitor vor der Zugabe
des Substrats für 15 Min. vorinkubiert.
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In Tabelle 2 sind semiquantitative Angaben über die Inhibition des
Enzyms für einige der neuen Inhibitoren zusammengestellt.
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ß) Granulozyten-Elastase-Inhibition Das für die Hemmteste verwendete
Isoenzymgemisch wurde nach K. Ohlsson und I. Olsson /Europ. J. Biochem. 42, 519
(19741? aus Humangranulozyten gewonnen. Als Substrat ist besonders Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-valinp-nitroanilid
LH.R. Wenzel et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 361, 1413 (1980)7 geeignet.
Angaben über die Hemmung von Granulozytenelastase durch einige erfindungsgemäße
Aprotinin-Homologen sind in Tabelle 2 aufgenommen.
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Chymotryps in- Inhibition Die Aktivität von Chymotrypsin wurde nach
W.
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Nagel, et al, Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem.
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340, 1 (1965 photometrisch mit Succinyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid
als Substrat bestimmt und die Hydrolyse durch kontinuierliche Messung der Extinktion
des freigesetzten p-Nitroanilins bei 405 nm bestimmt. Vor der Zugabe des Substrates
wurden Enzym und Inhibitor im Testpuffer 15 Minuten vorinkubiert.
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In Tabelle 2 sind Angaben zur Chymotrypsinhemmung für einige der erfindungsgemäßen
Aprotinin-Homol ogen enthalten.
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c) Kathepsin G-Inhibition Die Aktivität von Kathepsin G wurde mit
Succinyl-L-phenylalanin-ß-naphthylester als Substrat durch kontinuierliche spektroskopische
Bestimmung des bei der enzymatischen Spaltung freigesetzten ß-Naphthols bei 328,5
nm bestimmt. Die Enzymreaktion wird in einem 0,25 M pH 7,2 Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer
durchgeführt, der 0,05 % Brij 35 enthält und 0,005 M an Magnesiumchlorid ist. Nach
15 Min. Vorinkubation von Enzym und Inhibitor in 2,5 ml Testpuffer werden 0,025
ml einer Stammlösung von 39,4 mg Substrat in 1 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt und
der Extinktionsanstieg bei 328,5 nm bestimmt. Von dieser Extinktion wird der durch
Spontanhydrolyse bedingte Extinktionsanstieg abgezogen. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse
für einige der erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen enthalten.
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d) Trypsin-Inhibition Die Trypsinaktivität wurde nach H. Fritz et
al, /in Methoden der enzymatischen Analyse, Herausgeber H.W. Bergmeyer, 2. Auflage,
Band 1, 1011 (1970L/ mit Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid als Substrat bestimmt.
Das freigesetzte p-Nitro-
anilin wurde spektrophotometrisch bei
405 nm gemsssen. Enzym und Inhibitor wurden vor der Zugabe des Substrats 15 Min.
vorinkubiert. In Tabelle 2 finden sich Angaben zur Hemmbarkeit von Trypsin durch
einige der erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen.
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e) Pankreas-Rininogenase-Inhibition Pankreas-Kallikrein Als Testenzym
wurde Pankreas-Kallikrein (Schwein) verwendet. Die Bestimmung der Enzymaktivität
wurde mit dem Substrat D-Valyl-L-leucyl-L-arginin-p-nitroanilid (A.B. Kabi) nach
T. Dietl et al. /Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360, 67 (1979L7 durchgeführt.
Vor der Zugabe des Substrats wurden Enzym und Inhibitor 15 Min. vorinkubiert. Die
Hydrolyse wurde spektrophotometrisch durch Bestimmung des freigesetzten p-Nitroanilins
bei 405 nm verfolgt. Angaben zur Hemmbarkeit von Schweinepankreas-Kallikrein finden
sich in Tabelle 2.
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f) Collagenase-Inhibition Die Granulozytencollagenase wurde nach H.W.
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Macartney und H. Tschesche /FEBS Letters 119, 327 (1980)7 aus Humanleucozyten
isoliert und
die Bestimmung der Enzymaktivität nach dem in der
obigen Arbeit angegebenen Verfahren durchgeführt. In Tabelle 2 ist die Hemmbarkeit
der Granulozytencollagenase durch einige der erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen
qualitativ angegeben.
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g) Faktor Xa-Inhibitoren Humaner Faktor X wurde von der Fa. Boehringer
erworben -5 E in 0,5 ml -.
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Als Substrat wurde Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid
(S-2222 der Fa. A.B. Kabi) verwendet. Die Bestimmung der Enzymaktivität wurde anhand
der p-Nitroanilinfreisetzung nach 10 Min. Vorinkubation von Enzym und Inhibitor
durchgeführt. Tabelle 2 enthält Angaben zur Wirksamkeit einiger der erfindungsgemäßen
Aprotinin-Homologen.
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h) Plasmin-Inhibition Die plasmininhibitorische Wirkung einiger der
erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen ist qualitativ aus Tabelle 2 ersichtlich.
Die Bestimmungen wurden durchgeführt mit Humanplasmin unter Verwendung des Substrates
D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid (S-2251; Fa. A.B. Kabi) nach einer 10 minütigen
Vorinkubation
von Enzym und Inhibitor in einem 0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer,
pH 7,4, der 0,05 M Natriumchlorid enthielt.
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Tabelle 2 Semiquantitative Angaben zur Hemmbarkeit* einiger wichtiger
Proteinasen durch einige der erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen.
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Aminosäurerest Enzym in Position 15 des Inhibitors Chymotrypsin Kathepsin
G Collagenase Elastase Kallikrein Tyrpsin Plasmin Faktor Xa aus Granulo- Granulo-
Pankreas zyten zyten Lys (Aprotinin) ++ (+) - (+) - +++ +++ +++ -Gly ++ n.b. n.b.
- - +++ +++ n.b. n.b.
-
Ala + n.b. ++ + + + + n.b. n.b.
-
Met +++ ++ n.b. + + + + n.b. n.b.
-
Val + n.b. ++ +++ + + + n.b. n.b.
-
Leu +++ ++ n.b. +++ +++ + + n.b. n.b.
-
Arg ++ (+) n.b. (+) - +++ +++ +++ + x: - keine Hemmung; + schwasche
Hemmung; ++ starke Hemmung; +++ sehr starke Hemmung; n.b. = nicht bestimmt; (+)
Affinität zum Enzym vorhanden
Die erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen
sind in Modellen der akuten Entzündungsreaktion dem Aproltinin überlegen, da mit
ihnen nicht nur in deutlich geringeren Dosierungen die gleiche Wirkung wie mit Aprotinin
erzielt wird, sondern die Entzündungsreaktionen auch dann signifikant gehemmt wird,
wenn sie mehrere Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe verabreicht werden. Eine
solche therapeutische Wirkung ist mit dem Aprotinin im Kaolin- und Aerosilmodell
bei einmaliger Gabe nicht zu erreichen.
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Versuchsanordnung zum Nachweis entzündungshemmender Wirkung bei der
Ratte a) Kaol in-induzierte Entzündungsreaktion Die Entzündungsreaktion wurde durch
intraplantare Injektion von 0,1 ml einer 10 %igen Kaolinsuspension in eine Hinterpfote
von 130-160 g schweren Wistar-Ratten induziert. Die für die Behandlung der Entzündungsreaktion
verwendeten erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen wurden in 0,9 %aber Natriumchlorid
lösung in einer Konzentration von 10-20 mg/ml gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere
erfolgte durch intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion
von 0,5-1,0 ml Lösung der Inhibitoren und zum Vergleich Aprotinin entweder prophylaktisch,
d.h vor Setzen der Entzündungsnoxe, oder therapeutisch, d.h. nach Setzen der Entzündungsnoxe.
Die Schwellung der entzündeten Pfote, die ein
für die Schwere der
Entzündungsreaktion ist, wurde mit dem Antiphlogmeter nach Kemper /F. Kemper und
G. Ameln, Z. ges. exp. Med. 131, 407-411 (1959L7 zeitlich oerfolgt.
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Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen wurde der 4 Stunden nach
Setzen der Entzündungsnoxe gemessene Wert verwendet.
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b) Aerosil-induzierte Entzündungsreaktion Die Entzündungsreaktion
wurde durch intraplantare Injektion von 0,1 ml einer 2 %igen Aerosilsuspension in
eine Hinterpfote von 130-160 g schweren Wistar-Ratten induziert. Die für die Behandlung
der Entzündungsreaktion verwendeten erfindungsgemäßen Aprotinin-Homologen bzw. Aprotinin
wurden in 0,9 zeiger Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 10-20 mg/ml
gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgt durch intraperitoneale, subkutane
oder intravenöse Injektion von 0,5-1,0 ml Lösung der Inhibitoren und zum Vergleich
Aprotinin 15 h nach Setzen der Entzündungsnoxe. Die Schwellung der entzündeten Pfote,
die ein Maß für die Schwere der Entzündungsreaktion ist, wurde mit dem Antiphlogmeter
nach Kemper zeitlich verfolgt. Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen wurde
der 21-Stundenwert nach Entzündungsinduktion (= 6 Stunden nach Injektion der erfindungsgemäßen
Aprotinin-Homologen bzw. Aprotinin ermittelt).
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Das Ergebnis der Therapieversuche mit den neuen Inhibitoren nach den
Beispielen zeigt die Wirksamkeit der verwendeten Aprotinin-Homologen in diesen experimentellen
Modell, in dem Aprotinin in gleicher Dosierung die Entzündungsreaktion nicht hemmt.
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Die neuen Inhibitoren können aufgrund ihrer biologischen Wirksamkeit
insbesondere zur Behandlung folgender Krankheiten bzw. Krankheitserscheinungen eingesetzt
werden: 1. Verschiedene Formen des Schocks, insbesondere Schocklunge und Endotoxinschock,
pösttraumatische und postoperative Komplikationen, 2. Störungen der Blutgerinnung,
3. Akute und chronische Entzündungsreaktionen, insbesondere zur Therapie und Prophylaxe
von Organschädigungen, wie beispielsweise Pankreatitis und strahleninduzierte Enterritis,
immunkomplexbedingte Entzündungsreaktionen, wie Immunvasculitis, Glomerulonephritis
und Arthritiden; Kollagenosen, insbesondere rheumatoide Arthritis, 4. durch stoffwechselbedingte
Ablagerungen verursachte Arthritiden (z.B. Gicht), 5. Degereration der elastischen
Bestandteile der Bindegewebsteile von Organen, wie bei der Atherosklerose, oder
dem Lungenemphysem
6. Strahleninduzierte Enteritis.
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Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise (analog dem Aprotinin)
in übliche Formulierungen übergeführt werden.
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Folgende Formulierungen sind dabei bevorzugt zu nennen: 1. Lösungen
für parenterale Anwendung zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen Injektion
bzw. zur intraartikulären und intratumolaren Injektion.
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2. Lösungen für intravenöse Dauerinfusion, 3. Lösungen zur Anwendung
als Aerosole zur Inhalation, 4. Lösungen, Emulsionen, Salben, Pasten, Cremes, Lotions,
Puder zur äußerlichen lokalen Anwendung.
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5. Kombination verschiedener Hemmstoffe, deren Wirkungsspektrum sich
gegenseitig ergänzt.
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Die Konzentrationen der neuen Wirkstoffe in entsprechenden Formulierungen
bewegen sich dabei in den Grenzen 0,01 bis 100 mg/ml Lösung, vorzugsweise zwischen
0,1 bis 10 mg/ml Lösung.
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Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere
sind folgende Anwendungsmethoden als bevorzugt zu nennen: -a) parenteral: intravenös,
intramuskulär, subkutan, intraartikulär, intratumoral b) lokal: z.B. intranasal
c) oral.
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Als Dosierungsbereich kann für die erfindungsgemäßen Wirkstoffe angegeben
werden: 0,1 - 20 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht, vorzugsweise 1 bis 10 mg Wirkstoff/kg
Körpergewicht, die Dosierung ist dabei vor allem abhängig von der zu behandelnden
Spezies sowie von der Applikationsart.
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Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können bei Mensch und Tier eingesetzt
werden.
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Beispiel 1 Des-Lys-1 5-Aprotinin*-pentamethylester a) Aprotinin*-hexamethyles
ter 160 mg Aprotinin* ( 25 pM) wurden gelöst in 45 ml Methanol, das 0,1 M an Chlorwasserstoff
war und diese Lösung bei Raumtemperatur (200C) gehalten.
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Eine evtl. auftretende Fällung wurde durch Zugabe von weiterem Methanol
gelöst und die Veresterung durch HPLC und Chromatographie an CM Sephadex C-25 kontrolliert.
Nach ca. 150 h wurde das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand
mit 15 ml Methanol übergossen, das sofort abdestilliert wurde.
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Nach mehrmaliger Wiederholung des Löse-Abdampfvorgangs wurde der
Rückstand in 20 ml Wasser gelöst. Beim Lyophilieren wurden 150 mg Aprotinin*-hexamethylester
als farblose Substanz erhalten.
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Relative elektrophoretische Beweglichkeit: 1,61 (pH 5,0-Puffer);
relative Retentionszeit in der HPLC: 2,04 (für Aprotinin* 0,59).
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b) Di-Cysteinyl-14,38-Aprotinin*-hexamethylester 104 mg Aprotinin*-hexamethylester
( ~ 16 pMole) wurden gelöst in 12 ml 0,1 M sauerstoff-freiem Phosphatpuffer, pH
5,8. Zu dieser Lösung fügte man 154 mg Dithiothreitol (1 mMol) zu. Nach 6,5-stündigem
Stehen der Reaktionslösung unter einer Stickstoffatmosphäre wurde mit Essigsäure
ein
pH-Wert von 3 eingestellt0 Man filtrierte das Gemisch zum Abtrennen
des Dithiothreitoi über Sephadex G-25 (Säulendimensionen: 2,5 x 100 cm) und lyophilisierte
die proteinhaltigen Filtrate. Es wurden 95 mg farblose Substanz erhalten.
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c) Di-Cysteinyl-14,38-Aprotinin*-pentamethylester 90 mg (~14 pMole)
nach ib) erhaltene Substanz wurden in 10 ml 0,1 M Phosphatpufferg pH 6,75, gelöst
und versetzt mit 1 ml einer Lösung von 25 mg an den Tryptophanresten formyliertem
Trypsin in 2 ml 8 M Harnstoff lösung, pH 8,0.
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Man hielt die Reaktionslösung 14 h bei 220C. Dann wurde mit Salzsäure
bis pH 2,0 versetzt und die Lösung über eine Sephadex G-50-Säule (2,5 x 120 cm)
filtriert mit 0,1 M Essigsäure-Salzsäure, pH 2,0 als Elutionsmittel, um Enzym und
Aprotinin*-Derivat zu trennen. Bei der Gefriertrocknung der das Aprotinin*-Derivat
enthaltenden Fraktionen wurden 75 mg farblose Substanz erhalten.
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d) Aprotinin*-pentamethylester und Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester
Durch eine Lösung von 70 mg nach lc) erhaltener Substanz in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer,
pH 6,25
ließ man bei 220C einen langsamen Luftstrom perlen, bis
zum negativen Ausfall des Eilman-Testes Dann setzte man der Reaktionslösung 50 pl
einer Suspension von Carboxypeptidase B zu und hielt das Gemisch 1 h bei 220C. Nach
der Zugabe von 0r75 ml Eisessig wurde die Reaktionslösung zum Abtrennen der Carboxypeptidase
B und vom abgespaltenen Lysin über eine Sephadex G-25-Säule (2,5 x 125 cm) filtriert,
unter Benutzung von 0,1 M Essigsäure als Elutionsmittel. Beim Gefriertrocknen der
den Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester enthaltenden Fraktionen wurden 50 mg
farblose Substanz erhalten.
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Beispiel 2 Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester a) Aprotinin*-pentamethylester
100 mg nach Beispiel la) erhaltene Aprotinin*-hexamethylester werden in 48 ml 0,1
Natriumacetatpuffer, pH 3,5, gelöst. Nach Zugabe von 50 ml Dioxan versetzte man
mit 2 ml einer Lösung von 7,5 mg Trypsin (TPCK-behandelt) / ml 10 4 N Salzsäure
und hielt die Lösung bis zum Ende der Umsetzung (HPLC-Kontrolle) ca. 2 Stunden bei
Raumtemperatur. Dann wurde die Reaktionslösung- mit 1 ml Eisessig versetzt und im
Vakuum
auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Nach dem Einstellen von pH 2,0 mit N Salzsäure
wurde die Lösung mit 0,1 M Essigsäure-Salzsäure, pH 2,0, als Elutionsmittel über
eine Sephadex G-50-S§ule (2 x 120 cm) filtriert. Die den Aprotinin*-pentamethylester
enthaltenden Eluate werden nach Zugabe von N Natriumhydroxidlösung bis pH tR5 im
Vakuum auf ein Volumen von 10 ml eingeengt.
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b) Des-Lys-Aprotinin*-pentamethylester Nach Zugabe von 0,1 N Natriumhydroxidlösung
bis pH 5,5 zu dem nach a) erhaltenen Kondensat wurden 50 µ1 einer Suspension von
Carboxypeptidase B in die Lösung eingetragen0 Man hielt die Lösung 30 Min bei Raumtemperatur
und fügte dann 0,5 ml Eisessig hinzu. Zum Abtrennen der Carboxypeptidase filtrierte
man die Lösung mit 0,05 M Essigsäure, deren pH-Wert mit Salzsäure auf 2 eingestellt
war, über eine Sephadex G-50-Säule (2 x 120 cm) und engte die das Aprotininderivat
enthaltenden Eluate nach Zugabe von Natriumhydroxidlösung bis pH ,0 im Vakuum auf
10 ml ein. Die Entsalzung dieser Lösung erfolgte durch Filtration über eine Bio-Gel
P-2-Säule (2 x 100 cm). Beim Gefriertrocknen der entsprechenden Eluate wurden 85
mg Aprotinin-pentamethylester erhalten.
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Beispiel 3 L-Valin-15-Aprotinin a) L-Val in-1 5-Aprotinin*-hexamethyl
es ter Zu einer Lösung von 13 mg (2pMole) nach Beispiel 2 erhaltenem Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester
und 167 mg L-Valinmethylester-hydrochlorid (1 mMol) in 7,5 ml Wasser fügte man bei
200C 96 mg N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (500 pMole)
zu. Durch Zugabe von 0,1 N Salzsäure hielt man den pH-Wert der Reaktionslösung mit
Hilfe einer Autotitrators konstant bei 4,75. Nach 2 h wurden die im Reaktionsgemisch
enthaltenen niedrigmolekularen Substanzen durch Gelfiltration des Ansatzes über
eine Sephadex G-25-Säule (1,5 x 100 cm) mit 0,1 M Essigsäure als Elutionsmittel
abgetrennt. Beim Gefriertrocknen der proteinenthaltenden Eluate wurde in quantitativer
Ausbeute eine farblose Substanz erhalten.
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b) L-Valin-15-Aprotinin-pentamethylester Das nach 3a) erhaltene Lyophilisat
wurde in 15 ml 0,01 M Tris- (hydroxymethyl) -aminomethan-Salzsäurepuffer, pH 8,5
24 h mit 12,5 ml Trypsin-Sepharose 4 B - Beladung: 5 mg Trypsin pro ml Gel - unter
gelindem
Schütteln inkubiert Dann wurde der pH-Wert des Gemisches mit 0,1 N Salzsäure auf
1,8 eingestellt und das Affinitätsadsorbens durch Filtration abgetrennt und mit
insgesamt 20 ml 0,1 M Essigsäure-Salzsäure, pH 2,0 ausgewaschen.
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Filtrat und Waschwasser wurden vereinigt und die Lösung nach Einstellung
eines pH-Wertes von 4 mit N Natriumhydroxidlösung im Vakuum auf ein Volumen von
10 ml eingeengt Das Konzentrat wurde durch Filtration über eine Sephadex G-25-Säule
(1,5 x 100 cm) entsalzt Bei der Lyophilisation der protein enthaltenden Eluate wurden
13 mg farblose Substanz erhalten c) L-Valin-15-Aprotinin Die nach Beispiel 3b) erhaltene
Substanz wurde in 10 ml 0,001 N Natriumhydroxidlösung gelöst. Nach 12-stündigem
Stehen bei 21°C wurde die Lösung mit 0,01 N Salzsäure neutralisiert und nach Zugabe
von 550 mg Hydroxylammoniumchlorid 6 Stunden bei Raumtemperatur gehalten Man trug
die Lösung auf eine mit 0,01 M Boratpuffer, pH 8,6 äquilibrierte CM Sephadex C-25-Säule
(2 x 40 cm) auf. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten aus dem Äquilibrierpuffer
und dem 0,4 M Natriumchlorid enthaltenden Äquilibrierpuffer eluiert. Die Granulozytenelastasethemmenden
Eluate - Elution bei einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M - wurden vereinigt
und die Lösung nach dem Einengen durch
Gelfiltration über eine
Bio-Gel P-2-Säule (1,5 x 100 cm) mit 0,1 M Essigsäure als Eluans entsalzt. Nach
Lyphilisation wurden 5,7 mg Valin-15-Aprotinin erhalten. (45 96 bezogen auf den
eingesetzten Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester); Relative elektrophoretische
Beweglichkeit: 0,54.
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Beispiel 4 L-Leucin-15-Aprotinin Analog wie bei der Synthese von Valin-15-Aprotinin
wurden 13 mg Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester (2 p Mol) und 92 mg L-Leucinmethylester-hydrochlorid
(500 p Mol) mit Hilfe von 58 mg N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
(300 µMol) kondensiert.
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Die Reaktionslösung wurde mit 50 ml 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer,
pH 8,5 verdünnt und 20 ml ob Chymotrypsin-Sepharose 4 B CL - Beladung: 7 mg Enzym
je ml Gel - in die Mischung eingetragen. Nach 24 h gelindem Schütteln wurde von
dem Affinitätsträger abfiltriert und das Gel gut mit dem obigen Puffer nachgewaschen
und schließlich mit 250 ml Wasser.
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Man suspendierte die oG Chymotrypsin-Sepharose 4 B CL in 50 ml 0,1
M Essigsäure und versetzte bis zum Erreichen von pH 1,8 mit 0,1 N Salzsäure. Nach
20 Min.
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Stehen wurde erneut abgesaugt und der Träger mit insgesamt 100 ml
0,1 M Essigsäure in mehreren Anteilen gewaschen.
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Die vereinigten Filtrate wurden nach dem Einstellen auf pH 3g0 mit
N-Natriumhydroxidlösung im Vakuum auf ein Volumen von 5 ml eingeengt und das Konzentrat
mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Nach Zugabe von 0o5 ml 0,05 W Natriumhydroxidlösung
ließ man diese Mischung über Nacht bei 200C stehen und neutralisierte nach 14 h
mit 0,1 M Essigsäure Nach Zugabe von 300 mg Hydroxylammoniumchlorid hielt man die
Lösung a Stunden bei Raumtemperatur Die Lösung wurde durch Gelfiltration über eine
Sephadex G-25-Säule (15 x 100 cm) entsalzt und die proteinenthaltenden Eluate vereinigt
und gefriergetrocknet Es wurden 7,4 mg einer farblosen Substanz ( 58 %) erhalten;
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: 0,58.
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Beispiel 5 Glycin-15-Aprotinin a) Glycin-15-Aprotinin*-hexamethylester
13 mg Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester (2 pNol) wurden unter Verwendung
von 125,5 mg Glycinmethylesterhydrochlorid (1 mMol) wie bei Beispiel 3a) beschrieben;
mit Hilfe von 94 mg (750 µMol) N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
kondensiert und der Glycin-15-Aprotinin*-hexamethylester nach Gelfiltraltion wie
dort beschrieben, in quantitativer Ausbeute isoliert
b) Glycin-15-Aprotinin
Zu der Lösung der nach 5a) erhaltenen Substanz in 10 ml 0,05 M Phosphatpuffer, pH
3,7 fügte man 0,25 ml einer 0,1 M Calciumchloridlösung, deren pH-Wert mit 1 N Natriumhydroxidlösung
auf 6,0 eingestellt worden war und anschließend 60 mg Rindertrypsin (80 %ig) (2
\Mol). Nach 30 min.
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Stehen bei 200C wurde der pH-Wert der Lösung mit 1 N Natriumhydroxidlösung
auf 8,0 gestellt und zur Trennung von Trypsin und Trypsin-Glycin-15-Aprotinin-pentamethylester-Komplex
einerseits und inaktiven Des-Lysin-15-Aprotinin*-Derivaten andererseits über eine
Sephadex G-50 Säule (2 x 100 cm)- filtriert unter Verwendung von 0,05 M Tris- (hydroxymethyl)
-aminomethan-Salzsäurepuffer pH 7,5 als Elutionsmittel. Die dem Komplex bzw.
-
Trypsin entsprechenden Eluate wurden vereinigt und mit 2,5 ml 0,1
N Natriumhydroxidlösung versetzt. Nach 14-sttindigem Stehen der Reaktionslösung
bei 220C neutralisierte man mit 1 M Essigsäure und konzentrierte im Vakuum auf ein
Volumen von 10 ml. Zu dem Konzentrat fügte man 550 ml Hydroxylammoniumchlorid und
beließ die Lösung 4 Stunden bei Raumtemperatur. Der pH-Wert der Lösung wurde mit
konz. Salzsäure auf 2 eingestellt und das Gemisch ohne vorheriges Abtrennen des
gebildeten Niederschlages auf eine Sephadex G-50-Säule (2 x 100 cm) aufgetragen.
Die Säule
wurde mit 0,1 M Essigsäure-Salzsäure, pH 2, entwickelt.
Aus den das Glycin-15-Aprotinin enthaltenden Eluaten wurden nach dem Einengen und
Entsalzen durch Gelfiltration über eine Bio-Gel P-2-Säule (1,5 x 100 cm) durch Gefriertrocknen
8,3 mg (64 %) farblose Substanz erhalten.
-
Beispiel 6 L-Arginin-15-Aprotinin a) L-Arginin-15-Aprotinin-ol igomethylester
13 mg Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester (2 pMol) wurden mit 130,5 mg L-Argininmethylesterdihydrochlorid
(500 ,uMol) in Gegenwart von 57 mg N-Ethyl-N'- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimidhydrochlorid
umgesetzt, wie bei Beispiel 3a) beschrieben.
-
Durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung stellte man den pH-Wert
der Lösung anschließend auf 7,5 ein und setzte 1 ml einer 0,1 M Calciumchloridlösung
und 80 ml 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer, pH 7,5 zu. Nach
dem Nachstellen des pH-Wertes wurden 20 ml Trypsin-Sepharose 4 B CL - Enzymgehalt:
5 mg je ml Gel -in die Lösung eingetragen und die Suspension 15 h gelinde geschüttelt.
Dann wurde vom Affinitätsträger abfiltriert und das Gel mit 50 ml des obigen Puffers
und schließlich mit 100 ml Wasser
gewaschen. Man suspendierte die
Trypsin-Sepharose in 100 ml 0,1 M Essigsäure-Salzsäure, pH 1,8. Nach dem Nachstellen
des pH-Wertes wurde 20 Min. sachte geschüttelt und erneut filtriert. Das Affinitätsgel
wurde gut mit 100 ml 0,1 M Essigsäure-Salzsäure, pH 1,8 in mehreren Portionen gewaschen.
-
Die vereinigten Filtrate wurden nach dem Einstellen eines pH-Wertes
von 4,5 mit N Natriumhydridlösung im Vakuum auf ein Volumen von ca. 10 ml konzentriert,
nachdem man zuvor mit 5 ml N Natriumhydroxidlösung versetzt hatte. Das Konzentrat
wurde über eine Sephadex G-25-Säule (2 x 100 cm) filtriert mit 0,1 M Essigsäure
als Elutionsmittel. Aus den Protein enthaltenden Eluaten wurden durch Lyophilisation
9,6 mg (76 %) Arginin-15-Aprotininoligomethylester erhalten.
-
b) L-Arginin-15-Aprotinin Die nach 6a) erhaltene Substanz wurde in
10 ml 0,001 M Natriumhydroxidlösung gelöst und diese Lösung 24 h bei 200C gehalten.
Dann wurde mit 0,1 M Salzsäure neutralisiert und 500 mg Hydroxylammoniumchlorid
zu der Lösung hinzugefügt. Nach 3stündigem Stehen der Mischung bei Raumtemperatur
wurde diese Lösung zur Entsalzung unter Verwendung von 0,1 M Essigsäure als Elutionsmittel
über eine Sephadex g-25-Säule (2 x 100 cm) filtriert. Die proteinenthaltenden Eluate
wurden nach dem Einengen gefriergetrocknet. Man erhielt 8,2 mg (86 % bzw.
-
65 % bezogen auf den Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester) farblose
Substanz mit einer relativen
elektrophoretischen Beweglichkeit
von 1,05 und einer relativen Retentionszeit von 1,13 in der HPLC.
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Beispiel 7 L-Norleucin-15-Aprotinin Die bei der Umsetzung von 13 mg
Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester (2 ,Mol) und 55 mg L-Norleucinmethylester-hydrochlorid
(300 pMol) mit 83 mg N-Cyclohexyl-N'-/2-(4-morpholinyl)-ethyl/-carbodiimid-methyl-ptoluolsulfonat
(200 pMol) analog Beispiel 3a) erhaltene Substanz wurde zur Synthese der Peptidbindung
zwischen Norleucin 15 und Alanin 16 in 50 ml 0,1 M Tris- (hydroxymethyl)' -aminomethan-Salzsäurepuffer,
pH 8,0, mit 20 ml Chymotrypsin-Sepharose 4 B CL - Beladung: 7 mg Enzym je ml Gel
- 6 Stdn. hinkubiert.
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Das Gel wurde mit dem obigen Inkubationspuffer und schließlich mit
100 ml Wasser gewaschen. Man suspendierte anscließend in 50 ml 0,1 M Essigsäure-Salzsäure,
pH 1,8 und trennte Gel und Flüssigkeit durch Filtration. Das Affinitätsgel wurde
mit 100 ml 0,05 M Essigsäure-Salzsäure nachgewaschen und die vereinigten Filtrate
nach der Zugabe von konz. Ammoniumhydroxidlösung bis pH 4,0 im Vakuum auf ein Volumen
von es 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde neutralisiert und nach Zugabe von 550
mg Hydroxylammoniumchlorid
3 Stunden bei Raumtemperatur belassen.
Zur Entsalzung wurde die Lösung über Bio-Gel P-2-Säule (2 x 100 cm) filtriert mit
0,1 M Essigsäure als Elutionsmittel.
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Die proteinenthaltenden Eluate wurden konzentriert und lyophilisiert.
Man erhielt 9,2 mg (71 %) farblose Substanz.
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Beispiel 8 Norval in-1 5-Aprotinin Das bei der Kondensation von 13
mg Des-Lysin-15-Aprotinin*-pentamethylester (2 pMol) und 67 mg L-Norvalinmethylester-hydrochlorid
(400 Mol) in Gegenwart von 58 mg N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
(300 pMol) erhaltene Substanzgemisch wurde aufgearbeitet, wie bei Beispiel 4 beschrieben.
Zur Knüpfung der Amidbindung zwischen den Resten 15 und 16 wurden 20 ml Pankreaselastase-Sepharose
4 B CL - Beladung: 4 mg Enzym je ml Gel - in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 5,2 verwendet.
Bei der weiteren Aufarbeitung analog Beispiel 7 wurden 7,1 mg (60 %) farbloses Lyophilisat
erhalten.
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- L e e r s e i t e -