JP2661982B2 - 新規トリプシンインヒビターおよびその製造法 - Google Patents
新規トリプシンインヒビターおよびその製造法Info
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- JP2661982B2 JP2661982B2 JP63227186A JP22718688A JP2661982B2 JP 2661982 B2 JP2661982 B2 JP 2661982B2 JP 63227186 A JP63227186 A JP 63227186A JP 22718688 A JP22718688 A JP 22718688A JP 2661982 B2 JP2661982 B2 JP 2661982B2
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- Japan
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- trypsin
- tgti
- activity
- inhibits
- inhibitor
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、新規トリプシンインヒビターおよびその
製造法に関するものである。
製造法に関するものである。
［背景技術］ プロテアーゼ（トリプシン）インヒビターは動物、植
物または微生物に含まれる蛋白質分解酵素に対する阻害
活性をもった蛋白質であって、動植物体内でまたは試験
管内で蛋白質分解酵素を阻害する物質である。プロテア
ーゼインヒビターは蛋白質分解酵素に対してしばしば特
異性を示すので、蛋白質分解酵素の研究や植物の昆虫や
微生物に対する防御機構を研究する上で重要な役割を果
たすことが多い。
物または微生物に含まれる蛋白質分解酵素に対する阻害
活性をもった蛋白質であって、動植物体内でまたは試験
管内で蛋白質分解酵素を阻害する物質である。プロテア
ーゼインヒビターは蛋白質分解酵素に対してしばしば特
異性を示すので、蛋白質分解酵素の研究や植物の昆虫や
微生物に対する防御機構を研究する上で重要な役割を果
たすことが多い。
この発明者は、先にチューリップ属（Tulipa）植物が
トリプシンを阻害する蛋白質性の酸性インヒビターを含
むことを見出した（日本薬学会第106年会講演要旨集349
ページ、1986）が、さらに研究を続けた結果、チューリ
ップ属植物が酸性トリプシンインヒビター以外に別の塩
基性トリプシンインヒビターを含むことを見い出し、こ
れを分離して特性を明らかにすることに成功し、この発
明を完成したものである。
トリプシンを阻害する蛋白質性の酸性インヒビターを含
むことを見出した（日本薬学会第106年会講演要旨集349
ページ、1986）が、さらに研究を続けた結果、チューリ
ップ属植物が酸性トリプシンインヒビター以外に別の塩
基性トリプシンインヒビターを含むことを見い出し、こ
れを分離して特性を明らかにすることに成功し、この発
明を完成したものである。
［発明の構成］ すなわち、この発明は、チュリップ属（Tulipa）植物
から得られ、ゲル濾過により測定した分子量が約13000
〜24000であり、クロマトフォーカシングによる溶出pH
（等電点）が塩基性であり、トリプシンと結合すること
によりトリプシン活性を阻害し、キモトリプシン活性を
阻害し、パパイン、ズブチリシン、エラスターゼ活性は
阻害しないものである、トリプシンインヒビターを提供
するものである。
から得られ、ゲル濾過により測定した分子量が約13000
〜24000であり、クロマトフォーカシングによる溶出pH
（等電点）が塩基性であり、トリプシンと結合すること
によりトリプシン活性を阻害し、キモトリプシン活性を
阻害し、パパイン、ズブチリシン、エラスターゼ活性は
阻害しないものである、トリプシンインヒビターを提供
するものである。
上記トリプシンインヒビターは、チューリップ属（Tu
lipa）植物から得られる水性液を物理的、化学的もしく
は生物学的性質に基づく分画手段またはそれらの組合わ
せによって分画し、得られたフラクションから、ゲル濾
過により測定した分子量が約13000〜24000であり、トリ
プシン活性を阻害し、またキモトリプシン活性を阻害す
るが、パパイン、ズブシリシン、およびエラスターゼを
阻害しないことによって特徴づけられる物質を採取する
ことにより得られる。
lipa）植物から得られる水性液を物理的、化学的もしく
は生物学的性質に基づく分画手段またはそれらの組合わ
せによって分画し、得られたフラクションから、ゲル濾
過により測定した分子量が約13000〜24000であり、トリ
プシン活性を阻害し、またキモトリプシン活性を阻害す
るが、パパイン、ズブシリシン、およびエラスターゼを
阻害しないことによって特徴づけられる物質を採取する
ことにより得られる。
［詳細な記載］ 上記トリプシンインヒビターには、TgTI−Ｉ、II、II
I、IVおよびVIIが含まれる。これらは、上に示した性質
のほかに、次のような性質を有する。
I、IVおよびVIIが含まれる。これらは、上に示した性質
のほかに、次のような性質を有する。
（１）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％ゲル）
からTgTI−Ｉ（Mr＝24000）、TgTI−II（Mr＝17800）、
TgTI−III（Mr＝25000）、TgTI−IV（Mr＝18500）およ
びTgTI−VII（Mr＝13800）の分子量をもつ塩基性領域の
トリプシンインヒビターとしてクロマトフォーカシング
により分離される。
からTgTI−Ｉ（Mr＝24000）、TgTI−II（Mr＝17800）、
TgTI−III（Mr＝25000）、TgTI−IV（Mr＝18500）およ
びTgTI−VII（Mr＝13800）の分子量をもつ塩基性領域の
トリプシンインヒビターとしてクロマトフォーカシング
により分離される。
（２）アミノ酸組成 6M塩酸を用い110℃で24、48および72時間加水分解し
たのち、日本電子アミノ酸分析装置JIC−200A型を用い
て分析した概略アミノ酸組成は次の通りである。（な
お、1/2−シスチンは過ギ酸酸化の後酸加水分解により
システイン酸として、またトリプトファンについては別
に分光分析で測定した。糖は検出されなかった。） （３） トリプシン阻害活性 トリプシンとインヒビターの増加量との阻害実験から
トリプシンの残存活性を求めて得た各インヒビターの阻
害活性は次の通りである。すなわち、インヒビターとト
リプシンの結合モル比はTgTI−Ｉ（1:1）、TgTI−II
（5.7:1）、TgTI−III（2.1:1）、TgTI−IV（7.3:1）お
よびTgTI−VII（2:1）である。
たのち、日本電子アミノ酸分析装置JIC−200A型を用い
て分析した概略アミノ酸組成は次の通りである。（な
お、1/2−シスチンは過ギ酸酸化の後酸加水分解により
システイン酸として、またトリプトファンについては別
に分光分析で測定した。糖は検出されなかった。） （３） トリプシン阻害活性 トリプシンとインヒビターの増加量との阻害実験から
トリプシンの残存活性を求めて得た各インヒビターの阻
害活性は次の通りである。すなわち、インヒビターとト
リプシンの結合モル比はTgTI−Ｉ（1:1）、TgTI−II
（5.7:1）、TgTI−III（2.1:1）、TgTI−IV（7.3:1）お
よびTgTI−VII（2:1）である。
（４） 解離定数（阻害定数Ki値） 結合実験の結果、作図から本インヒビターの解離定数
はTgTI−Ｉ（2.1×10-10M）、TgTI−II（1.5×10
-8M）、TgTI−III（2.5×10-9M）、TgTI−IV（3.4×10
-7M）およびTgTI−VII（7.5×10-8M）である。
はTgTI−Ｉ（2.1×10-10M）、TgTI−II（1.5×10
-8M）、TgTI−III（2.5×10-9M）、TgTI−IV（3.4×10
-7M）およびTgTI−VII（7.5×10-8M）である。
（５） その他の蛋白分解酵素阻害 TgTIはキモリプシンに対しても一般にやや弱いながら
も（但し、例えばTgTI−IIIのように強いものもある）
阻害活性を有する。すなわち、50％抗キモトリプシン阻
害活性（ナノモル）は、TgTI−Ｉ（2.0）、TgTI−II
（3.0）、TgTI−III（0.57）、TgTI−IV（1.5）、TgTI
−VII（2.5）である。
も（但し、例えばTgTI−IIIのように強いものもある）
阻害活性を有する。すなわち、50％抗キモトリプシン阻
害活性（ナノモル）は、TgTI−Ｉ（2.0）、TgTI−II
（3.0）、TgTI−III（0.57）、TgTI−IV（1.5）、TgTI
−VII（2.5）である。
（６）その他の性質 TgTI−Ｉについて： バイオゲルＰ−100による分子量:23000 熱安定性（残留活性）:45℃/15分（100％）、55℃/15分 （50％） 酸安定性（残留活性）:1.6MHCl/18時間/20℃（100 ％）、3.0MHCl/18時間/20℃（50％） アルカリ安定性（残留活性）:0.1MNaOH/18時間/20℃ （100％）、0.3MNaOH/18時間/20℃（50％） λmax:222nm、276nm λmin:250nm λsh:288−292 A280/A260:1.606 トリプシンインヒビターTgTIは、前述したように、チ
ューリップ属（Tulipa）植物から得られる。チューリッ
プ属（Tulipa）植物には、チューリッパ・ゲスネリアナ
（T.gesheriana）、チューリッパ・スアベオレンス（T.
suaveolens）、その他2,3の種、これらの種間雑種、改
良品種等が含まれるが、園芸用として市販されているデ
ュクファントール種、一重早咲種、ダーウィン種、パー
ロット種、等は何れも使用できる。植物体としては、全
草を用いてもよいが、鱗茎のみを用いるのが好ましい。
ューリップ属（Tulipa）植物から得られる。チューリッ
プ属（Tulipa）植物には、チューリッパ・ゲスネリアナ
（T.gesheriana）、チューリッパ・スアベオレンス（T.
suaveolens）、その他2,3の種、これらの種間雑種、改
良品種等が含まれるが、園芸用として市販されているデ
ュクファントール種、一重早咲種、ダーウィン種、パー
ロット種、等は何れも使用できる。植物体としては、全
草を用いてもよいが、鱗茎のみを用いるのが好ましい。
トリプシンインヒビターTgTIの製造に際しては、植物
体例えば鱗茎を水性溶媒（例えば水、緩衝液）の存在下
または不存在下にすりつぶすか、または圧搾し、固体を
除き、液体から物理的、化学的もしくは生物学的性質に
基づく分画手段、例えば硫安分画、アフィニティクロマ
トグラフィー、ゲル濾過、クロマトフォーカシング、電
気泳動等を適宜組合わせた分離法により、トリプシンに
対する阻害活性のような適当な指標を用いてTgTIを精製
・分離する。
体例えば鱗茎を水性溶媒（例えば水、緩衝液）の存在下
または不存在下にすりつぶすか、または圧搾し、固体を
除き、液体から物理的、化学的もしくは生物学的性質に
基づく分画手段、例えば硫安分画、アフィニティクロマ
トグラフィー、ゲル濾過、クロマトフォーカシング、電
気泳動等を適宜組合わせた分離法により、トリプシンに
対する阻害活性のような適当な指標を用いてTgTIを精製
・分離する。
［用途］ こうして得られるトリプシンインヒビターTgTIは、ト
リプシンに対して特異的に阻害活性を有するので、各種
トリプシン（由来別）の活性と構造研究に用いることが
でき、また、適当な不溶性固体もしくは液体ポリマーに
結合させて、各種天然物もトリプシンの特異的精製に用
いることができ、さらに植物の害虫あるいは微生物に対
する防御機構を解明していく上で、生化学的試薬として
有用である。また、高等動物の血液凝固や繊溶、炎症な
どに関与するトロンビン、プラスミン、カリクレインな
どのプロテアーゼもトリプシンと密接な関連をもつこと
が知られていることから本インヒビターの抗血液凝固、
抗繊溶、抗炎症などへの用途も期待される。
リプシンに対して特異的に阻害活性を有するので、各種
トリプシン（由来別）の活性と構造研究に用いることが
でき、また、適当な不溶性固体もしくは液体ポリマーに
結合させて、各種天然物もトリプシンの特異的精製に用
いることができ、さらに植物の害虫あるいは微生物に対
する防御機構を解明していく上で、生化学的試薬として
有用である。また、高等動物の血液凝固や繊溶、炎症な
どに関与するトロンビン、プラスミン、カリクレインな
どのプロテアーゼもトリプシンと密接な関連をもつこと
が知られていることから本インヒビターの抗血液凝固、
抗繊溶、抗炎症などへの用途も期待される。
［実施例］ 以下、この発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明
する。
する。
実施例１（トリプシンインヒビターTgTIの製造） チューリッパ・ゲスネリアーナ（Tulipa gesnerian
a）の鱗茎（園芸用市販品）50個（約1700g）を蒸留水３
リットルと共にワーリングブレンダーでホモジナイズ
し、水相を硫安分画に付した。40−50％飽和で生成した
沈澱をpH7.5の20mMトリス/HCl緩衝液に対して透析し、
トリプシン・セファロース4B（ブロムシアン法で製造）
カラム（2.0×22cm、上記緩衝液で平衡）にかけた。280
nmの吸収がほぼ消失するまで緩衝液でカラムを洗い、さ
らに1M NaClで洗浄した後、0.1M酢酸でインヒビターを
溶離した。第１図に示すように0.1M酢酸でトリプシンに
対して強い阻害作用を示す活性画分を得た。このインヒ
ビターを含むフラクションを中和し、セファデックスＧ
−75カラム（2.5×145cm、0.2M NaCl含有50mMトリス/HC
l緩衝液（pH8.0）で平衡）にかけた。第２図に示すよう
に活性画分は２つのピークに分かれたが、第一番目の活
性画分には公知の酸性トリプシンインヒビターを含むこ
とが判明した。第２番目のインヒビターを含むフラクシ
ョン（第２図に両矢印で示す）を蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥した。この第２番目の活性画分をポリバッ
ファー交換体PBE94（0.025Mエタノールアミン/HCl緩衝
液（pH9.4）で平衡化した）カラムによるクロマトフォ
ーカシングにかけ、ポリバッファー96/HCl緩衝液（pH6.
8）でインヒビターを溶離した。第３図に示すように、
溶出pH8.35、8.33、8.05、7.85、7.62−7.45および7.23
で溶離された７個のピークにトリプシンに対する阻害活
性がそれぞれ認められたので、これらの活性フラクショ
ンをそれぞれ集め、バイオ・ゲルＰ−30カラムによるゲ
ル濾過法で脱塩し、凍結乾燥した。精製トリプシンイン
ヒビター（TgTI−Ｉ、TgTI−II、TgTI−III、TgTI−IV
およびTgTI−VIIと命名）がそれぞれ7mg、5.5mg、6.5m
g、3.2mg、3.1mg得られた。TgTI−ＶおよびVIのピーク
は分離できなかった。
a）の鱗茎（園芸用市販品）50個（約1700g）を蒸留水３
リットルと共にワーリングブレンダーでホモジナイズ
し、水相を硫安分画に付した。40−50％飽和で生成した
沈澱をpH7.5の20mMトリス/HCl緩衝液に対して透析し、
トリプシン・セファロース4B（ブロムシアン法で製造）
カラム（2.0×22cm、上記緩衝液で平衡）にかけた。280
nmの吸収がほぼ消失するまで緩衝液でカラムを洗い、さ
らに1M NaClで洗浄した後、0.1M酢酸でインヒビターを
溶離した。第１図に示すように0.1M酢酸でトリプシンに
対して強い阻害作用を示す活性画分を得た。このインヒ
ビターを含むフラクションを中和し、セファデックスＧ
−75カラム（2.5×145cm、0.2M NaCl含有50mMトリス/HC
l緩衝液（pH8.0）で平衡）にかけた。第２図に示すよう
に活性画分は２つのピークに分かれたが、第一番目の活
性画分には公知の酸性トリプシンインヒビターを含むこ
とが判明した。第２番目のインヒビターを含むフラクシ
ョン（第２図に両矢印で示す）を蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥した。この第２番目の活性画分をポリバッ
ファー交換体PBE94（0.025Mエタノールアミン/HCl緩衝
液（pH9.4）で平衡化した）カラムによるクロマトフォ
ーカシングにかけ、ポリバッファー96/HCl緩衝液（pH6.
8）でインヒビターを溶離した。第３図に示すように、
溶出pH8.35、8.33、8.05、7.85、7.62−7.45および7.23
で溶離された７個のピークにトリプシンに対する阻害活
性がそれぞれ認められたので、これらの活性フラクショ
ンをそれぞれ集め、バイオ・ゲルＰ−30カラムによるゲ
ル濾過法で脱塩し、凍結乾燥した。精製トリプシンイン
ヒビター（TgTI−Ｉ、TgTI−II、TgTI−III、TgTI−IV
およびTgTI−VIIと命名）がそれぞれ7mg、5.5mg、6.5m
g、3.2mg、3.1mg得られた。TgTI−ＶおよびVIのピーク
は分離できなかった。
本品は、ゲル濾過、pH2.3（TgTI−Ｉ）及び9.5（TgTI
−II、III、IV、VII）の７％ゲルでのディスクゲル電気
泳動で均質であった（第４図）。
−II、III、IV、VII）の７％ゲルでのディスクゲル電気
泳動で均質であった（第４図）。
0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む10％ゲル
を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に単離
したそれぞれのインヒビターとマーカー蛋白質（子うし
血清アルブミン＝68000;オボアルブミン＝45000、キモ
トリプシノーゲンＡ＝25000およびチトクロームＣ＝125
00）をかけ（第５図）、分子量の対数をRf値の関係から
TgTIの分子量を計算し約TgTI−Ｉ＝24000、TgTI−II＝1
7800、TgTI−III＝25000、TgTI−IV＝18500およびTgTI
−VII＝13800の値を得た。本品のアミノ酸組成の測定結
果は前掲の通りである。
を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に単離
したそれぞれのインヒビターとマーカー蛋白質（子うし
血清アルブミン＝68000;オボアルブミン＝45000、キモ
トリプシノーゲンＡ＝25000およびチトクロームＣ＝125
00）をかけ（第５図）、分子量の対数をRf値の関係から
TgTIの分子量を計算し約TgTI−Ｉ＝24000、TgTI−II＝1
7800、TgTI−III＝25000、TgTI−IV＝18500およびTgTI
−VII＝13800の値を得た。本品のアミノ酸組成の測定結
果は前掲の通りである。
実施例２（結合試験） 最終溶量0.2mlの25mMトリス/HCl緩衝液（pH8.0）中に
真のトリプシンとして17μｇを含むトリプシンと各種濃
度のTgTIを含む反応混合物を、35℃で15分間インキュベ
ートし、５×10-4M−Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニ
ンエチルエステル（50mM CaClを含む50mMトリス/HCl緩
衝液（pH8.0）に溶解した）を3.0ml加えすばやく253nm
における吸光度の増加をダブルビーム紫外可視分光光度
計で測定し、△A253nm・min-1・cm-1の値から、インヒ
ビターを含まないコントロールをトリプシン活性100％
とした時のそれぞれの残存トリプシン活性を求めた。第
６図に示すようにTgTI−Ｉはトリプシンに対する阻害活
性が最も強く1:1のモル比で完全に阻害した。TgTI−III
とVIIはトリプシンと2:1のモル比で、またTgTI−IIとIV
は６−7:1のモル比で阻害することが判明した。
真のトリプシンとして17μｇを含むトリプシンと各種濃
度のTgTIを含む反応混合物を、35℃で15分間インキュベ
ートし、５×10-4M−Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニ
ンエチルエステル（50mM CaClを含む50mMトリス/HCl緩
衝液（pH8.0）に溶解した）を3.0ml加えすばやく253nm
における吸光度の増加をダブルビーム紫外可視分光光度
計で測定し、△A253nm・min-1・cm-1の値から、インヒ
ビターを含まないコントロールをトリプシン活性100％
とした時のそれぞれの残存トリプシン活性を求めた。第
６図に示すようにTgTI−Ｉはトリプシンに対する阻害活
性が最も強く1:1のモル比で完全に阻害した。TgTI−III
とVIIはトリプシンと2:1のモル比で、またTgTI−IIとIV
は６−7:1のモル比で阻害することが判明した。
第１図、第２図および第３図は、それぞれ、実施例にお
けるトリプシン−セファロース4Bカラムクロマトグラフ
ィー、セファデックスＧ−75カラムクロマトグラフィー
およびポリバッファ交換体94を用いたクロマトフォーカ
シングの結果を示すグラフである。 第４図および第５図は、それぞれ、実施例１におけるPA
GEおよびSDS−PAGEの結果を示す図である。 第６図は、実施例２における結合実験の結果を示すグラ
フである。
けるトリプシン−セファロース4Bカラムクロマトグラフ
ィー、セファデックスＧ−75カラムクロマトグラフィー
およびポリバッファ交換体94を用いたクロマトフォーカ
シングの結果を示すグラフである。 第４図および第５図は、それぞれ、実施例１におけるPA
GEおよびSDS−PAGEの結果を示す図である。 第６図は、実施例２における結合実験の結果を示すグラ
フである。
Claims (4)
- 【請求項１】チュリップ属（Tulipa）植物から得られ、
ゲル濾過により測定した分子量が約13000〜24000であ
り、クロマトフォーカシングによる溶出pH（等電点）が
塩基性であり、トリプシンと結合することによりトリプ
シン活性を阻害し、キモトリプシン活性を阻害し、パパ
イン、ズブチリシン、エラスターゼ活性は阻害しないも
のである、トリプシンインヒビター。 - 【請求項２】アミノ酸組成が下表に示す通りのトリプシ
ンインヒビターTgTI−Ｉ、II、III、IVおよびVIIから選
ばれたものである、請求項１記載のトリプシンインヒビ
ター。 - 【請求項３】チューリップ属（Tulipa）植物から得られ
る水性液を硫安分画、アフィニティクロマトグラフィ
ー、ゲル瀘過、クロマトフォーカシング、電気泳動から
なる群から選ばれる、物理的、化学的もしくは生物学的
性質に基づく分画手段またはそれらの組合わせによって
分画し、得られたフラクションから、ゲル濾過により測
定した分子量が約13000〜24000であり、トリプシン活性
を阻害し、またキモトリプシン活性を阻害するが、パパ
イン、ズブシリシン、およびエラスターゼを阻害しない
ことによって特徴づけられる物質を採取することを特徴
とする、トリプシンインヒビターの製造法。 - 【請求項４】チューリップ属植物が鱗茎である、請求項
３の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63227186A JP2661982B2 (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 新規トリプシンインヒビターおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63227186A JP2661982B2 (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 新規トリプシンインヒビターおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0276900A JPH0276900A (ja) | 1990-03-16 |
| JP2661982B2 true JP2661982B2 (ja) | 1997-10-08 |
Family
ID=16856837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63227186A Expired - Lifetime JP2661982B2 (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 新規トリプシンインヒビターおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2661982B2 (ja) |
-
1988
- 1988-09-10 JP JP63227186A patent/JP2661982B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0276900A (ja) | 1990-03-16 |
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