DE2200828A1 - Polyvalente isoinhibitoren und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Polyvalente isoinhibitoren und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)'
Aktenzeichen: Hoe 72/b 001 —. Ma 146
Datum: 7- Januar 1972 Dr. Li/Fo
Polyvalente Isoinhibitoren und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft polyvalente Isoinhibitoren für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine und ein Verfahren zu
ihrer Herstellung aus Seeanemonen (Actinaria), vorzugsweise aus Anemonia sulcata.
Als polyvalent bezeichnet man die Inhibitoren, weil sie mehrere Enzyme hemmen. Da es sich um ein Gemisch von Inhibitoren
handelt, die sieh - wenn auch nur geringfügig - in ihrer Aminosäurenzüsammensetzung
unterscheiden, werden sie unter dem Begriff "Isoinhibitoren" zusammengefasst. Sie stellen somit ein Gemisch
von Proteinen mit gleicher Funktion, aber verschiedener Primär-
struktur dar. N
Die Aktivität der Inhibitoren wird in Inhibitor-Einheiten gemessen:
1 Inhibitor-Einheit (IU) ist diejenige Inhibitormenge, die unter Standardbedingungen den Substratumsatz eines Enzyms
um 1 ja Mol/min vermindert.
Es ist bisher nicht bekannt, dass in Seeanemonen polyvalente Isoinhibitoren enthalten sind. Es sind auch keine Versuche
unternommen worden, polyvalente Isoinhibitoren aus Seeanemonen zu isolieren.
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Es sind schon Verfahren zur Isolierung von Inhibitoren aus Serum sowie aus verschiedenen tierischen und pflanzlichen
Geweben wie Organen (Lunge, Pankreas, Parotis) von Rindern, Submandibulardrusen von Caniden und Feliden, Bohnen, Mais,
Kartoffeln, Getreide und Erdnüssen beschrieben worden. Die Konzentration der Inhibitoren im Serum ist jedoch gering,
ausserdem ist Serum teuer, so dass es sich nicht lohnt, Serum als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Inhibitoren heranzuziehen.
Inhibitoren aus pflanzlichem Material haben bisher keine Anwendung gefunden, da sie durch ihr höheres Molekulargewicht
immunogen wirken und ausserdem durch schwer abtrennbare toxische Beimengungen Nebenwirkungen hervorrufen.
Von den aus tierischen Geweben gewonrEnenlnhibitoren ist bekannt,
dass sie - bedingt durch ihren hohen isoelßktrischen Punkt - selektiv in den Nieren gespeichert werden.
Gegenstand des Schutzreßhtes sind polyvalente Isoinhibitoren
für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine, dadurch gekennzeichnet, dass sie die nachstehende Aminosäurezusammensetzung
besitzen:
| Aminosäure | Anzahl Moleküle |
| Asparaginsäure | 6 |
| Threonin | 1 |
| Serin | .3-5 |
| Glutaminsäure | 4-5 |
| Prolin | 2-3 |
| Glykokoll | 6-7 |
| Alanin | 2 |
| Cystein | 6 |
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— 3 —
| Aminosäure | Anzahl Moleküle |
| Valin | 4 |
| Isoleucin | 1-2 |
| Leucin | 2-3 |
| Tyrosin | 3 |
| Phenylalanin | 2-3 |
| Lysin | 3-4 |
| Histidin | 1-2 |
| Arginin | 5-7 |
dass deren aktive Zentren Arginylreste enthalten und frei von
Lysylresten sind, dass deren Molekulargewichte zwischen 5500 und 7000 vorzugsweise zwischen 6.000 und 6,600 liegen und
dass sich deren isoelektrischen Punkte zwischen pH 6,0 und pH 9,5 befinden.
Gegenstand des Schutzrechtes ist ausserdem ein Verfahren zur Isolierung von polyvalenten Isoinhibitoren für Trypsin, Chymotrypsin,
Plasmin und Kallikreine, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der aus einem durch Extraktion von Seeänemonen und
Fällung des Extraktes gewonnene Niederschlag durch in der Eiweiss-Chemie bekannte vorzugsweise chromatographische
Methoden fraktioniert oder durch Adsorption an Trypsinharz und anschliessende Desorption angereichert und isoliert wird.
Für die Gewinnung der polyvalenten Isoinhibitoren werden Seeanemonen
(Actinaria), vorzugsweise Anemonia sulcata, verwendet. Aber auch die Seeanemonen Calliactis parasitica, Condylactis
aurantiaca, Actinia aquina und Cribrinopsis crassa sind dafür
geeignet.
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Für die Isolierung der polyvalenten Isoinhiboren werden zunächst aus Seeanemonen sogenannte Rohtoxine gewonnen, in
denen die polyvalenten Inhibitoren in relativ geringer Konzentration enthalten sind (bei diesen Toxinen handelt
es sich um hochwirksame Giftstoffe, mit denen die Seeänemone ihre Beute lähmt). Man extrahiert dazu Seeanemonen mit Wasser
oder wasserhaltigen Alkoholen, z.B. Äthanol und fällt aus diesem Extrakt, gegebenenfalls nach vorheriger Konzentration,
z.B. durch Eindampfen,die aktiven Substanzen mit Alkohol, Aceton oder Äther aus.
Für die Isolierung des Rohinhibitors aus Rohtoxin können verschiedene Wege beschritten werden. Zweckmässig wird das
inhibitorhaltige Rohtoxin bei pH 5 - 6 in einer Säule aus
vernetztem Carboxymethyl-Dextran (Carboxymethyl-Sephadex C-50) chromatographiert. Zunächst werden die Toxine durch
Erhöhung der Molarität des Elutionspuffers aus der Säule
entfernt und anschliessend das Gemisch der Inhibitoren mittels eines 0,2 molaren Acetatpuffers, der noch 5 % Natriumchlorid
enthält, gewonnen. Aus dem Eluat werden die Inhibitoren entweder nach Dialyse durch Gefriertrocknung gewonnen oder
nach Ammonsulfatsättxgung durch Zentrifugation isoliert. Das erhaltene Sediment wird mittels einer Säule aus vernetztem
Dextran (Sephadex G-15)salzfrei gemacht und lyophil getrocknet.
Der auf diese V/eise gewonnene Rohinhibitor wird bei pH 7,5 bis 8,5 in einer Säule aus vernetztem Dextran (Sephadex G-50)
gereinigt. Das inhibitorhaltige Eluat, das einen symmetrischen Adsorptionsgipfel aufweist, wird konzentriert, salzfrei gemacht
und gefriergetrocknet. Die dadurch erhaltenen glänzenden, farblosen Blättchen, die eine spezifische Aktivität von 3,3 IU/
mg besitzen, stellen das Verfahrensprodukt dar. Es kann bei
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schwach alkalischem pH-Wert über eine Carboxymethylcellulose=
Säule in einzelne Fraktionen mit steigender Basizität aufgetrennt werden. Zur Elution verwendet man zweckmässig einen
linearen Gradienten aus einer Triäthanolamin-Salzsäurelösung, die noch Natriumchlorid enthält, und einer-Triäthanolamin-Salzsäurelösung
. Die einzelnen Fraktionen werden im Vakuum-Rotationsverdampfer eingeengt, entsalzt und gefriergetrocknet.
Durch Rechromatographie in der Carboxymethyl-Cellulose=Säule
können Fraktion C2 und Fraktion C^ in die Unterfraktionen
und C2^ sowie C» und C,, aufgeteilt werden.
In der nachstehenden Tabelle sind die Aminosäurezusammensetzungen des Verfahrensproduktes,der daraus isolierten Unterfraktionen
A, B, C2a und C^3 sowie zweier nach dem Stand der Technik
hergestellten Inhibitoren aus Rinderorganen und Rindercölοstrumangegeben,
ausserdem die Molekulargewichte.
| Amino säure |
Verfahrens produkt (Gemisch) |
1 | 2-3 | F - A |
r a B |
k t i C2a |
ο η e η C4b |
D | Rinder organe |
Rinder- colostr. |
| Asparaginsäure 6 | 3-5 | 6-7 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | VJl | 8 | |
| Threonin | Glutaminsäure 4-5 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 6 | |
| Serin | Prolin | 6 | VJl | VJl | 4 | 3 | 4 | 1 | 3 | |
| Glykokoll | 4 | VJl | VJl | 5 | VJl | 4 | 3 | 10 | ||
| Alanin | 0 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 4 | 7 | ||
| Cystein | 1-2 | 6 | 6 | 7 | 7 | 6 | 6 | 4 | ||
| Valin | 2-3 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 6 | 4 | ||
| Met. | 3 | 6 | 6 | .6 | 6 | 6 | 6 | 6 | ||
| Isoleucin | Phenylalanin 2-3 | 4 | 4 | 4 | 4 | '4 | 1 | — | ||
| Leucin | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | |||
| Tyrosin | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 | 1 | |||
| 2 | 2 | 2 | 3 | 2 | 2 | 5 | ||||
| 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 4 | 3 | ||||
| 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 4 |
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| Amino säure |
Verfahrens produkt (Gemisch) |
F r A |
a k B |
t i ο C2a |
η e η C4b |
D | Rinder organe |
Rinder- colostr. |
| Lysin | 3-4 | . 4 | 4 | 4 | . 3 | 3 | 4 | 2 |
| Histidin | 1-2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | - | _ |
| Arginin | 5-7 | 5 | 5 | 6 | 7 | 6 | 6 | 3 |
| Tryptophan O | 0 | O | O | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Summe | 58 | 58 | 59 | 58 | 54 | 58 | 67 | |
| Mol-Gew. | 6484 | 6484 | 6620 | 6577 | 6095 | 6513 | 7520 | |
Ebensowenig wie der Inhibitor aus Rinderorganen enthält auch das Verfahrensprodukt und auch seine Unterfraktionen Tryptophan.
Zum Unterschied zu dem Inhibitor aus Rinderorganen enthält das Verfahrensprodukt und seine Unterfraktionen kein Methionin, Die
Aminosäurenanalysenwerte von A und B sind identisch. Es ist möglich,
dass sich diese beiden Fraktionen im Amidierungsgrad unterscheiden
oder dass eine der Unterfraktionen eine gespaltene Peptidbindung innerhalb der Polypeptidkette enthält.
Die polyvalenten Isoinhibitoren können auch in. einem Verfahrensschritt mittels wasserunlöslicher im Handel erhältlicher
Trypsinharze gewonnen werden. Dazu wird das wasserunlösliche Trypsinharz in ein Homogenat von Seeanemonen gegeben, der
Inhibitor-Trypsinharz-Komplex isoliert- und die Inhibitoren
mit einer Kaliumchlorid-Salzsäurelösung bei saurem pH desorbiert.
Nach der Neutralisation wird die Inhibitorlösung im Vakuum-Rotationsverdampfer
konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet.
*) dafür jedoch Histidin,
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1 weitere Reinigung bis zu einer spezifischen Aktivität
von 3,3 lU/mg kann bei pH 7»5 bis 8,5 in einer Sephadex
G-50-Säule erzielt werden. Das salzfreie Eluat kristallisiert
beim Gefriertrocknen in glänzenden, farblosen Blättchen.
Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird die optische Absorption
einer durch das Enzym abgespaltenen Verbindung zunutze gemacht. So wird für Trypsin und Piasrain N-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid
und für Chjonotrypsin N-3-(Carboxypropionyl)~L-phenylalanin-p-nitroanilid
als Substrat verwendet und die optische Absorption des abgespaltenen p-Nitroanilins
gemessen.
Als Maß für die Kaliikrein-Aktivität dient die Spaltung des
Benzoyl-L-argininäth'ylesters. Das dabei freigewordene Äthanol
wird in Gegenwart von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid mittels
Alkoholdehydrogenase umgesetzt. Gemessen wird die Extinktion des reduzierten Nicotinamid-Adenin-Dinucleotids.
Werden diese Ansätze in Gegenwart der Inhibitoren ausgeführt, so werden die ,Spaltungsreaktionen gehemmt. Als Folge davon
wird eine niedrigere optische Absorption gemessen, die wiederum ein Maß für die Hemmungsaktivität des Inhibitors darstellt.
Die Aktivitätsbestimmungen sind in H.U. BERGMEYER "Methoden
der enzymatischen Analyse" 2. Aufl. Band 1, 1970, Seite 1011 ff., beschrieben.
Die aktiven Zentren der erfindungsgemäss gewonnenen Inhibitoren
enthalten einen Arginylrest. In den aktiven Zentren bekannter polyvalenter Inhibitoren befindet sich im
allgemeinen ein Lysylrest, dessen Reaktionsbereitschaft für die geringere Stabilität dieser Inhibitoren verantwortlich
ist.
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Da Maleinsäureanhydrid mit den Epsilon-Aminogruppen der
Lysylreste reagiert, wurde das erfindungsgemässe Präparat
und ein gemäss dem Stand der Technik (VOGEL u.a. "Natürliche Proteinasen-Inhibitoren" S. 59, 1966, Georg Thjgne-Verlag,
Stuttgart) hergestelltes Inhitdtorpräparat mit Maleinsäureanhydrid umgesetzt. Dazu werden 0,5 mg Inhibitor
in 0,5 ml 1 molarer Natriumhydrogencarbonatlösung unter Kühlung bei O0C mit 20 mg Maleinsäureanhydrid und 25 mg
Natriumhydrogencarbonat versetzt. Vor und nach der Reaktion wurden die Hemmwirkungen volumengleicher Proben der beiden
Inhibitoren gemessen. Während bei dem erfindungsgemässen Präparat die Hemmwirkung durch das Maleinsäureanhydrid unbeeinflusst
blieb, war bei dem Präparat des Standes der Technik die Hemmwirkung vollständig beseitigt.
Eine Probe des erfindungsgemäss hergestellten Inhibitors, der mit Maleinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht wurde, wird
zur Identifikation des reaktiven Zentrums mit Butandion-(2,3)
umgesetzt, das nach Blockierung der Aminogruppen durch Maleoylreste ' " ; spezifisch mit der Guanidinogruppe des
Arginins eine Bindung eingeht. Da die Hemmwirkung dadurch beseitigt wird, ist nachgewiesen, dass Arginin das reaktive
Zentrum des Verfahrensproduktes darstellt.
Zur Analyse der Aminosäurenzusammensetzung werden 300 yug des
Inhibitors in 6 normaler Salzsäure bei 110°C hydrolysiert und in einem Aminosäureanalysator ausgewertet.
Die Molekulargewichte werden unter Verwendung von Referenzsubstanzen
mittels Gelfiltration bestimmt und aus der Aminosäurezusammensetzung berechnet. Die isoelektrischen Punkte
werden elektrophoretisch ermittelt.
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Das erfindungsgemäss hergestellte Präparat inaktiviert die
wichtigsten Proteinasen und Esterasen des Plasmas und der Blutzellen.
Es beeinflusst auch die katalytische Wechselwirkung einzelner Faktoren der Gerinnung und der Fibrinolyse. Das
Indikationsgebiet erstreckt sich auf Blutungen als Folge überschiessender Fibrinolyse (Hyperplasrainämie), nach Behandlung
einer Verbrauchskoagulopathie und Substitution der verbrauchten Gerinnungsfaktoren (Fibrinogen, Faktor V,
Faktor VIII usw.)·
Die Verfahrensprodukte sind gut verträglich, als vorteilhaft erweist sich, dass sie weniger Tyrosin- und Phenylalanin-Moleküle
- die hauptsächlich für die Iramunogenität eines Proteins verantwortlich sind - enthalten als die bereits
bekannten Inhibitorpräparate .
Gewinnung des inhibitorhaltigen Rohtoxins
1 kg Seeanemonen Anemonia sulcata (spezifische Aktivität etwa 1,0 IU/g) wird mit 3 mal 100 ml 50 ?6igem wässrigem
Äthanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt , im Vakuum auf 50 ml eingeengt und mit ^>0 ml Äthanol, 300 ml
Aceton und 100 ml Äther vermischt. Dabei entsteht ein brauner Niederschlag, der durch Zentrifugation isoliert, in 50 ml
destilliertem Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet wird. Aus 1 kg Ausgangsmaterial werden 3g Rohtoxin mit einer spezifischen
Aktivität von 0,39 IU/mg gewonnen.
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Isolierung des Rohinhibitors
20 g inhibitorhaltiges Rohtoxin werden in 200 ml 0,1
molarem Natriumacetat-Puffer pH 5»5 gelöst und auf eine mit
0,1 molarem Natriumacetat-Puffer pH 5,5 äquilibrierte CM-Sephadex C-50=Säule (7 χ 40 cm) gegeben. Anschliessend werden
mit 7 Ltr. Q, 1 molaren Acetatpuffer, sodann mit 4 Ltr. 0,2 molarem
Acetatpuff er. und endlich mit 6 Ltr. 0,4 klaren Acetatpuffer die
Toxine und Verunreinigungen eluiert. Das Gemisch der Inhibitoren wird anschliessend mit 8 Ltr. 0,2 molarem Acetatpuffer, der
noch 5 % Natriumchlorid enthält, gewonnen. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität werden vereinigt (300 ml) und 16 Stunden
gegen destilliertes Wasser dialysiert und danach gefriergetrocknet. Aus 20 g Rohtoxin werden 2 g Rohinhibitor gewonnen.
Gemäss Beispiel A werden 20 g Rohtoxin aufgearbeitet und die
vereinigten Fraktionen mit der. höchsten Aktivität (300 ml) mit 200 g festem Ammonsulfat gesättigt. Der dadurch entstandene
inhibitorhaltige Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen.
Die im Niederschlag verbleibenden Salze werden durch Fraktionierung
an einer Sephadex G-15~Säule abgetrennt.
Reinigung des Rohinhibitors
2 g Rohinhibitor - gemäss Beispiel A hergestellt - werden in
0,1 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0 , der noch 1 Mol
Natriumchlorid enthält, gelöst und in einer Sephadex G-50= Säule (5f5 x HD cm), die mit einer Lösung aus 0,1 molarem
Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0 und 1 molarem Natriumchlorid äquilibriert wurde, gereinigt. Die zuletzt eluierte Fraktion
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(300 ml) wird mit dem Vakuum-Rotationsverdampfer auf 80 ml eingeengt und mit 31 g festem Ammonsulfat versetzt. Dabei
entsteht ein Niederschlag aus 400 mg des Inhibitorgemisches, zu dessen Entsalzung eine Sephadex G-15=Säule benutzt wird.
Das Eluat wird gefriergetrocknet, wobei glänzende farblose Blättchen mit einer spezifischen Aktivität von 3,3 IU/mg
erhalten werden.
Auftrennung in die einzelnen Inhibitoren
5 ml Inhibitorlösung - 50 mg Inhibitorgemisch mit einer "
spezifischen Aktivität von 3,3 IU/mg, gelöst in 0,05 molarer Triäthanolamin-Salz_säure-Lösung pH 8,5 - werden
über eine Carboxymethylcellulose-Säule (1,3 x 18 cm) aufgetrennt
(die CM-Cellulose-Säule wird vorher mit 0,05 molarer
Triäthanolamin-Salzsäure-Lösung pH 8,5 äquilituriert). Die
Entwicklung bis zur Fraktion 106 (eine Fraktion entspricht 5,4 ml) wird bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 11 ml/
Stunde mit 0,05 molarer Triäthanolamin-Salzsäure-Lösung pH 8,5 vorgenommen, von der Fraktion 107 ab bis zur Fraktion
300 mittels eines linearen Gradienten aus 500 ml 0,05 molarer Triäthanolamin-Salzsäure-Lösung pH 8,5, die 0,1 Mol Natriumchlorid
enthält, und 500 ml 0,05 molarer Triäthanolamin-
SaIζsäure-Lösung pH 8,5. .
+) durch entsprechendes Zusammen-
. » schlitten
Aus den 300 ursprünglichen Fraktionen werden/7 Fraktionen
mit steigender Basizität und mit folgenden Hemmaktivitäten, herausgezogen:
Fraktion A 4,2 % C3 6,6 %
B 17,5 % C4 22,0 %
C1 10,5 % D 5,4 %
C0 22,5 % :
2 88,7 %
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Die einzelnen Inhibitor-Fraktionen werden mit wenig Eisessig auf pH 5 eingestellt, im Vakuum-Rotationsverdampfer auf
l/lO ihres Ausgangsvolumens eingeengt, über eine Säule aus
einem Molekularsieb-Material auf Polyacrylamid-Basis
Bio-Gel P-2 (51,5 x 2 cm) entsalzt und gefriergetrocknet.
Rechromatographie der Fraktionen Cp und C-
Die beiden Fraktionen Cp und C* werden jeweils in 10 ml des
im vorigen Absatz erwähnten Äquilibrierpuffers gelöst, auf die CM-Cellulose-Säule gebracht und diese mit dem linearen
Gradienten gemäss der beschriebenen Auftrennung in die einzelnen Inhibitoren entwickelt.
Es werden von den beiden Fraktionen jeweils die beiden Unterfraktionen
Cpa und Cp-J3 sowie C, und C^ gewonnen. Die
Konzentrierung und Entsalzung der Unterfraktionen wird wie im Vorausgehenden beschrieben ausgeführt. Auch diese Fraktionen
werden gefriergetrocknet.
Isolierung mittels wasserunlöslicher Trypsinharze
1 kg Seeanemonen werden in 3 1 destilliertem Wasser homogenisiert und zentrifugiert. Der Überstand wird mit 300 ml 0,4 molarem
NatriumcbJori d und 0,1 molarem Triäthanolaminhydrochlorid
pH 8,0 versetzt. In dieser Extraktionslösung werden bei 4°C 5 g wasserunlösliches Trypsinharz, das mit einer Lösung aus
0,1 molarem Triäthanolamin pH 8 und 0,4 Mol Natriumchlorid gewaschen wurde, eine Stunde suspendiert und anschliessend
zentrifugiert. Der Inhibitor-Trypsinharz-Niederschlag wird
dreimal in der vorerwähnten Triäthanolamin-Natriumchlorid-
309829/0609
Ma 146
- 13
Pufferlösung gewaschen und bei 3000 U/rain 2 Minuten zentrifugiert.
Dabei sedimentiert nur das Harz, nicht auch die mitgeschleppten feinen Schwebeteilchen. Das Sediment wird
jeweils in 100 ml einer eisgekühlten 0,4 molaren Kalium- . chlorid-Salzsäure-Lösung pH 2,0 mehrmals suspendiert und
zentrifugiert. Die Überstände werden vereinigt, sie enthalten 90 % des vom Trypsinharz gebundenen Inhibitors. Die Inhibitor-Lösungen
werden mit 0,1 normaler Natriumhydroxid-Lösung neutralisiert, im Vakuum-Rotationsverdampfer bei 200C Badtemperatur
konzentriert, über eine Bio-Gel P-2=Säule entsalzt und gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität des gefriergetrockneten
Produktes beträgt 2,0 IU/mg, diese entspricht einer Anreicherung um das 2000-fache, bezogen auf den Inhibitorgehalt
meerwasserfeuchter Seeanemonen.
Eine weitere Reinigung wird in .einer Sephadex G-50=Säule, die
mit einer Lösung aus 0,1 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0
und 1 molarem Natriumchlorid äquilibriert wurde, erzielt. Durch Gefriertrocknung des entsalzten Eluates werden glänzende
farblose Blättchen mit einer spezifischen Aktivität von 3»3 IU/mg gewonnen.
309 829/0609
Claims (1)
- Ma 146- 14 -Patentansprüche1. Polyvalente Isoinhibitoren aus Seeanemonen.*£.' Polyvalente Isoinhibitoren für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine , dadurch gekennzeichnet, dass sie die nachstehende Aminosäurezusammensetzung besitzen:
Aminosäure Anzahl Moleküle Asparaginsäure 6 Thi-eonin 1 Serin 3-5 Glutaminsäure 4-5 Prolin '2-3 Glykokoll 6-7 Alanin 2 Cystein 6 Valin 4 Isoleucin 1-2 Leucin 2-3 Tyrosin 3 Phenylalanin 2-3 Lysin 3-4 Histidin 1-2 Arginin 5-7 dass deren aktive Zentren Arginylreste enthalten und frei von Lysylresten sind, dass deren Molekulargewichte zwischen 5.500 und 7.OOO, vorzugsweise zwischen 6.000 und 6.6OO liegen, und dass sich deren isoelektrischen Punkte zwischen-pH 6.0 und pH 9.5 befinden.309829/0609Ma3* Polyvalenter Isoinhibitor für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine entsprechend Anspruch 2, gekennzeichnet durch die nachstehende Aminosäurezusammensetzung:Asparaginsäure ·. 6 Threonin 1 Serin 5 Glutaminsäure VJl Prolin 3 Glykokoll 6 Alanin 2 Cystein 6 Valin 4 Isoleucin 2 Leucin 2 Tyro sin 3 Phenylalanin 2 Lysin 4 Histidin 2 Arginin VJl und ein Molekulargewicht von etwa 6484.4. Polyvalenter Isoinhibitor für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine entsprechend Anspruch 2, gekennzeichnet durch die nachstehende Aminosäurezusammensetzung:Asparaginsäure 6Threonin 1Serin . 4Glutaminsäure 5 'Prolin · 3Glykokoll 7309829/0609Ma- 16 -Alanin 2 Cystein 6 Valin 4 Isoleucin 2 Leucin 2 Tyrosin 3 Phenylalanin 3 Lysin 4 Histidin 1 Arginin 6 und ein Molekulargevacht von etwa 6620. 5. PolyvalenterIsoinhibitor . für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine entsprechend Anspruch 2, gekennzeichnet durch die nachstehende Aminosäurezusammensetzung:Asparaginsäure 6 Threonin 1 Serin 3 Glutaminsäure 5 Prolin 2 Glykokoll 7 Alanin 2 Cystein 6 Valin 4 Isoleucin 2 Leucin 3 Tyrosin 3 Phenylalanin 3 Lysin 3 Histidin 1 Arginin 7 uiti ein Molekulargewicht von etwa 6577·309829/0609Ma- 17 -6. Polyvalenter Isoinhibitor ·. für Trypsin, Chymotrypsin,Plasmin und Kallikreihe entsprechend Anspruch 2, gekennzeichnet durch die nachstehende Aminosäurezusammensetzung:Asparaginsäure 6Threonin 1Serin 4Glutaminsäure 4Prolin 2Glykokoll 6Alanin 2Cystein 6. Valin 4Isoleucin 1Leucin 2Tyrosin ' 3Phenylalanin 3Lysin 3Histidin 1Arginin 6 und ein Molekulargewicht von etwa 6095.7. Verfahren zur Isolierung von polyvalenten Isoinhibitoren für Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikreine, dadurch gekennzeichnet, dass der aus einem durch Extraktion von Seeanemonen und Fällung des Extraktes gewonnene Niederschlag durch in der Eiweiss-Chemie bekannte vorzugsweise chromatographische" Methoden fraktioniert wird oder durch Adsorption an Trypsinharz und· anschliessende Desorption angereichert und isoliert wird.309829/0609Ma 146- 18 -8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ma η. zur Auftrennung in Unterfraktionen das gemäss Anspruch 7 erhaltene Gemisch von Isoinhibitoren ein- oder mehrmals unter entsprechenden Bedingungen rechromatographiert.309829/0609 '
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