DE3927139A1 - Verwendung von proteasen zur extraktion und reinigung von ferritin - Google Patents
Verwendung von proteasen zur extraktion und reinigung von ferritinInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von
Proteasen bei der Extraktion und Reinigung von Ferritin.
Extrahiert wird das Ferritin aus biologischen Materialien
wie z. B. Kulturüberständen, Mikroorganismen und
insbesondere Organextrakten. Als Organextrakte sind
Milzextrakte gebräuchlich, da darin hohe Konzentrationen
von Ferritin zu finden sind. Als proteolytische Enzyme
sind die bekannten und vielfach auch handelsüblichen
Proteasen einsetzbar.
Ferritin ist ein Eisenprotein vom Molekulargewicht
465 000 Daltons, das meist durch Extraktion von Pferde-
oder Rindermilz gewonnen wird.
Nach Reinigung und Formulierung des Ferritins wird
dieses als Arzneimittel zur Therapie von Eisenmangelkrankheiten
eingesetzt.
Die bekanntgewordenen Isolierungs- und Reinigungsverfahren
sind unter anderem bei R. R. Crichton, Angew.
Chemie, 85 (1973), 53-62, beschrieben.
Ferritin ist relativ beständig gegen hohe Temperaturen,
kann bei 35%iger Ammoniumsulfatkonzentrationen gefällt
und aus 5%iger Cadmiumsulfatlösung einfach kristallisiert
werden.
Nachteile des beschriebenen Isolierungsverfahren sind
die Toxizität des verwendeten Cadmiumsulfates und eine
mäßige Reinheit des isolierten Ferritins. Ferritin aus
Rindermilz kann auf diesem Wege gar nicht hergestellt
werden.
Ein weiteres Isolierungsverfahren für Ferritin wurde von
J. W. Drysdale, Biochem. J., 141 (1974), 627-632, beschrieben.
Dabei wird Ferritin bei pH-Werten von 6-8 und
einer Leitfähigkeit der Lösung von ca. 10 ms/cm-1 an
anionischen Ionenaustauschern, wie z. B. der DEAE-Cellulose
oder der DEAE-Sephadex A 50, gebunden und gereinigt.
1 g der Ionenaustauscher binden jedoch nur 1-5 mg
Ferritin (D. M. Marcus und N. Zinberg, Arch. Biochem.
Biophys., 162 (1974),. 403-501). Wegen der geringen Kapazität
der DEAE-Cellulose-Austauscher für Ferritin werden
jedoch vergleichsweise große Mengen an DEAE-Cellulose
benötigt.
Bei Versuchen mit reinem Ferritin wurde überraschenderweise
gefunden, daß Ferritin von proteolytischen Enzymen
tierischen, pflanzlichen und bakteriellen Ursprungs
nicht abgebaut wird.
Das nach Proteasenzusatz isolierte Ferritin-Molekül
gleicht in seinem physikalischen Verhalten (HPLC,
Elektrophorese) dem nativen Ferritin. Damit ergibt sich
die Möglichkeit, Ferritin in seinen Lösungen unter Zusatz
löslicher oder trägergebundener proteolytischer
Enzyme durch Abbau der verunreinigenden Proteine zu
reinigen. Ferritin und die Abbauprodukte sind auf Grund
der unterschiedlichen Molekulargewichte einfach, z. B.
durch Ultrafiltration oder Fällung mit Salzen, trennbar.
Die proteolytischen Enzyme werden als käufliche Enzyme
ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die Tabelle 3 enthält
eine Liste verwendbarer Proteasen.
Gibt man die obengenannten proteolytischen Enzyme einzeln oder
als Mischung bereits zur wäßrigen Ferritin-Extraktion
aus Milz hinzu, können überraschenderweise auch die Ausbeute
sowie die Reinheit und das Lösungsverhalten (Konzentration
von polymerem Ferritin) des isolierten Ferritins
beträchtlich verbessert werden. Möglicherweise wird
zusätzliches Ferritin durch die zugesetzten Proteasen
aus unvollständig zerkleinerten Organkompartmenten oder
aus Peptidbindungen freigesetzt und damit die Ferritinmengen
pro kg Organ gegenüber den bekannten Verfahren
erhöht.
Damit können vor allem Milzen mit niedrigem Ferritingehalt
wirtschaftlich verarbeitet werden. Vorteilhafterweise
wird auch die Menge des Milzrückstandes
durch die Proteasenbehandlung um ca. 40% reduziert und
damit die Organabtrennung wesentlich erleichtert.
Die durch Filtration nur schwer klärbaren Trübungen
werden mit der Proteasenbehandlung beseitigt und die
Reinigung und Konzentrierung mittels Ultrafiltration
wesentlich erleichtert.
Die zugesetzten Proteasen können durch Hitzebehandlung,
Ultrafiltration oder Fällung mit Salzen vollständig
vom Ferritin abgetrennt werden.
Das beschriebene Verfahren ist technisch einfach durchführbar
und nutzt die begrenzt verfügbaren tierischen
Organe besser aus.
Das Verfahren läßt sich schematisch wie folgt beschreiben
50 g gefrorene, zerkleinerte Rindermilz werden mit je
1 g proteolytischem Enzym (ca. 18 000 Proteolytic
units/g Milz) aus Tabelle 1 mit 50 ml Wasser 2 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Die Organreste werden, eventuell
unter Zusatz von Filterhilfsmitteln abzentrifugiert,
abfiltriert oder abgepreßt. Die Ferritin enthaltende
Lösung wird durch Ultrafiltration über eine Membran
der Molekulargewichtstrenngrenze 100 000-500 000
Daltons konzentriert und Ferritin unter Zusatz von
Natriumsulfat gefällt.
Der Ferritin-Niederschlag wird in einer Zentrifuge oder
einem Separator von der überstehenden Lösung abgetrennt.
Der Ferritin-Niederschlag wird in Wasser gelöst, der pH-
Wert mit NaOH oder NH₃ auf 6-8 eingestellt, über eine
Ultrafiltrationsmembran konzentriert und abschließend
sprüh- oder gefriergetrocknet.
Der Eisen-Gehalt des Ferritin-Pulvers wird mittels Atomabsorption
geprüft. Es werden die in Tabelle 1 angegebenen
Eisenwerte gefunden.
Das Ferritin-Pulver wird ferner auf seine Einheitlichkeit
mittels HPLC untersucht. Im Vergleich zum einen
durch Cadmiumsulfat-kristallisierten Ferritin-Standard
(Abb. 1b) wird nach Proteasen-Zusatz ein vergleichbar
guter Ferritin-Wirkstoff enthalten (Abb. 1a).
Die Ausführung erfolgt mit Pferdemilz wie in Beispiel
1. Die Auswertung der Versuche ist in Tabelle 2
wiedergegeben.
Säule = LKB Ultropac TSK G 4000 SW (7,5×600 mm)
Temperatur: 25°C
Medium: 0,07 M KH₂PO₄, pH 6,8+0,02% NaN₃
Fluß: 0,8 ml/min
Wellenlänge: 280 nm
Injiziertes Volumen: 20 µl
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Medium: 0,07 M KH₂PO₄, pH 6,8+0,02% NaN₃
Fluß: 0,8 ml/min
Wellenlänge: 280 nm
Injiziertes Volumen: 20 µl
Die Abb. 1a zeigt eine HPLC-Analyse von Rinder-Ferritin,
welches mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt
wurde.
| Peak 1. Verunreinigung | |
| 1,2 Flächenprozent | |
| Peak 2. "Dimeres" Ferritin | 11,1 Flächenprozent |
| Peak 3. "Monomeres" Ferritin | 87,6 Flächenprozent |
| Peak 4. Verunreinigung | 0,2 Flächenprozent |
Die Abb. 1b zeigt als Vergleich die HPLC-Analyse von
einem Rinder-Ferritin-Standard
| Peak 1. Verunreinigung | |
| 2,0 Flächenprozent | |
| Peak 2. "Dimeres" Ferritin | 12,7 Flächenprozent |
| Peak 3. "Monomeres" Ferritin | 77,3 Flächenprozent |
| Peak 4. Verunreinigung | 2,9 Flächenprozent |
| Peak 5. Weitere Verunreinigungen | 4,5 Flächenprozent |
Claims (2)
1. Verwendung von Proteasen bei der Extraktion und
Reinigung von Ferritin aus biologischen Materialien.
2. Verwendung von
Papain aus Carica papaya,
Maxatase,
Alkalische Protease,
Fungal Protease,
Neutrale Protease,
Optimase,
HT-Proteolytic,
Gelatinase,
Trypsin aus Rinderpankreas,
α-chymotrypsin aus Rinderpankreas oder
Pronase P aus Streptomyces
bei der Extraktion und Reinigung von Ferritin aus biologischen Materialien.
Papain aus Carica papaya,
Maxatase,
Alkalische Protease,
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Neutrale Protease,
Optimase,
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Gelatinase,
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