HU185454B

HU185454B - Process for seperating endoprotinase-lys-c

Info

Publication number: HU185454B
Application number: HU812609A
Authority: HU
Inventors: Juergen Schrenk; Peter Wunderwald
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1980-09-10
Filing date: 1981-09-09
Publication date: 1985-02-28
Also published as: DE3034045C2; ES504834A0; BE890259A; NO161684B; LU83627A1; DK369781A; SE8104840L; DK151635B; NO813068L; NO161684C; FI76374C; GB2083477B; IT1138134B; NL186645C; ATA303781A; FR2489838B1; IT8123351A0; NL8103540A; CA1172979A; JPS5779884A

Description

Különböző célokra, főleg proteinok és peptidek, például a szekvenciameghatározás keretében végzett célzott hasítására technikai és tudományos érdekességűek olyan endoproteinázok, amelyek valamilyen meghatározott helyen hasítanak. Gombákból ismert már egy, a peptidkötést a lizin C-terminális végén hasító endoproteináz. Ez az enzim azonban nehezen hozzáférhető, és ezért nem áll kívánt mennyiségben rendelkezésre. Most találtunk egy hasonló specifitású enzimet baktériumokban, amelyet endoproteináz-Lys-C-ként jellemeztünk, és amely más bakteriális proteázoktól tulajdonságaiban jelentősen különbözik.

A baktériumokból nyert, találmány szerinti új endoproteináz-Lys-C-re jellemző, hogy egy 35000-38000 Dalion molekulasúlyú láncból áll, pH-optimuma pH 7,7nél van, és aprotinin gátolja, a₂-mahoglobulin, ai-aníitripszin és etilén-diamin-tetraecetsav viszont nem gátolja.

A találmány szerinti enzim nem redukáló körülmények között aggregálódásra hajlamos, mikoris előnyösen körülbelül 150000 Dalion molekulasúlyú tetramerek és körülbelül 300000 Dalton molekulasúlyú oktamerek képződnek, amelyek enzimatikusan aktívak.

Az ríj enzim pH-optimuma - amint már említettük 7,7 pH-nál van 37 °C-on az azokoll-módszerrel meghatározva. [J. Bact. 97, 524 (1966)].

Elektrofókuszálásnái az enzim számos sávra hasad fel, amelyek csaknem a teljes pH-taríományra kiterjednek. Ez a viselkedés arra enged következtetni, hogy glükoproteinről van szó; az enzim izoelektromos pontja ezért nem határozható meg.

Amint már említettük, a₂-makroglobulin, Qj-antitripszin és etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) 10² mól/ liter koncentrációig nem gátolnak. Benzamidin ellenben 2,5 mmól/1 koncentrációnál körülbelül 50 %-ot gátol; a benzamidin-koncentráció emelésével 70 %-os gátlás érhető el. Teljes gátlást a protinin okoz.

Az új enzim szubsztrátspecifitását az 1. táblázat mutatja. Fajlagos aktivitása tozii-glicii-prolil-lizil-(p-nitro)anüiddel mérve 25 °C-on körülbelül 25 egység/mg vagy körülbelül 50 azokoll-egység/mg enzim 37 ’C-on.

A Lysobacterből nyert proteináz Il-vel ellentétben a találmány szerinti enzim nem a lizin amino-végén, hanem a karboxil-végén hasít. A nagy specifitást mutatja a sávok kis száma is, amelyek az ezen enzimmel kapott fibrin hasítási termékek gélkromatográfiájánál fellépnek.

A találmány szerint az említett enzimet úgy nyerjük ki, hogy az ezen enzimet kielégítő mennyiségben termelő mikroorganizmusok, főleg a Lysobacterales rendbe és itt előnyösen a Lysobacteraceae családba, például a Lysobacter (amelyet Myxobacter-nak is neveznek) nemzetségbe tartozó baktériumtörzs megszűrt és/vagy kívánt esetben előtisztított tenyészfolyadékát hordozóhoz kötött a₂-makroglobulin-fémkomplexen kromatografáljuk és az enzimet a szürletböl kinyerjük. Az előtisztítást szokásos enzimtisztítási módszerekkel, például ammónium-szulfátos frakcionálással, acetonos frakcionálással és molekulaszűrős kromatografálással végezzük, így megszabadítjuk a legtöbb szennyeződéstől. Az új enzimtisztítási eljárási lépésnek a során a nehezen eltávolítható szennyeződések, de főleg a kísérő proteázok leválnak, míg a találmány szerinti endoproteináz-Lys-C oldatban marad, és innen elkülöníthető.

7. táblázat

Endoproteináz-Lys-C szubsztrátspecifitása

Azokoll	+
Kazein	+
Fibrinogén	+
Hemoglobin	+
TLME	+L
Chromozym PL^R	++
S 2251^R	++
Tozil-arginin-metil-észter	—
Chromozym TH^R	—
BAEE	—
Leucin-p-nitro-anilid	—
Lizin-p-nitro-anilid	—
ATEE	-
Inzulin B-lánca

Rövidítések:
TLME	= tozil-lizin-metil-észter
BAEE	= benzoil-arginin-etil-észter
ATEE	= arginin-tirozin-etil-észter
Chromozym PL^R	= tozil-glicil-prolil-lizin-p-nitroanilid
Chromozym TH^R	= tozil-glicil-prolil-arginin-p-nitroanilid
S2251^r	- valil-leucil-lizil-p-nitro-anilid.

A fent említett a₂-makroglobulin-fémkomplexben a fém a Zn, Co, Ni és/vagy Cu csoportból valamilyen kétértékű fém. Ezen komplex alkalmazását és előállítását az egyidejűleg benyújtott 30 34 043.3 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali irat ismerteti részletesebben.

Amint már említettük, közvetlenül a tény észfolyadékból kiindulva elvégezhető a hordozóhoz kötött a₂makroglobulin-fémkornplexszel történő találmány szerinti kezelés. Célszerűbb azonban a proteineket előbb más anyagoktól elválasztani, és eló'frakcionálást végezni.

185 454

2. táblázat

A 2. táblázat mutatja a találmány szerinti enzim eltéréseit Lyscbacterben eddig talált proteázoktól

	EC-szám	Molekulasúly	Reakciómechanizmus	Specifitás
α-litikus proteináz	3.4.21.12	20 000 D	szerin-proteáz	semleges aminosavak karboxilcsoportja, kivéve alanint
(3-litikus proteáz		19 000 D	Zn-metalloproteináz	hidrofób aminosavak karboxilcsoportja; oldja a bakteriális sejtfalakat
AL-I proteináz I	3.4.99.29	9 000 D (gélszűréssel), 14 000 D (ülepedési állandóból)	ismeretlen	hidrofób aminosavak, oldja a bakteriális sejtfalakat (különösen gram-pozilívakat)
AL-I proteináz II	3.4.99.30	17 000 D	ismeretlen	lizin aminocsoportja
Endoprpteináz-Lys-C		36-38 000 D (red. SDS-gél), kb. 35 000 D (Sephacryl S-300)	szerin-proteáz	lizin karboxilcsoportja

A proteineknek a tenyészfolyadék szűrletéből való leválasztása célszerűen ammónium-szulfáttal végzett kicsapással történik, bár más szokásos protein-lecsapószerek is használhatók, amelyek a benne lévő aktív proteinek enzimaktivitását nem befolyásolják. Ammóniumszulfát hozzáadásakor ezt célszerűen 2,5-3,5 mólos, 35 előnyösen 3—3,2 mólos koncentrációig alkalmazzuk.

Az ekkor képződő csapadékot elválasztjuk, például szűréssel, és ez tartalmazza az összes keresett aktivitást. Vízzel való feloldás és a maradék ammónium-szulfát célszerűen dialízissel történő eltávolítása után az így kapott 40 oldatot vagy az a₂-makroglobulin-fémkomplex-kroniatografálásnak vetjük alá, vagy további előtisztítást hajtunk végre.

Ha további előtisztítás kívánatos, akkor célszerűen ammónium-szulfátos frakcionálási végzünk, ahol a 2 és 45 3 mólos ammónium-szulfát koncentráció között kiváló frakció tartalmazza a kívánt aktivitást. Ekkor célszerűen első fokozatban 0,7-1,3 mólig adunk hozzá ammóniumszulfátot, a csapadékot leválasztjuk, és utána 3 mólra, előnyösen 2,25—2,32 mólra növeljük az ammónium- 50 szulfát koncentrációját, és az akkor kapott aktív csapadékot szokásos módon leválasztjuk, és a visszamaradt ammónium-szulfáttól dialízissel megtisztítjuk.

Amennyiben az így kapott oldatot nem vetjük alá az a₂-makroglobulin-fémkomplexes kezelésnek, végez- 55 hető még egy acetonos frakcionálás, és közbeiktatható egy molekulaszűrőn végzett kromatografálás is. Acetonos frakcionálás esetében 0,3-1,5 térfogat,-előnyösen 0,5-1,2 térfogat aceton hozzáadásával végezzük a lecsapást, a csapadékot leválasztjuk, és további 1,2 tér- 60 fogat acetont adunk hozzá, a csapadékot ismét leválasztjuk, és ezt 7,5—9 pH-jú pufferban oldjuk. A puffer koncentrációja célszerűen 0,01 és 0,05 mólos közötti. A maradék aceton eltávolítására szolgáló dialízis és a kapott oldat esetleges töményítése után valamilyen molekula- 65 szitán, például térhálósított dextránon, például Sephadex-G-100-οη kromatografálunk, amikor a kívánt aktivitást a kezdetkor eluáljuk az oszlopról, míg az ismert Al-1 proteináz I csak a vége felé eluálódik. Az eluátumot esetleges töményítés után hordozóhoz kötött a₂-makroglobulin-fémkomplexen kromatografáljuk, amikor a keresett endoproteináz-Lys-C átfut az oszlopon. Az eluálás célszerűen 7,0-8,5 pH-tartományban 0,03—0,08 mólos pufferkoncentrációnál történik. A szokásos, ebben a tartományban hatásos pufferanyágok megfelelők, előnyös a tris-puffer, IlEPES-puffer, [4-(2-hidroxi-etil)-lpiperazin-etán-szulfonsav] és foszfát-puffer. Jó eredményeket értünk el 6,5—9 pH-nál és 0,01—0,1 puffertartalomnál. Az eluátum tiszta endoproteináz-Lys-C-t és puffért tartalmaz, és közvetlenül liofilizálható.

A találmány szerinti új enzim főleg proteinek és peptidek szekvenciameghatározására használható. Nagyon fajlagos hasítási képessége alapján gyógyászatilag is alkalmazható, például véralvadási zavaroknál, illetve olyan más betegségeknél, amelyeknél proteinláncok hasítása szükséges,

A következő példák szemléltetik a találmány szerinti enzim kinyerését és meghatározását.

Az 1. példában az Endoproteináz-Lys-C kinyerésére kiindulási anyagként alkalmazott baktérium-tenyészfolyr.dék szűrletet a következőképpen kapjuk.

Az R. S. Wolfe-tól [Dept. of Mikrobiology, University of Illinois, Urbana/USA] származó és ATCC 27796, ill. DMS 1895 sz. alatt hozzáférhető organizmust 1 %-os Difco-élesztőkivonatból álló közegre vive ampullákban folyékony nitrogénben tároltuk, illetve ugyanilyen közeggel és adalékként 1,5 % agarral rendelkező ferde csövecskékbe, illetve agarlemezekre viszünk, legalább 7 napos átoltási ritmust tartva.

Szilárd táptalajon tartott kultúrákból kiindulva, az

185 454 organizmust folyékony közegen tenyésztjük, eközben az inokulum-térfogat 1—10%.

A főkultúrában levegőztetés közben (0,2-1,0 térfogat közegtérfogat) 30 °C-on erőteljes keverés közben pH 7,2—7,8-nál, előnyösen pH = 7,4-nél körülbelül 18— 24 órán át fermentálunk.

A sejteket centrifugálással elkülönítjük és az így kapott tenyész-felülúszót az enzim elkülönítésére alkalmazzuk.

1. példa

Endoproteináz-Lys-C kinyerése Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM1895 (ATCC 27796)-ból.

Kiindulási anyag: 206 liter Lysobacter tenyészfolyadék-szűrlet.

206 liter Lysobacter tenyészfolyadék-szűrletet lassan telítünk 3—3,2 mólosig szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával. A kevés pelyhes csapadékot kiszűrjük. A szűrőn maradó csapadékot kevés desztillált vízzel oldjuk, cs szilárd ammónium-szulfáttal 0,9 mólosra (1,3-3 mól) telítjük, és centrifugáljuk. A felülúszót tovább telítjük ammónium-szulfáttal 2,25—2,32 mólosra, és a csapadékot kiszűrjük vagy centrifugáljuk, majd körülbelül 400 ml desztillált vízzel oldjuk, és áramló csapvízzel dializáijuk.

A dializátumot 0,5-1,2 térfogat —20 °C-os acetonnal elegyítjük, és centrifugáljuk. A (tiszta) felülúszót további 1,2 térfogat (a kiindulási térfogatra számítva) acetonnal elegyítjük, a csapadékot centrifugáljuk, és a lehető legkevesebb 0,025 mólos, 9 pH-jú tris-pufferban oldjuk, és 10 liter ugyanilyen puffénál szemben dializáijuk.

A dializátumot egy Sephadex-G-100 töltetű oszlopba öntjük, amelynek méretei a következők:

átmérő: 5 cm; hossz: 150 cm; oszloptérfogat: körülbelül 2,9 liter.

Az oszlopot 0,025 mólos, 9 pH-jú trisz-pufferra! egyensúlyba hozzuk, és az anyag betöltése után ugyanilyen pufferral mossuk.

A Lysobacter-proteáz az elején eluálódik.

Az eluátumot szilárd ammónium-szulfáttal 3,2 mólosig telítjük, és centrifugáljuk. A csapadékból készített tömény oldatot 0,05 mólos 8,0 pH-jú tris-pufferral szemben dializáijuk. ‘

A további tisztításra agarózhoz kovalensen kötött a₂makroglobulin-cink-komplexet használunk. Egy 3 cm átmérőjű, 17,5 cm hosszú oszlopba 110 ml ilyen hordozót töltünk, és 0,05 mólos, 8,0 pH-jú tris-pufferral addig mossuk, amíg az átfolyóban már nincs protein.

Ezután feltöltjük a dializátumot, és 0,05 mólos, 8,0 pH-jú tris-pufferral utánamossuk. A proteináz-Lys-C átmegy.

Az átfolyót 0,05 mólos 8,0 pH-jú glicin-pufferral szemben dializáijuk, és 0,4 mgjml-re hígítjuk ugyanezzel a pufferral, és liofilizáljuk.

Össz-kitermelés: körülbelül 50—140 mg protein, 6— 23 egység/mg proteináz-Lys-C, Chromozym TH aktivitás < 0,2 %.

példa

A z endopro teináz-Lys-C meghatározása.

Az oldatok elkészítése:

1. 0,025 mólos tris, 0,001 mólos EDTA, pH 7,7.

0,303 g trist, 37,2 mg EDTA-t körülbelül 80 ml kétszer desztillált vízben oldunk, és a pH-t 2 n sósavoldattal 7,7-re állítjuk, és 100 mi re feltöltjük.

2. Chromozym-PL (14 pmól/ml).

mg Chromozym-PL-t 1 ml kétszer desztillált vízben oldunk.

3. Endoproteináz-Lys-C oldat.

mg liofilizátumot 1 ml készer desztillált vízben oldunk. Használat előtt az 1. oldattal 1 ·. 100-ra hígítunk.

Kivitelezés: 405 nin, 1 cm félmikroküvetta.

°C, teszt-térfogat 1,07 ml.

A küvettába bepipettázunk:

Imi 1. oldatot,

0,05 ml 2. oldatot, összekeverjük, és körülbelül 2 percig 25 °C-on temperáljuk.

Hozzáadunk 0,02 ml 3. oldatot, összekeverjük, és a lineáris fázisból körülbelül 5 perc múlva a ΔΕ/perc-t mérjük.

Számítás:

ΔΕ/perc X 1,07

-íETvTfTó--X 100 = egység/ml endoproteináz10,4X0,0. _LysC

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás endoproteináz-Lys-C enzim - amely enzim 35000-38000 Dal tón molekulasúlyú láncból áll, pH optimuma 7,7-nél van, és aprotinin gátolja, viszont a₂makroglobulin, -antitripszin és etiién-diamin-tetraecetsav nem gátolja — kinyerésére, azzal jellemezve, hogy valamilyen Lysobacterales rendbe tartozó baktériumtörzs megszűrt és/vagy kívánt esetben előtisztított tenyészfolyadékát hordozóhoz kötött a₂ -makroglobulinfémkoniplexen kromatografáljuk, és az enzimet a szűrletből kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0,01-0,1 mólos, 6,59 pH-jú pufferban kromatografálunk.

Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796) törzs tenyészetéből származó tenyészfolyadékot használunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal, jellemezve, hogy a tenyészfolyadék előtisztítása során megszűrt tenyészfolyadékból a proteint ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a csapadékot újraoldás után 1,3 és 3 mól ammőniiirh-'szulfát konpentráció kö4 zöít frakcionáljuk, és az ezen tartományban oldhatatlan frakciót vízben feloldjuk, és dialízis után acetonnal 1,2 és 2,4 térfogatnyi acetonmennyiség között frakcionálva kicsapjuk, cs kívánt esetben feloldás után molekulasúly szerint a kíséröanyagoktól elválasztjuk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás fojjanatosítá^s> módja, azzal jellemezve, hogy az acetonos frikcionátói csapadékát feloldás után valamilyen molekul^gzitán, előnyösen térhálósított dextránon kromatografáljukÁbra nélkül