KR20220086127A - 리크테이미아 라모사 3t-4를 이용한 약주용 발효제, 이의 제조방법 및 사용 - Google Patents

리크테이미아 라모사 3t-4를 이용한 약주용 발효제, 이의 제조방법 및 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리크테이미아 라모사 3T-4를 이용한 약주용 발효제, 이의 제조방법 및 사용에 관한 것으로, 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주는 우수한 전분 분해능을 가지면서 동시에 프로테아제 활성은 낮은 약주용 곰팡이로서 아미노산 성분에 의한 이취 등의 문제에 대하여 우려가 적어 보다 관능 특성이 우수한 고품질의 약주를 제조할 수 있는바 국산 약주의 고품질화를 위한 종균이 확보되는 유용한 효과가 있고, 또한 상기 약주용 곰팡이의 배양학적 특성, 접종량, 원료, 제국기간, 부형제, 건조방식 등의 세부 조건을 최적화하여 보다 우수한 약주용 발효제가 제공되는바, 국산 약주의 품질을 개선하여 고품질 약주가 제공되는 유용한 효과가 있다.

Description

리크테이미아 라모사 3T-4를 이용한 약주용 발효제, 이의 제조방법 및 사용{Fermenting agent for Yakju using Lichtheimia ramosa 3T-4, preparation method and use thereof}
본 발명은 리크테이미아 라모사 3T-4를 이용한 약주용 발효제, 이의 제조방법 및 사용에 관한 것이다.
우리나라의 대표적 발효주인 전통주는 미생물에 의해 탄수화물이 분해되면서 알코올을 비롯한 여러 가지 성분이 생기는 발효 음료로서, 가장 대표적인 것이 약주와 탁주이다. 발효주로서의 약주와 탁주는 전통적으로 곡류와 누룩을 넣고 발효시켜 제조되며, 당화와 알코올 발효가 동시에 일어나는 병행복 발효주이다. 양조 후, 술덧을 체로 걸러서 외관이 백탁한 것이 탁주 또는 막걸리이고, 술덧에 용수를 받아서 맑은 액만 여과하여 취한 것이 약주이다.
약주의 제조과정 중 발효제로 사용되는 누룩은 밀이나 보리, 쌀 등의 곡류를 갈아서 여기에 약 25% 정도의 물을 추가하여 반죽하고 성형한 다음 자연적으로 발효시켜 제조한다. 따라서, 당화제의 역할만 하는 일본의 입국과는 달리, 발효주는 환경으로부터 유래된 다양한 미생물이 자연적으로 착생하여 생육된 누룩을 이용하여 제조된다. 누룩은 생산된 지역의 기후나 풍토, 제조 환경 등에 따라 특색이 달라지는데, 누룩에 함유된 곰팡이와 효모에 의해 생성되는 당류, 유기산, 아미노산의 종류와 함량이 달라지고, 다양한 휘발성 향기성분 역시 다양하게 나타난다. 결국, 누룩 미생물의 다양성은 효소활성, 알코올 발효력, 유기산과 유리아미노산 함량 등에서 차이를 나타내고 이는 전통 발효주의 맛, 향기, 색 등의 품질 특성에 영향을 준다.
특히, 주류의 숙성 중에는 산화, 가수분해, 탈수병합 등의 다양한 화학반응이 관여한다. 당과 아미노산의 마일라드 반응에 의해 생성된 일부 카르보닐 화합물 및 피라진류는 주류를 오래 저장했을 때 발생하는 이취 및 탄내 등을 유발하며, 주류의 색도 변하게 만든다. 또한, 아미노산의 광산화에 의해서 생성된 인돌 화합물 및 하만 화합물은 주류의 색을 갈변시킨다. 아미노산의 변화로 만들어지는 폴리설파이드 화합물은 주류에 좋지 않은 냄새를 부여하기도 한다.
쌀과 입국으로 만든 일본 청주의 경우에는 장기간 숙성 시 발생하는 이취 성분으로서 이소발레릭 산, 에틸-이소발레릭 산 또는 1, 1-다이에톡시-3-부탄 등이 확인된 바 있다. 청주의 고급 알코올류인 아이소아밀 알코올은 발효제로부터 유래하는 효소(알코올 디하이드로게네이즈)적 산화에 의해 이소발레르알데히드가 된다. 이는 다시 산화되어 이소발레릭 산이 되고, 여기에 에틸기가 결합되어 에틸-이소발레르알데히드가 생성된다. 이후로 산화가 더욱 진행되면 1, 1-다이에톡시-3-부탄이 생성된다. 그리하여, 청주의 숙성과정 중 이러한 이취를 제어하기 위해 일본에서는, 쌀을 도정하여 전구체 물질을 제거하거나, 숙성 전 활성 숯으로 이취 성분을 흡착시키거나, 노향을 적게 생성하는 효모를 개발하는 등 여러 가지 노력을 기울이고 있다(Ko JS. Fun and easy to understand brewing Engineering. Yuhansa, Seoul, Korea. pp. 218-219 (2008)).
우리나라 약주에도 쌀, 밀 등의 다양한 전분질 원료를 사용하고 누룩에는 다양한 미생물과 효소가 있는데, 예를 들어 곰팡이에 존재하는 펩티다아제 등에 의해 생성되는 아미노산은 발효 중에 퓨젤 오일(fusel oil) 성분의 전구체로 사용되어 너무 진한 향기성분을 내면서 맛을 역하게 하거나, 발효 후에 아미노산 성분들이 다량 잔류하게 되면 맛을 너무 진하게 하는 지미성분으로 작용하고, 잔류된 아미노산 성분들은 유통 중 발효액의 당류와 반응하게 되어 마일라드 반응(Maillard reaction)에 의한 착색으로 약주의 관능 특성과 품질을 낮추는 요인이 된다.
따라서, 고품질 약주가 제공되기 위해서는 전분 분해능이 우수하면서 동시에 이미·이취를 야기하는 아미노산 성분이 저감되도록 프로테아제 활성이 낮은 곰팡이 균주를 선발하는 것이 중요하고, 또한 이 곰팡이 균주에 맞추어 최적 배양조건을 규명하여 우수한 약주용 발효제를 개발하는 것이 필요하다. 이러한 약주용 발효제를 개발하고 사용함으로써 궁극적으로 약주의 양조학적 품질이 향상되어 고품질의 약주가 제공될 수 있다.
상기한 배경하에, 본 발명자들은, 국산 약주의 품질 개선의 과제를 해결하고 고품질 약주를 제공하기 위하여, 전분 분해능이 우수하며 동시에 프로테아제 활성이 낮은 약주용 곰팡이와 약주용 발효제를 개발하기 위해 노력하던 중, 본 발명의 Lichtheimia ramosa 3T-4 (이하, Lich. ramosa 3T-4로 표시)가 여러 국내외 곰팡이 균주 중에서도 우수한 전분 분해능을 가지면서 동시에 이취의 문제를 야기하는 프로테아제 활성이 낮은 우수한 균주로서 약주용 곰팡이로 가장 적합함을 확인하고, 또한 약주용 발효제 제조에 적합한 접종량, 증자미 원료, 제국기간, 부형제, 건조방식 등의 세부 조건을 최적화함으로써 우수한 약주용 발효제를 개발한바, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 국산 약주의 품질 개선의 과제를 해결하고 고품질 약주를 제공하기 위한 것으로서, 구체적으로 전분 분해능이 높고 프로테아제 활성이 낮은 우수한 약주용 곰팡이 균주를 선발하고, 또한 약주용 발효제 제조에 적합한 접종량, 증자미 원료, 제국기간, 부형제, 건조방식 등의 세부 조건을 최적화함으로써 우수한 약주용 발효제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 기탁번호 KACC 93337P로 기탁된 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Lich. ramosa 3T-4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 약주용 종균의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 1) 상기 약주용 종균을 증자미에 접종하는 단계; 및
2) 종균이 접종된 증자미를 제국하는 단계;를 포함하는 약주용 발효제의 제조방법을 제공하다.
또한, 본 발명은 상기 약주용 발효제의 제조방법으로부터 제조되는 약주용 발효제를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 약주용 발효제를 이용하는 고품질 약주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주는 우수한 전분 분해능을 가지면서 동시에 프로테아제 활성은 낮은 약주용 곰팡이로서 아미노산 성분에 의한 이취 등의 문제에 대하여 우려가 적어 보다 관능특성이 우수한 고품질의 약주를 제조할 수 있는바 국산 약주의 고품질화를 위한 종균이 확보되는 유용한 효과가 있고, 또한 상기 약주용 곰팡이의 배양학적 특성, 접종량, 원료, 제국기간, 부형제, 건조방식 등의 세부 조건을 최적화하여 보다 우수한 약주용 발효제가 제공되는바, 국산 약주의 품질을 개선하여 고품질 약주가 제공되는 유용한 효과가 있다.
도 1은 일 예시의 약주용 발효제의 제조방법에 대한 단계별 순서도이다.
도 2는 삼광미 또는 전주 615호 2종류의 쌀에 대한 수침 시간에 따른 수분 함량 변화를 그래프로 도시한 것이다.
도 3은 삼광미 또는 전주 615호 2종류의 쌀을 이용한 증자미에 선발된 Asp. oryzae OF5-20 또는 Lich. ramosa 3T-4의 2종류 곰팡이를 이용한 약주용 발효제 제조에 있어서 제국기간에 따른 증자미에 파종된 고체종균의 품온 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 고상종균 건조에 사용된 열풍건조와 저온 송풍건조 2종류 건조방식에 사용된 각각의 장치 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KACC 93337P로 기탁된 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주를 제공한다.
상기 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주는 기탁번호 KACC 93337P로 특허 기탁된 균주로서, 약주 제조에 적합한 효소활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 약주 제조에 적합한 효소활성은 우수한 전분 분해활성을 의미하는 것으로 이해될 수 있고, 예를 들어 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성이 우수한 균주로서, 쌀과 같은 곡류 원료의 전분을 잘게 분해시켜 당을 생성하여 효모 등의 알코올 발효를 하는 미생물에 당을 원활하게 공급할 수 있는 균주로 이해될 수 있다.
또한, 상기 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주는 단백질 분해효소(peptidase) 활성이 낮아 단백질 분해력이 낮은 균주로서 약주 제조용으로 적합하다. 만약 단백질 분해 활성이 높아 단백질 분해력이 높은 경우 생성되는 아미노산으로부터 원하지 않는 이취 등의 문제가 야기될 수 있다. 예를 들어 아미노산은 알코올 발효 중에 퓨젤 오일(fusel oil) 성분의 전구체로 사용되어 너무 진한 향기성분을 내면서 맛을 역하게 하거나, 발효 후에 아미노산 성분들이 다량 잔류하게 되면 맛을 너무 진하게 하는 지미성분으로 작용할 수 있어 약주 품질을 저하시킨다. 또한 잔류된 아미노산 성분들은 유통 중 발효액의 당류와 반응하게 되어 마일라드 반응(Maillard reaction)에 의한 착색으로 약주의 관능 특성과 품질을 낮추는 요인이 된다.
따라서, 고품질 약주 제조를 위해서는 전분 분해 활성은 우수하지만 단백질 분해 활성은 낮은 것이 바람직하고, 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4 곰팡이 균주는 전분 분해 활성을 나타내는 글루코아밀라아제 (glucoamylase) 활성은 높고 단백질 분해 활성을 나타내는 펩티다아제(peptidase) 활성은 낮은 균주로서 약주 제조용으로 적합하다.
본 발명의 구체예에서, 농촌진흥청 보유 균주와 기타 국내외 곰팡이 균주 14주에 대하여 4종류의 배지를 이용해 글루코아밀라아제(glucoamylase), α-아밀라아제(α-amylase) 및 펩티다아제(peptidase) 효소활성을 조사한 결과, 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4 곰팡이 균주는 14주 중에서도 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성은 높으며, 펩티다아제(peptidase) 활성은 검출치 미만으로 거의 없음을 확인하였다(표 2, 3 및 4 참조).
또한, 본 발명은 상기 Lich. ramosa 3T-4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 약주용 종균의 제조방법을 제공한다.
상기 Lich. ramosa 3T-4 균주는 전술한 바와 같이 전분 분해활성은 우수하고 단백질 분해 활성은 낮은 균주로서 약주용으로 적합한 균주이고, 중복된 설명은 생략한다.
상기 배양 단계는 Lich. ramosa 3T-4 균주를 생육할 수 있는 조건의 배양이라면 본 발명에 모두 포함되고, 예를 들어 액체배양하여 액체 종균으로 제조하는 것일 수 있다.
상기 배양에서 사용되는 배지는 Lich. ramosa 3T-4 균주를 생육할 수 있는 조건의 배지라면 본 발명에 모두 포함되고, 상업적으로 입수 가능한 배지, 종래 균 배양을 목적으로 사용되는 배지라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 REB, MEB, 및 PDB로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 배지로 배양하는 것일 수 있다.
상기 배양시 온도는 균이 생육할 수 있는 온도라면 모두 포함되나, 예를 들어 20 내지 30℃, 24 내지 30℃, 25 내지 30℃, 27 내지 30℃ 또는 약 28℃에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양 기간은 예를 들어, 2 내지 10일, 3 내지 10일, 4 내지 10일, 4 내지 9일, 4 내지 8일, 5 내지 7일 또는 약 6일 동안 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양 방법과 장치는 통상적으로 균 배양에 사용되는 것을 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 진탕배양하는 것일 수 있고, 진탕 배양기로 100 내지 150 rpm 또는 약 120 rpm에서 진탕배양하는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은
1) 상기 약주용 종균을 증자미에 접종하는 단계; 및
2) 종균이 접종된 증자미를 제국하는 단계;를 포함하는 약주용 발효제의 제조방법을 제공한다.
상기 약주용 종균은 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4 균주를 배양하여 얻은 종균으로서, 상기 Lich. ramosa 3T-4 균주는 전술한 바와 같이 전분 분해활성은 우수하고 단백질 분해 활성은 낮은 균주로서 약주용으로 적합한 균주이고, 중복된 설명은 생략한다.
상기 증자미는 쌀을 물에 수침시켜 얻으며, 바람직하게 약주용 발효제 제조에 적합하도록 적절한 수분 함량을 갖는다. 상기 증자미는 예를 들어 29% 이상, 29 내지 40%, 29 내지 38%, 29 내지 35% 또는 약 30%의 수분 함량을 갖는다. 상기 하한 범위 미만으로 수분을 함량하는 경우 Lich. ramosa 3T-4 균의 증식이 어렵고, 상기 상한 범위 초과로 수분을 함량하는 경우 세균 등의 잡균 오염이 발생될 수 있다. 또한, 상기 증자미는 쌀 품종별로 침지시간을 조절하여 상기한 수분 함량을 달성하는 것일 수 있다.
상기 증자미는 예를 들어 삼광미 또는 전주 615호 쌀을 사용한 증자미일 수 있고, 삼광미를 사용한 증자미는 100분 이상, 120분 이상 또는 150분 이상으로 수침시켜 제조되는 증자미일 수 있고, 바람직하게 120분(2시간) 이상 수침시켜 제조되는 증자미이다. 한편, 전주 615호를 사용한 증자미는 10분 이상, 15분 이상, 10 내지 30분 또는 약 10분 동안 수침시켜 제조되는 증자미일 수 있고, 바람직하게 10분 이상 수침시켜 제조되는 증자미이다. 상기 시건 범위로 수침시키는 경우 증자미의 수분 함량을 상기한 29% 이상, 29 내지 40%, 29 내지 38%, 29 내지 35% 또는 약 30%로 달성할 수 있다. 상기 상한 범위 초과로 수분을 함량하는 경우 세균 등의 잡균 오염이 발생될 수 있다. 또한, 상기 증자미는 쌀 품종별로 침지시간을 조절하여 상기한 수분 함량을 달성하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 삼광미를 수침시켜 증자미를 제조한 결과 수분 함량이 약 30%로 달성되기 위해서는 120분 이상 수침하는 것이 바람직하다는 것을 확인하였고, 전주 615호를 수침시켜 증자미를 제조한 결과 수분 함량이 30%로 달성되기 위해서는 10분 이상 수침시키는 것이 바람직하다는 것을 확인하였다(표 7 참조).
상기 단계 1)의 접종은 종균을 증자미 중량 대비 1 내지 10%, 1 내지 9%, 2 내지 10%, 2 내지 8%, 2 내지 7%, 3 내지 8%, 3 내지 6%, 2 내지 4% 또는 약 4% 농도로 증자미에 접종하는 단계일 수 있다. 상기 하한 범위 미만으로 접종하는 경우 충분한 효소활성을 달성하기 어려운 문제가 있고, 상기 상한 범위 초과로 접종하는 경우에도 충분한 효소활성을 달성하지 못하거나, 불필요한 프로테아제 과활성이 야기될 우려가 있다.
본 발명의 구체예에서, 약조용 발효제 제조에 적합한 종균 접종량을 검토한 결과, 삼광미와 전주 615호를 사용한 경우 모두 4% 접종시 전분 분해활성이 우수하며, 동시에 단백질 분해활성은 낮게 유지될 수 있어, 종균을4% 접종하는 것이 가장 바람직하다는 것을 확인하였다(표 8 및 9 참조).
상기 단계 2)의 제국은 종균이 접종된 증자미를 30 내지 40℃, 32 내지 38℃, 34 내지 36℃ 또는 약 35℃에서 제국하는 것일 수 있다. 또한 상기 단계 2의 제국은 종균 접종 후 2 내지 10일, 3 내지 9일, 3 내지 6일, 6 내지 9일 또는 약 6일 또는 약 9일 동안 제국하는 것일 수 있다. 상기 하한 범위 미만으로 제국하는 경우 충분한 효소활성을 달성하기 어려운 문제가 있고, 상기 상한 범위 초과로 제국하는 경우 불필요한 프로테아제 과활성이 야기될 우려가 있다.
본 발명의 구체예에서, 제국기간에 따른 효소활성 변화를 검토한 결과, 삼광미를 사용한 경우 글루코아밀라아제 활성은 제국 9일에서 가장 우수하였고, α-아밀라아제 활성은 제국 6일에서 가장 우수하며, 프로테아제 활성은 6일에서 가장 낮게 유지된다는 것을 확인하였다(표 10 참조). 한편 전주 615호를 사용한 경우 글루코아밀라아제 활성은 제국 3일에서 가장 우수하였고, α-아밀라아제 활성은 제국 9일에서 가장 우수하며, 프로테아제 활성은 제국 3일에서 가장 낮게 유지된다는 것을 확인하여, 전분 분해 활성이 우수하면서 동시에 단백질 분해 활성을 낮게 유지하기 위해서는 6일 동안 제국하는 것이 바람직하다는 것을 확인하였다(표 11 참조).
상기 단계 1)에서 추가로 부형제를 더 첨가할 수 있고, 상기 부형제는 종균의 효소활성을 보호하고 유지하는 목적으로 사용되는 것일 수 있다. 상기 부형제는 상업적으로 입수 가능한 부형제를 모두 포함하고, 예를 들어 스킴 밀크(skim milk), 말토덱스트린(maltodextrin), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 락토밀(lactomeal)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 부형제 종류에 따른 균의 효소활성과 포자수 변화를 검토한 결과, 스킴 밀크(skim milk) 또는 사이클로덱스트린(cyclodextrin)이 바람직하고, 사이클로덱스트린(cyclodextrin)이 보다 바람직하다는 것을 확인하였다(표 12 및 13 참조).
상기 부형제는 증자미 중량 대비 1 내지 7%, 2 내지 7%, 2 내지 7%, 1 내지 5%, 1 내지 3% 또는 5 내지 7%로 첨가하는 것일 수 있다. 상기 하한 미만으로 부형제를 사용하는 경우 목적하는 효소활성 보호의 효과를 달성하기에 부족한 문제가 있고, 상기 상한 초과로 사용하는 경우에도 효소활성에 장애가 될 수 있는 우려가 있고, 또한 불필요한 프로테아제 과활성이 야기될 우려가 있다.
상기 부형제의 첨가량은 부형제 종류에 따라 상이할 수 있고, 예를 들어 상기 부형제가 스킴 밀크(skim milk)인 경우 전분 분해활성의 측면에서 5 내지 7% 사용하는 것일 수 있고 프로테아제 활성 측면에서 5% 미만, 1 내지 5% 또는 약 1% 사용되는 것일 수 있다. 한편, 상기 부형제가 사이클로덱스트린(cyclodextrin)인 경우 전분 분해활성 측면에서 3 내지 7%, 또는 약 5% 사용하는 것일 수 있고 프로테아제 활성 측면에서 3 내지 7%, 또는 약 5% 사용하는 것일 수 있다. 상기 범위에 따라 부형제를 사용하여 전분 분해활성을 높이면서 동시에 당백질 분해 활성은 낮출 수 있는 바, 약주용 발효제 제조에 적합하다.
본 발명의 구체예에서, 최적 부형제 첨가량을 검토한 결과 사이클로덱스트린을 증자미 중량 대비 5 내지 7%가 바람직하고, α-아밀라아제, 글루코아밀라아제와 같은 전분 분해활성 측면에서 5 내지 7%가 바람직하고, 낮은 프로테아제 활성 측면에서는 5%가 바람직하다는 것을 확인하였다(표 14 참조).
상기 제조방법은 단계 2)의 제국 후 얻어지는 고체종균을 건조시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 건조는 효소활성을 실활시키지 않는 건조 방법이라면 본 발명에 포함되고, 세균 등의 미생물 오염이 적은 건조 방법일 수 있다. 예를 들어 상기 건조는 저온 송풍건조 또는 열풍건조일 수 있고, 바람직하게 저온 송풍건조일 수 있다. 상기 저온 송풍건조는 예를 들어 20 내지 40℃, 30 내지 40℃ 또는 약 35℃의 온도에서 송풍건조하는 것일 수 있고, 10 내지 40시간, 12 내지 36시간, 16 내지 30시간, 20 내지 28시간 또는 약 24시간 동안 송풍건조하는 것일 수 있다. 한편, 상기 열풍건조는 예를 들어 40 내지 60℃, 45 내지 550℃ 또는 약 50℃의 온도에서 열풍건조하는 것일 수 있고, 5 내지 25시간, 10 내지 20시간, 12 내지 18시간, 14 내지 16시간 또는 약 15시간 동안 열풍건조하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 건조 방식에 따른 약주용 발효제의 효소활성을 검토한 결과, 열풍건조 대비 송풍건조하는 방식이 효소활성 실활 폭이 작다는 것을 확인하였다(표 15 참조).
본 발명의 구체예에서, 건조방식에 따른 약주용 발효제의 미생물 오염도를 검토한 결과, 두 방식 모두 오염도가 102 수준으로 낮게 유지되나, 바람직하게는 열풍건조 대비 송풍건조하는 방식이 보다 낮은 미생물 오염도를 나타내 적합하다는 것을 확인하였다(표 16 참조).
나아가, 본 발명은 상기 약주용 발효제의 제조방법으로부터 제조되는 약주용 발효제를 제공한다.
본 발명의 약주용 발효제는 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4 균주를 배양하여 얻은 종균을 접종하여 제조되는 발효제로서, 상기 Lich. ramosa 3T-4 균주는 전술한 바와 같이 전분 분해활성은 우수하고 단백질 분해 활성은 낮은 균주로서 약주용으로 적합한 균주이고, 중복된 설명은 생략한다.
상기 약주용 발효제는 전분 분해활성이 우수하여 효모 등의 알코올 발효를 하는 미생물이 약주를 제조함에 있어 필요한 당을 공급할 수 있을 뿐 아니라, 약주의 맛을 좋게하고, 무엇보다 상기 약주용 발효제는 단백질 분해 활성은 낮아 아미노산을 적게 생성하는바 퓨젤 오일(fusel oil)과 지미성분 발생이 적고, 이취 발생이 적으며, 마일라드 반응(Maillard reaction)에 의한 변색의 우려가 적어, 보다 고품질의 관능특성이 개선된 약주가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약주용 발효제를 이용하는 고품질 약주의 제조방법을 제공한다.
상기 약주용 발효제는 전분 분해활성이 우수하고 단백질 분해 활성은 낮아 약주의 관능 특성을 개선시켜 고품질의 약주를 제공하며, 중복된 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> 당화력 등 효소 활성능이 우수한 곰팡이 종균 선발
발효가공식품과 극저온 냉동고(-80℃)에 보관 중인 곰팡이 14주 대상으로 하였다(표 1). 준비된 곰팡이 14주를 곰팡이 배지 4종(REB, MEB, MERB(REB+MEB), PDB)에서 배양하면서 당화력이 우수한 곰팡이를 선발하였다.
배양: △flask → medium 50 mL add → autoclave → spore counter (X106 cells/mL) inoculated → shaking incubation(28℃, 120 rpm, 6 day) (Vision , Korea)
조효소액 : Broth → Centrifuge (3,000 rpm, 10 min) → sup. → 3 enzyme activity
α-amylase : 포도당이 연결된 다당류에서 α-1,4 glycoside 결합을 가수분해시키는 액화효소를 조사
No. Species / Strains No. Species / Strains
1 Lichtheimia ramosa / 3T-4 8 Rhizopus delemar / 26-4
2 Lichtheimia ramosa / 69-1 9 Rhizopus delemar / 58-8
3 Lichtheimia ramosa / 78-1 10 Aspergillus terreus / 71-10
4 Lichtheimia ramosa / 81-9 11 Aspergillus luchuensis / 74-5
5 Lichtheimia ramosa / CN044 12 Aspergillus oryzae / OF5-20
6 Lichtheimia ramosa / 82-1 13 Aspergillus oryzae / SFO
7 Rhizopus oryzae / 71-9 14 Aspergillus oryzae / HJJ
<1-1> α-amylase 활성
포도당이 연결된 다당류에서 α-1, 4 glycoside 결합을 가수분해시키는 α-아밀라아제(α-amylase) 활성을 조사하였다. 곰팡이 배양용 4종류의 배지에 생육시킨 후, 이들 곰팡이가 배지 종류에 따른 α-아밀라아제(α-amylase) 활성 결과를 표 2에 나타내었다.
No. Species / Strains REB
(U/mL)		 MEB
(U/mL)		 MERB
(U/mL)		 PDB
(U/mL)
1 Lichtheimia ramosa / 3T-4 0.03 N.D. N.D. N.D.
2 Lichtheimia ramosa / 69-1 N.D. N.D. 0.03 N.D.
3 Lichtheimia ramosa / 78-1 0.04 1.06 0.01 N.D.
4 Lichtheimia ramosa / 81-9 0.03 1.16 N.D. N.D.
5 Lichtheimia ramosa / CN044 0.30 0.17 N.D. N.D.
6 Lichtheimia ramosa / 82-1 N.D. 0.02 0.08 N.D.
7 Rhizopus oryzae / 71-9 N.D. N.D. N.D. N.D.
8 Rhizopus delemar / 26-4 N.D. 0.10 0.29 N.D.
9 Rhizopus delemar / 58-8 N.D. 0.08 0.15 N.D.
10 Aspergillus terreus / 71-10 N.D. 5.21 2.01 N.D.
11 Aspergillus luchuensis / 74-5 0.46 0.25 1.38 N.D.
12 Aspergillus oryzae / OF5-20 N.D. 2.44 5.19 N.D.
13 Aspergillus oryzae / SFO N.D. 0.06 1.06 N.D.
14 Aspergillus oryzae / HJJ N.D. 29.51 49.67 N.D.
(N.D.: not detected)
표 2에서 확인되는 바와 같이, Lich. ramosa 3T-4은 배지 상에서 α-아밀라아제(α-amylase) 활성이 낮은 것으로 확인되었다.
<1-2> Glucoamylase 활성
α-1, 4/α-1, 6 glycoside 결합을 비환원성 말단부터 포도당으로 절단하는 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 조사하였다. 곰팡이 배양용 4종류의 배지에 생육시킨 후, 이들 곰팡이가 배지 종류에 따른 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성 결과를 표 3에 나타내었다.
No. Species / Strains REB
(U/mL)		 MEB
(U/mL)		 MERB
(U/mL)		 PDB
(U/mL)
1 Lichtheimia ramosa / 3T-4 0.74 20.32 22.23 19.18
2 Lichtheimia ramosa / 69-1 0.23 N.D. 6.89 0.25
3 Lichtheimia ramosa / 78-1 0.01 6.58 N.D. 0.17
4 Lichtheimia ramosa / 81-9 0.05 0.25 5.00 1.61
5 Lichtheimia ramosa / CN044 2.25 0.44 0.04 0.15
6 Lichtheimia ramosa / 82-1 0.46 0.03 0.10 N.D.
7 Rhizopus oryzae / 71-9 0.05 12.07 10.61 0.40
8 Rhizopus delemar / 26-4 0.01 15.88 13.65 4.67
9 Rhizopus delemar / 58-8 0.01 18.53 16.56 3.61
10 Aspergillus terreus / 71-10 0.36 N.D. 8.84 N.D.
11 Aspergillus luchuensis / 74-5 5.53 0.60 19.48 0.27
12 Aspergillus oryzae / OF5-20 0.85 N.D. 10.74 0.02
13 Aspergillus oryzae / SFO 0.64 2.16 2.51 0.10
14 Aspergillus oryzae / HJJ 0.23 2.57 2.55 0.16
(N.D.: not detected)
표 3에서 확인되는 바와 같이, 글루코아밀라아제(glucoamylase)는 전분을 당화하여 대부분 포도당과 같은 단당류를 탄소원으로 이용하는 미생물에 직접적인 영향을 미치는 효소로서, Lich. ramosa 3T-4은 배지 상에서 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성이 높은 것으로 확인되었다.
<1-3> Protease 활성
곰팡이 배양용 4종류의 배지에 생육시킨 후, 이들 곰팡이가 배지 종류에 따른 프로테아제(protease) 활성 결과를 표 4에 나타내었다.
No. Species / Strains REB
(U/mL)		 MEB
(U/mL)		 MERB
(U/mL)		 PDB
(U/mL)
1 Lichtheimia ramosa / 3T-4 N.D. N.D. N.D. N.D.
2 Lichtheimia ramosa / 69-1 9.18 N.D. N.D. 1.69
3 Lichtheimia ramosa / 78-1 33.35 N.D. 5.33 8.06
4 Lichtheimia ramosa / 81-9 0.96 N.D. N.D. 6.87
5 Lichtheimia ramosa / CN044 9.34 N.D. N.D. 0.33
6 Lichtheimia ramosa / 82-1 156.33 N.D. 30.20 17.28
7 Rhizopus oryzae / 71-9 0.65 N.D. N.D. 1.64
8 Rhizopus delemar / 26-4 0.65 N.D. N.D. 0.34
9 Rhizopus delemar / 58-8 0.33 N.D. N.D. 0.98
10 Aspergillus terreus / 71-10 13.87 9.74 23.10 7.87
11 Aspergillus luchuensis / 74-5 294.15 30.60 728.93 17.35
12 Aspergillus oryzae / OF5-20 27.35 53.59 124.48 14.31
13 Aspergillus oryzae / SFO 7.76 1223.46 1892.08 32.33
14 Aspergillus oryzae / HJJ 0.96 2184.95 1914.97 113.76
(N.D.: not detected)
표 4에서 확인되는 바와 같이, Lich. ramosa 3T-4는 배지 상에서 프로테아제(protease) 활성이 없는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4는 당화력이 우수함과 동시에, 약주의 맛과 향을 좋지 못하게 하거나, 이취 발생의 문제를 야기하는 단백질 분해력은 낮은 것으로 확인되었다.
<실험예 2> 선발 균주별 건조 균체량 측정
선발한 5종의 곰팡이를 대상으로 액체 배양한 후(28℃, 5일), 여과(Filter paper No. 2, Advantec Co., Japan)하여 균체와 배양액을 분리하였다. 곰팡이 종류별로 회수한 균체 8 g을 105℃(Vision Scientific Co., Korea)에서 8시간 동안 건조하여 건조 중량을 측정하여 균체 생산성을 평가하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
No. Species / Strains 균체량(g)
1 Lichtheimia ramosa / 3T-4 1.367
2 Aspergillus luchuensis / 74-5 1.277
3 Aspergillus oryzae / OF5-20 1.425
4 Aspergillus oryzae / SFO 1.324
5 Aspergillus oryzae / HJJ 1.323
표 5에서 확인되는 바와 같이, Lich. ramosa 3T-4는 균체 생산성이 우수함이 확인된다.
<실험예 3> 균주별 발효제의 효소활성
당화력이 높은 균주를 선정하기 위하여 선발한 5종의 곰팡이를 대상으로 도 1에 개시된 바와 같이 곡류(쌀, 200 g)를 세미, 침지, 절수 및 증자한 후, 여기에 각 곰팡이의 액국을 1%로 접종하고, 35℃에서 3일 동안 제국하여, 곰팡이 균주별 발효제의 효소활성을 조사하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.
No. Species / Strains α-amylase
(Unit/g)		 glucoamylase
(Unit/g)		 protease
(Unit/g)
1 Lich. ramosa / 3T-4 5.06 ±0.72 51.06 ± 1.94 458.87 ± 23.8
2 Asp. luchuensis / 74-5 59.31 ± 5.20 418.50 ± 0.87 4868.73 ± 11.4
3 Asp. oryzae / OF5-20 67.55 ± 12.93 44.51 ± 0.74 1,893.40 ± 6.97
4 Asp. oryzae / SFO 169.09 ± 8.15 9.81 ± 0.49 500.69 ± 8.14
5 Asp. oryzae / HJJ 144.05 ± 0.84 7.95 ± 0.31 1,047.41 ± 16.3
(N.D.: not detected)
표 6에서 확인되는 바와 같이, 곰팡이 균주별 발효제로 효소활성을 평가한 결과 본 발명의 Lich. ramosa 3T-4가 곰팡이의 당화력을 나타내는 glucoamylase 활성이 가장 우수함과 동시에, 약주의 맛과 향을 좋지 못하게 하거나, 이취 발생의 문제를 야기하는 프로테아제(protease) 활성은 가장 낮은 것으로 확인된다.
<실험예 4> 곰팡이를 이용한 고상종균 제조기술 개발
<4-1> 고상종균 제조를 위한 원료 최적 침지시간 설정
2종류의 쌀 품종(삼광미, 전주 615)을 사용하여 원료미의 침지시간에 따른 수분 함량을 조사하였다.
삼광미 : 수원 361+밀양 101호 교잡, 중만생종, 경질미
전주 615 : 수원 542 개량종, 조생종, 전분립이 성글게 배열된 분질미(가루미)
수분 흡수율은 원료별 최적 침지시간을 설정하기 위해, 침지하여 포화 수분 함량에 도달하여 수분 함량이 30% 이상 되는 시점을 최적 침지시간으로 설정하였고, 그 결과를 표 7과 도 2에 나타내었다.
Figure pat00001
시간
(분)		 삼광미 시간
(분)		 전주 615
수분 흡수율(%) 수분함량(%) 수분 흡수율(%) 수분함량(%)
0 　- 11.5 0 - 8.46
40 21.491 28.49 5 17.792 25.50
60 22.297 28.32 10 28.103 32.17
80 22.476 28.42 15 30.997 33.19
100 24.023 29.02 20 33.353 34.31
120 23.239 29.35 25 34.609 34.75
140 24.120 29.47 30 36.214 35.01
160 24.607 29.63
표 7 및 도 2에서 확인되는 바와 같이, 품종별 수분 흡수율이 다르기 때문에 원료미를 달리할 경우 수분 흡수율을 측정해 수침시간을 조절할 필요가 있다. 수분 함량이 낮으면 곰팡이 종균의 증식이 어렵고 높으면 잡균의 오염이 발생할 수 있는바, 증자미의 수분 함량은 30% 이상이 바람직하다.
따라서, 본 발명에서 사용한 삼광미(경질미)는 수침을 2시간 이상하는 것이 바람직하고, 전주 615(분질미/가루미)는 10분 이하의 수침시간을 지켜야 좋은 증자미(고두밥)를 얻을 수 있다.
<4-2> 고상종균 제조기술의 접종량 선정
선발된 곰팡이를 각각 밀기울 배지에 동일한 포자수(108 cells/mL)로 접종하여 28℃, 120 rpm로 5일간 배양하였다. 액체 배양액을 여과하여 침전물과 분리된 액을 회수한 후, 액체종균 농도별(2, 4, 6%)로 고두밥에 파종하여 고상종균의 제국기간별 효소활성 분석으로 접종량을 선정하고자 하였고, 그 결과를 표 8 및 표 9에 나타내었다.
곡류 원료 : 경질미(삼광, 2018년, 논산), 분질미(전주 615, 2019년, 전북) 2종류 사용
곰팡이 : Lichtheimia ramosa 3T-4, Aspergillus oryzae OF5-20를 사용
Activity (Unit/g) AO OF5-20
접종량(%)		 삼광미 전주 615
3일 6일 9일 3일 6일 9일
α-amylase 2 572.23 594.08 565.27 566.27 591.10 634.81
4 575.21 662.63 626.87 582.16 601.04 601.04
6 604.02 687.47 627.86 568.25 575.21 652.70
Glucoamylase 2 845.65 949.50 1,137.42 798.67 947.03 1,117.64
4 823.40 1,251.17 1,592.39 773.94 838.23 1,174.51
6 986.59 1,036.04 1,275.89 882.74 942.08 1,105.28
Protease 2 4,995.34 2,555.22 594.08 2,785.42 3,291.86 2,762.40
4 2,486.16 4,419.84 662.63 1,2684.02 3,936.42 2,048.78
6 3,153.74 3,798.30 687.47 2,716.36 2,555.22 6,307.48
표 8과 같이, Asp. oryzae OF5-20으로 제조한 고상종균에 대하여, 9일 동안 제국한 경우 α-아밀라아제(α-amylase) 활성은 삼광미는 6%> 4%> 2%로 나타났으며 전주 615는 6%> 2%> 4%로 나타났다. 한편, 9일 동안 제국한 경우 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성은 삼광미는 4%> 6%> 2%로 나타났으며 전주 615는 4%> 2%> 6%로 나타났다. 다른 한편, 9일 동안 제국한 경우 프로테아제(protease) 활성은 삼광미는 2%< 4%< 6%로 나타났으며 전주 615는 4%< 2%< 6%로 나타났다.
따라서, Asp. oryzae OF5-20으로 제조한 고상종균의 효소활성에 따른 접종량을 조사한 결과, α-아밀라아제(α-amylase)와 글루코아밀라아제(glucoamylase)는 삼광미와 전주 615에서 4% 접종시 높은 활성을 나타내고, 프로테아제(protease)는 2～4%에서 낮은 활성을 가지는 것으로 확인된다.
Activity (Unit/g) LR 3T-4
접종량(%)		 삼광미 전주 615
3일 6일 9일 3일 6일 9일
α-amylase 2 4.39 6.44 3.79 12.84 18.97 8.62
4 3.70 3.85 4.67 10.69 14.56 13.75
6 5.40 6.34 3.87 9.86 11.83 6.87
Glucoamylase 2 109.17 135.87 174.82 174.82 208.80 325.90
4 99.90 134.51 179.89 177.17 213.32 385.24
6 105.34 132.91 170.98 186.69 202.36 345.18
Protease 2 21.87 29.93 65.61 43.74 215.24 227.90
4 29.93 132.37 359.11 12.66 382.13 195.67
6 18.42 462.70 521.40 24.17 370.98 250.92
표 9와 같이, Lich. ramosa 3T-4로 제조한 고상종균에 대하여, 9일 동안 제국한 경우 α-아밀라아제(α-amylase) 활성은 삼광미는 4%> 6%> 2%로 나타났으며 전주 615는 4%> 2%> 6%로 나타났다. 한편, 9일 동안 제국한 경우 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성은 삼광미는 4%> 2%> 6%로 나타났으며 전주 615는 4%> 6%> 2%로 나타났다. 다른 한편, 9일 동안 제국한 경우 프로테아제(protease) 활성은 삼광미는 2%< 4%< 6%로 나타났으며 전주 615는 4%< 2%< 6%로 나타났다.
따라서, Lich. ramosa 3T-4로 제조한 고상종균의 효소활성에 따른 접종량을 조사한 결과, α-아밀라아제(α-amylase)와 글루코아밀라아(glucoamylase)는 삼광미와 전주 615에서 4% 접종시 높은 활성을 나타내고, 프로테아제(protease)는 4%에서 가장 낮은 활성을 가지는 것으로 확인된다.
상기한 실험 결과로부터, 약주용 곰팡이 고상종균은 사용하는 곰팡이, 접종량과 원료미에 따라 효소활성의 차이가 있음을 알 수 있고, 이에 약주 제조용으로 사용하기에 적합한 고상종균 생산을 위해서는 상기한 곰팡이, 접종량 및 원료미의 조건을 설정하고 조절하는 것이 필요하다.
<4-3> 제국기간에 따른 고상종균의 품온 변화
선발한 곰팡이 종균을 밀기울 배지에 배양한 액체종균의 최적농도(2, 4, 6%)로 2품종의 증자미(각 10 kg)에 접종하여 9일 동안 35℃에서 소형 제국기(미니 제국기 15, 일본 야에가끼)로 제국하였다. 선발된 2종류의 곰팡이를 이용한 9일간의 제국기간에 증자미에 파종된 고상종균의 품온 변화를 조사하였고, 그 결과를 도 3에 도시하였다.
곰팡이 : Lichtheimia ramosa 3T-4, Aspergillus oryzae OF5-20를 사용
삼광미 : 쌀(10 kg) → 세미(5회) → 수침(3시간) → 절수(1시간) → 증자(50분) → 방냉(35℃) → 각각의 곰팡이 액국 접종 → 제국(35℃, 9일)
전주 615호 : 쌀(10 kg) → 세미(3회) → 수침(10분) → 절수(1시간) → 증자(50분) → 방냉(35℃) → 각각의 곰팡이 액국 접종 → 제국(35℃, 9일)
도 3에서 확인되는 바와 같이, 제국 시작(0일)부터 미생물 활동이 나타나며, 제국 2일째 가장 왕성한 생육 활성을 나타내면서 최고 품온이 41℃까지 올라갔으며, 3일부터 곰팡이가 생육하면서 내는 품온 변화가 일정하게 유지되었으며, 5일 이후 품온이 떨어지는 것이 확인되어 인위적 조절이 필요함을 알 수 있었다. 한편, Lich. ramosa 3T-4는 상대적으로 Asp. oryzae OF5-20보다 품온이 조금 늦게 올라가는 경향을 보였다.
<4-4> 제국기간에 따른 효소활성 변화
선발한 곰팡이를 증자미에 파종하여 이들 제국기간에 따른 고상종균의 효소활성을 조사하였고, 그 결과를 표 10 및 표 11에 나타냈다.
곰팡이 : Lichtheimia ramosa 3T-4, Aspergillus oryzae OF5-20를 사용
증자미 : 삼광미 또는 전주 615호 사용
균주 제국기간
(days)		 α-amylase (unit/g) Glucoamylase
(unit/g)		 Protease
(unit/g)
AO
OF5-20		 3 572.23 845.65 4,995.34
6 594.08 949.50 2,555.22
9 565.27 1,137.42 3,867.36
LR
3T-4		 3 4.39 109.17 21.87
6 6.44 135.87 29.93
9 3.79 174.82 62.15
표 10에서 확인되는 바와 같이 삼광미를 사용한 경우, α-아밀라아제(α-amylase) 활성은 Asp. oryzae OF5-20, Lich. ramosa 3T-4 모든 종균에서 제국 6일에 가장 높았으며, 제국기간이 경과 할수록 효소활성은 감소하였다. 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성은 제국 9일에 가장 높은 활성을 나타냈다. 한편, 프로테아제(protease) 활성이 높으면 단백질이 분해되어 아미노산으로 전환되고, 이때 주질의 맛 차이가 결정되기 때문에 단백질 분해력이 낮은 것이 유익하다.
따라서, 제국기간은 전체적으로 α-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성이 뛰어나고, 단백질 분해력이 너무 높지 않은 제국 6일이 적당하다.
균주 제국기간
(days)		 α-amylase (unit/g) Glucoamylase
(unit/g)		 Protease
(unit/g)
AO
OF5-20		 3 566.27 798.67 2,785.42
6 591.10 947.03 3,291.86
9 634.81 1,117.64 2,762.40
LR
3T-4		 3 12.84 174.82 43.74
6 8.84 205.23 215.24
9 8.62 325.90 227.90
표 11에서 확인되는 바와 같이 전주 615호를 사용한 경우, α-아밀라아제(α-amylase) 활성은 Asp. oryzae OF5-20을 사용한 경우 제국 9일에 가장 높았으며, Lich. ramosa 3T-4은 제국기간 경과에 따라 활성이 증가하다 감소하는 경향을 보였다. 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성은 제국기간이 경과 할수록 효소활성은 증가하였고, 제국 9일에 가장 높은 활성을 나타내었다.
제국기간은 전체적으로 α-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성이 뛰어나고 단백질 분해력이 높지 않은 제국 6일이 적당하다. 동일한 균주를 사용하여도 사용하는 쌀 원료에 따라 효소활성의 차이가 나타남이 확인된다.
<4-5> 고상종균의 부형제 선정
저장에 따른 고상종균의 효소가 실활되지 않고 활성을 유지할 수 있는 맞춤형 부형제를 선정하기 위해, 4종류의 부형제(skim milk, maltodextrin, cyclodextrin, lactomeal) 중 하나를 고상종균에 5% 첨가하고 35℃에서 24시간 동안 건조하였으며, 부형제 종류에 따른 효소활성 변화를 조사하여, 그 결과를 표 12에 나타내었다.
균주 부형제 α-amylase Glucoamylase Protease
AO
OF5-20		 skim milk 828.54 969.28 7,665.66
maltodextrin 766.94 897.58 7251.3
cyclodextrin 709.32 904.99 5,662.92
lactomeal 793.77 949.50 5,478.76
LR
3T-4		 skim milk 6.32 30.78 75.00
maltodextrin 9.02 30.66 230.20
cyclodextrin 9.42 37.34 151.93
lactomeal 6.04 29.05 29.93
(단위: Unit/g)
표 12에서 확인되는 바와 같이, α-아밀라아제(α-amylase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성은 Asp. oryzae OF5-20는 skim milk를 부형제로 사용하는 경우에서 활성이 가장 높게 유지되며, Lich. ramosa 3T-4는 cyclodextrin을 부형제로 사용하는 경우에서 활성이 가장 높게 유지되는 것을 확인하였다.
<4-6> 부형제 처리에 따른 포자수 변화
부형제 종류에 따른 포자수 변화를 측정하여 그 결과를 표 13에 나타내었다.
곰팡이 포자수 측정 방법은 각각의 서로 다른 4종의 부형제를 사용하여 제조한 고상종균 1 g에 대하여 5% tween용액 10 mL에 1% methylene blue 2～3방울을 가하고 묽게 희석한 후, hemocytometer로 포자수를 겸경하였다.
부형제 Spore counts
AO OF5-20 LR 3T-4
skim milk 1.18 X 108 0.72 X 108
maltodextrin 0.93 X 108 0.85 X 108
cyclodextrin 1.86 X 108 0.89 X 108
lactomeal 1.82 X 108 0.83 X 108
표 13에서 확인되는 바와 같이, Asp. oryzae OF5-20 또는 Lich. ramosa 3T-4를 사용한 고상종균 모두 cyclodextrin을 부형제로 사용한 경우 포자수가 가장 높게 유지되는 것을 확인하였다.
따라서, Asp. oryzae OF5-20 또는 Lich. ramosa 3T-4를 사용한 고상종균 모두 고상종균의 효소활성과 포자수 측면에서 가장 적합한 부형제는 cyclodextrin이 가장 적합한 것으로 확인되었다.
<4-7> 고상종균용 부형제의 최적농도 선정
고상종균 보존능에 적합한 선정한 2종류 부형제(cyclodextrin, skim milk)의 적정 농도(0, 1, 3, 5, 7%)를 선정하기 위해 각각의 효소활성을 분석하였고, 그 결과를 표 14에 나타내었다.
부형제 균주 농도(%) α-amylase
(Unit/g) 		Glucoamylase (Unit/g) Protease
(Unit/g)
skim
milk		 AO OF5-20 0 565.27 949.50 3,867.36
1 608.98 872.85 6,169.36
3 692.43 1,045.94 7,596.60
5 828.54 969.28 7,665.66
7 714.29 1,053.35 7,596.60
cycleo
dextrin		 LR
3T-4		 0 1.03 24.60 62.15
1 0.68 27.32 89.78
3 0.72 27.20 59.85
5 1.07 28.93 29.93
7 0.44 29.43 52.95
표 14에서 확인되는 바와 같이, α-아밀라아제(α-amylase) 활성 측면에서 Asp. oryzae OF5-20를 사용한 고상종균은 skim milk를 부형제로 5%의 농도로 사용하는 것이 가장 바람직하고, Lich. ramosa 3T-4를 사용한 고상종균은 cyclodextrin을 부형제로 5%의 농도로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성 측면에서 Asp. oryzae OF5-20를 사용한 고상종균은 skim milk를 부형제로 7%의 농도로 사용하는 것이 가장 바람직하고, Lich. ramosa 3T-4를 사용한 고상종균은 cyclodextrin을 부형제로 7%의 농도로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 한편, 약주의 맛과 향을 위하여 낮은 활성을 유지해야 하는 프로테아제(protease) 활성의 측면에서 Asp. oryzae OF5-20를 사용한 고상종균은 skim milk를 부형제로 1%의 농도로 사용하는 것이 가장 바람직하고, Lich. ramosa 3T-4를 사용한 고상종균은 cyclodextrin을 부형제로 5%의 농도로 사용하는 것이 가장 바람직하다.
<실험예 5> 고상종균의 건조기술 확립
<5-1> 건조방식에 따른 고상종균의 효소활성 분석
건조방식(열풍건조 또는 저온 송풍건조)에 따른 고상종균의 효소활성을 비교하였다.
구체적으로, 각각의 고상종균 샘플을 도 4의 기기로 열풍건조(50℃, 15 hr) 또는 저온 송풍건조(35℃, 24 hr)한 후, 이들 고상종균의 효소활성을 분석하여 그 결과를 표 15에 나타내었다.
균주 건조방식 α-amylase Glucoamylase Protease
AO
OF5-20		 송풍 634.80 1,137.42 3,867.36
열풍 626.87 907.47 6,169.36
LR 3T-4 송풍 0.95 56.01 62.15
열풍 0.89 19.78 11.51
(단위: Unit/g)
표 15에서 확인되는 바와 같이, Asp. oryzae OF5-20을 사용한 고상종균의 경우 저온 송풍건조 방식이 열풍건조 방식 대비 α-아밀라아제(α-amylase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase)의 활성이 높게 유지되고, 프로테아제(protease) 활성은 보다 낮게 유지되어, 저온 송풍건조 방식이 열풍건조 방식 대비 바람직함을 알 수 있었고, Lich. ramosa 3T-4을 사용한 고상종균의 경우 저온 송풍건조 방식이 열풍건조 방식 대비 α-아밀라아제(α-amylase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase)의 활성이 높게 유지되어, 저온 송풍건조 방식이 열풍건조 방식 대비 바람직함을 알 수 있다.
따라서, 저온 송풍건조 방식이 열풍건조보다 효소활성 실활 폭이 낮아 고상종균 건조에 적합하다.
<5-2> 건조방식에 따른 고상종균의 미생물 오염도 분석
건조방식(열풍건조 또는 저온 송풍건조)에 따른 고상종균의 미생물 오염도를 비교하였다.
구체적으로, 각각의 고상종균 샘플을 도 4의 기기로 열풍건조(50℃, 15 hr) 또는 저온 송풍건조(35℃, 24 hr)한 후, 고상종균의 미생물 오염도(세균 오염도)를 분석하여 그 결과를 표 16에 나타내었다.
균 주 CFU/g
건조전 저온 송풍건조 열풍건조
AO OF5-20 0.6 X 102 0.65 X 102 0.72 X 102
LR 3T-4 0.3 X 102 0.71 X 102 0.89 X 102
표 16에서 확인되는 바와 같이, 고상종균의 오염 수치는 102로 전체적으로 오염도가 낮은 것으로 확인되었다. 참조로 선진국인 일본의 종균 생산업체도 세균 오염은 102 정도로 제품을 생산 판매하고 있다는 점에서 상기한 결과는 제품 생산 판매에 적합한 수준으로 확인된다.
따라서, 향후 고상종균의 산업용 대량생산을 위한 건조방식은 저온 송풍건조가 적합하다.

Claims (17)

  1. 기탁번호 KACC 93337P로 기탁된 Lich. ramosa 3T-4 약주용 곰팡이 균주.
  2. 제1항의 Lich. ramosa 3T-4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 약주용 종균의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 약주용 종균은 액체종균인 것을 특징으로 하는, 약주용 종균의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 배양은 REB, MEB, 및 PDB로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 배지에서 배양하는 단계인 것을 특징으로 하는 약주용 종균의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 배양은 제1항의 Lich. ramosa 3T-4 균주를 20 내지 30℃에서 2 내지 10일 동안 액체배양하는 단계인 것을 특징으로 하는 약주용 종균의 제조방법.
  6. 1) 제2항의 약주용 종균을 증자미에 접종하는 단계; 및
    2) 종균이 접종된 증자미를 제국하는 단계;를 포함하는 약주용 발효제의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 1)의 접종은 종균을 증자미 중량 대비 1 내지 10% 농도로 증자미에 접종하는 단계인 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단계 2)의 제국은 종균이 접종된 증자미를 30 내지 40℃에서 2 내지 10일 동안 제국하는 단계인 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 증자미는 수분 함량이 30% 이상인 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 증자미는 삼광미 또는 전주 615호 쌀을 사용한 증자미인 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 단계 1)에서 부형제를 증자미 중량 대비 1 내지 7%로 첨가하는 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 부형제는 스킴 밀크(skim milk), 말토덱스트린(maltodextrin), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 락토밀(lactomeal)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 제조방법은 단계 2)의 제국 후 얻어지는 고체종균을 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 건조는 저온 송풍건조인 것을 특징으로 하는 약주용 발효제의 제조방법.
  15. 제6항의 약주용 발효제의 제조방법으로부터 제조되는 약주용 발효제.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 약주용 발효제는 누룩인 것을 특징으로 하는, 약주용 발효제.
  17. 제15항의 약주용 발효제를 이용하는 고품질 약주의 제조방법.
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