KR102054692B1 - 산 생성능이 우수한 토착 종균, 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5를 이용한 탁주용 고체종국 제조방법 - Google Patents

산 생성능이 우수한 토착 종균, 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5를 이용한 탁주용 고체종국 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산 생성능이 우수한 토착 종균, 아스퍼질러스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) 74-5(KACC93235P)를 이용한 탁주용 고체종국의 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된 탁주용 고체종국에 관한 것으로, 구체적으로 상기 균주의 고체종국 제조에 있어, 액체종균을 10% 접종하고, 40℃에서 6일 동안 배양하였을 때, 상기 균주의 효소활성이 높음을 확인하였고, 액체종균을 5% 접종하고, 40℃에서 5일 동안 배양하였을 때, 상기 고체종국의 포자수가 높음을 확인하였으며, 액체종균의 접종량이 적을수록, 발효기간이 길어질수록 고체종국의 세균수가 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 제조방법은 효소활성이 높고, 포자수가 많으며, 세균수가 적은 형태의 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)의 고체종국을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산 생성능이 우수한 토착 종균, 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5를 이용한 탁주용 고체종국 제조방법{Manufacturing method of solid starter for Takju using Aspergillus luchuensis 74-5 with high ability of acid production}
본 발명은 산 생성능이 우수한 토착 종균, 아스퍼질러스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) 74-5(KACC93235P)를 이용한 탁주용 고체종국의 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된 탁주용 고체종국에 관한 것이다.
탁주는 전통주 가운데서 가장 역사가 오래된 술이며, 주로 서울이남 지역에서 서민층이 주로 즐겨 마셨던 술로 농주(農酒)라고도 불리워지는 유백색의 탁한 액으로서, 알코올 도수는 약 5∼16도의 범위이며 보통은 6∼7도이다. 통상 막걸리라 불려지는 탁주의 양조법은 지방에 따라 다르기는 하나, 가장 일반적인 양조법은 찹쌀 또는 멥쌀을 세미하고 침지, 절수 및 증자를 하여 만든 고두밥에 누룩과 물을 섞어 만든 것으로 7∼10일 정도 경과하면 알코올 발효가 되어 술덧을 떠서 체로 걸러 탁주로 분리하게 된다. 탁주는 음주 후, 두통이 거의 없고 그윽한 풍미와 감칠맛이 일품인 우리 민족 고유의 가장 서민적인 전통 대중주이나, 탁주 제조를 위한 종국제조 기술의 상업적 생산에 어려움이 있고, 제품의 불균일성 및 맛의 다양성이 미흡할 뿐만 아니라 또한 이상 발효로 인한 감 산패가 발생한다는 문제점이 있다.
따라서 탁주의 품질 고급화 및 표준화를 위한 종균제조 기술은 국가주도의 운영이 필요하며, 이는 우수한 특성을 가진 종균을 보다 안정적으로 유지 및 공급하는 기술이 필요하다.
한편, 본 발명의 아스퍼질러스 루추엔시스74-5(KACC93235P)의 고체종국과 관련한 선행기술로서, 김민식 등은 누룩곰팡이 분리균의 다양성 및 당화능 분석과 독소생산능 조사에 대해 개시하였고(김민식 등, 한국균학회지 2014, 42(3) 191-200), 일본 등록특허 04723256에는 현미누룩의 제조 방법 및 이를 이용한 식초의 제조 방법에 관하여 개시하였으나, 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)의 고체종국 제조방법에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 산 생성능이 우수한 토착 종균인 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)의 탁주용 고체종국의 효율적인 제조를 위해 연구하던 중, 고체종국 제조에 있어, 액체종균을 10% 접종하고, 40℃에서 6일 동안 배양하였을 때, 상기 균주의 효소활성이 높음을 확인하였고, 액체종균을 5% 접종하고, 40℃에서 5일 동안 배양하였을 때, 상기 고체종국의 포자수가 높음을 확인하였으며, 액체종균의 접종량이 적을수록, 발효기간이 길어질수록 고체종국의 세균수가 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 제조방법은 효소활성이 높고, 포자수가 많으며, 세균수가 적은 형태의 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5의 고체종국을 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산 생성능이 우수한 토착 종균, 아스퍼질러스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis ) 74-5(KACC93235P)를 이용한 탁주용 고체종국 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된 탁주용 고체종국을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 도정된 쌀을 세척 후, 침지시킨 다음 절수하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 쌀을 증자시킨 후, 방냉시켜 고두밥을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 고두밥에 아스퍼질러스 루추엔시스( Aspergillus luchuensis) 74-5(KACC93235P)의 액체종균을 혼합한 후, 뒤집기와 뒤섞기를 하면서 배양시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 배양된 고두밥을 건조시킨 후, 분상 또는 조제 형태로 제조하는 단계를 포함하는 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)를 이용한 고체종국의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 고체종국을 제공한다.
본 발명은 산 생성능이 우수한 토착 종균인 아스퍼질러스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis ) 74-5(KACC93235P)의 탁주용 고체종국의 효율적인 제조를 위하여, 고체종국 제조에 있어, 액체종균을 10% 접종하고, 40℃에서 6일 동안 배양하였을 때, 상기 균주의 효소활성이 높음을 확인하였고, 액체종균을 5% 접종하고, 40℃에서 5일 동안 배양하였을 때, 상기 고체종국의 포자수가 높음을 확인하였으며, 액체종균의 접종량이 적을수록, 발효기간이 길어질수록 고체종국의 세균수가 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 제조방법은 효소활성이 높고, 포자수가 많으며, 세균수가 적은 형태의 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5의 고체종국을 제조하기 위한 최적조건으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 아스퍼질러스 루추엔시스( Aspergillus luchuensis ) 74-5(KACC93235P) 고체종국 제조방법의 단계를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 고체종국 제조 공정을 실제 사진으로 나타낸 도이다.
도 3은 액체종균 접종량(seed starter content)에 따른 제국의 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 액체종균 접종량에 따른 효소활성을 나타낸 도이다.
도 5는 제국 온도(fermentation temp)에 따른 효소활성을 나타낸 도이다.
도 6은 제국 시간에 따른 제국의 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 제국 시간에 따른 효소활성을 나타낸 도이다.
도 8은 제국 시간에 따른 품온 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 고체종국의 포자를 나타낸 도이다.
도 10은 A.접종량, B.제국 온도, 및 C.발효기간에 따른 포자수를 나타낸 도이다.
도 11은 A.접종량, B.제국 온도, 및 C.발효기간에 따른 세균수를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 도정된 쌀을 세척 후, 침지시킨 다음 절수하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 쌀을 증자시킨 후, 방냉시켜 고두밥을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 고두밥에 아스퍼질러스 루추엔시스( Aspergillus luchuensis) 74-5(KACC93235P)의 액체종균을 혼합한 후, 뒤집기와 뒤섞기를 하면서 배양시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 배양된 고두밥을 건조시킨 후, 분상 또는 조제 형태로 제조하는 단계를 포함하는 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)를 이용한 고체종국의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 침지는 물에 4 내지 12시간 동안 담그는 것이 바람직하고, 절수는 소쿠리 또는 체에 넣고 30분 내지 120분 동안 물을 빼주는 것이 바람직하며, 1시간동안 물을 빼주는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 단계 2)의 증자는 찜 솥을 이용하여 40분 내지 120분 동안 찌는 것이 바람직하고, 1시간 동안 찌는 것이 더욱 바람직하며, 방냉은 40 내지 50℃가 되도록 식히는 것이 바람직하고, 40℃가 되도록 빨리 식히는 것이 가장 바람직하다.
또한, 단계 3)의 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)는 25 내지 30℃에서 4 내지 6일 동안 각각 전배양 및 본배양을 시켜 종균을 제조하는 것이 바람직하고, 상기 균주 1 백금이를 28℃에서 5일 동안 전배양 하고, 이를 본배양 배지에 2% 접종하여 6일 동안 배양시키는 것이 더욱 바람직하다. 이때, 습도는 모두 70%인 것이 바람직하다. 또한, 단계 3)의 액체종균은 5 내지 10%의 농도로 고두밥에 접종시키는 것이 바람직하고, 배양은 35 내지 40℃에서 5 내지 7일 동안 배양하는 것이 바람직하며, 본 발명의 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)의 높은 효소활성을 위해서는 액체종균을 10% 접종하고 40℃에서 6일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하고, 높은 포자수를 위해서는 액체종균을 5% 접종하고 40℃에서 5일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 단계 4)의 건조는 40 내지 50℃에서 20 내지 30시간 동안 건조시키는 것이 바람직하며, 45℃에서 24시간 동안 건조시키는 것이 더욱 바람직하다.
아울러, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 고체종국을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 아스퍼질러스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) 74-5(KACC93235P)의 고체종국 제조의 최적화 조건을 구명하기 위하여, 액체종균의 접종량, 제국 온도, 및 제국 시간에 따른 효소활성을 분석한 결과, 도 4, 도 5, 및 도 7에 나타난 바와 같이, 액체종균을 10% 접종하고, 40℃에서 6일 동안 배양하였을 때, 상기 균주의 효소활성이 높음을 확인하였고(도 4, 도 5, 및 도 7), 포자수의 경우, 표 2 내지 표 4, 및 도 10에 나타난 바와 같이, 액체종균을 5% 접종하고, 40℃에서 5일 동안 배양하였을 때, 상기 고체종국의 포자수가 높음을 확인하였다(표 2 내지 표 4, 및 도 10). 또한, 표 5 내지 표 7, 및 도 11에 나타난 바와 같이, 액체종균의 접종량이 적을수록, 발효기간이 길어질수록 고체종국의 세균수가 감소하는 것을 확인하였다(표 5 내지 표 7, 및 도 11).
따라서, 본 발명의 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5 고체종국의 제조방법은 효소활성이 높고, 포자수가 많으며, 세균수가 적은 형태의 고체종국을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 균주 배양
생쌀 전분 및 호화배지에서 산 생성능이 높은 탁주용 곰팡이로 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)를 선정하여 사용하였다. 상기 곰팡이는 전통 발효식품인 누룩에서 분리하여 농촌진흥청 발효식품과 발효자원연구실에서 확보하여 하기 표 1의 조성으로 제조한 밀기울 배지(밀기울(7.5%)을 증류수 100 mL에 넣고 초고압멸균기(121℃, 15분)로 살균) 또는 PDA 배지를 이용하여 계대배양한 후, 4℃에 보관하면서 사용하였다.
배지 조성(%)
PDA 배지 MEA 배지
감자 전분(potato starch) 0.4 맥아 추출물(malt extract) 3
덱스트로스(dextrose) 2 펩톤(peptone) 0.5
한천(agar) 1.5 한천(agar) 1.5
< 실시예 2> 고체종국 제조
고체종국은 잡균의 오염 등을 방지하기 위해서 소형 제국기(Mini-15, Yaekagi, 일본)를 이용하여 도 1에 나타난 과정으로 제조하였으며, 구체적인 방법은 하기와 같으며 도 2에 나타내었다:
1) 도정된 쌀을 깨끗이 씻고 물에 4~12시간 담근다;
2) 물이 축적된 쌀을 소쿠리에 1시간 정도 넣어 두어 물을 뺀다;
3) 쌀을 찜 솥에 넣고 1시간 정도 찐 뒤, 40℃가 되도록 빨리 식힌다;
4) ME 배지(맥아 추출물 3% 및 펩톤 0.5%)에 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5를 1 백금이 접종하여 28℃에서 5일 동안 전배양 한 후, 본배양 배지에 2%를 접종하여 6일 동안 더 배양한 액체종균을 고두밥에 5% 뿌려 섞은 후, 종균을 배양시킨다;
(배양조건 : 36℃, 수분 50%(5시간) 배양 → 38℃, 수분 70%(16시간) 배양);
5) 배양하면서, 상기 고두밥을 2~3일 간격으로 뒤집기와 뒤섞기를 수행한다;
6) 4일째 제국기에서 꺼내어, 45℃에서 24시간 동안 거조시켜 사용한다; 및
7) 탁주용 고체종국을 분상 및 조제형태로 제조한다(도 2).
<실험예 1> 탁주용 곰팡이를 이용한 고체종국 최적화 조건 구명
<1-1> 액체종균 접종량에 따른 품질 분석
탁주 제조용 곰팡이 고체종국 최적화 조건을 구명하기 위하여 액체종균의 접종량에 따른 효소활성을 분석하였다.
구체적으로, ME 배지에 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)를 각각 1 백금이 접종하고, 28℃에서 5일 동안 전배양 한 후, 본배양 배지에 2%를 접종하여 6일 동안 더 배양한 액체종균을 고두밥에 각각 2, 5, 및 10%를 살포하여 섞은 후, 상기 <실시예 2>의 소형 제국기를 이용하여 습도를 70%로 유지하며 종국을 배양시켰다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 제조된 고체종국의 효소활성은 액체종균의 접종량이 증가할수록 효소활성이 높아짐을 확인하였다(도 3).
<1-2> 제국 온도에 따른 품질 분석
제국 온도에 따른 품질을 분석하기 위하여, 상기 <실시예 2>의 소형 제국기의 습도를 70%로 일정하게 유지하고, 단계 4)의 온도 조건을 변화하며 이하 동일한 제조방법으로 제국 온도의 설정에 따른 효소활성을 분석하였다.
그 결과, 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5(KACC93235P)는 40℃에서 산성 단백질 효소활성이 가장 높게 나타나, 낮은 온도(20~30℃) 보다는 곰팡이 균사체와 포자가 잘 생육할 수 있는 35~40℃로 최적온도를 조정함으로써 효소활성이 2배 이상 높은 것을 확인하였다(도 5).
<1-3> 제국 시간에 따른 효소활성 분석
상기 균주를 이용한 고체종국의 최적 발효시간을 구명하기 위하여, 상기 <실시예 2>의 제조방법으로, 도 6에 나타난 바와 같이 7일간 배양하면서 효소활성을 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5는 발효시간이 경과할수록 효소활성이 증가하는 경향을 보였고, 특히 96시간에 급격히 증가함을 확인하였으며, glucoamylase 활성의 경우, 96시간 이후에도 증가하여 96~144시간에 가장 높은 활성을 나타내고 이후에는 감소하는 경향을 나타냄을 확인하였다(도 7). 종래에 일본에서 도입된 국법의 경우, 아스퍼질러스 루추엔시스의 제국 발효는 4일(96시간)째에 출국을 하지만, 우리나라 전통누룩에서 분리한 상기 균주의 접종량과 양조미 제국조건에 따른 차이를 바탕으로, 효소활성이 가장 우수한 제국 6일째로 최적조건을 구명하였다.
< 실험예 2> 고체종국의 포자수 확인
액체종균 접종량, 제국 온도, 및 제국 기간에 따른 고체종국의 포자수 및 세균수를 하기의 방법으로 측정하였다.
구체적으로, 시험재료 1~2 g을 정확히 준비하여 5% 트윈(Tween) 용액 10 mL에 1% 메틸렌 블루(Methylene blue) 2~3 방울을 가하고 묽게 희석한 후, 혈구계산판(hemocytometer)에 떨어뜨리고, 현미경을 이용하여 검정하였다(도 5). 현미경으로 반복하여 측정한 수를 a라 하고, 포자수는 하기의 식으로 구하였다.
포자수 = (측정한수(a) × 묽게 한 배수)/시험재료량(g)
그 결과, 표 2 내지 표 4, 및 도 10에 나타난 바와 같이, 액체종균을 5% 접종하였을 때, 제국 온도 40℃, 및 제국 5일째에 가장 많은 포자를 생성함을 확인하였다(표 2 내지 표 4, 및 도 10).
액체종균 접종량에 따른 고체종국의 포자수
종균 접종량(%)
2 5 10
A. luchuensis 74-5 13.2±13.8×106 12.7±8.9×106 10.2±19.7×106
제국 온도에 따른 고체종국의 포자수
종균 제국 온도(℃)
20 30 35 40
A. luchuensis 74-5 3.9±11.5×106 13.3±21.0×106 15.7±10.8×106 16.5±21.0×106
제국 기간에 따른 고체종국의 포자수
종균 제국 기간(일)
1 2 3 4 5 6
A. luchuensis 74-5 2.15±2.8×106 11.3±6.6×106 11.7±4.3×106 12.7±18.0×106 15.2±9.3×106 13.2±13.9×106
< 실험예 3> 고체종국의 세균수 확인
액체종균 접종량, 제국 온도, 및 제국 기간에 따른 세균수를 하기의 방법으로 측정하였다.
구체적으로, 시료 10 g을 취하여 멸균 백에 넣고, 90 mL의 멸균 생리식염수를 사하여 균질기로 용해하고 멸균 생리식염수로 단계별로 희석한 후, PCA 배지에 도말하고, 나타난 세균수를 CFU/g으로 표기하였다.
그 결과, 표 5 내지 표 7, 및 도 11에 나타난 바와 같이, 세균의 오염 수치는 102~103이었고, 액체종균의 접종량이 증가할수록, 세균수는 적게 나타났고, 제국온도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 나타냈으며, 제국 기간이 길어지면서 세균의 수가 감소하는 것을 확인하였다(표 5 내지 표 7, 및 도 11).
액체종균 접종량에 따른 세균수
종균 접종량(%)
2 5 10
A. luchuensis 74-5 4.10±10.5×103(CFU/g) 3.40±11.7×103(CFU/g) 2.47±1.15×103(CFU/g)
제국 온도에 따른 고체종국의 세균수
종균 제국 온도(℃)
20 30 35 40
A. luchuensis 74-5 3.0±0.6×102(CFU/g) 2.0±1.0×102(CFU/g) 2.7±4.0×103(CFU/g) 3.7±21.5×103(CFU/g)
제국 시간에 따른 고체종국의 세균수
종균 제국 기간(일)
1 2 3 4 5 6
A. luchuensis 74-5 7.4±11.0×103
(CFU/g)		 3.9±17.4×103
(CFU/g)		 5.3±2.5×103
(CFU/g)		 3.8±8.5×103
(CFU/g)		 1.9±6.6×103
(CFU/g)		 3.4±10.0×103
(CFU/g)
특히, 일본 종균제조 회사의 경우, 평균 102개 정도의 세균 오염은 무시하고 제품을 출시하는데, 본 발명의 실험예의 결과는 일본 보다 세균수가 조금 높지만, 탁주용 종균 산업화를 위한 대량생산 시스템 구축(Clean room) 된 종균회사에서 생산을 하면 일본의 종국회사처럼 오염도를 낮출 수 있다.
< 실험예 4> 제국 시간에 따른 품온 변화
상기 균주를 이용한 고체종국을 상기 <실시예 2>의 방법으로 7일간 제국하면서, 이의 품온 변화를 조사하였는데, 제국기의 온도를 일정하게 유지함으로써, 상기 균주가 생육하면서 내는 품온의 변화도 일정하게 유지하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
국립농업과학원 KACC93235P 20150615

Claims (2)

1) 도정된 쌀을 세척 후, 물에 4 내지 12시간 동안 침지시킨 다음 30분 내지 120분 동안 절수하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 쌀을 40분 내지 120분 동안 증자시킨 후, 40 내지 50℃가 되도록 방냉시켜 고두밥을 제조하는 단계;
3) 아스퍼질러스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) 74-5(KACC93235P)를 25 내지 30℃에서 4 내지 6일 동안 전배양하고, 상기 전배양한 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5를 본배양 배지에 접종하여 25 내지 30℃에서 4 내지 6일 동안 본배양하여 액체 종균을 얻는 단계;
4) 제국기에서 상기 단계 2)의 고두밥에 상기 단계 3)에서 얻은 액체 종균을 5 내지 10%의 농도로 접종한 후, 뒤집기와 뒤섞기를 하면서 배양시키되, 상기 배양은 30 내지 35℃에서 5-6일 동안 배양하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 배양된 고두밥을 40 내지 50℃에서 20 내지 30시간 동안 건조시킨 후, 분상 또는 조제 형태로 제조하는 단계를 포함하는 효소 활성이 높고, 포자수가 증가하며 세균수가 감소되는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5를 이용한 고체종국의 제조방법.
제1항의 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 루추엔시스 74-5 균주의 고체종국.

















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