WO2013176460A1 - 탄소원 기질과 염기의 유가식 공급에 의한 유기산 제조 방법 - Google Patents

탄소원 기질과 염기의 유가식 공급에 의한 유기산 제조 방법 Download PDF

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organic acid
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박재연
강신영
박우찬
구민수
조인호
박중민
이승엽
김동현
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an organic acid by fed-batch culture. More specifically, the present invention relates to a method for producing an organic acid by supplying a carbon source and a base in a fed-batch manner.
  • organic acids Fermentation for the production of organic acids has been carried out for a long time, such as being used in various foods, food additives, chemical materials, etc.
  • organic acids are highly available as raw materials for fuel and chemical production as well as eco-friendly and renewable energy development. It is evaluated as a resource.
  • Organic acid fermentation has generally been realized through a batch fermentation method, and organic acid production by batch fermentation is disclosed in US Pat. Nos. 5,503,750, 5,766,439, and the like.
  • the batch fermentation method is a method of obtaining an organic acid by injecting a microorganism into a fermentor at the same time into a fermentor, which is a substance for producing an organic acid, by injecting microorganisms. Because yields of organic acids from a certain amount of sugar are limited, high concentrations of sugars must be initially injected to obtain high concentrations of organic acids in batch fermentation. However, a high concentration of sugar inhibits the growth of microorganisms and causes a decrease in fermentation rate. A method designed to solve this problem is fed-batch culture.
  • the fed-batch culture is a method of batch culture by setting an appropriate sugar concentration at the beginning and gradually injecting a high concentration of sugar to obtain a product of a desired concentration so that the sugar is kept at a low concentration in the culture.
  • the sugar control method known to date is a method in which a user injects a sugar by determining a sugar infusion rate according to an analysis of growth patterns of microorganisms, or recognizes DO (dissolved oxygen content) or pH (hydrogen ion index) value accordingly. It is known to inject sugar automatically. In the case of fed-batch cultivation using the former method, productivity and yield can be improved compared to batch cultivation, but there is an inefficiency because it can not accurately adjust the growth and sugar consumption rate of microorganisms, There is a difficulty to observe.
  • the latter pH stat or OD stat fed-batch cultivation method is known to have a small change in sugar concentration and well match the growth tendency of microorganisms, so it is widely used for culturing aerobic microorganisms such as Escherichia coli.
  • the pH-stat fed-batch cultivation method utilizes the pH drop caused by aerobic microorganisms, such as Escherichia coli, ingesting and metabolizing sugars. It aims to inject sugar to the extent that it does not. This is done by setting a desired pH and injecting a small amount of sugar when there is a slight rise in pH.When a small amount of sugar is metabolized, the pH is slightly reduced. Over and over again.
  • conventional fed-batch methods such as pH stat cannot be used.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for producing an organic acid that can obtain a high level of organic acid concentration, productivity and yield by using a fed-batch culture method through a simple and reliable carbon source injection method for organic acid fermentation.
  • kits comprising: i) a carbon source substrate; And ii) ammonium bicarbonate, ammonium carbonate, or alkali metal-containing weak bases such as sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate
  • a medium containing one or more bases selected from (potassium carbonate) in a fed-batch to a reactor containing a carbon source substrate and an organic acid producing strain, it is possible to change the pH and the carbon source substrate concentration according to the fermentation to an appropriate pH. It is to provide a method for producing an organic acid by fed-batch cultivation which simultaneously achieves control and supply of a carbon source substrate (eg saccharides).
  • a carbon source substrate eg saccharides
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for producing butyric acid through the fed-batch culture method of the present invention.
  • Carbon source is injected along with the base injection according to the pH change, and the carbon source is fed in a fed-batch manner to the fermentation system for organic acid production by feeding the carbon source substrate and base together in a fed-batch manner.
  • the concentration can be kept constant. Therefore, compared to the conventional method of directly measuring the concentration or pH of the carbon source or the user to determine the growth rate of microorganisms by time zone, the reproducibility is high and the productivity and yield of organic acids are excellent.
  • the process efficiency can be maximized, and the production of by-products such as acetic acid is relatively low and the need for expensive seed culture medium is eliminated. Elimination or reduction can provide an economical way to reduce the cost of the fermentation process.
  • 1 is a view schematically showing an embodiment of the organic acid production method by fed-batch culture according to the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the production profile of butyric acid and acetic acid according to the fed-batch culture of Example 2.
  • the present invention is based on the fact that there is a direct relationship between the content of carbon sources consumed by microorganisms and the content of organic acids produced (ie lowered pH).
  • the present invention provides a carbon source substrate, ammonium bicarbonate, ammonium carbonate or (ammonium carbonate) so as to supplement the carbon source lost due to organic acid production and at the same time increase the pH lowered by the organic acid produced during organic acid production.
  • the substrate-base mixed solution containing at least one base selected from alkali metal-containing weak bases is fed in a fed-batch manner to improve the efficiency of organic acid production.
  • strong bases such as NaOH, KOH, Ca (OH) 2, etc.
  • strong bases especially bases containing calcium (Ca)
  • weak bases in particular ammonium bicarbonate, ammonium carbonate or alkali metal-containing weak bases, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate or mixtures thereof are used for neutralizing organic acids.
  • ammonium bicarbonate and ammonium carbonate are advantageous in that they act as nutrients in addition to the organic acid neutralizing function by supplying ammonium ions necessary for the growth of microorganisms.
  • One aspect of the present invention provides a method for producing a microorganism comprising i) a carbon source substrate to maintain a pH suitable for growth of microorganisms for fermentation of a carbon source substrate; And ii) fed a substrate-base mixture comprising at least one base selected from ammonium bicarbonate, ammonium carbonate or an alkaline base into a fermentation reactor comprising a carbon source substrate and an organic acid producing strain. It provides a method for producing an organic acid by fermentation of a carbon source substrate comprising the step of.
  • One embodiment of the present invention provides a method for preparing an organic acid by fed-batch cultivation, the method comprising:
  • a culture solution comprising a carbon source substrate, an organic acid producing strain, and a component (strain growth component) necessary for growth of the strain;
  • a carbon source substrate such that the pH of the culture is maintained in a pH range suitable for growth of an organic acid producing strain; And fermenting the carbon source substrate under an environment suitable for strain growth while feeding the substrate-base mixed solution comprising at least one base selected from ammonium bicarbonate, ammonium carbonate, or an alkali metal containing weak base in a fed-batch manner, and:
  • an alkali metal-containing weak base is a weak base containing an alkali metal of Group 1 of the periodic table, and is interpreted to include sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium carbonate, or potassium carbonate.
  • the carbon source substrate comprises monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, or mixtures thereof as sugars, for example glucose, fructose, sucrose, galactose, mannose, xylose, arabinose , Sugar cane, molasses (Molasses), starch hydrolysates and the like, but is not limited thereto.
  • the content ratio of the carbon source substrate and the base in the substrate-base mixture supplied during fermentation may be arbitrarily adjusted by the user in consideration of the solubility of the base and the rate of organic acid formation.
  • the content ratio of the carbon source substrate and the base may be arbitrarily changed even during the fermentation process under the premise that the supplied carbon source substrate and the base are sterilized.
  • the carbon source substrate fed in a fed-batch may be the same as or different from the carbon source substrate originally included in the culture in the fermentation reactor.
  • Essential components for growth of the strain include, but are not limited to, carbon source degrading enzymes such as nitrogen sources, vitamins, inorganic salts, and / or invertases, in addition to carbon source substrates. Those skilled in the art can easily determine the ingredients necessary for growth depending on the strain based on known techniques.
  • the organic acid produced according to the fed-batch culture is butyric acid, lactic acid, acetic acid, formic acid, citric acid, adipic acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, 3-hydroxy propionic acid, glutamic acid, glutaric acid, glutamic acid, ita It is interpreted to include various organic acids that can be utilized as biofuels and biochemicals such as cornic acid, acrylic acid, and muconic acid.
  • the organic acid producing strain may include all microorganisms capable of producing an organic acid by fermenting a carbon source, for example Clostridium strain, Pseudomonas strain, Rhizopus genus Strain, Aspergillus strain, Corynebacterium strain, Actinobacillus strain, Yeast, Candida yeast, Pichia yeast, Escherichia coli (E. Coli), and Lactic acid bacteria, and more specifically, Clostridium C. tyrobutyricum, Clostridium Butyricum, Clostridium C. acetobutyricum, P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, R. arrhizus, R.
  • Clostridium strain for example Clostridium strain, Pseudomonas strain, Rhizopus genus Strain, Aspergillus strain, Corynebacterium strain, Actinobacillus strain, Yeast, Candida yeast, Pichia yeast
  • arrhizus Fuchs o Can be re R. oryzae
  • Aspergillus duck material A. oryzae
  • Corynebacterium glutamicum C. glutamicum
  • Lactobacillus also know pillar's (L. acidophilus), etc.
  • Environment suitable for strain growth in the present invention means anaerobic conditions, temperature range, and pH range suitable for fermentation using the strain, these conditions may vary depending on the strain used, a person skilled in the art based on known techniques
  • the environment of the reactor can be adjusted to be suitable for strain growth.
  • the temperature can range from 20 to 50 ° C. and the pH can range from 4 to 7.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing butyric acid by fermenting a saccharide in the presence of strains of the genus Clostridium, from saccharides and ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate and potassium carbonate
  • a process for the production of butyric acid fed by fed at least one base selected. If necessary, the culture may be progressed by adding a carbon source substrate, a nitrogen source, vitamins and inorganic salts, and / or enzymes such as invertase, which are components normally required for fermentation.
  • preparing a culture medium comprising a carbon source substrate, butyric acid producing strain, and components necessary for growth of the strain
  • Butyric acid is prepared through fed-batch culturing comprising recovering butyric acid produced by fermentation of a carbon source substrate from the culture.
  • Butyric acid-producing strains include Clostridium spp., More specifically Clostridium tyrobutyricum, Clostridium butyricum, Clostridium acetobutyricum and The same strain etc. are mentioned.
  • the present invention feed-fed a neutralization solution containing a carbon source substrate and a base (eg, ammonium bicarbonate) from the feed tank into the fermentor.
  • a neutralization solution containing a carbon source substrate and a base eg, ammonium bicarbonate
  • the fermenter may be equipped with a pH control sensor and / or a gas meter.
  • the pH control sensor is for setting the pH of the culture solution in the fermentor to a pH suitable for the growth of organic acid producing microorganisms.
  • the fermentation reactor may include a conventional fermentation broth component such as an organic nitrogen source. As the fermentation progresses, it is designed to automatically inject a mixture of carbon source substrate and base (eg ammonium bicarbonate) when the pH is outside the set range.
  • a mixture of carbon source substrate and base eg ammonium bicarbonate
  • Suitable pH for the growth of each organic acid producing microorganism is known in the art. For example, if the organic acid produced is butyric acid, the optimal pH suitable for butyric acid producing microorganism growth is in the range of 4.5-7.
  • a gas meter may be used in conjunction with or separately from a pH control sensor as necessary, and the rate of injection of the carbon source substrate and the base mixed solution through the gas generation rate or Injection stop timing can be adjusted.
  • the injection stop point of the carbon source substrate and the base mixed solution may be determined in consideration of the gas generation rate as described above, or may be easily determined by those skilled in the art in consideration of the amount of the mixed solution injected.
  • organic acid fermentation has a product inhibition by organic acids produced during fermentation, so as the fermentation progresses, the fermentation performance gradually decreases. In some cases, the fermentation is stopped without exhausting the carbon source substrate. Carbon sources can be lost.
  • the medium injected for fed-batch cultivation uses ammonium bicarbonate, which is a weakly basic neutralizing agent, in order not to be affected by high pH, and a base such as ammonium bicarbonate neutralizes an organic acid such as butyric acid and carbon dioxide ( CO 2 ) and hydrogen (H 2 ) gas are discharged. At this time, after determining the performance of the fermentation by the production rate of the discharged gas can be continuously supplied to the carbon source substrate until the appropriate time.
  • the fermentation proceeds by consuming all of the carbon source substrate, and thus, the supply of the carbon source substrate can be stopped at an appropriate time point so that the process can be efficiently operated to achieve the optimum fermentation performance without loss of the remaining carbon source substrate.
  • the pH control of the fermentor is carried out by conventional methods known in the art, such as ammonia water, alkali metal hydroxide, until the fermentation of the remaining carbon source substrate is completed.
  • the fermentation medium is generally used as a medium for the final culture of seed trains without using expensive medium required for seed culture of bacterial strains. It can be used to greatly improve the economics of fermentation.
  • the seed culture was used as Reinforced Clostridial Medium (RCM) or a similar high nutrient medium.
  • RCM Reinforced Clostridial Medium
  • such expensive seed culture medium is a factor of raising the cost of the product by making the economy of fermentation worse.
  • the medium component of the final seed train is used together with the present fermentation component, it can be fermented normally without any performance decrease.
  • Sugar cane sap and minerals were added to a 50L anaerobic fermenter (sugar concentration 150-200 g / L, 30L), and the reaction solution was anaerobic through nitrogen purging.
  • Clostridium tyrobutyricum was added to 1% of the culture medium. After inoculation at ⁇ 20%, the pH of the fermentation broth was maintained at 6.0 using ammonia water while maintaining at 37 ° C. The fermentation proceeds while maintaining the anaerobic conditions by the carbon dioxide (CO 2 ) and hydrogen (H 2 ) generated as the fermentation proceeds.
  • Sugar cane sap and minerals were added to a 50 L anaerobic fermenter (sugar concentration 20-40 g / L, 10-15 L), inoculated with the same microorganism as Comparative Example 1, and then mixed with ammonium bicarbonate and maintained at 37 ° C.
  • the pH of the fermentation broth was maintained at 6.0 using an aqueous solution (ammonium bicarbonate concentration 80-120 g / L, sugar concentration 200-300 g / L, 15-20 L).
  • the initial volume of the culture starts smaller than the batch type, but the volume of the final culture medium is the same and the volume of the final culture medium can be adjusted.
  • Example 1 it can be seen that the fed-batch culture is excellent in all the fermentation result indicators tested.
  • Example 1 it can be seen that the production of by-product acetic acid (AA) is suppressed to greatly improve the yield of butyric acid.
  • This increase in fermentation performance is interpreted to occur as the inhibition of microbial growth is greatly reduced as the sugar concentration is maintained at a level that does not inhibit microbial growth.
  • the batch culture of Comparative Example 1 even if the initial initial sugar concentration is maintained, the fermentation may not proceed anymore even in the presence of sugar due to the state of the microorganisms depending on the ash content and the ash of the fermentation. .
  • Example 2 fed-batch cultivation through a mixed feed of ammonium bicarbonate and medium
  • BA butyric acid
  • the fermenter starts culturing with a volume of 20% to 50% of the desired final volume, using the two reactors of the feed tank and the fermentor, and the remaining volume is the substrate-base mixed liquid (carbon source substrate) in the feed tank according to the pH change.
  • a pH adjuster comprising a base).
  • the medium composition of the fermenter is as follows. Dissolve 0.8L of sugarcane syrup stock solution, 180g of organic nitrogen source CSP (Corn Steep Powder), and 1.8g of FeSO 4 ⁇ 7H 2 O to make 14L fermentation broth, add 1.5ml of antifoaming agent, and autoclave to make medium for fermentation reactor. Prepare. After dissolving 54 g of KH 2 PO 4 in a 1 L container, autoclave it to cool completely and injecting it into the fermentor together with a prepared medium. In a supply tank, add 19.5 L of a solution of 7.4 L of sugarcane syrup solution and water, and add 2 ml of antifoam. After the autoclave, 2 kg ammonium bicarbonate (NH 4 HCO 3 ) is added. Stirring continued for 12 hours after injection to completely dissolve the ammonium bicarbonate.
  • 3 L of spawn medium of Clostridium tyrobutyricum is inoculated into the fermentation reactor. If necessary, several ppm of enzyme (invertase) was added to the reactor.
  • the pH is adjusted to 6.3 using ammonia water.
  • the reaction conditions are as follows. pH: 6.3, temperature: 37 ° C., stirring speed: 200 rpm.
  • the medium composition of the fermenter is as follows. Dissolve 8L of sugarcane syrup solution, 330g of organic nitrogen source CSP (Corn Steep Powder), and 1.6g of FeSO 4 ⁇ 7H 2 O to make 27L of fermentation broth, add 3 ml of antifoam, and autoclave to prepare the medium for the fermentation reactor. Prepare. After dissolving 49 g of KH 2 PO 4 in a 1 L container, autoclave it, and after cooling completely, it is injected into a fermentor together with a prepared medium. After the end of the autoclave, 3 L of spawn medium of Clostridium tyrobutyricum is inoculated into the fermentation reactor. If necessary, several ppm of enzyme (invertase) was added to the reactor.
  • the pH is adjusted to 6.3 using ammonia water.
  • the reaction conditions are as follows. pH: 6.3, temperature: 37 ° C., stirring speed: 200 rpm.
  • Example 2 The results obtained through the fermentation of Example 2 and Comparative Example 2 are shown in Table 2.
  • Table 2 compared to the conventional batch culture (Comparative Example 2), the fed-batch culture (Example 2) according to the present invention can be seen that there is an increase in all fermentation performance and a significant increase in the BA titer (titer) have.
  • Figure 2 shows the production profile of the resulting BA and byproduct acetic acid (AA). Through this, it can be seen that there is a decrease in AA in the fed-batch culture according to the present invention, and this decrease in AA contributes to the improvement of fermentation yield and BA production.

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Abstract

본 발명은 탄소원의 발효를 위한 미생물의 성장에 적합한 pH를 유지하도록 탄소원 기질 및 염기를 유가식으로 공급하는 단계를 포함하는 유가식 배양 방법 및 이를 이용한 유기산 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 미생물 발효에 의한 유기산 생산시 이탄산 암모늄, 탄산 암모늄 또는 알칼리 금속 함유 약염기와 같은 중화제 및 탄소원 기질을 함께 유가식으로 공급함으로써, 탄소원 발효를 위한 미생물 생존에 적절한 pH를 유지하는 동시에 원료 물질인 탄소원 기질의 주입 속도를 적절하게 조절하는 것으로서, 유기산의 생산성, 수율 및 생성농도를 높여주며 pH 변화에 따라 염기와 탄소원 기질이 자동으로 주입되므로 발효 공정 운전의 신뢰도 및 간편성을 높일 수 있다.

Description

탄소원 기질과 염기의 유가식 공급에 의한 유기산 제조 방법
본 발명은 유가식 배양에 의한 유기산 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 탄소원과 염기를 유가식으로 공급하여 유기산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
유기산 제조를 위한 발효는 각종 식품과 식품첨가물, 화학재료 등에 활용되는 등 오랜 기간 동안 수행되어 왔으며, 최근 들어 유기산은 친환경, 신재생 에너지 개발과 더불어 연료 및 화학 물질 생산의 원료 물질로서 활용가능성이 높은 자원으로 평가받고 있다.
유기산 발효는 일반적으로 회분식(batch) 발효 방법을 통해 구현할 수 있었으며, 회분식 발효에 의한 유기산 생성은 미국 특허 제5,503,750호, 제5,766,439호 등에 개시되어 있다. 회분식 발효 방법은 미생물이 유기산을 생성하기 위한 물질인 발효기에 당, 질소원, 무기물 등을 동시에 넣고 미생물을 주입하여 발효시킴으로써 유기산을 얻는 방법이다. 일정한 양의 당으로부터 얻을 수 있는 유기산의 수율은 제한적이기 때문에, 회분식 발효에서 높은 농도의 유기산을 얻기 위해서는 초기에 고농도의 당을 주입해야 한다. 그러나, 고농도의 당은 미생물 성장을 저해하여 발효 속도를 저하시키는 원인이 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 고안된 방법이 유가식(fed-batch) 배양이다.
유가식 배양은 초기에 적당한 당 농도를 설정하여 회분식 배양을 하고 사용자가 원하는 농도의 생성물을 얻기 위해 고농도의 당을 점진적으로 주입하여 배양액 내에서 당이 낮은 농도로 유지되도록 하는 방법이다. 이때, 어느 시기에 어떠한 방법으로 얼마만큼의 당을 주입하느냐에 따라 다양한 유가식 배양방법이 존재하며, 각각의 방법에 따라 미생물의 생장 속도나 생성물의 수율 등에 영향을 줄 수 있다.
현재까지 알려진 당 제어 방식은, 미생물의 생장 패턴 분석에 따라 사용자가 당의 주입속도를 결정하여 일정하게 당을 주입하는 방식, 또는 DO(용존 산소량) 혹은 pH(수소이온지수) 값을 인지하여 이에 따라 자동적으로 당을 주입하는 방식이 알려져 있다. 전자의 방식을 이용한 유가식 배양의 경우 회분식 배양에 비해서는 생산성과 수율의 향상을 가져올 수 있지만, 미생물의 생장 및 당 소모 속도를 정확하게 맞춰줄 수 없어 비효율적인 부분이 있으며 사용자가 당의 주입양을 지속적으로 관찰해야 하는 어려움이 있다.
한편, 후자의 pH stat이나 OD stat 유가식 배양 방법은 당 농도의 변화가 적고 미생물의 생장 경향과 잘 맞는다고 알려져 있어 대장균과 같은 호기성 미생물의 배양에 널리 사용되고 있다. 특히, pH-stat 유가식 배양방법은 대장균과 같은 호기성 미생물이 당을 섭취하고 대사하면서 발생하는 pH 강하(drop) 현상을 당 주입에 활용한 것으로서 최소한의 당 농도를 유지하면서 미생물의 활성은 떨어뜨리지 않는 범위 내에서 당을 주입하는 것을 목적으로 하고 있다. 이는 원하는 pH를 설정하고 미세한 pH 상승이 있을 때 소량의 당이 주입되는 방식으로, 소량의 당이 대사되면 pH는 미세하게 감소되며 당이 모두 소진되면 다시 pH가 상승하여 당이 다시 주입되는 순환을 거듭하게 된다. 그러나, 유기산 생산을 위한 발효의 경우 생성된 유기산에 의하여 pH의 지속적인 감소는 있으나, 당의 소모에 따른 미세한 pH의 상승과 같은 현상이 발생하지 않으므로 pH stat과 같은 기존의 유가식 방법은 사용할 수 없다.
본 발명자들은 발효가 진행됨에 따라 pH가 지속적으로 감소하는 유기산 생산 발효에 pH stat과 같은 기존의 유가식 배양 방법을 사용하기가 적절하지 않다는 점을 확인하고, 탄소원 기질(당)과 염기를 함께 공급하여 유기산 생성을 위한 혐기성 미생물의 생장을 위한 최적 조건을 제공할 수 있는 유가식 배양에 의한 유기산 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 한 면은 유기산 발효 시 간편하고 신뢰성있는 탄소원 주입 방식을 통한 유가식 배양법을 이용하여, 높은 수준의 유기산 농도, 생산성 및 수율을 얻을 수 있는 유기산 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 한 면은, i) 탄소원 기질; 및 ii) 이탄산 암모늄(ammonium bicarbonate), 탄산 암모늄(ammonium carbonate) 또는 알칼리 금속 함유 약염기(예: 이탄산 나트륨(sodium bicarbonate), 이탄산 칼륨(potassium bicarbonate), 탄산 나트륨(sodium carbonate), 탄산 칼륨(potassium carbonate))으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 혼합한 배지를 탄소원 기질 및 유기산 생산 균주를 포함하는 반응기에 유가식으로 공급함으로써, 발효 진행에 따른 pH와 탄소원 기질 농도의 변화에 대응하여 적절한 pH로의 조절과 탄소원 기질(예: 당류) 공급을 동시에 달성하는 유가식 배양에 의한 유기산 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 면은, 본 발명의 유가식 배양 방법을 통하여 부티르산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, pH 변화에 따른 염기 주입에 동반하여 탄소원을 주입하고, 염기 주입 속도에 따라 탄소원의 주입 속도를 결정하는 방식으로, 유기산 생성을 위한 발효 시스템에 탄소원 기질과 염기를 함께 유가식으로 공급함으로써 배양액 내의 탄소원 농도를 일정하게 유지할 수 있다. 따라서, 탄소원의 농도나 pH를 직접 측정하거나, 사용자가 미생물의 생장을 시간대별로 확인하여 당 주입속도를 결정하는 기존의 방식에 비하여 간편하면서도 재현성이 높고 유기산의 생산성과 수율이 우수하다.
또한, 본 발명에 따르면 발효기 내의 모든 탄소원을 소비할 때까지 발효가 지속되므로, 공정 효율을 최대한으로 높일 수 있으며, 아세트산과 같은 부산물 생산이 비교적 적고 고가의 종균 배양(seed culture)용 배지의 필요성을 없애거나 줄일 수 있으므로 발효 공정의 비용을 절감하는 경제적인 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유가식 배양에 의한 유기산 제조 방법의 구현예를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 실시예 2의 유가식 배양에 따른 부티르산과 아세트산의 생성 프로파일을 도시한 도면이다.
본 발명은 미생물에 의하여 소모된 탄소원의 함량과 생산된 유기산의 함량(즉, 낮아진 pH) 사이에 직접적인 관련이 있다는 사실에 기초한 것이다. 본 발명은 유기산 생산에 따라 소실된 탄소원을 보충하는 동시에 유기산 생성 시 생성된 유기산에 의하여 낮아진 pH를 높이는 역할을 할 수 있도록 탄소원 기질과 이탄산 암모늄(ammonium bicarbonate), 탄산 암모늄((ammonium carbonate) 또는 알칼리 금속 함유 약염기로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 함유하는 기질-염기 혼합액을 유가식으로 공급하여 유기산 생성 효율을 향상시키기 위한 것이다.
유기산 발효에서 생성되는 유기산을 중화시키기 위하여 NaOH, KOH, Ca(OH)2 등과 같은 강염기를 사용한 예들이 있으나, 이와 같은 강염기, 특히 칼슘(Ca)을 포함한 염기들은 단백질을 변형 및 침전시키는 성질이 있다. 따라서 이러한 강염기들이 배지와 혼합될 경우 배지의 질소원을 변형시켜 미생물의 이용을 저해하는 부작용이 있어 발효 효율을 떨어뜨리므로 사용이 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 약염기, 특히 이탄산 암모늄, 탄산 암모늄 또는 알칼리 금속 함유 약염기인 이탄산 나트륨, 이탄산 칼륨, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨 또는 이들의 혼합물을 유기산 중화에 사용한다. 특히 이탄산 암모늄과 탄산 암모늄은 미생물의 생장에 필요한 암모늄 이온을 공급함으로써 유기산 중화 기능 이외에 영양소로서 작용한다는 점에서 유리하다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 면은 탄소원 기질의 발효를 위한 미생물의 성장에 적합한 pH를 유지하도록 i) 탄소원 기질; 및 ii) 이탄산 암모늄(ammonium bicarbonate), 탄산 암모늄(ammonium carbonate) 또는 알칼리성 염기로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 포함하는 기질-염기 혼합액을 탄소원 기질 및 유기산 생산 균주를 포함하는 발효 반응기에 유가식으로 공급하는 단계를 포함하는 탄소원 기질의 발효에 의한 유기산 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에서는 유가식 배양에 의한 유기산 제조 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
탄소원 기질, 유기산 생산 균주, 및 상기 균주의 성장에 필수적인 성분(균주 성장 성분)을 포함하는 배양액을 준비하는 단계;
상기 배양액의 pH가 유기산 생산 균주의 성장에 적합한 pH 범위로 유지되도록 탄소원 기질; 및 이탄산 암모늄, 탄산 암모늄 또는 알칼리 금속 함유 약염기로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 포함하는 기질-염기 혼합액을 배양액에 유가식으로 공급하면서 균주 성장에 적합한 환경 하에서 탄소원 기질을 발효시키는 단계: 및
상기 배양액으로부터 탄소원 기질의 발효에 의하여 생성된 유기산을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 알칼리 금속 함유 약염기란 주기율표 1족의 알칼리 금속을 포함하는 약염기로서 이탄산 나트륨, 이탄산 칼륨, 탄산 나트륨, 또는 탄산 칼륨을 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명의 일 구현예에서 탄소원 기질은 당류로서 단당류, 이당류, 다당류, 또는 이들의 혼합물을 포함하며, 예를 들면 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로오스, 갈락토오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스, 사탕수수, 당밀(Molasses), 전분 가수분해물 등을 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
발효시 공급되는 기질-염기 혼합액 내 탄소원 기질과 염기의 함량비는 염기의 용해도, 유기산 생성 속도 등을 고려하여 사용자가 발효특성에 맞게 임의로 조절할 수 있다. 탄소원 기질과 염기의 함량비는 공급되는 탄소원 기질과 염기의 멸균상태가 유지된다는 전제 하에서 발효 공정 수행 중에도 임의로 변경이 가능하다.
유가식으로 공급되는 탄소원 기질은 발효 반응기 내 배양액에 최초로 포함된 탄소원 기질과 같거나 다를 수 있다.
균주의 성장에 필수적인 성분으로는, 탄소원 기질 이외에 질소원, 비타민, 무기염류, 및/또는 인버타아제와 같은 탄소원 분해 효소 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 통상의 기술자는 공지 기술을 기초로 균주에 따라 성장에 필수적인 성분을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에서, 유가식 배양에 따라 생성되는 유기산은 부티르산, 젖산, 초산, 개미산, 시트르산, 아디프산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 3-히드록시 프로피온산, 글루탐산, 글루타릭산, 글루카르산, 이타콘산, 아크릴산, 뮤콘산 등 바이오 연료 및 바이오 케미칼로 활용될 수 있는 다양한 유기산을 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서, 유기산 생산 균주는 탄소원을 발효시켜 유기산을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있으며, 예를 들면 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 리조푸스(Rhizopus) 속 균주, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주, 악티노 바실러스 속(Actinobacillus) 속 균주, 이스트(Yeast), 캔디다(Candida) 효모, 피치아(Pichia) 효모, 대장균(E. Coli), 및 유산균(Lactic acid bacteria)으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 클로스트리디움 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리디움 아세토부티리쿰(C. acetobutyricum), 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 플루오레슨스(P. fluorescens), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 리조푸스 오리재(R. oryzae), 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus) 등을 들 수 있다.
각 균주별 적절한 발효 조건은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서 균주 성장에 적합한 환경이란 균주를 이용한 발효에 적합한 혐기 조건, 온도 범위, 및 pH 범위를 의미하고, 이들 조건은 사용되는 균주에 따라 달라질 수 있으며, 통상의 기술자는 공지 기술을 기초로 발효 반응기의 환경이 균주 성장에 적합하게 되도록 조절할 수 있다. 예를 들면, 온도는 20 내지 50℃ 범위이고, pH는 4 내지 7의 범위일 수 있다.
본 발명의 한 구현예는, 클로스트리디움 속 균주의 존재 하에서 당류를 발효시켜 부티르산을 생산하는 방법으로서, 당류와 이탄산 암모늄, 이탄산 나트륨, 이탄산 칼륨, 탄산 암모늄, 탄산 나트륨 및 탄산 칼륨으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 유가식으로 공급하는 부티르산의 생성 방법을 제공한다. 필요에 따라, 발효를 위하여 통상적으로 필요한 성분인 탄소원 기질, 질소원, 비타민 및 무기염류, 및/또는 인버타아제(invertase)와 같은 효소 등을 첨가하여 배양을 진행시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 한 구현예에 따르면, 탄소원 기질, 부티르산 생산 균주, 및 상기 균주 성장에 필수적인 성분을 포함하는 배양액을 준비하는 단계;
상기 배양액의 pH가 4.5 내지 7의 범위로 유지되도록 탄소원 기질; 및 이탄산 암모늄, 이탄산 나트륨, 이탄산 칼륨, 탄산 암모늄, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 염기를 배양액에 유가식으로 공급하면서 균주 성장에 적합한 환경 하에서 탄소원 기질을 발효시키는 단계: 및
상기 배양액으로부터 탄소원 기질의 발효에 의하여 생성된 부티르산을 회수하는 단계를 포함하는 유가식 배양을 통하여 부티르산을 제조한다.
부티르산 생산 균주로는 클로스트리디움 속 균주, 보다 구체적으로 클로스트리디움 타이로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 클로스트리디움 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리디움 아세토부티리쿰(C. acetobutyricum)과 같은 균주 등을 들 수 있다.
도 1을 참조로 본 발명의 구현예를 설명한다.
본 발명은 발효기에서 미생물을 이용하여 탄소원 기질을 유기산 발효시킬 때, 공급 탱크로부터 탄소원 기질 및 염기(예: 이탄산 암모늄)를 포함하는 중화 용액을 발효기에 유가식으로 공급한다.
발효기에는 pH 조절 센서 및/또는 가스 미터가 장착될 수 있다.
pH 조절 센서는 발효기 내 배양액의 pH를 유기산 생성 미생물의 성장에 적합한 pH로 설정하기 위한 것이다. 발효 반응기 내에는 탄소원 이외에 유기 질소원 등의 통상적 발효액 성분을 포함할 수 있다. 발효가 진행됨에 따라 pH가 설정된 범위를 벗어나면 탄소원 기질과 염기(예: 이탄산 암모늄) 혼합 용액이 자동적으로 주입되도록 설계된다. 각 유기산 생성 미생물 성장에 적합한 pH는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 생산되는 유기산이 부티르산인 경우, 부티르산 생성 미생물 성장에 적합한 최적 pH는 4.5 내지 7의 범위인 것이다.
또한, 발효기 내에 생성되는 가스양 및 가스 생성 속도를 측정하기 위하여, 필요에 따라 pH 조절 센서와 함께 또는 별도로 가스 미터가 연결되어 사용될 수 있으며, 가스 생성 속도를 통하여 탄소원 기질과 염기 혼합 용액의 주입 속도 또는 주입 중단 시점 조절 등이 가능하다.
탄소원 기질과 염기 혼합 용액의 주입 중단 시점은 상기한 바와 같이 가스 생성 속도를 고려하여 결정될 수 있으며, 또는 주입되는 혼합 용액의 양 등을 고려하여 통상의 기술자가 용이하게 결정할 수 있다.
일반적으로 유기산 발효는 발효과정에서 생성되는 유기산에 의한 저해 작용(product inhibition)이 있기 때문에 발효가 진행될수록 점차 발효 성능이 저하되며 경우에 따라서는 탄소원 기질을 다 소모하지 못하고 발효가 중단되고, 남아 있는 탄소원이 손실될 수 있다. 본 발명에서는, 유가식 배양을 위하여 주입되는 배지가 높은 pH로 인하여 영향을 받지 않기 위하여 약염기성 중화제인 이탄산 암모늄 등을 사용하는데, 이탄산 암모늄과 같은 염기는 부티르산과 같은 유기산을 중화시키고 이산화탄소(CO2)와 수소(H2) 가스를 배출한다. 이 때 배출되는 가스의 생성 속도에 의하여 발효의 성능을 판단한 뒤 적정한 시점까지 지속적으로 탄소원 기질을 공급할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 탄소원 기질을 모두 소모하여 발효가 진행되며 이에 따라 항상 적정한 시점에 탄소원 기질의 공급을 멈출 수 있어 잔류 탄소원 기질의 손실 없이 최적의 발효 성능을 발휘하도록 공정을 효율적으로 운영할 수 있다. 공급 탱크 내 pH 조절제, 즉 탄소원 기질과 염기의 공급이 완료된 후, 발효조의 pH 조절은 남아있는 탄소원 기질의 발효가 완료될 때까지 당업계에 공지된 통상적인 방법, 예를 들면 암모니아수, 알칼리 금속 수산화물 수용액, 알칼리 토금속 수산화물 수용액, 또는 이들의 혼합물, 예를 들면 수산화 나트륨, 수산화 칼슘, 수산화 칼륨 수용액을 일정한 속도로 공급하는 등의 방법에 따라 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유가식 배양 방법을 이용하여 유기산 발효를 진행할 경우 일반적으로 박테리아 계열 발효의 종균 배양에 필요한 고가의 배지 사용 없이 본 발효 배지로써 종균 트레인(seed train)의 마지막 배양의 배지로도 사용이 가능하여 발효의 경제성을 크게 향상시킬 수 있다. 기존의 부티르산 발효에서는 본 발효에서의 효능을 높이기 위하여 종균 배양은 RCM(Reinforced Clostridial Medium) 혹은 이와 유사한 고영양분의 배지를 이용하였다. 그러나 이러한 고가의 종균 배양 배지는 발효의 경제성을 나쁘게 만들어 생산물의 원가를 상승시키는 요인이 된다. 그러나, 본 발명에 따른 유가식 배양의 경우 마지막 종균 트레인의 배지 성분을 본 발효 성분과 같이 사용하여도 성능의 감소가 없이 정상적으로 발효될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범주가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
비교예 1: 회분식 배양
50L 혐기 발효기에 사탕수수액과 무기질을 넣고(당 농도 150~200 g/L, 30L) 질소 퍼징을 통하여 반응액을 혐기로 만든 뒤 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 배양액의 1%~20%로 접종한 후, 37℃에서 유지하면서 암모니아수를 이용하여 발효액의 pH를 6.0으로 유지하였다. 발효가 진행됨에 따라 발생하는 이산화탄소(CO2)와 수소(H2)에 의하여 배양액은 혐기조건을 유지하면서 발효가 진행된다.
실시예 1: 유가식 배양
50L 혐기 발효기에 사탕수수액과 무기질을 넣고(당 농도 20~40 g/L, 10~15L), 비교예 1과 동일한 미생물을 접종한 후, 37℃로 유지하면서 이탄산 암모늄과 혼합된 사탕수수액 (이탄산 암모늄 농도 80~120 g/L, 당 농도 200~300 g/L, 15~20L)을 이용하여 발효액의 pH를 6.0으로 유지하였다. 유가식 배양의 경우 배양초기 부피는 회분식보다 작게 시작하지만 최종균 배양액의 부피는 동일하며 최종균 배양액의 부피 조절이 가능하다. 배양이 진행되면서 발생하는 CO2와 H2의 가스 발생 속도를 점검하여 이 속도가 1.5~2.5L/L 반응기/hr 범위의 적정한 수준에 도달하였을 때 이탄산 암모늄과 혼합된 사탕수수액 공급을 종료하면 그 이후 그때까지 제공한 당을 모두 소모하면서 발효가 종료된다.
비교예 1과 실시예 1의 두 가지 배양 방법 모두 부티르산은 6% 이상의 농도까지 생산되었으며 동일한 비교를 위하여 같은 농도의 부티르산 농도를 달성한 시점을 통해 두 배양 방법의 효과를 비교하였다. 세포의 농도(OD600-MAX), 부티르산 생산성(P BA), 부티르산 생산 수율(Y BA), 아세트산 생산 수율(Y AA)에 대한 비교예 1(회분식 배양)과 실시예 1(유가식 배양)의 결과는 표 1과 같다.
표 1
Figure PCTKR2013004439-appb-T000001
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 시험된 발효 결과 지표 모두에서 유가식 배양이 우수함을 알 수 있다. 특히, 실시예 1에서는 부산물인 아세트산(AA)의 생산이 억제되어 부티르산의 생산수율이 크게 향상됨을 알 수 있다. 이러한 발효성능의 증가는 미생물 생장을 저해하지 않는 수준으로 당 농도가 유지됨에 따라 미생물 생장 저해가 크게 줄어듦에 따라 나타나는 것으로 해석된다. 반면, 비교예 1의 회분식 배양의 경우 적정한 초기 당 농도를 유지하더라도 발효의 회분과 회분에 따라 달라지는 미생물의 상태에 의해 당이 있는 상태에서도 발효가 더 이상 진행되지 못하여 미량의 당이 남는 경우가 있다. 그러나, 본 발명에 따른 유가식 배양의 경우 배양이 진행되면서 발생하는 CO2와 H2의 가스 발생 속도에 의해 당의 공급 중단 시기를 조절할 수 있기 때문에 당의 손실 없이 항상 모든 당을 소모하며 발효를 진행시킬 수 있다. 본 발명에 의하여 생성되는 부티르산(BA)의 생산수율은 일반 회분식 배양 및 계단식으로 총 당을 수회에 나눠서 가당하는 방식(하기 비교예 2 참조)에 비해 크게 증가된 수준이며 이는 본 발명을 통해 제시한 이탄산 암모늄과 배지의 혼합에 따른 pH 조절의 가당 방법이 신뢰성 및 효율성이 높음을 보여준다.
실시예 2: 이탄산 암모늄과 배지 혼합 공급을 통한 유가식 배양
본 실시예에서는 유가식 배양을 이용할 경우 생산되는 부티르산(BA) 농도를 크게 향상시킬 수 있음을 보여준다. BA의 발효 생산 시 생성되는 BA는 자체 독성을 갖고 있기 때문에 생성물 억제(product inhibition)에 의하여, 당이 잔존하는 경우에도 더 이상 생성물을 생성하지 못하는 현상이 발생하며 이에 따라 생성 산의 농도가 제한되거나 당이 배양액에 남아 손실이 생기는 경우가 있다. 본 실시예에서는 적정 당 농도의 조절에 의하여 미생물에 미치는 삼투압의 변화를 최소화하여 스트레스를 감소시킴으로써 미생물의 활성을 유지시켜 고농도의 BA를 생성할 수 있도록 한다.
본 실시예에서는 공급 탱크와 발효기의 두 반응기를 이용하여 발효기는 원하는 최종 부피의 20%~50%의 부피로 배양을 시작하고, 나머지 부피는 pH 변화에 따라 공급 탱크에서 기질-염기 혼합액(탄소원 기질과 염기를 포함하는 pH 조절제)을 공급하여 채워진다.
발효기의 배지 조성은 다음과 같다. 사탕수수 시럽 원액 0.8L, 유기 질소원 CSP(Corn Steep Powder) 180g, FeSO4·7H2O 1.8g을 녹여서 14L의 발효액을 만들고 여기에 1.5ml의 소포제를 투입한 후 오토클레이브하여 발효 반응기를 위한 배지를 준비한다. 1L 용기에 KH2PO4 54g를 녹인 후 오토클레이브하여 완전히 식은 뒤 미리 준비된 배지와 함께 발효기에 주입한다. 공급 탱크에는 사탕수수 시럽 원액 7.4L과 물을 혼합하여 녹인 용액 19.5L를 넣고 여기에 2ml의 소포제를 투입한다. 오토클레이브가 끝난 후 이탄산 암모늄(NH4HCO3) 2kg을 넣는다. 주입 후 12시간 동안 계속 교반하여 이탄산 암모늄을 완전히 녹인다.
클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 종균 배지 3L를 발효 반응기에 접종한다. 필요에 따라, 수 ppm의 효소(인버타아제: invertase)를 반응기에 첨가하였다.
접종 직후 암모니아수를 이용하여 pH를 6.3으로 맞춘다. 반응 조건은 다음과 같다. pH : 6.3, 온도 : 37℃, 교반 속도 : 200rpm.
반응이 진행되면 적정한 양의 CSP를 추가로 주입할 수 있다. 가스 발생 속도를 관찰하여 그 속도가 1.5~2.5L/L 반응기/hr 범위의 적정한 수준에 도달하였을 때 공급을 멈추고 이후 발효가 완료될 때까지는 암모니아수를 이용하여 pH를 조절하였다.
비교예 2
실시예 2와 발효 결과를 비교하기 위하여, 기존의 회분식 배양에 의해 발효를 진행하였다. 발효기의 배지 조성은 다음과 같다. 사탕수수 시럽 원액 8L, 유기 질소원 CSP(Corn Steep Powder) 330g, FeSO4·7H2O 1.6g을 녹여서 27L의 발효액을 만들고 여기에 3 ml의 소포제를 투입한 후 오토클레이브하여 발효 반응기를 위한 배지를 준비한다. 1L 용기에 KH2PO4 49g를 녹인 후 오토클레이브하고, 완전히 식은 뒤 미리 준비된 배지와 함께 발효기에 주입한다. 오토클레이브가 끝난 후 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 종균 배지 3L를 발효 반응기에 접종한다. 필요에 따라, 수 ppm의 효소(인버타아제: invertase)를 반응기에 첨가하였다.
접종 직후 암모니아수를 이용하여 pH를 6.3로 맞춘다. 반응 조건은 다음과 같다. pH : 6.3, 온도 : 37℃, 교반 속도 : 200rpm.
실시예 2와 비교예 2의 발효를 통하여 나온 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이, 기존 회분식 배양(비교예 2)에 비하여 본 발명에 따른 유가식 배양(실시예 2)의 경우 모든 발효 성능의 증가 및 BA 적정량(titer)의 큰 증가가 있음을 알 수 있다. 도 2는 생성되는 BA 및 부산물인 아세트산(AA)의 생성 프로파일을 나타낸 것이다. 이를 통하여 본 발명에 따른 유가식 배양의 경우 AA의 감소가 있음을 알 수 있으며 이와 같은 AA의 감소가 발효 수율의 향상 및 BA 생성에 기여함을 알 수 있다.
표 2
Figure PCTKR2013004439-appb-T000002
비교예 3
본 비교예에서는 간헐적 당 주입 방식 및 다양한 염기를 이용하여 유가식 배양 방법에 의한 유기산 생성 효과를 확인하고자 한 것이다. 발효 개시 전 초기의 발효조 pH는 암모니아수에 의하여 조절하여 유기산 생산 균주에 적합한 환경을 조성하였다. 발효 개시 후 아래 표 3에 기재된 염기용액을 pH 프로브(probe)에 의하여 자동으로 첨가하고, 그 외에 당 만으로 이루어진 용액을 간헐적으로 주입하였다. 간헐적 당 주입은 표 3에 나타낸 바와 같이 일정한 시간 간격으로 당을 주입하는 방법 또는 지속적으로 당 농도를 분석하여 추가하는 방법에 의하여 실시되었다.
50L 혐기 발효기에 당액, 유기 질소 성분(RCM: Reinforced Clostridial Medium) 및 무기질을 넣고(당 농도 30~100 g/L, 30L), 질소 퍼징을 통하여 반응액을 혐기로 만든 뒤 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 배양액의 1%~20%로 접종한 후, 37℃에서 유지하면서 암모니아수를 이용하여 발효액의 초기 pH를 6.0으로 맞추었다. 발효 개시 후 발생되는 수소와 이산화탄소에 의하여 배양액은 혐기조건이 유지되면서 발효가 진행된다.
발효 개시 후의 발효 조건 및 발효에 의하여 생성된 최종 부티르산(BA) 최종 농도, 생성율, 수율, 및 선택도를 표 3에 나타내었다.
Fed-batch #1 : 전체 발효에 필요한 당을 3회에 걸쳐 균등분할하여 주입하였으며 각 당은 존재하는 당농도가 1~10g/L일 때 주입하였다. 사용한 염기는 암모니아 희석액이며 사용양이 표 3에 명시되었다.
Fed-batch #2 : 전체 발효에 필요한 당을 6회에 걸쳐 균등분할하여 주입하였으며 각 당은 존재하는 당농도가 20g/L 일 때 주입하였다. 이로 인하여 전체 당농도를 20~40g/L로 유지하도록 하였다. 사용한 염기는 암모니아 희석액이며 사용양이 표 3에 명시되었다.
Fed-batch #3 : 전체 발효에 필요한 당을 3회에 걸쳐 균등분할하여 주입하였으며 각 당은 존재하는 당농도가 1~10g/L일 때 주입하였다. 이는 #1의 조건과 동일하나 사용하는 염기의 종류를 암모니아에서 Ca(OH)2로 변경하여 염기 종류 변경에 의한 효과가 있는지를 확인하였다.
Fed-batch #4 : 전체 발효에 필요한 당을 지속적으로 소량으로 투입하여 (10회 이상) 당농도를 30g/L로 유지하였다. 이는 #2의 조건과 유사하지만, 이 보다 다단계로 주입하여 발효 기간 동안 당 농도 변화가 크지 않도록 하였다.
표 3
Figure PCTKR2013004439-appb-T000003
1) 생성물 중 다른 유기산의 농도(%)
표 3의 결과를 볼 때 이러한 주입 전략에서는 유의하게 높은 생성물 농도 및 수율이나 생성율 증가는 나타나지 않았다. 이 중 Fed batch #2의 경우 생성율이 증가하였으나 생성물 선택도가 떨어지는 결과를 나타내었다.
또한, 간헐적 당 주입 운전 방식은 적절한 당 농도로의 조절에 실패할 위험성이 높거나 높은 인력의존도와 낮은 자동화 가능성, 및 잦은 분석으로 인한 오염 가능성 증가 등으로 인하여 실 공정에서 사용하기가 어려웠다.

Claims (11)

  1. 탄소원 기질 및 유기산 생산 균주를 포함하는 반응기에 탄소원 기질; 및 이탄산 암모늄(ammonium bicarbonate), 탄산 암모늄(ammonium bicarbonate) 또는 알칼리 금속 함유 약염기로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 포함하는 기질-염기 혼합액을 유가식으로 공급하는 유가식 배양에 의하여 탄소원 기질을 발효시켜 유기산을 제조하는 방법.
  2. 탄소원 기질, 유기산 생산 균주, 및 상기 균주의 성장 성분을 포함하는 배양액을 준비하는 단계;
    상기 배양액의 pH가 상기 유기산 생산 균주의 성장에 적합한 pH 범위로 유지되도록 탄소원 기질; 및 이탄산 암모늄, 탄산 암모늄 또는 알칼리 금속 함유 약염기로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 포함하는 기질-염기 혼합액을 상기 배양액에 유가식으로 공급하면서 탄소원 기질을 발효시키는 단계: 및
    상기 배양액으로부터 탄소원 기질의 발효에 의하여 생성된 유기산을 회수하는 단계:
    를 포함하는 유가식 배양에 의하여 유기산을 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알칼리 금속 함유 약염기는 이탄산 나트륨(sodium bicarbonate), 이탄산 칼륨(potassium bicarbonate), 탄산 나트륨(sodium carbonate), 탄산 칼륨(potassium carbonate) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탄소원 기질은 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아라비노오스, 사탕수수, 당밀, 및 전분 가수분해물로부터 선택되는 하나 이상의 당류인 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기산은 부티르산, 젖산, 초산, 개미산, 시트르산, 아디프산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 3-히드록시 프로피온산, 글루탐산, 글루타릭산, 글루카르산, 이타콘산, 아크릴산, 및 뮤콘산으로부터 선택되는 하나 이상의 유기산인 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기산 생산 균주는 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 리조푸스(Rhizopus) 속 균주, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주, 악티노 바실러스 속(Actinobacillus) 속 균주, 이스트(Yeast), 캔디다(Candida) 효모, 피치아(Pichia) 효모, 대장균(E. Coli), 및 유산균(Lactic acid bacteria)으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 발효는 pH 조절 센서, 가스 미터, 또는 이들 모두가 장착된 발효기에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  8. 제2항에 있어서, 탄소원 기질의 발효 단계에서 상기 기질-염기 혼합액의 투입이 완료된 후 배양액 중 탄소원 기질의 발효가 완료될 때까지 암모니아수, 알칼리 금속 수산화물 수용액, 알칼리 토금속 수산화물 수용액, 또는 이들의 혼합물을 공급하면서 배양액의 pH를 상기 유기산 생산 균주의 성장에 적합한 pH 범위로 유지시키는 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 균주의 성장 성분은 질소원, 비타민, 무기염류, 및 탄소원 분해 효소로부터 선택되는 하나 이상의 성분인 것을 특징으로 하는 유기산 제조 방법.
  10. 탄소원 기질, 부티르산 생산 균주, 및 상기 균주의 성장 성분을 포함하는 배양액을 준비하는 단계;
    상기 배양액의 pH가 4.5 내지 7의 범위로 유지되도록 탄소원 기질; 및 이탄산 암모늄, 이탄산 나트륨, 이탄산 칼륨, 탄산 암모늄, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 염기를 상기 배양액에 유가식으로 공급하면서 탄소원 기질을 발효시키는 단계: 및
    상기 배양액으로부터 탄소원 기질의 발효에 의하여 생성된 부티르산을 회수하는 단계:
    를 포함하는 유가식 배양에 의하여 부티르산을 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 부티르산 생산 균주는 클로스트리디움 속 미생물인 것을 특징으로 하는 부티르산 제조 방법.
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