BR112014029364B1

BR112014029364B1 - Método de produção de ácido orgânico por cultura de lotes descontínuos alimentados e método de produção de ácido butírico por cultura de lotes descontínuos alimentados

Info

Publication number: BR112014029364B1
Application number: BR112014029364-3A
Authority: BR
Inventors: Jae Yeon Park; Sin Young Kang; Woo Chan Park; Min Su Koo; In Ho Cho; Joong Min Park; Seung Yeop Lee; Dong Hyun Kim
Original assignee: Sk Innovation Co., Ltd; Sk Energy Co., Ltd
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2021-07-13
Also published as: CN104487582A; US10337035B2; CN111073913A; KR101843586B1; JP2015517319A; JP6215313B2; BR112014029364A2; US20150140615A1; KR20130131022A; WO2013176460A1

Abstract

método de preparação de ácido orgânico através da alimentação de base e substrato de fonte de carbono em lotes descontínuos alimentados. a presente invenção fornece um método de cultura de lotes descontínuos alimentados, compreendendo uma etapa de alimentação em lotes descontínuos alimentados de uma base de fonte de carbono e uma base em tal forma que o nível de ph possa ser mantido a um nível adequado para o cultivo de microrganismos para a fermentação de uma fonte de carbono. a presente invenção também fornece um método para preparar ácidos orgânicos utilizando o método de cultura de lotes descontínuos alimentados. a presente invenção alimenta em lotes descontínuos alimentados um agente neutralizador, tal como bicarbonato de amônio, carbonato de amônio ou uma base fraca contendo metais alcalinos e um substrato de fonte de carbono no preparo de ácidos orgânicos por fermentação de microrganismos. assim, um nível de ph adequado para a sobrevivência de microrganismos para a fermentação de fonte de carbono pode ser mantido e a velocidade de injeção da base de fonte de carbono, que é o material de origem, pode ser adequadamente ajustada. a presente invenção pode melhorar a produtividade, a taxa de rendimento e a concentração de ácidos orgânicos e pode injetar automaticamente uma base e um substrato de fonte de carbono de acordo com uma variação no nível de ph, aumentando, deste modo, a confiabilidade e conveniência de uma operação de processamento de fermentação.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um método para produção de um ácido orgânico através da cultura de lotes descontínuos alimentados. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para produção de um ácido orgânico através da alimentação de uma fonte de carbono e uma base de uma forma descontínua alimentada.

HISTÓRICO DA TÉCNICA

[0002] Usados em diversos alimentos, aditivos alimentares, materiais químicos etc., os ácidos orgânicos têm sido produzidos há muito tempo através de fermentação. Nos últimos anos, os ácidos orgânicos foram avaliados como recursos altamente disponíveis como matéria-prima para combustíveis e materiais químicos úteis no desenvolvimento de novos elementos químicos ambientalmente amigáveis e de energia renovável.

[0003] A fermentação para a produção de ácidos orgânicos é geralmente conduzida de forma descontínua. A produção dos ácidos orgânicos por fermentação é divulgada nas Patentes Norte-Americanas n°. 5.503.750 e 5.766.439. De acordo com as fermentações descontínuas, os microrganismos para produção de um ácido orgânico de interesse são cultivados em um biorreator, onde uma quantidade limitada de nutrientes para o cultivo, como açúcares, uma fonte de nitrogênio, de minerais etc., é alimentada simultaneamente. Visto que a produção de ácidos orgânicos a partir de uma quantidade limitada de açúcares é limitada, uma alta concentração de açúcares é inicialmente empregada para dar uma maior quantidade de ácidos orgânicos em uma cultura descontínua. Porém, uma alta concentração de açúcares age como causa de inibir o cultivo de microrganismos a diminuir a taxa de fermentação. A cultura de lotes descontínuos alimentados é sugerida como alternativa para solucionar o problema.

[0004] A cultura de lotes descontínuos alimentados é uma técnica operacional nos processos biotecnológicos em que a cultura descontínua é inicialmente conduzida a uma concentração adequada de açúcar e então, uma alta concentração de açúcar é posteriormente fornecida para manter uma baixa concentração de açúcar no meio de cultura. A respeito dessa técnica existem diversos métodos de cultura de lotes descontínuos alimentados que dependem de quando, como e quanto açúcar deverá ser alimentado. A taxa de crescimento dos microrganismos e o rendimento do produto podem ser afetados de acordo com cada método.

[0005] As técnicas de controle de açúcar conhecidas hoje incluem uma alimentação manual de açúcar a uma taxa constante, determinada de acordo com a análise de padrão de crescimento dos microrganismos e uma alimentação automática de açúcar em resposta à informação de DO (dissolved oxygen | oxigênio dissolvido) ou pH (expoente de hidrogênio). Ao empregar a técnica anterior, a cultura de lotes descontínuos alimentados pode melhorar em produtividade e rendimento quando comparada à cultura de lotes descontínuos, porém pode ser ineficiente devido ao açúcar não poder ser alimentado de forma precisa em conjunto com o cultivo de microrganismos e o consumo de açúcar. Além disso, o operador deve observar continuamente a quantidade alimentada de açúcar.

[0006] Quanto à última técnica, a fermentação em lotes descontínuos alimentados por estatística de pH ou OD é amplamente empregada para a cultura de microrganismos aeróbicos, como o E. coli, pois faz com que as concentrações de açúcar na cultura flutuem pouco e coincidam com o perfil de crescimento dos microrganismos. Particularmente, a cultura de lotes descontínuos alimentados por estatística de pH foi desenvolvida tendo em conta o fenômeno de queda de pH que ocorre enquanto microrganismos aeróbicos como o E. coli metabolizam açúcares e é projetada para alimentar açúcar a uma concentração que seja mínima, mas não diminua a atividade dos microrganismos. No modo de lotes descontínuos alimentados por estatística de pH, é estabelecido um pH desejado e uma pequena quantidade de açúcar é alimentada quando o pH da cultura exceder a margem do valor estabelecido. Enquanto uma pequena quantidade de açúcar é metabolizada, o pH ligeiramente diminui. Caso o açúcar seja consumido completamente, o pH da cultura aumenta novamente e então o açúcar é alimentado. Esse ciclo é continuado até que o produto seja obtido de uma forma desejada. Durante a fermentação para produção de ácido orgânico, porém, a cultura não sofre o ligeiro aumento de pH induzido pelo consumo de açúcar, mas constantemente diminui em pH com a produção de ácidos orgânicos. Portanto, a cultura convencional em lotes descontínuos alimentados, tal como as estatísticas de pH, não pode ser aplicada à fermentação para a produção de ácidos orgânicos.

DIVULGAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0007] Tendo em mente o problema de que a cultura convencional em lotes descontínuos alimentados é inadequada para o uso na fermentação para a produção de ácidos orgânicos, visto que a cultura continua a diminuir em pH, com a produção de ácidos orgânicos, os presentes inventores conceberam um método para produção de um ácido orgânico no qual um substrato de fonte de carbono (açúcar) e uma base são alimentados de modo descontínuo alimentado para estabelecer uma condição ideal para o cultivo de um microrganismo aeróbico que produza o ácido orgânico.

[0008] Um aspecto da presente invenção diz respeito a um método para produção de um ácido orgânico ao alimentar de modo simples e confiável uma fonte de carbono de uma forma descontínua alimentada, através da qual uma grande concentração do ácido orgânico pode ser obtida com alta produtividade e rendimento.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[0009] De acordo com um aspecto respectivo, a presente invenção fornece um método para produção de um ácido orgânico ao alimentar uma mistura de i) um substrato de fonte de carbono; e ii) pelo menos, uma base selecionada a partir de bicarbonato de amônio ou uma base fraca contendo metal alcalino (p.ex., bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio) de uma forma descontínua alimentada a um biorreator contendo uma cepa de microrganismos produtores de ácido orgânico, através da qual a cultura possa ser adequadamente ajustada em pH e em concentração de substrato de fonte de carbono ao mesmo tempo contra uma alteração em pH e em concentração de substrato de fonte de carbono (p.ex., açúcar) enquanto a fermentação procede.

[00010] Em outro aspecto respectivo, a presente invenção fornece um método para produção de ácido butírico através do método de cultura de lotes descontínuos alimentados da presente invenção.

EFEITOS VANTAJOSOS

[00011] O método da presente invenção é configurado para alimentar uma fonte de carbono a uma taxa dependendo da taxa da qual uma base é alimentada em resposta a uma alteração de pH. Em um sistema de fermentação para a produção de ácidos orgânicos, uma fonte de carbono é alimentada, junto com uma base, de uma forma descontínua alimentada, para manter a fonte de carbono em uma concentração constante em um meio de cultura de acordo com a presente invenção. Comparado a um método convencional no qual um operador determina a taxa de alimentação de açúcar após medir diretamente a concentração da fonte de carbono, ou o pH do meio de cultura, ou analisar o cultivo de microrganismos por hora, portanto, o método da presente invenção é superior em produtividade e rendimento, além de ser mais simples e mais reproduzível.

[00012] De acordo com o método da presente invenção, a fermentação pode, ainda, durar até que a fonte de carbono esteja completamente exaurida, de forma que uma produção máxima possa ser obtida com a produção concomitante de subprodutos, tal como ácido acético, a uma extensão muito menor. Além disso, é removida ou reduzida a necessidade de um meio para o cultivo de sementes, o que é geralmente caro. Consequentemente, o método da presente invenção fornece uma estratégia econômica de reduzir os custos dos processos de fermentação.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00013] A Figura 1 é uma visualização esquemática de um sistema no qual um ácido orgânico é produzido através de cultura de lotes descontínuos alimentados, de acordo com uma aplicação da presente invenção.

[00014] A Figura 2 exibe perfis de produção do produto ácido butírico e do subproduto ácido acético.

MODO DA INVENÇÃO

[00015] A presente invenção se baseia no fato de que há uma correlação direta entre o consumo de fontes de carbono por microrganismos e o conteúdo dos ácidos orgânicos produzidos (p.ex., pH reduzido). Uma cultura para produzir um ácido orgânico se torna baixa no conteúdo de uma fonte de carbono e no pH enquanto o ácido orgânico é produzido. Na presente invenção, uma mistura de substrato-base de uma fonte de carbono e, pelo menos, uma base selecionada a partir de uma base fraca entre bicarbonato de amônio e um alcalino contendo metal é fornecida de uma forma descontínua alimentada para suplementar o conteúdo reduzido de uma fonte de carbono e aumentar o valor reduzido de pH devido à produção do ácido orgânico, melhorando assim a produtividade do ácido orgânico.

[00016] Bases fortes, tais como NaOH, KOH e Ca(OH)2, podem ser empregadas para neutralizar os ácidos orgânicos produzidos em uma cultura; no entanto elas, inter alia, as bases contendo cálcio (Ca), são altamente aptas para desnaturar e precipitar proteínas. Ao entrar em um meio, tais bases fortes desnaturam uma fonte de nitrogênio para inibir o uso da fonte de nitrogênio pelos microrganismos, resultando em uma diminuição da eficiência da fermentação. Portanto, uma base fraca especificamente, bicarbonato de amônio ou uma base fraca contendo metal alcalino, tal como bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio etc., ou ambas, são usadas para neutralizar os ácidos orgânicos na presente invenção. O bicarbonato de amônio é vantajoso, pois pode agir como uma fonte de nutrientes de íons de amônio necessária para o cultivo de microrganismos, também.

[00017] Abaixo, será dada uma descrição detalhada da presente invenção.

[00018] Um aspecto da presente invenção aborda um método para produção de um ácido orgânico por meio da fermentação de um substrato de fonte de carbono, compreendendo a alimentação de uma mistura de substrato-base contendo i) um substrato de fonte de carbono; e ii) pelo menos, uma base selecionada a partir de bicarbonato de amônio, carbonato de amônio e uma base fraca contendo metais alcalinos de forma descontínua alimentada a um biorreator contendo um substrato de fonte de carbono e uma cepa produtora de ácido orgânico para manter o pH adequado para o cultivo de microrganismos fermentando o substrato da fonte de carbono.

[00019] De acordo com uma aplicação respectiva, a presente invenção fornece um método para produção de um ácido orgânico através da cultura de lotes descontínuos alimentados, compreendendo: - preparar um meio de cultura contendo um substrato de fonte de carbono, uma cepa produtora de ácido orgânico e um ingrediente essencial para o cultivo da cepa (ingrediente de cultivo de cepas); - fermentar o substrato de fonte de carbono em uma condição ideal estabelecida ao alimentar uma mistura de substrato-base de um substrato de fonte de carbono e, pelo menos, uma base selecionada a partir de bicarbonato de amônio, carbonato de amônio e uma base fraca contendo metais alcalinos de forma descontínua alimentada ao meio de cultura para permitir que o meio de cultura tenha um valor de pH ideal para o cultivo da cepa produtora de ácido orgânico; e - recuperar o ácido orgânico do meio de cultura, o ácido orgânico sendo produzido com a fermentação do substrato de fonte de carbono.

[00020] O termo “base fraca” significa uma base contendo um metal alcalino do Grupo 1 na Tabela Periódica, assim como exemplificado pelo bicarbonato de sódio e bicarbonato de potássio.

[00021] Em uma aplicação da presente invenção, o substrato de fonte de carbono pode ser um açúcar que possa estar na forma de monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos e uma combinação respectiva. Os exemplos incluem, mas não são limitados, a glucose, frutose, sucrose, galactose, manose, xilose, arabinose, cana de açúcar, melaços e hidratos de amido.

[00022] As relações de conteúdo entre o substrato de fonte de carbono e a base na mistura de substrato-base a ser fornecida durante a fermentação pode ser ajustada em conjunto com as características da fermentação em consideração à solubilidade da base e à taxa de produção do ácido orgânico. Sob a suposição que o substrato de fonte de carbono e a base são mantidos assepticamente, a relação de conteúdo entre o substrato de fonte de carbono e a base deve ser ajustada mesmo enquanto o processo de fermentação estiver em andamento.

[00023] O substrato de fonte de carbono alimentado de forma descontínua alimentada pode ser o mesmo ou ser diferente do substrato de fonte de carbono inicialmente contido no meio de cultura do biorreator.

[00024] Dentro do escopo dos ingredientes essenciais ao cultivo da cepa de microrganismos, uma fonte de nitrogênio, uma vitamina, um sal inorgânico e/ou uma enzima de degradação da fonte de carbono, tal como uma invertase além do substrato de fonte de carbono, podem ser considerados. Uma pessoa com habilidade comum na técnica pode prontamente determinar os ingredientes necessários para o cultivo, de acordo com a cepa.

[00025] Entre a gama de ácidos orgânicos que podem ser produzidos no método de cultura de lotes descontínuos alimentados da presente invenção estão o ácido butírico, ácido lático, ácido acético, ácido fórmico, ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido glucárico, ácido itacônico, ácido acrílico e ácido mucônico, que são conhecidos por serem úteis como biocombustíveis e bioquímicos.

[00026] Contanto que produza um ácido orgânico, qualquer microrganismo pode ser usado como cepa produtora de ácido orgânico na presente invenção. A cepa produtora de ácido orgânico pode ser selecionada entre Clostridium spp., Pseudomonas spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Corynebacterium spp., Actinobacillus spp., leveduras, Candida spp., Pichia spp. e. coli ebactéria do ácido lático. Exemplos concretos de cepas produtoras de ácido orgânico incluem Clostridium tyrobutyricum, C. butyricum, C. acetobutyricum, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, Rhizopus arrhizus, R. oryzae, Aspergillus oryzae, Corynebacterium glutamicum e Lactobacillus acidophilus.

[00027] As condições apropriadas de fermentação para cepas específicas são conhecidas na técnica.

[00028] Conforme utilizado no presente documento, o termo “condição ideal” em contexto com o cultivo de cepas significa um ambiente, incluindo uma condição anaeróbica, uma gama de temperaturas e uma gama de pH, sob a qual a cepa de microrganismos cresce, com a produção concomitante máxima do ácido orgânico. A condição ideal pode ser alterada dependendo da cepa usada. A pessoa tendo habilidade comum na técnica pode ajustar o ambiente do biorreator em uma condição ideal, dependendo do estágio de cultivo da cepa de microrganismos. Por exemplo, o biorreator pode ser configurado para ser aquecido ou resfriado a uma temperatura de 20 a 50°C enquanto o meio de cultura pode ter um pH de 4 a 7.

[00029] Além disso, um método para produção de ácido butírico através da fermentação de açúcares na presença de uma cepa de Clostridium com o fornecimento de açúcares e, pelo menos, uma base selecionada entre bicarbonato de sódio e bicarbonato de potássio de forma descontínua alimentada é contemplado em uma aplicação da presente invenção. Conforme necessário para a fermentação, um substrato de fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, vitaminas e minerais e/ou uma enzima, tal como a invertase, podem ser adicionados ao meio de cultura.

[00030] Mais particularmente, a presente invenção fornece um método para produção de ácido butírico através da cultura de lotes descontínuos alimentados, compreendendo: - preparar um meio de cultura contendo um substrato de fonte de carbono, uma cepa de microrganismos produtora de ácido butírico e um ingrediente essencial para o cultivo da cepa (ingrediente essencial de cultivo); - fermentar o substrato de fonte de carbono em uma condição ideal estabelecida ao alimentar uma mistura de substrato-base de um substrato de fonte de carbono e, pelo menos, uma base selecionada a partir de bicarbonato de amônio, bicarbonato de sódio e bicarbonato de potássio de uma forma descontínua alimentada ao meio de cultura para permitir que o meio de cultura tenha um pH de 4,5 a 7; e - recuperar o ácido butírico do meio de cultura, o ácido butírico sendo produzido com a fermentação do substrato de fonte de carbono.

[00031] A cepa de microrganismos produtores de ácido butírico pode ser uma Clostridium sp. e pode ser selecionada a partir do grupo consistindo de C. tyrobutyricum, C. butyricum e C. acetobutyricum.

[00032] Com referência à Figura 1, uma aplicação da presente invenção é explicada.

[00033] A presente invenção é configurada para alimentar uma solução de neutralização, contendo um substrato de fonte de carbono e uma base (p.ex., bicarbonato de amônio) de forma descontínua alimentada a partir de um tanque de alimentação a um fermentador, onde um substrato de fonte de carbono é fermentado na presença de um microrganismo para produzir um ácido orgânico.

[00034] O fermentador pode ser equipado com um sensor de controle de pH e/ou um medidor de gás.

[00035] O sensor de controle de pH busca estabelecer um pH ideal para o cultivo dos microrganismos produtores de ácido orgânico no meio de cultura do fermentador Dentro do fermentador, os ingredientes típicos necessários para o cultivo de microrganismos, tal como fontes de nitrogênio, podem existir em conjunto com o substrato de fonte de carbono. Quando o pH do meio de cultura desviar da faixa pré-determinada enquanto a fermentação proceder, o sistema é projetado para alimentar automaticamente uma mistura de um substrato de fonte de carbono e uma base (p. ex. bicarbonato de amônio). Valores de pH adequados para o cultivo de microrganismos produtores de ácido orgânico específicos são conhecidos na técnica. Por exemplo, quando o ácido butírico é produzido, um valor ideal de pH para o cultivo de microrganismos produtores de ácido butírico fica na faixa de 4,5 a 7.

[00036] Em conjunto ou separadamente do sensor de controle de pH, um medidor de gás pode ser instalado no fermentador para medir a quantidade gerada e a taxa de geração de gás no fermentador. A taxa de geração de gás fornece informações quanto à taxa de alimentação da mistura de substrato-base ou do tempo para concluir a alimentação.

[00037] Conforme descrito acima, o tempo no qual a alimentação da mistura de substrato-base é concluída pode ser prontamente determinado em consideração à taxa de geração de gás e a quantidade alimentada da mistura por uma pessoa com habilidade comum.

[00038] Como regra, a fermentação é inibida por seu produto final (inibição do produto). Enquanto a fermentação é realizada, a atividade da cepa de microrganismos é diminuída pelo produto do ácido orgânico. Frequentemente, a fermentação pode parar mesmo quando o substrato de fonte de carbono não tiver sido completamente consumido. Nesse caso, o substrato de fonte de carbono é desperdiçado. Na presente invenção, uma base fraca, tal como bicarbonato de amônio, é usada como um neutralizador para evitar que a cepa de microrganismos seja influenciada pelo alto pH. A base neutraliza um ácido orgânico, tal como o ácido butírico, com a geração concomitante de dióxido de carbono (CO2) e gás hidrogênio (H2). A taxa de geração do gás pode ser utilizada para monitorar a atividade da cepa de microrganismos, fornecendo a informação de um momento apropriado até que o substrato de fonte de carbono seja fornecido. Na presente invenção, portanto, a fermentação pode ser realizada com o consumo completo do substrato de fonte de carbono. Consequentemente, visto que o fornecimento de um substrato de fonte de carbono pode ser interrompido em um momento adequado para evitar a perda do substrato de fonte de carbono restante, o processo de fermentação pode ser operado efetivamente com a manutenção da atividade ideal no microrganismo. Após a conclusão da alimentação do substrato de fonte de carbono e da base, o pH do fermentador pode ser ajustado em um método conhecido na técnica, por exemplo, ao alimentar um agente de ajuste de pH, tal como amoníaco, solução de hidróxido de metal alcalino, solução de hidróxido de metal alcalino-terroso e uma mistura respectiva, p.ex., hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio etc., a uma taxa constante.

[00039] Além disso, quando o método de cultura de lotes descontínuos alimentados, de acordo com a presente invenção, é aplicado à fermentação para a produção de ácido orgânico, o meio de cultura descrito na presente invenção pode ser usado, ao invés de um meio de cultura caro para o cultivo de sementes de fermentação bacteriana, no último estágio do cultivo para uma sequência de sementes, aumentando imensamente, assim, a economia de fermentação. A fermentação convencional de ácido butírico emprega um RCM (Reinforced Clostridial Medium|Meio Clostrídico Reforçado) ou um meio similar rico em nutrientes para que uma cultura de sementes aumente a eficiência da cultura principal. Porém esse meio de cultura de sementes caro é um motivo para aumentar o custo de produção, baixando a economia da fermentação. Em contraste, o cultivo em lotes descontínuos alimentados, de acordo com a presente invenção, permite que o meio de cultura para a última sequência de sementes seja empregado na cultura principal sem diminuição na atividade dos microrganismos.

[00040] Uma melhor compreensão da presente invenção poderá ser obtida através dos exemplos a seguir, que são ilustrativamente apresentados, não devendo ser interpretados como limitantes à presente invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO COMPARATIVO 1: CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS

[00041] Líquidos e minerais de cana de açúcar (concentração de açúcar entre 150 e 200 g/L, 30 L) foram colocados em um fermentador anaeróbico de 50 L que foi purgado com nitrogênio. Sob essa condição anaeróbica, o Clostridium tyrobutyricum foi inoculado em um volume de 1 a 20% do caldo pelo qual o amoníaco foi então, adicionado para ajustar o pH em 6,0. Enquanto a fermentação prosseguiu a 37°C, dióxido de carbono (CO2) e hidrogênio (H2) foram gerados, mantendo a condição anaeróbica.

EXEMPLO 1: CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS

[00042] Em um fermentador anaeróbico de 50 L, o mesmo microrganismo do Exemplo Comparativo 1 foi inoculado em minerais e líquidos de cana de açúcar (concentração de açúcar entre 20 e 40 g/L, 10 e 15L) e então cultivados a 37°C enquanto alimentam uma mistura de bicarbonato de amônio e de líquido de cana de açúcar (bicarbonato de amônio entre 80 a 120 g/L, concentração de açúcar entre 200 a 300 g/L, 15 a 20L) para manter o caldo a um pH de 6,0. O cultivo em lotes descontínuos alimentados iniciou com um menor volume de um meio de cultura, comparado com o cultivo em lotes descontínuos, mas o volume final de cada meio de cultura foi idêntico. De forma alternativa, o volume final pode ser ajustado. Com o progresso da fermentação, foram gerados gases de CO2 e H2. Quando a taxa de geração do gás foi monitorada para alcançar entre 1,5 a 2,5L/L do fermentador/hora, a alimentação da mistura do bicarbonato de amônio e líquido de cana de açúcar foi concluída, de forma que a fermentação prosseguiu até que o açúcar, alimentado até aquele momento, foi completamente consumido.

[00043] Tanto os métodos de cultivo do Exemplo Comparativo 1 e do Exemplo 1 produziram ácido butírico a uma concentração de 6% ou superior. Por comparação, os dois métodos foram examinados quanto à eficiência no momento em que a mesma concentração de ácido butírico foi alcançada. As medições de concentração de células (OD600-MAX), de produtividade do ácido butírico (PBA), de rendimento da produção do ácido butírico ( YBA) e de rendimento da produção do ácido acético ( YAA) para o Exemplo Comparativo 1 (cultura de lotes descontínuos) e o Exemplo 1 (cultura de lotes descontínuos alimentados) são fornecidas na Tabela 1, abaixo. TABELA 1

[00044] Conforme entendido a partir dos dados da Tabela 1, o cultivo em lotes descontínuos alimentados foi superior em todos os índices ao cultivo em lotes descontínuos. Especificamente, a produção do subproduto ácido acético (AA | acetic acid) foi imensamente inibida no Exemplo 1, com a consequente melhoria significativa de rendimento de produção do ácido butírico. Entende-se que esse aumento no desempenho da fermentação resulta da manutenção do açúcar a tal concentração que não iniba o cultivo do microrganismo. Em contraste, o cultivo em lote descontínuo do Exemplo Comparativo 1 pode não mais fermentar o açúcar mesmo quando mantida a concentração inicial, pois o estado do microrganismo diferiu de um lote descontínuo ao outro. Como resultado, o açúcar não foi consumido completamente, mas mantido. Na cultura de lotes descontínuos alimentados, o açúcar pode ser completamente consumido sem perda, pois o tempo para interromper o fornecimento de açúcar pode ser controlado sob a monitoria da geração de gás de CO2 e H2 de acordo com o progresso da fermentação. O rendimento de produção do ácido butírico (BA|butyric acid), de acordo com a presente invenção, foi imensamente aumentado, quando comparado com a cultura de lotes descontínuos convencional ou a adição gradual de açúcar em alíquotas (consulte o Exemplo Comparativo 2 abaixo), demonstrando que a alimentação do açúcar na mistura com bicarbonato de amônio para ajuste de pH é altamente confiável e eficiente.

EXEMPLO 2: CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS ATRAVÉS DA ALIMENTAÇÃO DA MISTURA DE BICARBONATO DE AMÔNIO E DO MEIO

[00045] Nesse exemplo, a cultura de lotes descontínuos alimentados foi demonstrada para aumentar imensamente a concentração de ácido butírico (BA). Devido ao próprio BA ser tóxico ao microrganismo que produz BA ele inibe a atividade do microrganismo (inibição do produto), o que resulta em nenhuma produção adicional do produto mesmo quando o substrato de açúcar estiver presente. Consequentemente, o rendimento da produção do ácido é limitado ou o açúcar é desperdiçado. Esse Exemplo foi desenhado para manter a atividade do microrganismo ao controlar uma concentração apropriada de açúcar para minimizar uma alteração osmótica no microrganismo, produzindo assim BA a uma alta concentração.

[00046] Nesse Exemplo, um sistema de biorreator composto de um tanque de alimentação e um fermentador foi empregado. No fermentador, a fermentação iniciou com um meio de cultura tendo um volume de 20 a 50% de um volume final desejado enquanto o volume restante foi alimentado a uma taxa dependendo da alteração de pH do tanque de alimentação preenchido com uma mistura de substrato-base (um agente de ajuste de pH contendo um substrato de fonte de carbono e uma base).

[00047] O meio de cultura do fermentador possui a seguinte composição: 14 L de uma solução de xarope de cana de açúcar 0,8 L, 180 g de fonte de nitrogênio orgânico CSP (Milhocina em pó) e 1,8 g de FeSO.-7HO em água foi adicionada com 1,5 ml de um agente antiespumante e autoclavada para fornecer um meio. Separadamente, 1 L de uma solução aquosa contendo 5.g de KH2PO. foi autoclavado e completamente resfriado. Isso foi alimentado, junto com o meio, no fermentador. Para um reservatório de meios no tanque de alimentação, 19,5L de uma solução aquosa contendo 7,4 L de xarope de cana de açúcar foi mixada com 2 ml de um agente antiespumante. Após o processo de autoclave, a solução foi adicionada com 2kg de bicarbonato de amônio (NH4HCO3), introduzida no tanque de alimentação e agitada por 12 horas para dissolver completamente o bicarbonato de amônio.

[00048] Uma cultura de semente de Clostridium tyrobutyricum foi inoculada em uma quantidade de 3 L no fermentador. Opcionalmente, uma enzima (invertase) foi adicionada a uma concentração de diversos ppm.

[00049] Imediatamente após a inoculação, o pH do meio de cultura foi ajustado a 6,3 com amoníaco. A fermentação foi realizada na seguinte condição: pH: 6,3, Temp.: 37°C, velocidade de agitação: 200rpm.

[00050] Enquanto a fermentação prossegue, uma quantidade adequada de CSP pode ser adicionalmente introduzida ao fermentador. Quando a taxa de geração de gás foi monitorada para chegar entre 1,5 a 2,5 L/L do fermentador/hora, a alimentação foi interrompida. Desde então, o pH do meio foi ajustado com amoníaco até a fermentação ser concluída.

EXEMPLO COMPARATIVO 2

[00051] Para comparação com o Exemplo 2, a fermentação foi realizada de forma descontínua. O meio de cultura do fermentador possuía a seguinte composição: 27 L de uma solução de xarope de cana de açúcar 8 L, 330 g de fonte de nitrogênio orgânico CSP (Milhocina em pó) e 1,6 g de FeSO.-7HO em água foi adicionada com 3 ml de um agente antiespumante e autoclavada para fornecer um meio. Separadamente, 1 L de uma solução aquosa contendo 49 g de KH2PO4 foi autoclavado e completamente resfriado. Isso foi alimentado, junto com o meio, no fermentador. Após o processo de autoclave, uma cultura de sementes de Clostridium tyrobutyricum foi inoculada em uma quantidade de 3 L no fermentador. Opcionalmente, uma enzima (invertase) foi adicionada a uma concentração de diversos ppm.

[00052] Imediatamente após a inoculação, o pH do meio de cultura foi ajustado a 6,3 com amoníaco. A fermentação foi realizada na seguinte condição: pH: 6,3, Temp.: 37°C, velocidade de agitação: 200rpm.

[00053] Os resultados da fermentação do Exemplo 2 e do Exemplo Comparativo 2 estão resumidos na Tabela 2 abaixo. Pode ser entendido a partir dos dados da Tabela 2 que a cultura de lotes descontínuos alimentados, de acordo com a presente invenção (Exemplo 2), melhorou imensamente em todos os índices a contagem do desempenho da fermentação e do título do BA, comparado com a cultura convencional de lotes descontínuos (Exemplo Comparativo 2). A Figura 2 exibe perfis de produção do produto BA e do subproduto ácido acético (AA). Como pode ser visto, uma diminuição na produção de AA foi detectada na cultura de lotes descontínuos alimentados, contribuindo para uma melhora no rendimento da fermentação e na produtividade do BA. TABELA 2

EXEMPLO COMPARATIVO 3

[00054] Nesse Exemplo Comparativo, o açúcar foi alimentado em uma forma intermitente, junto com diversas bases, de forma a confirmar o efeito da cultura de lotes descontínuos alimentados na produção de ácidos orgânicos. O pH inicial do fermentador, antes do início da fermentação, foi ajustado com amoníaco para estabelecer um ambiente adequado para uma cepa produtora de ácido orgânico. Após o início da fermentação, as soluções de base listadas na Tabela 3, abaixo, foram automaticamente adicionadas sob monitoria com uma sonda de pH enquanto uma solução composta apenas de açúcar foi intermitentemente alimentada. A introdução intermitente de açúcar foi realizada de tal forma que o açúcar foi alimentado em intervalos de tempo regulares ou na base da análise de dados de açúcar continuamente medidos, assim como exibido na Tabela 3.

[00055] Líquido de cana de açúcar, um ingrediente de nitrogênio orgânico (RCM: Meio Clostrídico Reforçado) e minerais (concentração de açúcar entre 30 e 100 g/L, 30 L) foram colocados em um fermentador anaeróbico de 50 L que foi purgado com nitrogênio. Sob essa condição anaeróbica, o Clostridium tyrobutyricum foi inoculado em um volume de 1 a 20% do caldo pelo qual o amoníaco foi então adicionado, para ajustar o pH em 6,0. Enquanto a fermentação prosseguiu a 37°C, dióxido de carbono (CO2) e hidrogênio (H2) foram gerados, mantendo a condição anaeróbica.

[00056] A Tabela 3 resume os dados de concentração final, produtividade, rendimento da produção e seletividade do ácido butírico (BA) produzido sob condições de fermentação após o início da fermentação.

[00057] Lotes descontínuos alimentados #1: Uma quantidade total de açúcar requerida para a fermentação no geral foi alimentada em três alíquotas iguais, quando a concentração de açúcar apresentou medição de 1 a 10 g/L; Como uma base, uma diluição da amônia foi usada em uma quantidade exibida na Tabela 3.

[00058] Lotes descontínuos alimentados #2: Uma quantidade total de açúcar requerida para a fermentação no geral foi alimentada em seis alíquotas iguais, quando a concentração de açúcar apresentou medição de 20 g/L. Assim, a concentração total de açúcar foi mantida entre 20 e 40 g/L. Como uma base, uma diluição da amônia foi usada em uma quantidade exibida na Tabela 3.

[00059] Lotes descontínuos alimentados #3: Uma quantidade total de açúcar requerida para a fermentação no geral foi alimentada em três alíquotas iguais, quando a concentração de açúcar apresentou medição de 1 a 10 g/L; Essa foi a mesma apresentada em #1, porém a base foi alterada de amônia para Ca(OH)2 para examinar os efeitos da alteração das bases.

[00060] Lotes descontínuos alimentados #4: Uma quantidade total de açúcar requerida para a fermentação no geral foi alimentada continuamente em porções múltiplas (10 vezes), para manter a concentração de açúcar em 30 g/L. Isso foi similar à condição apresentada em #2, porém a frequência de alimentação foi maior, de forma que a concentração de açúcar flutuou a uma menor extensão durante a fermentação. TABELA 3

1)Concentrações de diferentes ácidos orgânicos que não sejam o BA do produto (%)

[00061] Conforme exibido na Tabela 3, não houve estratégia que predominou sobre as outras estratégias em termos de produtividade, concentração de produção e rendimento. Por exemplo, observou-se que os lotes descontínuos alimentados #2 tiveram um aumento em produtividade, mas uma diminuição em seletividade.

[00062] Além disso, a estratégia de alimentação intermitente de açúcar é difícil de ser aplicada em processos práticos, não apenas por ter uma alta propensão à falha no controle de uma concentração adequada de açúcar, mas também por ser trabalhosa e por provavelmente causar dificuldade na automação e tender a causar contaminação devido a análises frequentes. Legenda da figura 1 T1 — pH T2 — Tanque de alimentação Fonte de carbono+NH4HCO3 (Base) T3 - Fermentador Fermentação de ácido orgânico Fonte de carbono ^ ácido orgânico.

Claims

1. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, consistindo em: (i) preparar um meio de cultura, contendo um substrato de fonte de carbono, uma cepa de bactéria produtora de ácido orgânico e um ingrediente de cultivo da referida cepa de bactéria; (ii) fermentar o referido meio de cultura para produzir o referido ácido orgânico; (iii) medir uma alteração de pH no referido meio de cultura; (iv) correlacionar a referida alteração de pH ao consumo do referido substrato de fonte de carbono; (v) alimentar por lotes descontínuos alimentados uma mistura de base-substrato adicional de substrato de fonte de carbono e uma base fraca contendo metal alcalino ao referido meio de cultura em uma quantidade para manter a concentração do referido substrato de fonte de carbono, a referida base fraca contendo metal alcalino em uma quantidade para manter um pH ideal para o cultivo da referida cepa de bactéria; e (vi) remover qualquer ácido orgânico produzido no referido meio de cultura; caracterizado por a relação do substrato de fonte de carbono para a base fraca contendo metal alcalino ser de 200~300 g/L a 80~120 g/L; em que os gases de CO2 e H2 são gerados durante a referida fermentação e, quando os gases de CO2 e H2 atingirem uma taxa de geração de 1,5 a 2,5 L/L do fermentador/hora, a alimentação da mistura de base-substrato ser encerrada, de modo que a referida fermentação prossiga até que o substrato de fonte de carbono seja completamente consumido.

2. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por, após a conclusão da alimentação da mistura de base-substrato, água de amônia, solução de hidróxido de metal alcalino, solução de hidróxido de metal alcalino-terroso ou uma combinação respectiva ser fornecida ao referido fermentador para permitir que o meio de cultura tenha um valor de pH ideal para o cultivo da cepa produtora de ácido orgânico até que o substrato de fonte de carbono seja completamente fermentado.

3. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por o ingrediente de cultivo ser, pelo menos, um selecionado do grupo consistindo em uma fonte de nitrogênio, uma vitamina, um mineral e uma enzima de degradação da fonte de carbono.

4. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO BUTÍRICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, consistindo em (i) preparar um meio de cultura, contendo um substrato de fonte de carbono, uma cepa de bactéria produtora de ácido butírico e um ingrediente de cultivo da cepa de bactérias; (ii) fermentar o referido meio de cultura para produzir o referido ácido butírico; (iii) medir uma alteração de pH no referido meio de cultura; (iv) correlacionar a referida alteração de pH ao consumo do referido substrato de fonte de carbono; (v) alimentar por lotes descontínuos alimentados uma mistura de base-substrato adicional de substrato de fonte de carbono e, pelo menos, uma base selecionada do grupo consistindo em bicarbonato de amônio, bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, carbonato de amônio, carbonato de sódio, carbonato de potássio e uma mistura respectiva em uma quantidade para manter um pH do referido meio de cultura em um pH de 4,5 a 7; e (vi) remover qualquer ácido butírico produzido no referido meio de cultura; caracterizado por a relação do substrato de fonte de carbono a, pelo menos, uma referida base ser de 200~300 g/L a 80~120 g/L; em que os gases CO2 e H2 são gerados durante a referida fermentação e, quando os gases CO2 e H2 atingirem uma taxa de geração de 1,5 a 2,5 L/L do fermentador/hora, a alimentação da referida mistura de base-substrato ser encerrada, de modo que a referida fermentação prossiga até que o substrato de fonte de carbono seja completamente consumido.

5. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO BUTÍRICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 4, caracterizado por a referida cepa de bactéria produtora de ácido butírico ser um microrganismo Clostridiumsp.

6. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por o referido substrato de fonte de carbono ser selecionado do grupo consistindo em glicose, frutose, sacarose, galactose, xilose, arabinose, cana- de-açúcar, melaço e hidrolisado de amido.

7. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por o ácido orgânico ser selecionado, pelo menos, do grupo consistindo em ácido butírico, ácido lático, ácido acético, ácido fórmico, ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido glucárico, ácido itacônico, ácido acrílico e ácido mucônico.

8. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por a cepa produtora de ácido orgânico ser selecionada do grupo consistindo em Clostridium spp., Pseudomonas spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Corynebacteriumspp., Actinobacillus spp., leveduras, leveduras de Candida, leveduras de Pichia, E. coli e bactérias produtoras de ácido lático.

9. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO POR CULTURA DE LOTES DESCONTÍNUOS ALIMENTADOS”, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por consistir em fermentar o referido meio de cultura em um fermentador equipado com um sensor de controle de pH, um medidor de gás ou ambos.