JP6215313B2 - 炭素源基質と塩基の流加式供給による有機酸製造方法 - Google Patents
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Description
有機酸の発酵は、一般に、回分式(batch)発酵方法によって実現することができる。回分式発酵による有機酸の生成は米国特許第5,503,750号、同第5,766,439号などに開示されている。回分式発酵方法は、微生物が有機酸を生成するように発酵させる発酵器に糖、窒素源、無機物などを同時に仕込み、微生物を注入して発酵させることにより有機酸を得る方法である。一定量の糖から得られる有機酸の収率は制限的であるため、回分式発酵で高濃度の有機酸を得るためには初期に高濃度の糖を注入しなければならない。ところが、高濃度の糖は微生物の成長を阻害して発酵速度を低下させる原因となる。このような問題点を解決するために考案された方法が流加式(fed-batch)培養である。
現在まで知られた糖制御方式は、微生物の生長パターン分析に基づいて使用者が糖の注入速度を決定して一定に糖を注入する方式、または、DO(溶存酸素量)或いはpH(水素イオン指数)の値を認知し、それに応じて自動的に糖を注入する方式が知られている。前者の方式を用いた流加式培養の場合、回分式培養に比べては生産性および収率の向上を図ることができるが、微生物の生長および糖消耗速度を正確に調節することができなくて非効率的な部分があり、使用者が糖の注入量を持続的に観察しなければならないという困難さがある。
本発明の他の観点によれば、本発明の流加式培養方法によって酪酸を製造する方法を提供する。
また、本発明によれば、発酵器内の全ての炭素源を消費するまで発酵が持続するので、工程効率を最大限に高めることができ、酢酸などの副産物の生産が比較的少なく、高価の種菌培養(seed culture)用培地の必要性を無くし或いは減少させることができるので、発酵工程の費用を節減する経済的な方法を提供することができる。
本発明のある観点は、炭素源基質の発酵のための微生物の成長に適したpHを保つように、i)炭素源基質と、ii)二炭酸アンモニウム(ammonium bicarbonate) 、炭酸アンモニウム(ammonium carbonate)またはアルカリ性塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を、炭素源基質および有機酸生産菌株を含む発酵反応器に流加式で供給する段階を含む、炭素源基質の発酵による有機酸製造方法を提供する。
炭素源基質、有機酸生産菌株、および前記菌株の成長に必須的な成分(菌株成長成分)を含む培養液を準備する段階と、
前記培養液のpHが有機酸生産菌株の成長に適したpH範囲に保たれるように炭素源基質と、前記二炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよびアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を培養液に流加式で供給しながら、菌株の成長に適した環境の下で炭素源基質を発酵させる段階と、
前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された有機酸を回収する段階とを含んでなる。
本発明の一具現例において、炭素源基質は、糖類であって、単糖類、二糖類、多糖類またはこれらの混合物を含み、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、砂糖黍、糖蜜(Molasses)、澱粉加水分解物などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
発酵の際に供給される基質−塩基混合液内の炭素源基質と塩基の含量比は、塩基の溶解度や有機酸の生成速度などを考慮して使用者が発酵特性に合うように任意に調節することができる。炭素源基質と塩基の含量比は、供給される炭素源基質と塩基の滅菌状態が保たれるという前提の下で発酵工程中にも任意に変更可能である。
流加式で供給される炭素源基質は、発酵反応器内の培養液に最初に含まれた炭素源基質とは同じでもよく、異なってもよい。
菌株の成長に必須的な成分としては、炭素源基質以外に、窒素源、ビタミン、無機塩類、および/またはインベルターゼなどの炭素源分解酵素などが例示されるが、これに制限されるものではない。通常の技術者は、公知の技術に基づいて、菌株に応じて成長に必須的な成分を容易に決定することができる。
本発明において、流加式培養によって生成される有機酸は、酪酸、乳酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルカル酸、イタコン酸、アクリル酸、ムコン酸などのバイオ燃料およびバイオケミカルとして活用することができる様々な有機酸を含むものと解析される。
本発明において、菌株の成長に適した環境とは、菌株を用いた発酵に適した嫌気条件、温度範囲およびpH範囲を意味し、これらの条件は、使用される菌株によって異なる。通常の技術者は、公知の技術に基づいて、発酵反応器の環境が菌株の成長に適するように調節することができる。例えば、温度は20〜50℃の範囲であり、pHは4〜7の範囲であってもよい。
より具体的に、本発明の一具現例によれば、炭素源基質、酪酸生産菌株、および前記菌株の成長に必須的な成分を含む培養液を準備する段階と、前記培養液のpHが4.5〜7の範囲に保たれるように、炭素源基質と、二炭酸アンモニウム、二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウムおよびこれらの混合物から選ばれる塩基とを培養液に流加式で供給しながら、菌株の成長に適した環境の下で炭素源基質を発酵させる段階と、前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された酪酸を回収する段階とを含んで、流加式培養によって酪酸を製造する。
酪酸生産菌株としては、クロストリジウム属菌株、より具体的に、クロストリジウム・チロブチリカム(C. tyrobutyricum)、クロストリジウム・ブチリカム(C. butyricum)、クロストリジウム・アセトプチリカム(C. acetobutyricum)などの菌株を挙げることができる。
本発明は、発酵器で微生物を用いて炭素源基質を有機酸発酵させるとき、供給タンクから、炭素源基質と塩基(例えば、二炭酸アンモニウム)とを含む中和溶液を発酵器に流加式で供給する。
発酵器にはpH調節センサーおよび/またはガスメーターの装着が可能である。
pH調節センサーは、発酵器内の培養液のpHを、有機酸生成微生物の成長に適したpHに設定するためのものである。発酵反応器内には、炭素源以外に、有機窒素源などの通常的発酵液成分を含むことができる。発酵が進むにつれて、設定された範囲をpHが外れると、炭素源基質と塩基(例えば、二炭酸アンモニウム)との混合溶液が自動的に注入されるように設計される。各有機酸生成微生物の成長に適したpHは当業界に公知になっている。例えば、生産される有機酸が酪酸である場合、酪酸生成微生物の成長に適した最適のpHは4.5〜7の範囲である。
炭素源基質と塩基との混合溶液の注入中断時点は、前述したようにガス生成速度を考慮して決定することができ、或いは注入される混合溶液の量などを考慮して通常の技術者が容易に決定することができる。
一般に、有機酸発酵は、発酵過程で生成される有機酸による阻害作用(product inhibition)があるため、発酵が進むほど漸次的に発酵性能が低下し、場合に応じては、炭素源基質を全て消耗せずに発酵が中断し、残っている炭素源が損失することがある。本発明では、流加式培養のために注入される培地が高いpHに影響されないように、弱塩基性中和剤である二炭酸アンモニウムなどを使用するが、二炭酸アンモニウムなどの塩基は、酪酸などの有機酸を中和させ、二酸化炭素(CO2)および水素(H2)ガスを排出する。この際、排出されるガスの生成速度によって発酵の性能を判断した後、適正な時点まで持続的に炭素源基質を供給することができる。よって、本発明によれば、炭素源基質を全て消耗して発酵が進み、これにより常に適正な時点に炭素源基質の供給を止めることができて残留炭素源基質の損失なしで最適の発酵性能を発揮するように工程を効率よく運営することができる。供給タンク内のpH調節剤、すなわち炭素源基質および塩基の発酵が完了した後、発酵槽のpH調節は、残っている炭素源基質の発酵が完了するまで、当業界における公知の通常の方法、例えば、アンモニア水、アルカリ金属水酸化物水溶液、アルカリ土金属水酸化物水溶液、またはこれらの混合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム水溶液を一定の速度で供給するなどの方法によって行われ得る。
50Lの嫌気発酵器に砂糖黍液と無機質を入れ(糖濃度150〜200g/L、30L)、窒素パージングを介して反応液を嫌気にし、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)を培養液の1%〜20%で接種した後、37℃に維持しながらアンモニア水を用いて発酵液のpHを6.0に保った。発酵が進むにつれて発生する二酸化炭素(CO2)と水素(H2)によって、培養液は嫌気条件を保ちながら発酵が行われる。
50Lの嫌気発酵器に砂糖黍液と無機質を入れ(糖濃度20〜40g/L、10〜15L)、比較例1と同様の微生物を接種した後、37℃に維持しながら、二炭酸アンモニウムと混合された砂糖黍液(二炭酸アンモニウム濃度80〜120g/L、糖濃度200〜300g/L、15〜20L)を用いて発酵液のpHを6.0に保った。流加式培養の場合、培養初期の体積は回分式の場合より小さいが、最終菌培養液の体積は同一であり、最終菌培養液の体積調節が可能である。培養が進むにつれて発生するCO2とH2のガス発生速度を点検し、この速度が1.5〜2.5L/L反応器/hrの範囲の適正水準に到達したとき、二炭酸アンモニウムと混合された砂糖黍液の供給を終了すると、その後、そのときまで提供された糖を全て消耗しながら発酵が終了する。
比較例1と実施例1の2つの培養方法はいずれも、酪酸が6%以上の濃度まで生産された。同一比較のために、同濃度の酪酸濃度を達成した時点で2つの培養方法の効果を比較した。細胞の濃度(OD600-MAX)、酪酸生産性(PBA)、酪酸生産収率(YBA)、酢酸生産収率(YAA)に対する比較例1(回分式培養)と実施例1(流加式培養)の結果は表1のとおりである。
本実施例では、流加式培養を用いる場合、生産される酪酸(BA)の濃度を大きく向上させることができることを示す。BAの発酵生産の際に生成されるBAは自体毒性を持っているため、生成物抑制(product inhibition)によって、糖が残存する場合にももはや生成物を生成することができない現象が発生し、これにより生成酸の濃度が制限されるか、或いは糖が培養液に残って損失が起こる場合がある。本実施例では、微生物に及ぼす浸透圧の変化を適正な糖濃度の調節によって最小化してストレスを減少させることにより、微生物の活性を維持させて高濃度のBAを生成することができるようにする。
本実施例では、供給タンクと発酵器の2つの反応器を用いて、発酵器は所望の最終体積の20%〜50%の体積で培養を開始し、残りの体積はpHの変化に応じて供給タンクから基質−塩基混合液(炭素源基質と塩基とを含むpH調節剤)を供給することにより満たされる。
発酵器の培地組成は次のとおりである。砂糖黍シロップ源液0.8L、有機窒素源CSP(Corn Steep Powder)180gおよびFeSO4・7H2Oを1.8g溶かして14Lの発酵液を作り、ここに1.5mLの消泡剤を投入した後、オートクレーブして発酵反応器のための培地を準備する。1Lの容器にKH2PO454gを溶かし、オートクレーブして完全に冷やした後、予め準備された培地と共に発酵器に注入する。供給タンクには砂糖黍シロップ源液7.4Lと水とを混合して溶かした溶液19.5Lを入れ、ここに2mLの消泡剤を投入する。オートクレーブが終わった後、二炭酸アンモニウム(NH4HCO3)2kgを入れる。注入後12時間撹拌し続けて二炭酸アンモニウムを完全に溶解させる。
クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)の種菌培地3Lを発酵反応器に接種する。必要に応じて、数ppmの酵素(インベルターゼ(invertase))を反応器に添加した。
接種直後、アンモニア水を用いてpHを6.3に合わせる。反応条件は次のとおりである。pH:6.3、温度:37℃、撹拌速度:200rpm。
反応が行われると、適正量のCSPをさらに注入することができる。ガス発生速度を観察し、その速度が1.5〜2.5L/L反応器/hrの範囲の適正な水準に到達したときに供給を止め、発酵が完了するまではアンモニア水を用いてpHを調節した。
実施例2と発酵結果を比較するために、既存の回分式培養によって発酵を行った。発酵器の培地組成は次のとおりである。砂糖黍シロップ源液8L、有機窒素源CSP(Corn Steep Powder)330gおよびFeSO4・7H2Oを1.6gを溶かして27Lの発酵液を作り、ここに3mLの消泡剤を投入した後、オートクレーブして発酵反応器のための培地を準備する。1Lの容器にKH2PO4を49g溶かし、オートクレーブして完全に冷やした後、予め準備された培地と共に発酵器に注入する。オートクレーブが終わった後、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)の種菌培地3Lを発酵反応器に接種する。必要に応じて、数ppmの酵素(インベルターゼ(invertase))を反応器に添加した。
接種直後、アンモニア水を用いてpHを6.3に合わせる。反応条件は次のとおりである。pH:6.3、温度:37℃、撹拌速度:200rpm。
実施例2と比較例2の発酵を経て得られた結果を表2に示す。表2に示すように、既存の回分式培養(比較例2)に比べて、本発明に係る流加式培養(実施例2)の場合、全ての発酵性能の増加およびBA滴定量(titer)の大きい増加を示すことが分かる。図2は生成されるBAおよび副酸物たる酢酸(AA)の生成プロファイルを示す。図2より、本発明に係る流加式培養の場合にAAの減少があり、このようなAAの減少が発酵収率の向上およびBAの生成に寄与することが分かる。
本比較例では、間欠的糖注入方式および多様な塩基を用いて流加式培養方法による有機酸生成効果を確認しようとする。発酵開始前、初期の発酵槽のpHをアンモニア水によって調節することにより、有機酸生産菌株に適した環境を造成した。発酵開始後、下記表3に記載された塩基溶液をpHプローブ(probe)によって自動的に添加し、その他に糖のみからなる溶液を間欠的に注入した。間欠的糖注入は、表3に示すように一定の時間間隔で糖を注入する方法、または持続的に糖の濃度を分析して追加する方法によって行われた。
50Lの嫌気発酵器に糖液、有機窒素成分(RCM:Reinforced Clostridial Medium)および無機質を入れ(糖濃度30〜100g/L、30L)、窒素パージングを介して反応液を嫌気にした後、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)を培養液の1%〜20%で接種し、しかる後に、37℃に維持しながらアンモニア水を用いて発酵液の初期pHを6.0に合わせた。発酵開始後、発生する水素と二酸化炭素によって、培養液は嫌気条件が保たれながら発酵が行われる。
Fed−batch #1:全体発酵に必要な糖を3回にわたって均等分割して注入し、各糖は存在する糖の濃度が1〜10g/Lであるときに注入した。使用した塩基はアンモニア希釈液であり、その使用量が表3に示されている。
Fed−batch #2:全体発酵に必要な糖を6回にわたって均等分割して注入し、各糖は存在する糖の濃度が20g/Lであるときに注入した。これにより、全体糖濃度を20〜40g/Lに保つようにした。使用した塩基はアンモニア希釈液であり、その使用量が表3に示されている。
Fed−batch #3:全体発酵に必要な糖を3回にわたって均等分割して注入し、各糖は存在する糖の濃度が1〜10g/Lであるときに注入した。これは#1の条件と同一であるが、使用する塩基の種類をアンモニアからCa(OH)2に変更して塩基種類の変更による効果があるかを確認した。
Fed−batch #4:全体発酵に必要な糖を持続的に少量で投入して(10回以上)糖濃度を30g/Lに保った。これは#2の条件と類似するが、#2より多段階で注入して発酵期間における糖濃度の変化が大きくならないようにした。
また、間欠的糖注入運転方式は、適切な糖濃度への調節に失敗する高い危険性、高い人力依存度、低い自動化可能性、および頻繁な分析による汚染可能性の増加などにより実工程で使用することは困難であった。
Claims (10)
- 炭素源基質および有機酸生産菌株を含む反応器に、(i)炭素源基質と、(ii)二炭酸アンモニウム(ammonium bicarbonate)またはアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を流加式で供給する流加式培養によって炭素源基質を発酵させて、
ここで、発酵進行によって反応器でpHおよび炭素源基質の濃度は変化し、
前記pHの変化による塩基注入に伴って炭素源を注入し、塩基注入速度に応じて炭素源基質の注入速度を決定する方式で上記基質−塩基混合液を流加式で供給し、
前記炭素源基質はグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、砂糖黍、糖蜜、および澱粉加水分解物から選ばれる一つ以上の糖類であることを特徴とする有機酸製造方法。 - 炭素源基質、有機酸生産菌株、および前記菌株の成長成分を含む培養液を準備する段階と、
前記培養液のpHが前記有機酸生産菌株の成長に適したpH範囲に保たれるように、(i)炭素源基質と、(ii)二炭酸アンモニウムまたはアルカリ金属含有弱塩基から選ばれる一つ以上の塩基とを含む基質−塩基混合液を前記培養液に流加式で供給しながら、炭素源基質を発酵させる段階と、
前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された有機酸を回収する段階とを含んでなり、
ここで、発酵進行によって培養液でpHおよび炭素源基質の濃度は変化し、
前記pHの変化による塩基注入に伴って炭素源を注入し、塩基注入速度に応じて炭素源基質の注入速度を決定する方式で上記基質−塩基混合液を流加式で供給し、
前記炭素源基質はグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、砂糖黍、糖蜜、および澱粉加水分解物から選ばれる一つ以上の糖類であることを特徴とする流加式培養による有機酸製造方法。 - 前記アルカリ金属含有弱塩基が二炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)、二炭酸カリウム(potassium bicarbonate)またはこれらの混合物であることを特徴とする、請求項1または2に記載の有機酸製造方法。
- 前記有機酸は酪酸、乳酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルカル酸、イタコン酸、アクリル酸、およびムコン酸から選ばれる一つ以上の有機酸であることを特徴とする、請求項1または2に記載の有機酸製造方法。
- 前記有機酸生産菌株はクロストリジウム(Clostridium)属菌株、シュードモナス(Pseudomonas)属菌株、リゾプス(Rhizopus)属菌株、アスペルギルス(Aspergillus)属菌株、コリネバクテリム(Corynebacterium)属菌株、酵母(Yeast)、カンジダ(Candida)酵母、ピチア(Pichia)酵母、大腸菌(E. coli)、および乳酸菌(Lactic acid bacteria)から選ばれる微生物であることを特徴とする、請求項1または2に記載の有機酸製造方法。
- 前記発酵はpH調節センサー、ガスメーター、またはこれらの全てが取り付けられた発酵器で行われることを特徴とする、請求項1または2に記載の有機酸製造方法。
- 炭素源基質の発酵段階で前記基質−塩基混合液の投入が完了した後、培養液中の炭素源基質の発酵が完了するまでアンモニア水、アルカリ金属水酸化物水溶液、アルカリ土金属水酸化物水溶液、またはこれらの混合物を供給しながら、培養液のpHを、前記有機酸生産菌株の成長に適したpHの範囲に保たせることを特徴とする、請求項2に記載の有機酸製造方法。
- 前記菌株の成長成分は窒素源、ビタミン、無機塩類、および炭素源分解酵素から選ばれる一つ以上の成分であることを特徴とする、請求項2に記載の有機酸製造方法。
- 炭素源基質、酪酸生産菌株、および前記菌株の成長成分を含む培養液を準備する段階と、
前記培養液のpHが4.5〜7の範囲に保たれるように、(i)炭素源基質と、(ii)二炭酸アンモニウム、二炭酸ナトリウム、二炭酸カリウム、およびこれらの混合物から選ばれる塩基とを含む基質−塩基混合液を前記培養液に流加式で供給しながら、炭素源基質を発酵させる段階と、
前記培養液から、炭素源基質の発酵によって生成された酪酸を回収する段階とを含んでなり、
ここで、発酵進行によって培養液でpHおよび炭素源基質の濃度は変化し、
前記pHの変化による塩基注入に伴って炭素源を注入し、塩基注入速度に応じて炭素源基質の注入速度を決定する方式で上記基質−塩基混合液を流加式で供給し、
前記炭素源基質はグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、砂糖黍、糖蜜、および澱粉加水分解物から選ばれる一つ以上の糖類であることを特徴とする流加式培養による酪酸製造方法。 - 前記酪酸生産菌株がクロストリジウム属微生物であることを特徴とする、請求項9に記載の酪酸製造方法。
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