KR820000523B1

KR820000523B1 - 미생물에 의한 l-알기닌의 제조법

Info

Publication number: KR820000523B1
Application number: KR1019800000351A
Authority: KR
Inventors: 임병학; 한상열; 이강만
Original assignee: 미 원 주식회사; 임철수
Priority date: 1980-01-31
Filing date: 1980-01-31
Publication date: 1982-04-12

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 L-알기닌의 제조법

본 발명은 미생물을 이용한 발효법에 의한 L-알기닌의 제조법에 관한 것이다.

L-알기닌은 천연아미노산의 일종으로서 의약 및 영양제용으로 매우 중요하며 최근에는 조미료 및 사료 등으로도 이용되는 중요한 아미노산의 일종이다.

종래 L-알기닌의 공업적인 제조 방법으로는 천연단백질을 가수분해하여 추출분하는 방법이었으나 추출분리조작이 대단히 복잡하여 L-알기닌의 제조가는 고가일 수 밖에 없었다. 그러나 최근에는 미생물을 배양시켜 발효법에 의해 L-알기닌을 제조하므로 저렴한 가격으로 제조할 수가 있다.

발효법에 의한 L-알기닌의 생산은 L-알기닌 길항체에 내성인세균을 이용하는 방법(일본특허 48-3391) 또는 L-오르니틴을 기질로 하는 방법(일본특허 47-27960) 등이 보고되어 있다.

본 발명에 있어서 특징적인 것은 당류 발효성이 전혀 다른 두 균주를 혼합배양 시키므로써 상조작용(synergistic action)에 의해 L-알기닌의 생산성을 현저하게 증가시킴에 있다.

본 발명에 대하여 구체적로 설명하면 본 발명에 사용된 미생물은 브레비 박테리움 프라붐(ATCC 14067 및 ATCC 13826)을 통상의 변이류도 조작으로(예를 들면 X-선조사로, 또는 NTG, DS, EI 등의 화학변이 유기체로) 처리하여 얻은 알기닌 탈탄산효소, 알기닌탈탄산 산화효소 동시결손변이주 MS-05760(KFCC-10018)와 알기닌디시미나제 결손 변이주 MS-05770(KFCC-10019)을 각각 다른 배양조에서 20-40시간 배양한 다음 무균적으로 액량비 1:1로 혼합하고 그 후 20-40시간 혼합배양함으로써 L-알기닌이 현저하게 축적됨을 알고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용된 알기닌탈탄산효소, 알기닌탈탄산 산화효소 동시 결손변이주 MS-05760(KFCC-10018)과 알기닌 디시미나제 결손 변이주 MS-05770(KFCC-10019)을 친주와 당류 발효성에 대하여 비교해 보면 아래표(표 1)과 같다.

[표 1]

당을 함유한 펩톤 배지(펩톤 1.0%, 염화나트륨 0.5%, 당 0.5-2.0%) 5cc, 시험관에 정치, 30℃에서 9일간 배양.

본 발명의 알기닌탈탄산효소, 알기닌탈탄산 산화효소 동시 결손변이주인 브레비 박테리움 프라붐 MS-05760(KFCC-10018)을 버기스매뉴얼(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology) 및 미국 세균협회에서 발행한 미생물 실험서(Manual of Microbiological Method)에 따라 균학적 성질을 조사한 결과는 다음과 같다.

본 발명에 사용되는 변이주들의 발효용 배지로서는 통상의 탄소원, 질소원, 무기염류 및 유기영양물질을 함유하고 있는데 탄소원으로서는 포도당, 당밀, 전분가수분해물등의 당류를 사용한다.

질소원으로서는 염화암모니움, 유산암모니움등의 무기암모니움 등의 2-5% 사용했으며 무기염류로서는 인산카리, 유산마그네슘, 유산철 등을 소량 첨가했으며 유기영양물질로서는 펩톤, 효모에키스, 콘스팁. 리카 등을 0.01-2.0% 사용했다.

발효방법으로는 온도 27-33℃, pH 6.5-7.5로 유지하면서 호기적으로 대수증식기의 중간지점(배양 후 28-32시간)에서 무균적으로 액량이 1:1로 혼합하여 혼합배양을 한 후 정상기말(처음 균접종 후 56-64시간)에서 배양을 완료한다.

축적된 L-알기닌의 채취는 통상이온교환수지와 그외의 공지의 방법을 조합했다. 이때 L-알기닌- 이외의 다른 아미노산의 생성은 극히 소량이었다.

L-알기닌은 바이오에세이법에 의해 정량했으며 두 혼합액의 액량비에 따른 L-알기닌의 생성량은 아래표(표 2)와 같다.

[표 2]

상기표에서 변이주 단독배양의 경우보다 동량혼합배양의 경우가 L-알기닌 생성이 현저함을 알 수 있다.

[실시예 1]

당밀 5%, 염화암모니움 2.5%, 펩톤 0.1%, 효모에키스 0.1%, 제1인산가리 1.5%, 유산마그네슘 0.05%, 유산 제1철 0.001%, 콘. 스팁. 리카 1.5%, 유산망간 0.001%, 탄산칼슘 2%을 함유한 배지(pH7.2) 50ml을 500ml 진탕후라스크에 넣어 115℃에서 15분간 가압멸균을 한다.

이때 당밀과 탄산칼슘은 별도로 멸균하여 첨가한다.

이 배지에 브레비 박테리움 프라붐 MS-05760(알기닌 탈탄산효소 알기닌 탈탄산 산화효소 동시 결손주)(KFCC-10018)을 1백금이 접종한 후 30℃에서 32시간 진탕 배양한다.(이와 같이 조성한 배지를 “가”배지, 배양액을 “가”액이라 함)

별도로 당밀 4%, 유안 2.5%, 0.15%, 펩톤효모에키스 0.1% 제2인산카리 0.7%, 유산마그네슘 0.05% 유산제1철 0.001%, 콘. 스팁. 리카 1.5%, 유산망간 0.001%을 함유한 배지(pH7.2) 50ml를 500ml 진탕 후라스크에 넣어 115℃에서 15분간 가압멸균을 한다.

이 배지에 브레비 박테리움 프라붐 MS-05770(알기닌 디시미나제 결손주)(KFCC-10019)을 1백금이 접종한 후 30℃에서 28시간 진탕배양한다.(이와 같이 조성한 배지다“나”배지, 배양액을 “나”액이라 함)

“가”액과 “나”액을 미리 멸균한 1ℓ 후라스크에 무균적으로 주입하여 28시간 혼합배양한다. 이때 배양액주의 L-알기닌의 생성량은 30.2mg/ml이미, “가”배지이만 60시간 배양할 경우 L-알기닌의 생성량은 20.4mg/ml, “나”배지에만 60시간 배양할 경우 L-알기닌의 생성량은 24.6mg/ml이다.

[실시예 2]

실시예 1)의 “가”,“나”배지에 각각 L-라이신 2.0%을 첨가하여 “가”배지에 브레비 박테리움 프라붐 MS-05760(KFCC-10018)를 접종하고, “나”배지에 브레비 박테리움 프라붐 MS-05770(KFCC-10019)를 접종하고, 각각 30시간 실시예 1과 같이 배양 후 실시예 1과 같은 방법으로 혼합한 후 30시간 혼합배양한다.

이때 배양액중 L-알기닌의 생성량은 30.8mg/ml이며, “가”가지에만 60시간 배양할 경우 L-알기닌의 생성량은 20.9mg/ml, “나”배지에만 60시간 배양할 경우 L-알기닌의 생성량은 25.1mg/ml이다.

[실시예 3]

실시예 2)와 같은 방법으로 행하나 L-라이신 2.0% 대신에 L-아스파라긴산 2.0%을 첨가한다.

이 발효액 100ml을 가열한 후 여과한다.

이액을 엠버라이트 IR-120B(H형) 칼람을 통한 후 수세, 흡착 후 L-알기닌을 5% 암모니아수로 용출한 후, 분리된 L-알기닌을 감압농축하여, 얻어진 잔사를 메타놀 및 염산으로 석출결정한다. 이 결정을 함수 메타놀로 재결정한다.

이때 L-알기닌 염산염 3.28g을 얻었으며, “가”배지에 단독배양할 경우 2.32g, “나”배지에 단독배양할 경우 2.28g을 얻었다.

Claims

브레비 박테리움 프라붐에 속하는 두 변이주 즉 알기닌탈탄산효소, 알기닌탈탄산 산화효소 동시 결손주(KFCC-10018)와 알기닌 디시미나제결손주(KFCC-10019)를 각각 배양한 후 대수증식기 중간지점에서 무균적으로 액량비 1:1로 혼합 배양하여 배지중에 L-알기닌을 다량생성 축적시켜 채취하는 것을 특징으로 하는 L-알기닌의 제조법.