CN115216419A - 一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素b2的培养基 - Google Patents

一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素b2的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基及发酵培养基，该培养基中使用了双糖替代葡萄糖，避免高浓度糖对代谢产物阻遏作用；该培养基中使用了山梨醇替代抗生素，具有抑菌作用，但不会引起枯草芽孢杆菌工程菌基因突变，有利于生态环境安全和人类健康；山梨醇可提高枯草芽孢杆菌工程菌细胞膜渗透压，使其细胞内的代谢产物维生素B2迅速渗漏到细胞外，解除末端产物反馈抑制作用，提高发酵产物维生素B2的产量。采用本发明的培养基平均发酵效价达到35.7g/L，同传统技术相比，发酵水平提高11％以上。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基。
背景技术
维生素B2(VB2)，又叫核黄素，化学名：7，8-二甲基-10(1，-D-核糖醇基)-异咯嗪。VB2为人体和动物体内黄酶类辅基的组成部分(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，是生物生命活动中不可缺少的维生素之一，与碳水化合物、脂肪及氨基酸代谢有着密切的关系，对生物生长发育起着重要作用。人和动物体内不能合成VB2，必须由食物供给。当缺乏VB2时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，会产生多种疾病,例如心血管病、口角炎、偏头痛、心绞痛、白内障、疟疾等，故本品可用于上述疾病的防治。近年来，国内外用于抗衰老和保健的多维制剂中都含有VB2，这类药物不仅限于治病也用于保健，提高机体的抗病能力和延年益寿。VB2还可作饲料添加剂及化妆品等。
VB2化学式:C17H20N4O6，分子量：376.37
结构式(氧化态)：
Figure BDA0003030767560000011
目前维生素B2的工业化生产主要包括微生物发酵法和化学半合成法两种。
半合成生产法系微生物发酵法生产出D-核糖，再以D-核糖为原料通过合成法生产维生素B2；微生物发酵法又分为传统的酵母菌发酵法和新型的基因工程菌发酵法，酵母发酵法采用菌种主要包括棉囊阿舒氏酵母(A shbya gossyp ii)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)。
微生物发酵法以生产工艺简单、原料廉价、环境友好，以及资源可再生等优点，成为工业化生产主流。
酵母菌发酵法生产维生素B2，虽然发酵周期长(6～7天)，发酵单位较低(5～6克/升)，生产效率低于半合成法。但因其具有经济有效的生产工艺、易于自动化控制、产品无毒、纯度高等优点，被广泛用于核黄素的工业生产。
随着生命科学技术的迅速发展，从九十年代以来，出现了一种利用基因工程菌发酵生产维生素B2的新方法，即运用DNA重组技术构建出能够过量合成维生素B2的基因工程菌。基因工程菌的发酵周期短(2～3天)，发酵单位高(10克/升以上)，它既有酵母菌发酵法产品质量好的特点，又有化学半合成法生产效率高的优势，代表了维生素B2生产技术的发展方向，其中，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为受体菌的基因工程菌，工艺比较成熟，已普遍用于维生素B2的工业化生产。
目前，国内采用基因工程菌发酵法，存在的主要问题有以下几点：
1)为抑制杂菌生长，利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2发酵培养基中，经常添加少量抗生素,易使枯草芽孢杆菌工程菌产生抗性基因，或者携带未知突变基因，发酵液菌渣处理不当时,易使环境微生物产生抗药性，对生态环境及人类健康会造成有害影响。
2)枯草芽孢杆菌工程菌发酵培养基中，碳源以葡萄糖为主，易形成高浓度葡萄糖液，易使枯草芽孢杆菌工程菌产生溢流代谢，对维生素B2产素代谢造成阻遏，影响维生素B2发酵水平，降低维生素B2发酵产量。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵生物量，增强酶活力，降低生产成本的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基组成为：玉米浆(折干粉)10～30g/L、酵母粉3～6g/L、双糖6～8g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、硫酸镁0.3-1g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、磷酸氢二钾1～3g/L；
所述二级种子培养基组成为：玉米浆(折干粉)10～30g/L、酵母粉6～8g/L、双糖6～8g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、硫酸镁0.3-1g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、磷酸氢二钾1～3g/L；
所述发酵培养基组成为：玉米浆(折干粉)30～50g/L、酵母粉6～8g/L、甜菜碱0.5～1.5g/L、双糖6～8g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、硫酸镁0.3-1g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、聚醚改性硅0.08～0.12g/L；
其中：所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基组成还包括山梨醇或异山梨醇。
本发明一些实施例中，所述双糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖中的一种；
优选地，所述双糖选自麦芽糖。
本发明一些实施例中，所述山梨醇或异山梨醇的重量百分比为1～5g/L；
优选地，所述所述山梨醇或异山梨醇的重量百分比为2～4g/L；
更优选地，所述所述山梨醇或异山梨醇的重量百分比为3g/L。
本发明一些实施例中，所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮100～150mg/100ml、总糖3.0～5.0g/100ml、pH6.5～7.5。
本发明一些实施例中，所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮110～150mg/100ml、总糖3.0～5.0g/100ml、pH6.5～7.5。
本发明一些实施例中，所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮150～300mg/100ml、总糖2.0～3.6g/100ml、pH6.8～7.5。
本发明取得了如下的至少一项的有益效果：
1、本发明发酵培养基中使用了双糖替代葡萄糖，避免高浓度糖对代谢产物阻遏作用，比传统工艺提高发酵单位11％以上。
2、本发明发酵培养基中使用了山梨醇或异山梨醇替代抗生素，具有抑菌作用，能抑制杂菌生长，但山梨醇或异山梨醇毒性低，不会引起枯草芽孢杆菌工程菌基因突变，有利于生态环境安全和人类健康；山梨醇可提高枯草芽孢杆菌工程菌细胞膜渗透压，使其细胞内的代谢产物维生素B2迅速渗漏到细胞外。解除末端产物反馈抑制作用，提高发酵产物维生素B2的产量。
3、本发明确认了利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的一级种子、二级种子、发酵罐培养基的碳源、氮源最佳配伍比例，菌种生长代谢环境稳定，有利发酵产量、质量稳定。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种工艺过程为：
一级种子培养工艺：
在火焰保护下，将已经培养好的枯草芽孢杆菌工程菌母瓶菌丝按照0.8L左右的接种量，接入已消毒，无菌空气保压，温度38±0.5℃的一级种子培养基中，进行一级种子培养。
一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温38±0.5℃；空气流量50-100m3/h；搅拌转速120-200r/min，培养时间20h左右移种。移种比例1:0.08～0.12(V/V)，移入已消毒，无菌空气保压，温度38±0.5℃的二级种子培养基中，进行二级种子培养。
二级种子培养工艺：
二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温38±0.5℃；空气流量1500-1000m3/h；搅拌转速100-200r/min，培养时间10h左右移种。移种比例1:0.08～0.12(V/V)，移入已消毒，无菌空气保压，温度38±0.5℃的发酵培养基中，进行发酵培养。
发酵培养工艺：
发酵罐培养条件为：发酵温度：38±0.5℃；罐压0.03～0.05MPa；空气流量:1:0.6～1.2V/V/min(发酵液体积m3：每分钟通入无菌空气体积m3)；搅拌转速140-160r/min；pH控制在6.5-7.0。
发酵补料工艺：发酵罐移种10hr后开始补料，发酵截止前2hr左右，停止补料。采用流加补料方式，补料液为已消毒，温度30～35℃的40～50％(g/g)液化葡萄糖液，及经无菌过滤浓度为20～25％(g/g)氨水。
发酵过程监测并控制：糖浓度1.0～3.0g/100ml，氨基氮100～200mg/100ml
发酵培养结束要求：
发酵周期控制在55～65h。
实施例1
一级种子培养：种子培养基有效体积1.1m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)11kg、酵母粉3.3kg、麦芽糖6.6kg、山梨醇1.1kg、(NH4)2SO45.5kg、硫酸镁0.33kg、轻质碳酸钙6.6kg、磷酸氢二钾1.1kg。一级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮100mg/100ml、总糖3.0g/100ml、pH6.5。
二级种子培养：种子培养基有效体积11m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)110kg、酵母粉66kg、麦芽糖66kg、山梨醇11kg、(NH4)2SO455kg、硫酸镁3.3kg、轻质碳酸钙66kg、磷酸氢二钾11kg。二级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮110mg/100ml、总糖3.0g/100ml、pH6.8。
发酵培养：发酵培养基有效体积110m3。
1、玉米浆(折干粉)3300kg、酵母粉660kg、甜菜碱55kg、麦芽糖660kg、山梨醇110kg、(NH4)2SO4 550kg、硫酸镁33kg、轻质碳酸钙660kg、磷酸氢二钾110kg、聚醚改性硅8.8kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮150mg/100ml、总糖2.0g/100ml、pH6.8。
发酵培养结束，发酵效价35.6g/L，发酵周期62h。
实施例2
一级种子培养：种子培养基有效体积1.1m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)16.5kg、酵母粉4.4kg、麦芽糖7.7kg、山梨醇2.2kg、(NH4)2SO4 8.25kg、硫酸镁0.55kg、轻质碳酸钙7.7kg、磷酸氢二钾2.2kg。一级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮135mg/100ml、总糖3.9g/100ml、pH6.9。
二级种子培养：种子培养基有效体积11m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)165kg、酵母粉77kg、麦芽糖77kg、山梨醇22kg、(NH4)2SO482.5kg、硫酸镁5.5kg、轻质碳酸钙77kg、磷酸氢二钾22kg。二级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮122mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH6.5。
发酵培养：发酵培养基有效体积110m3。
玉米浆(折干粉)3850kg、酵母粉770kg、甜菜碱110kg、麦芽糖770kg、山梨醇220kg、(NH4)2SO4 825kg、硫酸镁55kg、轻质碳酸钙770kg、磷酸氢二钾220kg、聚醚改性硅9.9kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮180mg/100ml、总糖2.4g/100ml、pH7.0。
发酵培养结束，发酵效价35.9g/L，发酵周期55h。
实施例3
一级种子培养：种子培养基有效体积1.1m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)33kg、酵母粉5.5kg、麦芽糖8.8kg、山梨醇3.3kg、(NH4)2SO411kg、硫酸镁0.77kg、轻质碳酸钙8.8kg、磷酸氢二钾3.3kg。一级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮150mg/100ml、总糖5.0g/100ml、pH7.3。
二级种子培养：种子培养基有效体积11m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)330kg、酵母粉88kg、麦芽糖88kg、山梨醇33kg、(NH4)2SO4110kg、硫酸镁7.7kg、轻质碳酸钙88kg、磷酸氢二钾33kg。二级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮150mg/100ml、总糖4.6g/100ml、pH7.2。
发酵培养：发酵培养基有效体积110m3。
玉米浆(折干粉)4400kg、酵母粉880kg、甜菜碱165kg、麦芽糖880kg、山梨醇330kg、(NH4)2SO4 1100kg、硫酸镁77kg、轻质碳酸钙880kg、磷酸氢二钾330kg、聚醚改性硅11kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮300mg/100ml、总糖3.6g/100ml、pH7.2。
发酵培养结束，发酵效价36.1g/L，发酵周期63h。
实施例4
一级种子培养：种子培养基有效体积1.1m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)16.5kg、酵母粉6.6kg、麦芽糖7.7kg、山梨醇4.4kg、(NH4)2SO4 8.25kg、硫酸镁1.1kg、轻质碳酸钙9.9kg、磷酸氢二钾2.2kg。一级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮140mg/100ml、总糖4.2g/100ml、pH7.5。
二级种子培养：种子培养基有效体积11m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)165kg、酵母粉77kg、麦芽糖77kg、山梨醇44kg、(NH4)2SO482.5kg、硫酸镁11kg、轻质碳酸钙99kg、磷酸氢二钾22kg。二级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮123mg/100ml、总糖4.6g/100ml、pH7.5。
发酵培养：发酵培养基有效体积110m3。
玉米浆(折干粉)4950kg、酵母粉770kg、甜菜碱110kg、麦芽糖770kg、山梨醇440kg、(NH4)2SO4 825kg、硫酸镁110kg、轻质碳酸钙990kg、磷酸氢二钾220kg、聚醚改性硅12.1kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮230mg/100ml、总糖3.2g/100ml、pH7.5。
发酵培养结束，发酵效价35.7g/L，发酵周期65h。
实施例5
一级种子培养：种子培养基有效体积1.1m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)16.5kg、酵母粉4.95kg、麦芽糖7.7kg、山梨醇5.5kg、(NH4)2SO4 8.25kg、硫酸镁0.72kg、轻质碳酸钙8.2kg、磷酸氢二钾2.2kg。一级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮136mg/100ml、总糖4.8g/100ml、pH6.8。
二级种子培养：种子培养基有效体积11m3。
种子培养基：玉米浆(折干粉)165kg、酵母粉77kg、麦芽糖77kg、山梨醇55kg、(NH4)2SO482.5kg、硫酸镁7.2kg、轻质碳酸钙82.5kg、磷酸氢二钾22kg。二级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮125mg/100ml、总糖5.0g/100ml、pH7.3。
发酵培养：发酵培养基有效体积110m3。
玉米浆(折干粉)5500kg、酵母粉770kg、甜菜碱110kg、麦芽糖770kg、山梨醇550kg、(NH4)2SO4 825kg、硫酸镁71.5kg、轻质碳酸钙825kg、磷酸氢二钾220kg、聚醚改性硅13.2kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮290mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.1。
发酵培养结束，发酵效价35.2g/L，发酵周期63h。
对比案例1
一级种子培养：种子培养基有效体积1.1m3。
一级种子培养基：玉米浆(折干粉)22kg、酵母粉5.5g/L、葡萄糖16.5kg、(NH4)2SO48.8kg、硫酸镁0.66kg、轻质碳酸钙6.6kg、磷酸氢二钾2.2kg、红霉素0.011kg、氯霉素0.011kg。一级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮145mg/100ml、总糖4.8g/100ml、pH6.5。
二级种子培养基：种子培养基有效体积11m3。
玉米浆(折干粉)220kg、酵母粉66kg、葡萄糖220kg、(NH4)2SO4 88kg、硫酸镁6.6kg、轻质碳酸钙88kg、磷酸氢二钾25kg、红霉素0.11kg、氯霉素0.11kg。二级种子培养基灭菌后质量为：氨基氮134mg/100ml、总糖4.6g/100ml、pH6.9。
发酵培养：发酵培养基有效体积110m3。
玉米浆(折干粉)4400kg、酵母粉660kg、甜菜碱110kg、葡萄糖2200kg、(NH4)2SO41100kg、硫酸镁66kg、轻质碳酸钙770kg、磷酸氢二钾220kg、聚醚改性硅11kg、红霉素1.1kg、氯霉素1.1kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮236mg/100ml、总糖3.8g/100ml、pH7.6。发酵培养结束，发酵效价31.8g/L，发酵周期61h。

Claims (9)

1.一种利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基组成为：玉米浆(折干粉)10～30g/L、酵母粉3～6g/L、双糖6～8g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、硫酸镁0.3-1g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、磷酸氢二钾1～3g/L；
所述二级种子培养基组成为：玉米浆(折干粉)10～30g/L、酵母粉6～8g/L、双糖6～8g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、硫酸镁0.3-1g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、磷酸氢二钾1～3g/L；
所述发酵培养基组成为：玉米浆(折干粉)30～50g/L、酵母粉6～8g/L、甜菜碱0.5～1.5g/L、双糖6～8g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、硫酸镁0.3-1g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、聚醚改性硅0.08～0.12g/L；
其特征在于：
所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基组成还包括山梨醇或异山梨醇。
2.按照权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述双糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖中的一种。
3.按照权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述双糖为麦芽糖。
4.按照权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述山梨醇或异山梨醇的重量百分比为1～5g/L。
5.按照权利要求4所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述山梨醇或异山梨醇的重量百分比为2～4g/L。
6.按照权利要求5所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述山梨醇或异山梨醇的重量百分比为3g/L。
7.按照权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮100～150mg/100ml、总糖3.0～5.0g/100ml、pH6.5～7.5。
8.按照权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮110～150mg/100ml、总糖3.0～5.0g/100ml、pH6.5～7.5。
9.按照权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产维生素B2的培养基，其中所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮150～300mg/100ml、总糖2.0～3.6g/100ml、pH6.8～7.5。
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