CN105861586B

CN105861586B - 包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法

Info

Publication number: CN105861586B
Application number: CN201610322421.5A
Authority: CN
Inventors: 马吉银; 温廷益; 刘树文; 梁勇; 李戴欢; 张芸; 商秀玲; 赵春光; 郭小炜; 孟刚
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Heilongjiang Yipin New Materials Co ltd
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: EP3460068A4; CN105861586A; US11060080B2; WO2017198147A1; KR20190008908A; EP3460068B1; EP3460068A1; US20190322995A1; KR102460156B1

Abstract

本发明属于生物发酵工程领域，其提供了发酵制备戊二胺的方法，其包括，培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞，获得包含戊二胺的全细胞发酵液；和，提取步骤（1）获得的全细胞发酵液中的戊二胺，其中在向全细胞发酵液中加入强碱之前脱除其中的二氧化碳。本发明的方法可以大幅提高戊二胺的产量。

Description

包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法

技术领域

本发明属于生物发酵工程领域，具体而言，本发明涉及生物催化法生产1, 5-戊二胺及其分离提取技术，即二氧化碳脱除法分离提取全细胞催化液中的戊二胺的技术。

背景技术

1, 5-戊二胺(1,5-Pentanediamine) ，又名尸胺(Cadaverine)、1, 5-二氨基戊烷(1, 5- Diaminopentane)，与二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料（即尼龙）。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体—1,5-戊二胺具有重要的经济学和生态学意义。

全细胞催化法以赖氨酸为底物，利用菌体细胞中的赖氨酸脱羧酶催化产生戊二胺。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，利润率极低。因此，开发高效的以赖氨酸为底物的戊二胺生物催化的生产方法，不但可以开发新型生物基材料市场，还可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。

关于从发酵液/全细胞催化液中分离提取戊二胺的现有技术，可以列举以下的报道。专利US7189543B2公布了直接从催化液中制备戊二胺己二酸盐晶体的方法。使用己二酸中和全细胞催化过程中产生的戊二胺，获得pH为6.0的戊二胺己二酸盐溶液；去除戊二胺催化液中的细胞，活性炭脱色后浓缩至盐含量为70-77%，降温得到戊二胺己二酸盐晶体，用于尼龙聚合。专利（US2010/0292429A1, CN101981202A和EP1482055A1）和文献（MetabolicEngineering, 2014, 25:113–123）公开了应用丁醇萃取法从发酵液中分离提取戊二胺。在戊二胺发酵液中加入氢氧化钠，高温回流裂解发酵液中的副产物后，使用丁醇多次萃取获得含有戊二胺的有机相，蒸出有机相中的低沸点溶剂得到高沸点的戊二胺，进一步精馏获得高纯度的戊二胺。

目前公开的戊二胺分离提取的现有技术中，析晶法得到戊二胺羧酸盐的收率低，并且残存赖氨酸等杂质，难以进一步精制，所得到的戊二胺羧酸盐用作聚酰胺树脂膜材料时产生鱼眼等表面外观缺陷，并影响注射成型的流动性（CN101578256A）。萃取法得到戊二胺的收率较低；有机溶剂残留降低了戊二胺产品的纯度；有机溶剂气味大、毒性高、易燃易爆，增加了实际应用的操作难度；有机溶剂需要回收，增加了工艺流程和能耗。

发明内容

发明简述

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵制备1, 5-戊二胺的方法，其能提高1, 5-戊二胺，和/或能减少强碱用量并降低盐渣生成量，从而降低戊二胺生产的综合成本。具体而言，本发明的方法包括：

（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞，获得包含1, 5-戊二胺的发酵液；和

（2）提取步骤（1）获得的发酵液中的1, 5-戊二胺，其中在向发酵液中加入强碱之前脱除其中的二氧化碳。

优选在本发明的方法的步骤（1）中，所述细胞是过表达赖氨酸脱羧酶的细胞，优选是赖氨酸脱羧酶基因表达增强（如，通过替换赖氨酸脱羧酶基因的启动子为强启动子（如，T7启动子）而表达增强）的细胞。

也优选在本发明的方法的步骤（1）中，所述细胞是细菌细胞，优选是大肠杆菌细胞，如大肠杆菌BL21(DE3)。

还优选在本发明的方法的步骤（1）中，所述培养中不补加酸性pH调节剂，而且所述细胞自身会产生CO₂以中和1, 5-戊二胺。

另外优选在本发明的方法的步骤（1）中，所述细菌以赖氨酸为底物，通过赖氨酸脱羧酶催化而产生1, 5-戊二胺。

优选在本发明的方法中，步骤（2）包括：

（21）分离（如，离心或过滤）出发酵液中的液体；

（22）脱除步骤（21）获得的液体中的二氧化碳，然后加入碱处理；和

（23）从步骤（22）获得的处理液中提取出含1, 5-戊二胺的成分（如，馏分）。

更优选在本发明的方法的步骤（22）中，通过减压和/或升温分离出液体中的二氧化碳来脱除液体中的二氧化碳。

也更优选在本发明的方法的步骤（22）中，碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化钙。

还更优选在本发明的方法的步骤（23）中，所述提取包括蒸馏（如，常压蒸馏、减压蒸馏和/或精馏）、蒸发（如，闪蒸）和/或干燥（如，喷雾干燥和/或减压干燥）。

优选在本发明的方法中，1, 5-戊二胺的产量大于30g/L所述发酵液，优选大于50g/L所述发酵液，更优选大于80 g/L所述发酵液，更加优选大于100 g/L所述发酵液，最优选大于120 g/L所述发酵液。

发明详述

本发明人前期建立了利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化戊二胺的生产工艺，理论上，催化反应液中含有等摩尔的戊二胺和二氧化碳（碳酸根离子）。

本发明人进一步研究发现，通过减压和升温处理可以脱除全细胞催化液中赖氨酸脱羧生成戊二胺时产生的二氧化碳，使催化液的pH升高；进一步使用强碱调节催化液达到相同的碱性条件时，脱除二氧化碳后碱用量明显降低，后续戊二胺的蒸馏收率明显提高。在此基础上，建立了从戊二胺盐离子催化液中分离提取戊二胺的方法，完成了本发明。

本发明提供的从全细胞催化液中分离提取戊二胺的方法包括如下步骤：

（1) 去除戊二胺催化液中的菌体细胞，得到催化液清液；

（2）脱除该清液中部分二氧化碳；

（3）在脱除二氧化碳的清液中加入强碱；

（4）蒸出并收集得到戊二胺。

采用固液分离的化工原理方法去除催化液中菌体细胞，收集清液。去除催化液中细胞的具体方法包括絮凝、沉降、离心或过滤等。

由于二氧化碳为酸性气体，碱性的戊二胺可以作为二氧化碳的化学吸收剂，可逆反应生成可溶于水的盐。温度变化对该可逆反应的影响很大，低温有利于反应向生成弱酸弱碱盐的方向进行，而高温可使弱酸弱碱盐发生分解，释放二氧化碳。本发明人进一步发现，降低气压同样有利于二氧化碳从戊二胺溶液中脱除。同时进行减压和升温，可快速的脱除戊二胺催化液中的二氧化碳。其中二氧化碳分解温度介于40℃～200℃；蒸馏压力( 绝对压力)介于0.2kPa～1100kPa之间。

需要指出的是，虽然提高温度可以提高二氧化碳的脱除效率，但是同时导致戊二胺挥发，产物损失率提高。本发明人在实验过程中发现，在蒸馏压力介于20～200kPa之间，加热温度超过120℃时，挥发的戊二胺与二氧化碳气体在设备管道表面凝结成乳白色戊二胺碳酸盐。这不仅会导致戊二胺收率降低，戊二胺生产成本增加，而且还会导致设备管道阻塞，增加了生产应用的操作难度。考虑到实际生产应用的成本和可操作性，脱除二氧化碳的加热温度优选为60-120℃，戊二胺催化液中的二氧化碳的脱除率为30%～80%，戊二胺损失率为0.01%～10.00%。

在脱除二氧化碳的戊二胺催化液中加入强碱，置换出游离的戊二胺。其中强碱包括氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙等。强碱的加入量与催化液中戊二胺含量的摩尔比值为0.1～5.0:1，优选为0.5～3.0:1。

戊二胺催化液加入强碱后，可以通过常压蒸馏、减压蒸馏、精馏、闪蒸、喷雾干燥或减压干燥等方法，收集挥发的戊二胺。其中蒸馏温度介于40℃～ 200℃；蒸馏压力( 绝对压力)介于0.2kPa～1100.0kPa之间。

本发明还提供了回收利用催化液中逸出的二氧化碳的方法。由于戊二胺催化液中不含其它酸性气体，因此回收得到的二氧化碳通过加压液化即可得到高纯度二氧化碳；收集得到的二氧化碳与氨气混合，升温增压反应可以生产尿素；二氧化碳与碱（如氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵等）中和，生成碳酸铵/碳酸氢铵、碳酸钠/碳酸氢钠、碳酸钾/碳酸氢钾、碳酸钙、碳酸镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵等。

本发明所述的戊二胺全细胞催化液是通过利用副产物CO₂自控pH的方法全细胞催化生产戊二胺结束时得到的催化液。其中利用副产物CO₂自控pH具体为在全细胞催化的过程中不向催化液补加酸性pH调节剂且不通入任何气体，利用赖氨酸脱羧酶促反应所产生的酸性CO₂中和碱性产物戊二胺。

上述利用副产物CO₂调控pH的全细胞催化生产戊二胺的方法，副产物CO₂是指赖氨酸在赖氨酸脱羧酶的催化作用下产生戊二胺并同时产生的CO₂。

本发明中，酸性二氧化碳和碱性戊二胺在水溶液中容易形成戊二胺碳酸盐。伴随着溶液中底物赖氨酸的催化消耗和戊二胺碳酸盐的生成，催化液的pH缓慢升高直至稳定。底物赖氨酸盐的浓度可以为20-500g/L，稳定时催化液pH不超过8.5，一般不超过8.0。

本发明中用于催化生产戊二胺的细胞是指过表达赖氨酸脱羧酶基因的细菌。

其中赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1，5- 戊二胺的酶，没有特别限制，可举出例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或深海热球菌(Pyrococcus abyssi)等微生物的酶。优选来自大肠杆菌的酶。

本发明用于全细胞催化生产戊二胺的工程菌是过表达赖氨酸脱羧酶基因的细菌。所述细菌优选为大肠杆菌，更有选为大肠杆菌B株或其衍生菌株。所述过表达是指提高赖氨酸脱羧酶在细胞内的量，具体方法可以是增加所述赖氨酸脱羧酶基因的拷贝数，例如使用多拷贝表达质粒携带赖氨酸脱羧酶基因全部或部分核苷酸序列，或是在染色体中插入多拷贝赖氨酸脱羧酶基因全部或部分核苷酸序列；过表达的方法也可以是应用高效的仅表达元件调控基因的表达水平，所述元件可以是强启动子，增强子或RBS等；过表达的方法也可以是改造基因的编码序列，如密码子优化，提高赖氨酸脱羧酶的翻译效率。

用于全细胞催化生产戊二胺的工程菌还可以是在过表达赖氨酸脱羧酶基因的基础上进一步适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。所述适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子；所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T ₅启动子、 lac启动子、tac启动子或T ₇启动子。

一种制备1, 5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述的工程菌在LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入丰富培养基中，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化，即得；

所述诱导剂具体为IPTG或乳糖；

所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液；

所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物, 20 g/L胰蛋白胨, 0.9g/L K₂HPO₄·3H₂O, 1.14 g/LKH₂PO₄, 10g/L (NH₄)₂SO₄, 0.3g/L MgSO₄·7H₂O, 5 mL/L微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；

所述微量元素储液含有6g/L FeSO₄·7H₂O, 1.35g/L CaCl₂, 0.8g/L ZnSO₄·7H₂O，1.5g/L MnSO₄·4H₂O, 0.15g/L CuSO₄·5H₂O, 0.2g/L (NH₄ )₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.1g/LH₃BO₃, 0.25g/L CoCl₂·6H₂O和 10mL/L浓盐酸，余量为水。

所述种子液的OD₆₀₀为2-25，优选为3-5；

所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30.0%，具体为5%；

所述发酵培养的温度为25ºC-45ºC，具体为37 ºC；

所述发酵培养的DO在50%以上；

所述发酵培养的pH为4.0-9.0；

所述IPTG的终浓度为0.01-10.00mM，优选为0.05-0.40mM；

所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-10h，优选为2-6h；

所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；

所述加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-10h，优选为1-5h；

所述催化还包括如下步骤：温度控制在25-60ºC，搅拌转速为0-1200rpm；

所述催化过程中，所述温度具体为30 -50ºC；

所述催化过程中，所述搅拌转速具体为200-1000rpm。

一种制备1, 5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将权利要求所述的工程菌在LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入无机盐培养基，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化，即得；

所述诱导剂为IPTG或乳糖；

所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；

所述无机盐培养基含有2g/L (NH₄)₂HPO_4, 4g/L KH₂PO₄, 0.85g/L柠檬酸, 0.7 g/L MgSO₄·7H₂O，10mg/L FeSO₄·7H₂O, 2.25mg/L ZnSO₄·7H₂O, 0.2mg/L CuSO₄·5H₂O,0.5mg/L MnSO₄·5H₂O, 0.23mg/L NaB₄O₇·10H₂O, 2.0mg/L CaCl₂·2H₂O, 0.1 mg/LNH₄Mo₇O₂₄，0.15 mg/L CoCl₂·6H₂O，余量为水。

上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/L；

所述种子液的OD₆₀₀为2-25，优选为3-5；

所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30.0%，具体为2.0%；

所述发酵培养的温度为25ºC-45ºC，具体为37 ºC；

所述发酵培养的DO在50%以上；

所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，具体是通过流加补料液实现的，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO₄·7H₂O，余量为水；

所述IPTG的终浓度为0.01-10.00mM，优选为 0.05-0.40mM；

所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-20h，具体为4-12h；

所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；

所述加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-24 h，具体为1-5 h；

所述催化过程中，所述温度具体为30-50 ºC；

所述搅拌转速具体为200-1000 rpm。

所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液，其中赖氨酸盐是赖氨酸和有机酸或无机酸的反应产物，可以例举为赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐、赖氨酸乙酸盐、赖氨酸己二酸盐、赖氨酸丁二酸盐或赖氨酸癸二酸盐等。

本发明的有益效果在于：

首先，通过脱除戊二胺催化液中的二氧化碳，降低其中的碳酸（氢）根离子含量，减少了戊二胺分离提取过程中置换戊二胺的强碱用量，相应地减少了戊二胺挥发后形成的盐渣量，从而降低了戊二胺生产的辅料成本和废渣处理成本；

其次，二氧化碳的脱除可避免因戊二胺蒸馏过程中碱用量不足造成的二氧化碳与气态的戊二胺中和后凝结在加热容器出口或管道，导致管道堵塞和收率降低等问题；

再次，通过合理控制二氧化碳脱除条件，避免戊二胺在脱除二氧化碳的过程中大量蒸出，导致产品收率降低、生产成本提高；

最后，本发明提供了赖氨酸脱羧副产物二氧化碳的捕集及利用方法，不但可以减少温室气体的排放，还可以产生额外的经济效益。

综上所述，本发明技术在实践上适用于1, 5-戊二胺的工业化生产，具有很高的实用性和应用性。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1 pET28a-cadA质粒图谱。

图2 全细胞催化生产戊二胺的过程曲线

图3 碱液回收二氧化碳过程的pH变化曲线

图4 二氧化碳脱除过程曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 HPLC法检测赖氨酸和戊二胺

取1mL全细胞催化液，8000g离心5min，收集上清液检测赖氨酸含量；取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5mol/L NaHCO₃水溶液和100μL 1%（体积比）二硝基氟苯乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，加入700μL 0.04mol/L KH₂PO₄水溶液（pH=7.2±0.05,用40g/L KOH水溶液调整pH）释并摇匀，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL；

所用色谱柱为C18柱（ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA）；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH=7.2±0.05,用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55%（体积比）乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min，洗脱过程如下：

洗脱起始时刻（0min）流动相A占流动相总流量的体积份数为86%、流动相B占流动相总流量的体积份数为14%；洗脱过程分为5个阶段，每个阶段中流动相A和流动相D占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段（从起始时刻开始共进行2min）结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88%、流动相B占流动相总流量的体积份数为12%，第2阶段（从第1阶段结束时刻开始共进行2min）结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86%、流动相B占流动相总流量的体积份数为14%，第3阶段（从第2阶段结束时刻开始共进行6min）结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70%、流动相B占流动相总流量的体积份数为30%，第4阶段（从第3阶段结束时刻开始共进行10min）结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30%、流动相B占流动相总流量的体积份数为70%。以市售L-赖氨酸标准品制作标准曲线，计算样品的赖氨酸浓度。

检测戊二胺时，取10µL样品上清液加入含有100µL 4.2g/100mL的碳酸氢钠水溶液的2mL离心管，混匀后加入200µL 含有体积百分含量为1%的2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，混匀；60ºC衍生反应60分钟（严格计时，30分钟取出轻微震荡混匀继续衍生反应）。取出避光降温至室温，加入1600µL乙腈，漩涡震荡混匀30秒，有机系滤膜过滤后取15µL进样。

流动相A为pH7.2的5.4 g/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为体积百分含量80%的乙腈水溶液，将A和B按照体积比5：95的比例，1 mL/min的流速泵入流动相，所用色谱柱为C18柱（ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm, Agilent,USA）；柱温：35ºC；检测波长：360nm。

以 1,5-戊二胺盐酸盐（购自sigma公司）为标准品，1,5-戊二胺盐酸盐的浓度在1-5 g/L之间线性关系良好。以标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

以下实施例中的1, 5-戊二胺浓度均由标准曲线公式计算得到的1,5-戊二胺盐酸盐的测定值换算成1, 5-戊二胺浓度值。

实施例2 全细胞催化生产戊二胺工程菌的构建

（一）赖氨酸脱羧酶基因cadA过表达质粒的构建

在pET28a（+）表达载体的T7启动子和RBS之后插入优化的赖氨酸脱羧酶基因cadA的ORF。以优化设计的序列设计引物，以野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFi^TM HotStar，以P1和P2为引物，PCR扩增cadA基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。PCR程序为：98ºC变性30秒，65ºC退火15秒，72ºC延伸150秒，26个循环，通过引物P1引入突变位点，从而获得改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA*的片段。

P1：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT

(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)

P2：5’-ACGCGTCGACCTCCTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTG-3’

(下划线所示序列为Sal I酶切识别位点)

切胶回收上述PCR电泳条带,使用限制性内切酶Nco I 和Sal I双酶切赖氨酸脱羧酶基因cadA*的DNA片段和 pET28a（+）质粒，得到酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段和载体大片段；将酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段与载体大片段连接，转化至大肠杆菌EC135（Zhang et al, Plos Genetics，2012,8(9): e1002987）的感受态细胞，在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadA*质粒示意图见图1。

（二）染色体cadB基因启动子的替换

以大肠杆菌BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板，以引物P3和P4、P5和P6分别进行PCR扩增，获得长度分别为510bp和610bp的两条DNA片段,分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。其中，T7启动子序列和lac调控序列由引物P4和P5引入。PCR按如下方式进行：94ºC变性30 s，52ºC退火30 s，以及72 ºC延伸30 s（30个循环）。其中，引物序列如下：

P3：5’-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3’

(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)

P4：5’-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCA ACATATT ATACCAACAG-3’

P5：5’-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAG GAGAAGAGCATGAG-3’

P6：5’-ATTGCGGCCGC TCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3’

(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)

将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA分子的混合物为模板，以P3和P6为引物，通过Overlap PCR扩增到长约1.1kb的Overlap片段，如SEQ ID No.4所示。其中PCR程序为：94 ºC变性30秒，52ºC退火30 秒，72ºC延伸60秒，26个循环。

SEQ ID No.4中自5’末端起第477位至第495位核苷酸所示的序列为T₇启动子序列，SEQ ID No.4中自5’末端起第496位至第520位核苷酸所示的序列为lac调控序列。

Bam HI和Not I双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；Bam HI和NotI双酶切pKOV质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pKOV-P_T7-cadB，并其送测序，验证其含有正确T₇启动子和lac调控基因序列，保存备用。

将构建好的pKOV-P_T7-cadB质粒电转化入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，于30 ºC、150rpm，在LB培养基中复苏2 h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的cadB基因的自身启动子被替换为T7启动子，将该菌株命名为E. coli BL21 P_cadB:: P_T7。

（三）戊二胺工程菌的构建

将质粒pET28a-cadA*转化至E. coli BL21 P_cadB:: P_T7的感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E. coli BL21 P_cadB:: P_T7/pET28a-cadA ^*，用于1, 5-戊二胺全细胞催化。

实施例3 菌体培养和戊二胺催化生产工艺

刮取工程菌E. coli BL21 (DE3) P_cadB:: P_T7/ pET28a-cadA ^*菌苔接入含有50 mLLB（含50 mg/L 卡那霉素（5-200 mg/L均可）培养基的500 mL三角瓶中，在37 ºC 220 rpm摇床中培养4 h，得到种子液，OD₆₀₀为4-5；培养所得的种子液按2%的接种量接入含有2 L无机盐培养基的10 L发酵罐中，培养温度为37 ºC，DO控制在30%以上，罐压控制在0.02-0.10MPa。通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5 g/L以下。当培养液中菌体OD₆₀₀达到30-40时加入0.1mM诱导剂IPTG，2h后菌体培养液OD₆₀₀达到80左右，离心获得湿菌体。

其中无机盐培养基成分和补料液成分如下：无机盐培养基：2 g/L (NH₄)₂HPO_4, 4g/L KH₂PO₄, 0.85 g/L Citric acid（柠檬酸）, 0.7 g/L MgSO₄·7H₂O，10 mg/L FeSO₄·7H₂O, 2.25 mg/L ZnSO₄·7H₂O, 0.2 mg/L CuSO₄·5H₂O, 0.5 mg/L MnSO₄·5H₂O, 0.23mg/L NaB₄O₇·10H₂O, 2.0 mg/L CaCl₂·2H₂O, 0.1 mg/L NH₄Mo₇O₂₄，0.15 mg/L CoCl₂·6H₂O，余量为水。补料液包含700 g/L葡萄糖和20g/L MgSO₄·7H₂O，余量为水。

配制含有300 g/L赖氨酸盐酸盐和0.2 mmol/L PLP的催化液体系，调控温度至37°C以后，发酵罐搅拌转速设置为500 rpm，加入20 g/L湿菌体（折合细胞干重4 g/L）开始全细胞催化。不补加酸性物质调节pH，并且不通空气，利用副产物CO₂调节自调控催化体系的pH。在催化开始的前20分钟，pH迅速上升至7.2左右，而在之后的几个小时pH缓慢升高至7.8（图2）。每隔0.5h从发酵罐中取出催化液，12000 × g离心5分钟，倒出上清液，按照实施例1 的赖氨酸和-戊二胺方法检测全细胞催化过程中1,5-戊二胺产量。如图2所示，赖氨酸消耗和戊二胺生产过程变化趋势与pH类似，前0.5小时赖氨酸迅速消耗且戊二胺迅速积累，之后变化过程缓慢。催化4h的底物催化消耗率达到99.8%，赖氨酸盐酸盐残余量仅为0.67 g/L。

实施例4 减压蒸馏脱除戊二胺催化液中的二氧化碳

离心去除催化反应液中的菌体，取500mL离心后的戊二胺催化液，加入20L油浴旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，减压蒸馏脱除二氧化碳。二氧化碳解吸过程中循环水式真空泵的真空表读数达到-0.095 Mpa左右，水浴锅加热温度分别设置为60 ºC、70 ºC、80ºC、90 ºC、100ºC、120 ºC、140ºC和160ºC，考察不同温度条件下的二氧化碳脱除情况。压力和温度保持稳定后减压蒸馏60 min，蒸馏结束后在圆底烧瓶中加入超纯水，并定容至初始体积，测定蒸馏前后的戊二胺催化液中的二氧化碳含量。使用总有机碳总氮分析仪(Vario TOC)检测催化液总无机碳（TIC）含量，计算催化反应液的二氧化碳脱出率。计算公式为：二氧化碳脱除率=（减压蒸馏前戊二胺催化液中TIC含量-减压整流后戊二胺催化液中TIC含量）÷减压蒸馏前戊二胺催化液中TIC含量×100%。实验结果表明，戊二胺催化液中二氧化碳脱出率随着加热温度升高而提高（表1）。

表1 不同减压蒸馏温度条件下戊二胺催化液的二氧化碳脱除率

温度 (ºC)	CO₂脱除率 (%)
		60	42.9
70	48.7
		80	53.1
90	57.1
		100	59.3
120	66.6
		140	68.9
160	80.2

二氧化碳脱除的过程中，戊二胺也会随之挥发。在上述不同温度条件下的减压蒸馏过程中，将冷却循环水温度设置为20ºC，收集冷凝后的馏分，检测其中的戊二胺含量，计算二氧化碳脱除过程中的戊二胺的损失率。计算方法为：戊二胺损失率=（馏分戊二胺含量×馏分体积）÷（蒸馏前催化液的戊二胺含量×加入圆底烧瓶中的催化液体积）×100%，结果如表2所示：戊二胺的损失率随着蒸馏温度的升高而提高，当加热温度设置为60ºC时，戊二胺损失率低于0.1%；而加热温度升高至160ºC时，戊二胺损失率达到8%以上。加热温度温度大于等120℃时，大量的戊二胺挥发逃逸，与二氧化碳气体在温度较低的设备管道表面凝结成乳白色的戊二胺碳酸盐，不仅容易堵塞管道，而且增加了设备清洗难度。

表2 不同减压蒸馏温度条件下戊二胺损失率

温度 (ºC)	戊二胺损失率 (%)
		60	0.06
70	0.09
		80	0.35
90	0.96
		100	1.22
120	3.07
		140	4.13
160	8.16

实施例5 碱液回收脱除的二氧化碳

离心去除催化反应液中的菌体，取500mL离心后的戊二胺催化液，加入5L旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，减压蒸馏脱除二氧化碳。蒸馏过程中循环水式真空泵的真空表读数为-0.095 Mpa左右，水浴锅加热温度分别设置为40ºC、50ºC、60ºC和70ºC，考察不同温度条件下的二氧化碳解析情况。循环水式真空泵水槽中加入10L含量为6g/L的氢氧化钠溶液，用于吸收戊二胺催化液中解吸的二氧化碳。将pH电极插入水槽中，实时记录循环水式真空泵水槽碱液的pH值。随着脱除的二氧化碳在碱液中化学吸收，水槽碱液的pH逐渐降低。加热温度越高，水槽碱液的pH降低越快（图3）。

使用总有机碳总氮分析仪(型号Vario TOC)检测循环水式真空泵水槽碱液中的总无机碳（TIC）含量，计算碱液吸收二氧化碳的吸收量。加热温度设置为50ºC减压蒸馏时的碱液吸收的二氧化碳过程曲线如图4所示，循环水式真空泵水槽碱液中TIC含量逐渐升高。

实施例6 二氧化碳脱除减少置换游离戊二胺所需的强碱消耗量

按照实施例5的温度和压力条件脱除二氧化碳90分钟，倒出圆底烧瓶中脱除二氧化碳后的戊二胺催化液，加入超纯水稀释至2L，测定稀释后催化液的pH值。水浴锅加热温度分别设置为40ºC、50ºC、60ºC和70ºC脱除二氧化碳后，催化液的pH由7.66分别上升至8.45、9.63、9.75和9.90。进一步使用氢氧化钠调节稀释至等体积的戊二胺催化液的pH，将100 mL脱除二氧化碳后的催化液的pH调节至11、12和13，分别需要消耗42mL、72mL和106mL的氢氧化钠溶液（100g/L）；而稀释相同戊二胺含量的脱除二氧化碳之前的催化液则分别消耗97mL、141mL和185mL氢氧化钠溶液。结果表明，在强碱置换出游离戊二胺的工序，脱除催化液中的二氧化碳可明显降低强碱用量，蒸馏戊二胺后形成的固体废渣更少。

实施例7 二氧化碳脱除提高戊二胺蒸馏收率

离心去除催化反应液中的菌体，取500mL离心后的戊二胺催化液，加入20L旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，油浴加热温度设置为70ºC减压蒸馏脱除二氧化碳。90分钟后加入等摩尔量的氢氧化钠，将油浴温度设置为120ºC，继续减压蒸馏120min，收集戊二胺馏分。对照试验不脱除二氧化碳，按照相同的条件直接蒸馏加入等摩尔量氢氧化钠的戊二胺催化液，收集戊二胺馏分。脱除二氧化碳后再蒸馏强碱置换的戊二胺催化液，可得到62.3g戊二胺，而对照试验仅得到11.8g戊二胺。

序列表

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

中国科学院微生物研究所

<120> 包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法

<130> CN

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2148

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

cgcggatcct gcgccattct caacatcctt tagatgaaaa acaattagca gcactgaaca60

cagaaataga taacattgtt acactaccgg aattgaataa cctgtccatt atatatcaaa120

taaaagcggt cagtgctctg gtaaaaggta aaacagatga gtcttaccag gcgataaata180

ctggcattga tcttgaaatg tcctggctaa attatgtatt gcttggcaag gtttatgaaa240

tgaaggggat gaaccgggaa gcggctgatg catatctcac cgcctttaat ttacgcccag300

gggcaaacac cctttactgg attgaaaatg gtatattcca gacttctgtt ccttatgttg360

taccttatct cgacaaattt ctcgcttcag aataagtaac tcccgggttg atttatgctc420

ggcaatattt gttgttgagt ttttgtatgt tactgttggt ataatatgtt gcggcataat480

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 510

<210> 3

<211> 610

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

actcactata ggggaattgt gagcggataa caattccgaa attaggagaa gagcatgagt60

tctgccaaga agatcgggct atttgcctgt accggtgttg ttgccggtaa tatgatgggg120

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accgctgtat cttatctttc caccttcttc ccagtattaa atgatcctgt tccggcgggt420

atcgcctgta ttgctatcgt ctgggtattt acctttgtaa atatgctcgg cggtacctgg480

gtaagccgtt taaccactat tggtctggtg ctggttctta ttcctgtggt gatgactgct540

attgttggct ggcattggtt tgatgcggca acttatgcag ctaactggaa tactgcggag600

cggccgcaat 610

<210> 4

<211> 1080

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

cgcggatcct gcgccattct caacatcctt tagatgaaaa acaattagca gcactgaaca60

cagaaataga taacattgtt acactaccgg aattgaataa cctgtccatt atatatcaaa120

taaaagcggt cagtgctctg gtaaaaggta aaacagatga gtcttaccag gcgataaata180

ctggcattga tcttgaaatg tcctggctaa attatgtatt gcttggcaag gtttatgaaa240

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gggcaaacac cctttactgg attgaaaatg gtatattcca gacttctgtt ccttatgttg360

taccttatct cgacaaattt ctcgcttcag aataagtaac tcccgggttg atttatgctc420

ggcaatattt gttgttgagt ttttgtatgt tactgttggt ataatatgtt gcggcataat480

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc gaaattagga gaagagcatg540

agttctgcca agaagatcgg gctatttgcc tgtaccggtg ttgttgccgg taatatgatg600

gggagcggta ttgcattatt acctgcgaac ctagcaagta tcggtggtat tgctatctgg660

ggttggatta tctctattat tggtgcaatg tcgctggcgt atgtatatgc ccgactggca720

acaaaaaacc cgcaacaagg tggcccaatt gcttatgccg gagaaatttc ccctgcattt780

ggttttcaga caggtgttct ttattaccat gctaactgga ttggtaacct ggcgattggt840

attaccgctg tatcttatct ttccaccttc ttcccagtat taaatgatcc tgttccggcg900

ggtatcgcct gtattgctat cgtctgggta tttacctttg taaatatgct cggcggtacc960

tgggtaagcc gtttaaccac tattggtctg gtgctggttc ttattcctgt ggtgatgact1020

gctattgttg gctggcattg gtttgatgcg gcaacttatg cagctaactg gaatactgcg1080

Claims

1.发酵制备1, 5-戊二胺的方法，其包括：

（21）分离出发酵液中的液体；

（23）从步骤（22）获得的处理液中提取出含1, 5-戊二胺的成分。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是过表达赖氨酸脱羧酶的细胞。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是赖氨酸脱羧酶基因表达增强的细胞。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是通过替换赖氨酸脱羧酶基因的启动子为强启动子而表达增强的细胞。

5.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是通过替换赖氨酸脱羧酶基因的启动子为T7启动子而表达增强的细胞。

6.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是细菌细胞。

7.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是大肠杆菌细胞。

8.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

9.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述培养中不补加酸性pH调节剂，而且所述细胞自身会产生CO₂以中和1, 5-戊二胺。

10.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中，所述细胞以赖氨酸为底物，通过赖氨酸脱羧酶催化而产生1, 5-戊二胺。

11.权利要求1所述的方法，其中步骤（21）中，分离是离心或过滤。

12.权利要求1所述的方法，其中步骤（22）中，通过减压和/或升温分离出液体中的二氧化碳来脱除液体中的二氧化碳。

13.权利要求1所述的方法，其中步骤（22）中，碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化钙。

14.权利要求1所述的方法，其中步骤（23）中，所述成分是馏分。

15.权利要求1所述的方法，其中步骤（23）中，所述提取包括蒸馏、蒸发和/或干燥。

16.权利要求15所述的方法，其中步骤（23）中，所述蒸馏是常压蒸馏、减压蒸馏和/或精馏。

17.权利要求15所述的方法，其中步骤（23）中，所述蒸发是闪蒸。

18.权利要求15所述的方法，其中步骤（23）中，所述干燥是喷雾干燥和/或减压干燥。

19.权利要求1所述的方法，其中1, 5-戊二胺的产量大于30g/L所述发酵液。

20.权利要求19所述的方法，其中1, 5-戊二胺的产量大于50 g/L所述发酵液。

21.权利要求20所述的方法，其中1, 5-戊二胺的产量大于80 g/L所述发酵液。

22.权利要求21所述的方法，其中1, 5-戊二胺的产量大于100 g/L所述发酵液。

23.权利要求22所述的方法，其中1, 5-戊二胺的产量大于120 g/L所述发酵液。