KR102460156B1

KR102460156B1 - 이산화탄소 스트리핑 공정을 포함한 펜탄디아민의 발효 생산 방법

Info

Publication number: KR102460156B1
Application number: KR1020187036434A
Authority: KR
Inventors: 지인 마; 팅이 웬; 슈웬 리우; 용 리앙; 다이후안 리; 윤 장; 시우링 샹; 춘구앙 챠오; 샤오웨이 구; 강 멩
Original assignee: 헤이롱지앙 에펜 뉴 마테리알스 씨오.,엘티디.
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2022-10-31
Also published as: CN105861586A; EP3460068A4; EP3460068B1; WO2017198147A1; US11060080B2; CN105861586B; EP3460068A1; KR20190008908A; US20190322995A1

Abstract

본 발명은 리신 탈카르복실화효소를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 펜탄디아민을 포함하는 전세포 발효액을 획득하는 단계; 및 상기 전세포 발효액 중의 펜탄디아민을 추출하는 단계를 포함하고, 여기서, 전세포 발효액에 강염기를 넣기 전에 그 중의 이산화탄소를 스트리핑하는 펜탄디아민의 발효 제조 방법을 제공하였다. 상기 방법은 펜탄디아민의 생산량을 크게 향상시킬 수 있다.

Description

이산화탄소 스트리핑 공정을 포함한 펜탄디아민의 발효 생산 방법

본원 발명은 출원일자가 2016년 5월 16일이고 출원번호가 CN201610322421.5인 중국 특허 출원의 우선권을 주장한다. 본원 발명은 상기 중국 특허 출원의 전문을 인용한다.

본 발명은 생물 발효 공정 분야에 속하며, 구체적으로, 본 발명은 생물 촉매법에 의한 1,5-펜탄디아민의 생산 및 이의 분리 추출 기술, 즉 이산화탄소 스트리핑법으로 전세포 촉매액 중의 펜탄디아민을 분리 추출하는 기술에 관한 것이다.

1,5-펜탄디아민(1,5-pentanediamine)은 카다베린(cadaverine), 1,5-디아미노펜탄(1,5-diaminopentane)이라고도 하는데, 이원산(binary acid)과 함께 고분자 폴리아미드(polyamide) 재료(즉 나일론)로 중합될 수 있다. 전세계적으로 매년 약 700만톤의 폴리아미드 재료를 생산함으로써 대량의 석유 화학 자원을 소모하며, 따라서 생물법으로 폴리아미드의 중요한 조성 단량체인 1,5-펜탄디아민을 합성하는 것은 중요한 경제학 및 생태학적 의미를 가지고 있다.

전세포 생촉매법은 리신(lysine)을 기질로 사용하고 균체 세포 중의 리신 탈카르복실화효소(lysine decarboxylase)를 이용하여 촉매 작용을 일으켜 펜탄디아민을 생산한다. 현재, 리신은 대중적인 아미노산 종류 중의 하나로서, 에너지 과잉 생산이 엄중하고, 이익률이 극히 낮다. 따라서, 리신을 기질로 하는 펜탄디아민 생촉매화 고효율적인 생산 방법을 개발하면, 신규 생물 기질 재료의 시장을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 아미노산 발효 산업의 전환과 업그레이드를 추진할 수 있다.

발효액/전세포 생촉매액으로부터 펜탄디아민을 분리 추출하는 선행기술에 관하여, 하기와 같은 보도를 예를 들 수 있다. 특허 US7189543B2는 직접 촉매액으로부터 펜탄디아민 아디페이트(pentanediamine adipate) 결정체를 제조하는 방법을 공개하였다. 아디프산(Adipic acid)을 사용하여 전세포 생촉매 과정에서 생산된 펜탄디아민을 중화시켜 pH가 6.0인 펜탄디아민 아디페이트 용액을 획득하고, 펜탄디아민 촉매액 중의 세포를 제거하며, 활성탄으로 탈색시킨 후 염 함량이 70 내지 77%로 될 때까지 농축시키고, 온도를 낮추어 펜탄디아민 아디페이트 결정체를 획득하여 나일론 중합에 사용하였다. 특허(US2010/0292429A1, CN101981202A 및 EP1482055A1)와 문헌(Metabolic Engineering, 2014, 25:113-123)에서는 부탄올 추출법을 이용하여 발효액으로부터 펜탄디아민을 분리 추출하는 방법을 공개하였다. 펜탄디아민 발효액에 수산화나트륨을 넣고, 고온에서 환류시켜 발효액 중의 부산물을 열분해시킨 후, 부탄올을 사용하여 여러 번 추출하여 펜탄디아민을 함유한 유기상을 획득하며, 유기상 중의 저비등점의 용매를 증발시켜 고비등점의 펜탄디아민을 획득하고, 진일보 정류시켜 고순도의 펜탄디아민을 획득하였다.

현재 공개된 펜탄디아민 분리 추출의 선행기술에서, 결정화법으로 펜탄디아민 카르복시레이트(pentanediamine carboxylate)를 획득하는 수율이 낮고, 리신 등 불순물이 잔존하여 더 정제하기 어려우며, 획득한 펜탄디아민 카르복시레이트를 폴리아미드 수지 필름 재료로 사용할 경우 어안 등 표면 외관에 결함이 발생하고, 사출성형의 유동성(CN101578256A)에 영향주게 된다. 추출법으로 펜탄디아민을 획득하는 수율이 비교적 낮고, 유기 용매의 잔류는 펜탄디아민 제품의 순도를 감소시키며, 유기 용매의 냄새가 심하고, 독성이 크며, 쉽게 인화되고 폭발하므로, 실제 응용의 조작 난이도를 증가시키며, 유기 용매를 회수해야 됨으로, 공정 프로세스와 에너지 소모를 증가시킨다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 1,5-펜탄디아민의 생성량을 증가시킬 수 있고, 및/또는 강염기 용량을 감소시키며 솔트 슬래그(salt slag) 생성량을 감소시켜, 펜탄디아민을 생산하는 종합적 원가를 절감하는 신규 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로 말하면, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:

(1)리신 탈카르복실화효소를 발현하는 세포를 배양하여, 1,5-펜탄디아민을 포함하는 발효액을 획득하는 단계; 및

(2)단계(1)에서 획득한 발효액 중의 1,5-펜탄디아민을 추출하고, 발효액에 강염기를 넣기 전에 그 중의 이산화탄소를 스트리핑하는 단계.

바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(1)에서, 상기 세포는 리신 탈카르복실화효소를 과발현시키는 세포이고, 바람직하게, 리신 탈카르복실화효소 유전자 발현이 증강(예를 들어, 리신 탈카르복실화효소 유전자의 프로모터를 강한 프로모터(예를 들어, T7 프로모터)로 대체하여 발현이 증강)된 세포이다.

더 바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(1)에서, 상기 세포는 세균 세포이고, 바람직하게, 대장균 세포이며, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3)이다.

더 바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(1)에서, 상기 배양에 산성 pH 조절제를 추가하지 않고, 상기 세포 자체가 CO₂를 생성하여 1,5-펜탄디아민을 중화시킨다.

더 바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(1)에서, 상기 세포는 리신을 기질로 하고 리신 탈카르복실화 효소의 촉매 작용을 통해 1,5-펜탄디아민을 생성한다.

바람직하게, 본 발명의 방법에서, 단계(2)는,

(21)발효액 중의 액체를 분리(예를 들어, 원심분리 또는 여과)하는 단계;

(22)단계(21)에서 획득한 액체 중의 이산화탄소를 스트리핑한 후 염기를 넣어 처리하는 단계; 및

(23)단계(22)에서 획득한 처리액으로부터 1,5-펜탄디아민을 함유하는 성분(예를 들어, 유분)을 추출하는 단계를 포함한다.

더 바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(22)에서, 감압 및/또는 승온을 통해 액체 중의 이산화탄소를 분리하여 액체 중의 이산화탄소를 스트리핑한다.

더 바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(22)에서, 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨 및/또는 수산화칼슘을 포함한다.

더 바람직하게, 본 발명의 방법의 단계(23)에서, 상기 추출은 증류(예를 들어, 상압 증류, 감압 증류 및/또는 정류), 증발(예를 들어, 플래시 증발) 및/또는 건조(예를 들어, 분무 건조 및/또는 감압 건조)를 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 방법에서, 1,5-펜탄디아민의 생산량은 30 g/L 상기 발효액보다 크고, 바람직하게, 50 g/L 상기 발효액보다 크며, 더 바람직하게, 80 g/L 상기 발효액보다 크고, 보다 더 바람직하게, 100 g/L 상기 발효액보다 크며, 가장 바람직하게, 120 g/L 상기 발효액보다 크다.

본 발명자는 초반에 부산물인 이산화탄소를 이용하여 pH를 자아 제어하는 펜탄디아민 전세포 촉매 작용에 의한 생산 공정을 구축하였고, 이론적으로, 촉매 반응액은 등몰(equimolar)의 펜탄디아민과 이산화탄소(탄산염 이온)를 함유한다.

본 발명자는 진일보의 연구를 거쳐, 감압과 승온 처리를 통해 전세포 촉매액 중 리신이 탈카복시화되어 펜탄디아민을 생성할 경우 발생되는 이산화탄소를 스트리핑할 수 있어, 촉매액의 pH를 상승시키고, 진일보 강염기를 사용하여 촉매액이 동일한 염기성 조건에 도달하도록 할 경우, 이산화탄소를 스트리핑한 후 염기 사용량이 현저히 감소되며, 후속적 펜탄디아민의 증류 수율이 현저히 높아짐을 발견하였다. 이 기초상에서, 펜탄디아민염 이온 촉매액으로부터 펜탄디아민을 분리 추출하는 방법을 구축하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 제공하는 전세포 촉매액으로부터 펜탄디아민을 분리 추출하는 방법은 하기 단계를 포함한다.

(1)펜탄디아민 촉매액 중의 균체 세포를 제거하여 촉매액 상청액을 획득하는 단계;

(2)상기 상청액 중 일부분 이산화탄소를 스트리핑하는 단계;

(3)이산화탄소를 스트리핑한 상청액에 강염기를 넣는 단계;

(4)증발 및 수집하여 펜탄디아민을 획득하는 단계.

고체 액체 분리의 화학공업 원리 방법으로 촉매액 중 균체 세포를 제거하여 상청액을 수집한다. 촉매액 중 세포를 제거하는 구체적인 방법은 응집, 침전, 원심분리 또는 여과 등을 포함한다.

이산화탄소는 산성 기체이므로, 염기성의 펜탄디아민은 이산화탄소의 화학 흡수제로 사용될 수 있고, 가역 반응을 통해 물에 용해될 수 있는 염을 생성한다. 온도 변화가 상기 가역 반응에 대한 영향이 아주 크고, 저온은 반응이 약산 약염기염을 생성하는 방향으로 진행하는데 유리하지만, 고온은 약산 약염기염을 분해시켜 이산화탄소를 방출하도록 한다. 본 발명자는, 또한 대기압을 감압시키면 마찬가지로 이산화탄소가 펜탄디아민 용액으로부터 스트리핑되는데 유리함을 발견하였다. 동시에 감압과 승온을 진행하면 펜탄디아민 촉매액 중의 이산화탄소를 신속하게 스트리핑할 수 있다. 여기서, 이산화탄소의 분해 온도는 40℃ 내지 200℃ 사이이고, 증류 압력(절대 압력)은 0.2kPa 내지 1100 kPa 사이이다.

설명해야 할 점은, 비록 온도를 높이면 이산화탄소의 스트리핑 효율을 향상시킬 수 있지만, 동시에 펜탄디아민이 휘발되어 생성물 손실률이 높아진다. 본 발명자는 실험 과정에서, 증류 압력이 20 내지 200 kPa 사이이고 가열 온도가 120℃를 초과할 경우, 휘발된 펜탄디아민과 이산화탄소 기체가 설비 파이프 표면에서 유백색의 펜탄디아민 탄산염으로 응결되는 것을 발견하였다. 이는 펜탄디아민 수율을 감소시킬 뿐만 아니라, 펜탄디아민의 생산 원가를 증가시키고, 설비 파이프가 막히게 되며, 생산 응용의 조작 난이도를 증가시킨다. 실제 생산 응용의 원가와 조작 가능성을 고려하면, 이산화탄소를 스트리핑하는 가열 온도는 바람직하게 60 내지 120℃이고, 펜탄디아민 촉매액 중의 이산화탄소의 스트리핑률은 30% 내지 80%이며, 펜탄디아민 손실률은 0.01% 내지 10.00%이다.

이산화탄소가 스트리핑된 펜탄디아민 촉매액에 강염기를 넣어 유리상태의 펜탄디아민을 치환시킨다. 여기서, 강염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화칼슘 등을 포함한다. 강염기의 첨가량과 촉매액 중 펜타디아민 함량의 몰비는 0.1 내지 5.0:1이고, 바람직하게 0.5 내지 3.0:1이다.

펜탄디아민 촉매액에 강염기를 넣은 후, 상압 증류, 감압 증류, 정류, 플래시 증발, 분무 건조 또는 감압 건조 등 방법을 통해 휘발된 펜탄디아민을 수집할 수 있다. 여기서, 증류 온도는 40℃ 내지 200℃ 사이이고, 증류 압력(절대 압력)은 0.2kPa 내지 1100 kPa 사이이다.

본 발명은 촉매액으로부터 나오는 이산화탄소를 회수 이용하는 방법을 더 제공한다. 펜탄디아민 촉매액에 다른 산성 기체가 포함되지 않기에, 회수하여 얻은 이산화탄소는 가압 액화를 통해 고순도의 이산화탄소를 얻을 수 있고, 수집하여 얻은 이산화탄소를 암모니아 가스와 혼합하고 승온 증압 반응시켜 요소를 생성할 수 있으며, 이산화탄소를 염기(예를 들어, 암모니아수, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산암모늄 등)와 중화시켜 탄산암모늄/탄산수소암모늄, 탄산나트륨/탄산수소나트륨, 탄산칼륨/탄산수소칼륨, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산수소암모늄 등을 생성한다.

본 발명에 따른 펜탄디아민의 전세포 촉매액은 부산물 CO₂를 이용하여 pH를 자아 제어하는 방법을 통해 전세포 촉매 작용을 일으켜 펜탄디아민에 대한 생산 종료 시 얻은 촉매액이다. 여기서, 부산물 CO₂를 이용하여 pH를 자아 제어하는 것은 구체적으로 전체 세포 촉매 작용 과정에서 촉매액에 산성 pH 조절제를 추가하지 않고 어떠한 기체도 통과시키지 않으며, 리신 탈카르복실화효소를 이용하여 반응을 촉진시켜 생성된 산성 CO₂로 염기성 산물인 펜탄디아민을 중화시키는 것이다.

부산물 CO₂를 이용하여 pH를 조절 제어하는 전세포 촉매 작용으로 펜탄디아민을 생산하는 상기 방법에서, 부산물 CO₂는 리신이 리신 탈카르복실화효소의 촉매 작용 하에 펜탄디아민을 생성하는 동시에 생성된 CO₂를 의미한다.

본 발명에서, 산성 이산화탄소와 염기성 펜탄디아민은 수용액에서 쉽게 펜탄디아민 탄산염을 형성한다. 용액 중 기질인 리신의 촉매 소모와 펜탄디아민 탄산염의 생성이 수반되어, 촉매액의 pH는 안정될 때까지 천천히 상승된다. 기질인 리신염의 농도는 20 내지 500 g/L일 수 있고, 안정적일 경우 촉매액의 pH는 8.5를 초과하지 않으며, 일반적으로 8.0를 초과하지 않는다.

본 발명에서 촉매 작용을 통해 펜탄디아민을 생산하는데 사용되는 세포는 리신 탈카르복실화효소 유전자를 과발현하는 세균을 의미한다.

여기서, 리신 탈카르복실화효소는 리신을 1,5-펜탄디아민으로 전환시키는 효소이며, 특별히 제한하지 않는데, 예를 들어 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium), 하프니아 알베이(Hafnia alvei), 콜레라균(Vibrio cholerae), 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토미세스 필로수스(Streptomyces pilosus), 유박테리움 아시다미노필룸(Eubacterium acidaminophilum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 피로코쿠스 아비시(Pyrococcus abyssi) 등 미생물에서 유래된 효소를 예를 들 수 있다. 바람직하게 대장균에서 유래된 효소이다.

본 발명에서, 전세포 촉매 작용으로 펜탄디아민을 생산하는데 사용되는 엔지니어링 박테리아는 리신 탈카르복실화효소 유전자를 과발현하는 세균이다. 상기 세균은 바람직하게 대장균이고, 더 바람직하게 대장균 B균주 또는 이의 유도 균주이다. 상기 과발현은 리신 탈카르복실화효소가 세포 내에 있어서의 량을 증가시키는 것을 의미하고, 구체적인 방법은 상기 리신 탈카르복실화효소 유전자의 복제 개수를 증가시키는 것일 수 있는데, 예를 들어, 다복제 발현 플라스미드를 사용하여 리신 탈카르복실화효소 유전자의 전부 또는 일부분의 뉴클레오티드 서열을 갖고 있거나, 염색체에 다복제 리신 탈카르복실화효소 유전자의 전부 또는 일부분의 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 것이고, 과발현하는 방법은 고효율적인 구성 요소 조절유전자만 발현하는 발현 수준을 응용하는 것일 수도 있으며, 상기 구성 요소는 강한 프로모터, 증폭자 또는 RBS 등일 수 있고, 과발현하는 방법은 유전자의 코딩 서열을 개조하는 것일 수도 있는데, 예를 들어, 코돈(codon) 최적화, 리신 탈카르복실화효소의 번역 효율의 향상이다.

전세포 촉매 작용으로 펜탄디아민을 생산하는데 사용되는 엔지니어링 박테리아는 리신 탈카르복실화효소 유전자를 과발현시키는 기초상에서, 진일보 리신-펜탄디아민 역수송 단백질 유전자 cadB를 적당히 발현시키는 것일 수 있다. 상기 리신-펜탄디아민 역수송 단백질 유전자 cadB를 적당히 발현시키는 것은 RBS 서열을 포함하거나 포함하지 않는 리신-펜탄디아민 역수송 단백질 유전자의 전부 또는 일부분의 뉴클레오티드 서열을 외인성 발현 플라스미드 중의 리신 탈카르복실화효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 안착시킨 후 발현시키는 것을 의미하거나, 또는 대장균에 적용되는 cadB 전사 억제를 해소할 수 있는 프로모터로 대장균 B균주 또는 이의 유도 균주 염색체에서의 리신-펜탄디아민 역수송 단백질 유전자 자체의 프로모터를 대체하는 것을 의미하고, 상기 대장균에 적용되는 cadB 전사 억제를 해소할 수 있는 프로모터는 구체적으로 L프로모터, trc프로모터, T ₅ 프로모터, lac프로모터, tac 프로모터 또는 T ₇ 프로모터이다.

1,5-펜탄디아민의 제조 방법도 본 발명의 보호 범위에 속하며, 하기와 같은 단계를 포함한다. 상기 어느 하나의 엔지니어링 박테리아를 LB 액체 배지에서 배양하여 시드액을 획득하고; 시드액을 리치 배지(rich medium)에 접종하고, 발효 배양하며; 유도제를 넣어 발현을 유도한 다음, 기질인 리신과 인산피리독살(pyridoxal phosphate)을 넣어 전세포 촉매 작용을 시작하여 1,5-펜탄디아민을 얻는다.

상기 유도제는 구체적으로 IPTG 또는 유당이다.

상기 기질인 리신은 구체적으로 리신 생산균을 함유하는 리신 발효액, 균체가 제거된 리신 발효액, 균체가 제거되고 탈색된 리신 발효액, 리신 발효액의 이온 교환 용출액, 유리상태 리신, 리신염 건조분말 또는 이의 용액이다.

상기 리치 배지는 10 g/L의 효모 추출물, 20 g/L의 트립톤(tryptone), 0.9 g/L의 K₂HPO₄·3H₂O, 1.14 g/L의 KH₂PO₄, 10 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 0.3 g/L의 MgSO₄·7H₂O, 5 mL/L의 미량 원소 저장액, 50 mg/L의 카나마이신(kanamycin)을 함유하고, 나머지는 물이다.

상기 미량 원소 저장액은 6 g/L의 FeSO₄·7H₂O, 1.35 g/L의 CaCl₂, 0.8 g/L의 ZnSO₄·7H₂O, 1.5 g/L의 MnSO₄·4H₂O, 0.15 g/L의 CuSO₄·5H₂O, 0.2 g/L의 (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0.1 g/L의 H₃BO₃, 0.25 g/L의 CoCl₂·6H₂O 및 10 mL/L의 농염산을 함유하고, 나머지는 물이다.

상기 시드액의 OD₆₀₀는 2 내지 25이고, 바람직하게 3 내지 5이다.

상기 시드액을 리치 배지에 접종하는 비율은 0.5 내지 30.0 %이고, 구체적으로 5%이다.

상기 발효 배양의 온도는 25℃ 내지 45℃이고, 구체적으로 37℃이다.

상기 발효 배양의 DO는 50% 이상이다.

상기 발효 배양의 pH는 4.0 내지 9.0이다.

상기 IPTG의 최종 농도는 0.01 내지 10.00 mM이고, 바람직하게 0.05 내지 0.40 mM이다.

상기 IPTG의 첨가 시간은 발효 배양 후 2 ~내지 10 h이고, 바람직하게 2 내지 6 h이다.

상기 리신염은 L-리신 염산염 또는 리신 황산염을 포함한다.

상기 기질인 리신과 인산피리독살을 넣고 전세포 촉매 작용을 시작하는 시간은 유도 시작 후의 0.5 내지 10 h이고, 바람직하게 1 내지 5 h이다.

상기 촉매 작용은 온도를 25 내지 60 ℃로 제어하고 교반 속도를 0 내지 1200 rpm로 제어하는 단계를 더 포함한다.

상기 촉매 작용 과정에서, 상기 온도는 구체적으로 30 내지 50 ℃이다.

상기 촉매 작용 과정에서, 상기 교반 속도는 구체적으로 200 내지 1000 rpm이다.

1,5-펜탄디아민의 제조 방법도 본 발명의 보호 범위에 속하고, 하기와 같은 단계를 포함한다. 즉, 상기 엔지니어링 박테리아를 LB 액체 배지에서 배양하여 시드액을 획득하고; 시드액을 무기염 배지에 접종하고, 발효 배양하며; 유도제를 넣어 발현을 유도한 다음, 기질인 리신과 인산피리독살을 넣고 전세포 촉매 작용을 시작하여 1,5-펜탄디아민을 얻는다.

상기 유도제는 IPTG 또는 유당이다.

상기 기질인 리신은 리신 생산균을 함유하는 리신 발효액, 균체가 제거된 리신 발효액, 균체가 제거되고 탈색된 리신 발효액, 리신 발효액의 이온 교환 용출액, 유리상태 리신, 리신염 건조분말 또는 이의 용액이다.

상기 무기염 배지는 2 g/L의 (NH₄)₂HPO₄, 4 g/L의 KH₂PO₄, 0.85 g/L의 구연산, 0.7 g/L의 MgSO₄·7H₂O, 10 mg/L의 FeSO₄·7H₂O, 2.25 mg/L의 ZnSO₄·7H₂O, 0.2 mg/L의 CuSO₄·5H₂O, 0.5 mg/L의 MnSO₄·5H₂O, 0.23 mg/L의 NaB₄O₇·10H₂O, 2.0 mg/L의 CaCl₂·2H₂O, 0.1 mg/L의 NH₄Mo₇O₂₄, 0.15 mg/L의 CoCl₂·6H₂O을 함유하고, 나머지는 물이다.

상기 방법에서, 상기 LB 액체 배지 중 카나마이신의 농도는 5 내지 200 mg/L이고, 구체적으로 50 mg/L이다.

상기 시드액을 무기염 배지에 접종하는 비율은 0.5 내지 30.0 %이고, 구체적으로 2.0 %이다.

상기 발효 배양의 온도는 25 ℃ 내지 45 ℃이고, 구체적으로 37 ℃이다.

상기 발효 배양의 DO는 50 % 이상이다.

상기 발효 배양 시 포도당의 농도는 5 g/L 이하로 유지되고, 구체적으로 유가(fed-batch)액을 통해 실현되며, 상기 유가액은 700 g/L의 포도당과 20 g/L의 MgSO₄·7H₂O를 함유하고, 나머지는 물이다.

상기 IPTG의 첨가 시간은 발효 배양 후 3 내지 20 h이고, 구체적으로 4 내지 12 h이다.

상기 리신염은 L-리신 염산염 또는 리신 황산염을 포함한다.

상기 기질인 리신과 인산피리독살을 넣고 전세포 촉매 작용을 시작하는 시간은 유도 시작 후의 0.5 내지 24 h이고, 구체적으로 1 내지 5 h이다.

상기 교반 속도는 구체적으로 200 내지 1000 rpm이다.

상기 기질인 리신은 구체적으로 리신 생산균을 함유하는 리신 발효액, 균체가 제거된 리신 발효액, 균체가 제거되고 탈색된 리신 발효액, 리신 발효액의 이온 교환 용출액, 유리상태 리신, 리신염 건조분말 또는 이의 용액이고, 여기서, 리신염은 리신과 유기산 또는 무기산의 반응 생성물이며, 리신 염산염, 리신 황산염, 리신 탄산염, 리신 초산염, 리신 아디프산염, 리신 호박산염 또는 리신 세바스산염 등을 예를 들 수 있다.

본 발명의 유익한 효과는 하기와 같다.

우선, 펜탄디아민 촉매액 중의 이산화탄소를 스트리핑하는 것을 통해 그 중의 탄산(수소)염 이온 함량을 감소시키고, 펜탄디아민의 분리 추출 과정에서 펜탄디아민을 치환하는 강염기 사용량을 감소시키며, 상응하게 펜탄디아민이 휘발된 후 형성된 솔트 슬래그 양을 감소시킴으로써, 펜탄디아민을 생산하는 보조재료 원가와 폐기물 잔재 처리 원가를 감소시켰다.

다음, 이산화탄소의 스트리핑은 펜탄디아민 증류 과정에서 염기 용량의 부족으로 인한 이산화탄소와 기체 상태의 펜탄디아민이 중화된 후 가열 용기 출구 또는 파이프에 응결되어 파이프가 막히고 수율이 감소되는 등 문제를 방지할 수 있다.

그 다음, 이산화탄소 스트리핑 조건을 합리적으로 제어하는 것을 통해, 펜탄디아민이 이산화탄소가 스트리핑되는 과정에서 대량 증발되어 제품 수율이 감소되고 생산 원가가 증가되는 것을 방지한다.

마지막으로, 본 발명은 리신 탈카르복실화 부산물인 이산화탄소의 포집 및 이용 방법을 제공하여, 실온 기체의 배출을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 별도의 경제적 효익도 발생할 수 있다.

상술한 바를 종합하면, 본 발명의 기술은 실행과정에서 1,5-펜탄디아민의 공업화 생산에 적용되고, 아주 높은 실용성과 응용성을 구비한다.

도 1은 pET28a-cadA 플라스미드도이다.
도 2는 전세포 촉매 작용으로 펜탄디아민을 생산하는 과정의 그래프이다.
도 3은 염기액으로 이산화탄소를 회수하는 과정의 pH 변화 그래프이다.
도 4는 이산화탄소 스트리핑 과정의 그래프이다.

이해를 돕기 위하여, 아래 구체적인 도면과 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 특별히 설명해야 할 점은, 이러한 설명은 단지 예시적인 설명이고, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서의 논술에 따르면, 본 발명의 여러가지 변화, 개변은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.

이 밖에, 본 발명은 공개 문헌을 인용하고, 이러한 문헌은 본 발명을 더 명확하게 설명하기 위한 것이며, 이들의 모든 내용이 본 명세서에서 이미 중복으로 서술된 것 처럼 이들의 모든 내용은 참조로서 본 명세서에 인용된다.

하기 실시예에서 사용한 실험 방법은 특별히 설명되지 않는 한 모두 통상적인 방법이다. 하기 실시예에서 사용한 재료, 시약 등은 특별히 설명되지 않는 한 모두 상업적 경로를 통해 얻을 수 있다.

실시예 1. HPLC법으로 리신과 펜탄디아민을 측정

1 mL의 전세포 촉매액을 취하여 8000g에서 5min 동안 원심분리하고 상청액을 수집하여 리신 함량을 측정하고, 10μL의 상청액을 2mL의 원심분리 튜브에 취하여 200μL의 0.5mol/L의 NaHCO₃ 수용액과 100μL의 1 %(체적비)의 디니트로플루오로페닐아세토니트릴(dinitrofluorophenylacetonitrile) 용액을 넣어, 60 ℃의 수욕(water bath)에서 어두운 곳에서 60min 동안 항온 가열한 다음, 실온까지 냉각시키며, 700μL의 0.04 mol/L의 KH₂PO₄ 수용액(pH=7.2±0.05, 40g/L의 KOH 수용액으로 pH를 조절함)을 넣고 균일하게 흔들고, 15 min 동안 방치하고 여과한 후 샘플링하며, 샘플링량은 15μL이다.

사용되는 크로마토그래피 칼럼은 C18 칼럼(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6×150 mm, Agilent, USA)이고, 칼럼 온도는 40℃이며, 자외선 측정 파장은 360nm이고, 유동상A는 0.04mol/L의 KH₂PO₄ 수용액(pH=7.2±0.05, 40g/100mL의 KOH 수용액으로 pH를 조절함)이며, 유동상B는 55%(체적비)의 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액이고, 유동상 총 유동량은 1mL/min이고, 용출 과정은 하기와 같다.

용출 시작 시각(0 min)에 유동상A가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 86 %이고, 유동상B가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 14 %이며, 용출 과정은 5개의 단계로 나뉘고, 각각의 단계에서 유동상A와 유동상B가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 모두 선형 변화이며, 제1 단계(시작 시각으로부터 시작하여 총 2min 동안 진행함)가 종료될 시 유동상A가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 88 %이고, 유동상B가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 12 %이며, 제2 단계(제1 단계가 종료되는 시각으로부터 시작하여 총 2 min 동안 진행함)가 종료될 시 유동상A가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 86 %이고, 유동상B가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 14 %이며, 제3 단계(제2 단계가 종료되는 시각으로부터 시작하여 총 6 min 동안 진행함)가 종료될 시 유동상A가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 70 %이고, 유동상B가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 30 %이며, 제4 단계(제3 단계가 종료되는 시각으로부터 시작하여 총 10 min 동안 진행함)가 종료될 시 유동상A가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 30 %이고, 유동상B가 유동상 총 유동량에서 차지하는 체적 부수는 70 %이다. 시중에서 판매하는 L-리신 표준품으로 표준곡선을 제작하고, 샘플의 리신 농도를 계산하였다.

펜탄디아민을 측정할 경우, 10μL의 샘플 상청액을 취하여 100μL의 4.2g/100mL의 탄산수소나트륨 수용액을 함유한 2mL의 원심분리 튜브에 넣고, 균일하게 혼합한 후 체적 백분율이 1%인 2,4-디니트로플루오로벤젠(2,4-dinitrofluorobenzene)을 함유한 200μL의 아세토니트릴 용액을 넣고 균일하게 혼합하며, 60℃에서 60분 동안 유도 반응(시간을 엄격하게 기록하고, 30분 후 꺼내서 가볍게 흔들어 균일하게 혼합하며 계속하여 유도 반응을 진행함)을 진행하였다. 꺼내서 빛이 차단된 곳에서 실온까지 온도를 낮추고, 1600μL의 아세토니트릴을 넣고 흔들어 30 초 동안 균일하게 혼합하며, 유기계 여과막으로 여과한 후 15 μL를 취하여 샘플링하였다.

유동상A는 pH가 7.2인 5.4g/L의 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate) 수용액이고, 유동상B는 체적 백분율이 80%인 아세토니트릴 수용액이며, A와 B를 체적비가 5:95인 비율에 따라 1 mL/min의 유속으로 유동상에 펌핑하고, 사용되는 크로마토그래피 칼럼은 C18 칼럼(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6×150mm, Agilent,USA)이며, 칼럼 온도는 35℃이고, 측정 파장은 360nm이다.

1,5-펜탄디아민 염산염(sigma 회사에서 구매함)을 표준품으로 하고, 1,5-펜탄디아민 염산염의 농도는 1 내지 5 g/L 사이에서 선형 관계가 양호하다. 표준품의 농도는 횡좌표로 하고, 표준품 적분 피크 면적을 종좌표로 하여 표준곡선을 제작하였다.

이하, 실시예 중의 1,5-펜탄디아민 농도는 모두 표준곡선 공식으로 계산하여 얻은 1,5-펜탄디아민 염산염의 측정값을 1,5-펜탄디아민 농도값으로 환산하였다.

실시예 2. 전세포 촉매 작용으로 펜탄디아민 엔지니어링 박테리아를 생산하는 방법의 구축

(1) 리신 탈카르복실화효소 유전자cadA 과발현 플라스미드의 구축

pET28a(+)는 발현벡터의 T7 프로모터와 RBS 뒤에 최적화된 리신 탈카르복실화효소 유전자cadA의 ORF를 삽입하였다. 최적화 설계된 서열로 프라이머를 설계하고,야생형 대장균 K12 W3110 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 고품질의 폴리메라아제(polymerase) KAPA HiFi^TM HotStar를 사용하고, P1과 P2를 프라이머로 하며, PCR로 cadA 유전자를 증폭시켰으며, 상기 유전자는 서열번호1로 표시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열이다. PCR 과정은, 98℃에서 30초 동안 변성시키고, 65℃에서 15초 동안 어닐링(annealing)시키며, 72℃에서 150초 동안 연장시키며, 26번 순환시키고, 프라이머P1을 통해 돌연변이 부위에 인입함으로써, 개조된 리신 탈카르복실화효소 유전자cadA*의 단편을 획득하였다.

P1: 5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT

(밑줄 그은 서열은 Nco I 제한효소 절단 인식 부위이다)

P2: 5'-ACGCGTCGACCTCCTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTG-3'

(밑줄 그은 서열은 Sal I 제한효소 절단 인식 부위이다)

겔을 절단하여 상기 PCR 전기영동 밴드를 회수하였으며, 제한 내부핵산 가수분해 효소(restriction endonuclease) Nco I와 Sal I 로 리신 탈카르복실화효소 유전자cadA*의 DNA 단편 및 pET28a(+) 플라스미드를 이중 절단하여, 제한효소로 절단한 리신 탈카르복실화효소 유전자cadA*의 유전자 단편과 담체의 큰 단편을 얻었다. 제한효소로 절단한 리신 탈카르복실화효소 유전자cadA*의 유전자 단편과 담체의 큰 단편을 연결시켜 대장균 EC135(Zhang et al, Plos Genetics, 2012, 8(9): e1002987)의 컴피턴트 세포(competent cell)로 도입시켰으며, 50 mg/L의 카나마이신을 함유한 LB 평판에서 선별하여 재조합 플라스미드를 함유한 형질전환체(transformant)를 획득하고, 플라스미드를 추출하여 이를 시퀀싱(sequencing)하여 결과가 정확한 플라스미드를 pET28a-cadA* 플라스미드로 명명하며 모식도는 도 1에 도시되었다.

(2)염색체 cadB 유전자 프로모터의 교체

대장균 BL21(DE3) 균주 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머P3 및 P4, P5 및 P6으로 PCR 증폭을 진행하여, 길이가 각각 510bp 및 610bp인 두 갈래의 DNA 단편을 획득하며, 각각 서열번호2 및 서열번호3으로 표시된 바와 같다. 여기서, T₇ 프로모터 서열과 lac 조절 서열은 프라이머 P4와 P5에 의해 인입되었다. PCR는, 94℃에서 30s 동안 변성시키고, 52℃에서 30s 동안 어닐링시키며, 72℃에서 30s 동안 연장(30개 사이클링)시키는 방식으로 진행되었다. 여기서, 프라이머 서열은 하기와 같다.

P3: 5'-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3'

(밑줄 그은 서열은 BamHI 제한효소 절단 인식 부위이다)

P4: 5'-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCA ACATATT ATACCAACAG-3'

P5: 5'-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAG GAGAAGAGCATGAG-3'

P6: 5'-ATTGCGGCCGC TCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3'

(밑줄 그은 서열은 Not I 제한효소 절단 인식 부위이다)

서열번호2 및 서열번호3으로 표시된 DNA 분자의 혼합물을 주형으로 하고, P3 및 P6을 프라이머로 하여, Overlap PCR을 통해 길이가 약 1.1kb인 Overlap 단편을 증폭하였으며, 서열번호4로 표시된 바와 같다. 여기서, PCR 과정은, 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 52℃에서 30초 동안 어닐링시키며, 72℃에서 60초 동안 연장시키며, 26번 순환하는 것이다.

서열번호4에서 5'말단으로부터 제477번째 부위에서 제495번째 부위까지의 뉴클레오티드로 표시되는 서열은 T₇ 프로모터 서열이고, 서열번호4에서 5'말단으로부터 제496번째 부위에서 제520번째 부위까지의 뉴클레오티드로 표시되는 서열은 lac 조절 서열이다.

Bam HI 및 Not I로 서열번호3으로 표시되는 DNA 분자를 이중 절단하여, 유전자 단편을 얻었으며, Bam HI 및 Not I로 pKOV플라스미드를 이중 절단하여 담체의 큰 단편을 얻었고, 유전자 단편과 담체의 큰 단편을 연결시켜 재조합 플라스미드를 얻어 이를 pKOV-P_T7-cadB로 명명하고, 이를 시퀀싱하여, 정확한 T₇ 프로모터와 lac 조절 유전자 서열을 포함함을 검증하여, 저장하여 사용할 준비를 하였다.

구축된 pKOV-P_T7-cadB 플라스미드를 대장균BL21(DE3) 균주에 전기층격 형질전환시키고, 30℃, 150rpm에서, LB 배지에서 2시간 동안 소생시킨 후, Addgene 회사의 pKOV 플라스미드의 제품 프로토콜에 따라 상동성 재조합 양성의 단일클론을 선별하고, 시퀀싱을 거쳐 이의 염색체에서의 cadB 유전자의 자체 프로모터가 T7 프로모터로 교체되었음을 확인하였으며, 상기 균주를 E. coli BL21 P _cadB _:: P_T7로 명명하였다.

(3) 펜탄디아민 엔지니어링 박테리아의 구축

플라스미드 pET28a-cadA*를 E. coli BL21 P _cadB _:: P_T7의 컴피턴트 세포에 도입시키고, 50mg/L의 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에서 선별하여 엔지니어링 박테리아E . coli BL21 P _cadB _:: P_T7/pET28a-cadA*를 획득하였으며, 1,5-펜탄디아민 전세포 촉매에 사용하였다.

실시예 3. 균체 배양과 펜탄디아민 촉매 작용 생산 공정

엔지니어링 박테리아 E. coli BL21(DE3) P _cadB _:: P_T7/ pET28a-cadA* 론(lawn)을 긁어 내어 50 mL의 LB(50mg/L의 카나마이신(5 내지 200 mg/L 모두 가능)을 함유함) 배지를 함유한 500 mL의 삼각 플라스크에 접종시키고, 37℃, 220rpm의 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하여 시드액을 얻었으며, OD₆₀₀는 4 내지 5이고, 배양하여 얻은 시드액을 2%의 접종량에 따라 2 L의 무기염 배지를 함유한 10L의 발효 탱크에 접종하였으며, 배양 온도는 37℃이고, DO를 30%이상으로 제어하며, 탱크 압력을 0.02 내지 0.10 MPa로 제어하였다. 유가액을 통해 배양액 중 포도당의 농도를 5g/L 이하로 유지시켯다. 배양액 중 균체 OD₆₀₀이 30 내지 40에 도달할 경우 0.1 mM의 유도제 IPTG를 넣고, 2시간 후 균체 배양액의 OD₆₀₀이 80정도에 도달하자, 원심분리하여 습균체를 얻었다.

여기서, 무기염 배지 성분과 유가액 성분은 하기와 같은 바, 무기염 배지는 2g/L의 (NH₄)₂HPO₄, 4 g/L의 KH₂PO₄, 0.85g/L의 Citric acid(구연산), 0.7g/L의 MgSO₄·7H₂O, 10mg/L의 FeSO₄·7H₂O, 2.25mg/L의 ZnSO₄·7H₂O, 0.2mg/L의 CuSO₄·5H₂O, 0.5mg/L의 MnSO₄·5H₂O, 0.23mg/L의 NaB₄O₇·10H₂O, 2.0mg/L의 CaCl₂·2H₂O, 0.1mg/L의 NH₄Mo₇O₂₄, 0.15mg/L의 CoCl₂·6H₂O이고, 나머지는 물이다. 유가액은 700g/L의 포도당과 20 g/L의 MgSO₄·7H₂O를 포함하고, 나머지는 물이다.

300g/L의 리신 염산염과 0.2 mmol/L의 PLP를 함유한 촉매액 체계를 조제하고, 온도를 37℃까지 조절한 후, 발효 탱크에서의 교반 속도를 500rpm으로 설정하며, 20g/L의 습균체(세포건조무게로 환산하면 4g/L임)를 넣고 전세포 촉매 작용을 시작하였다. 산성 물질을 추가하지 않고 pH를 조절하며, 공기를 통과시키기 않고, 부산물 CO₂ 조절을 이용하여 촉매 작용 체계의 pH를 자아 조절하였다. 촉매 작용이 시작하기 20분 전에, pH는 7.2 정도까지 신속하게 상승되고, 그 후의 몇 시간 동안 pH는 7.8까지 천천히 상승되었다(도 2). 0.5시간 간격으로 발효 탱크에서 촉매액을 취하여 12000Хg에서 5분 동안 원심분리시키고, 상청액을 쏟아내고, 실시예 1의 리신과 펜탄디아민 방법으로 전세포 촉매 과정에서 1,5-펜탄디아민 생산량을 측정하였다. 도2에 도시된 바와 같이, 리신 소모와 펜탄디아민 생산 과정 변화 추세는 pH와 유사하고, 전 0.5 시간 동안 리신은 신속하게 소모되며 펜탄디아민은 신속하게 축적되고, 그 후의 변화 과정은 느리다. 4시간 동안 촉매 작용을 일으킨 기질 촉매 작용 소모율은 99.8%에 도달하고, 리신 염산염의 잔여량은 0.67g/L밖에 안되었다.

실시예 4. 감압 증류에 의한 펜탄디아민 촉매액 중의 이산화탄소의 스트리핑

원심분리하여 촉매 반응액 중의 균체를 제거하고, 500mL의 원심분리 후의 펜탄디아민 촉매액을 취하여 20L의 유욕(oil bath) 회전증발기의 둥근 바닥 플라스크에 넣어 감압 증류를 통해 이산화탄소를 스트리핑하였다. 이산화탄소의 탈착 과정에서 물 순환형 진공 펌프의 진공계 눈금은 -0.095 Mpa 정도에 도달하였으며, 수욕 가열 온도를 각각 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 100℃, 120℃, 140℃ 및 160℃로 설정하여 상이한 온도 조건 하에서의 이산화탄소 스트리핑 정황을 관찰하였다. 압력과 온도가 안정적으로 유지된 후 60분 동안 감압 증류시켰으며, 증류가 종료된 후 둥근 바닥 플라스크에 초순수를 넣어 초기 체적까지 정용(constant volume)하여 증류 전후의 펜탄디아민 촉매액 중의 이산화탄소 함량을 측정하였다. 총유기탄소 총질소 분석기(Vario TOC)를 사용하여 촉매액의 총유기탄소(TIC)의 함량을 측정하고, 촉매 반응액의 이산화탄소 스트리핑률을 계산하였다. 계산 공식은 이산화탄소 스트리핑률=(감압 증류 전 펜탄디아민 촉매액 중 TIC 함량-감압 증류 후 펜탄디아민 촉매액 중 TIC 함량)χ감압 증류 전 펜탄디아민 촉매액 중 TIC 함량 Х100%이다. 실험 결과는, 펜탄디아민 촉매액 중 이산화탄소 스트리핑률이 가열 온도 상승에 따라 증가됨을 표명하였다(표 1).

상이한 감압 증류 온도 조건 하에서의 펜탄디아민 촉매액의 이산화탄소 스트리핑률

온도(℃)	CO₂스트리핑률(%)
60	42.9
70	48.7
80	53.1
90	57.1
100	59.3
120	66.6
140	68.9
160	80.2

이산화탄소 스트리핑 과정에서, 펜탄디아민도 이에 따라 휘발되었다. 상기 상이한 온도조건 하에서의 감압 증류 과정에서, 냉각 물 순환 온도를 20℃로 설정하고, 응축 후의 유분을 수집하여 그 중의 펜탄디아민 함량을 측정하였으며, 이산화탄소 스트리핑 과정 중의 펜탄디아민의 손실률을 계산하였다. 계산 방법은, 펜탄디아민 손실률 = (유분인 펜탄디아민 함량 Х 유분 체적) χ (증류 전 촉매액의 펜탄디아민 함량Х둥근 바닥 플라스크에 넣은 촉매액 체적)Х100%이며, 결과는 표 2에 표시된 바와 같다. 펜탄디아민의 손실률은 증류 온도의 상승에 따라 증가되고, 가열 온도를 60℃로 설정할 경우, 펜탄디아민 손실률은 0.1%보다 낮으며, 가열 온도를 160℃까지 높일 경우, 펜탄디아민 손실률은 8% 이상에 달하였다. 가열 온도가 120℃보다 크거나 같을 경우, 대량의 펜탄디아민이 휘발되어 이산화탄소 기체와 함께 온도가 비교적 낮은 설비 파이프 표면에서 유백색의 펜탄디아민 탄산염으로 응결되므로, 파이프가 쉽게 막힐뿐만 아니라, 기기 세척 난이도를 증가시켰다.

상이한 감압 증류 온도 조건 하에서의 펜탄디아민 손실률

온도(℃)	펜탄디아민 손실률(%)
60	0.06
70	0.09
80	0.35
90	0.96
100	1.22
120	3.07
140	4.13
160	8.16

실시예 5. 염기액에 의한 스트리핑된 이산화탄소의 회수원심분리하여 촉매 반응액 중의 균체를 제거하고, 500 mL의 원심분리 후의 펜탄디아민 촉매액을 취하여 5 L의 회전증발기의 둥근 바닥 플라스크에 넣어 감압 증류를 통해 이산화탄소를 스트리핑하였다. 증류 과정에서 물 순환형 진공 펌프의 진공계 눈금이 -0.095 Mpa정도에 도달하게 하며, 수욕 가열 온도를 각각 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃로 설정하여 상이한 온도 조건 하에서의 이산화탄소 탈착 정황을 관찰하였다. 물 순환형 진공 펌프 물 탱크에10 L의 함량이 6 g/L인 수산화나트륨 용액을 넣어 펜탄디아민 촉매액에서 스트리핑된 이산화탄소의 흡수에 사용하였다. pH 전극을 물 탱크에 삽입하고, 물 순환형 진공 펌프 물 탱크의 염기액의 pH값을 실시간으로 기록하였다. 스트리핑된 이산화탄소가 염기액에서 화학적으로 흡수됨에 따라, 물 탱크의 염기액의 pH는 점차적으로 낮아졌다. 가열 온도가 높을 수록, 물 탱크의 염기액의 pH가 더 빠르게 낮아졌다(도 3).

총유기탄소 총질소 분석기(모델명: Vario TOC)를 사용하여 물 순환형 진공 펌프 물 탱크의 염기액 중의 총 유기탄소(TIC)의 함량을 측정하고, 염기액이 이산화탄소를 흡수하는 흡수량을 계산하였다. 가열 온도를 50℃로 설정하고 감압 증류 시의 염기액이 흡수한 이산화탄소 과정 그래프는 도 4에 도시된 바와 같으며, 물 순환형 진공 펌프 물 탱크의 염기액 중의 TIC 함량이 점차적으로 증가되었다.

실시예 6. 이산화탄소 스트리핑에 의한 유리상태 펜탄디아민 치환에 수요되는 강염기 소모량의 감소

실시예 5의 온도와 압력 조건에 따라 이산화탄소를 90분 동안 스트리핑하고, 둥근 바닥 플라스크 중 이산화탄소가 스트리핑된 후의 펜탄디아민 촉매액을 쏟아내고, 초순수를 넣어 2 L까지 희석하여 희석 후의 촉매액의 pH값을 측정하였다. 수욕 가열 온도를 각각 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃로 설정하고 이산화탄소를 스트리핑한 후, 촉매액의 pH는 7.66로부터 각각 8.45, 9.63, 9.75 및 9.90까지 상승되었다. 진일보 수산화나트륨을 사용하여 등체적까지 희석한 펜탄디아민 촉매액의 pH를 조절하고, 이산화탄소가 스트리핑된 후의 100 mL의 촉매액의 pH를 11, 12 및 13까지 조절하는데, 각각 42 mL, 72 mL 및 106 mL의 수산화나트륨 용액(100 g/L)을 소모하였다. 동일한 펜탄디아민 함량의 이산화탄소를 스트리핑하기 전의 촉매액을 희석하는데 각각 97mL, 141mL 및 185mL의 수산화나트륨 용액을 소모하였다. 결과는, 강염기로 유리상태 펜탄디아민을 치환하는 공정에서, 촉매액 중의 이산화탄소를 스트리핑하면 강염기의 용량을 현저히 감소시킬 수 있으며, 펜탄디아민을 증류시킨 후 형성된 고체 폐기물 잔재가 더 적음을 표명하였다.

실시예 7. 이산화탄소 스트리핑에 의한 펜탄디아민 증류 수율의 향상

원심분리하여 촉매 반응액 중의 균체를 제거하고, 500 mL의 원심분리 후의 펜탄디아민 촉매액을 취하여 20L의 회전증발기의 둥근 바닥 플라스크에 넣으며, 유욕 가열 온도를 70℃로 설정하고 감압 증류하여 이산화탄소를 스트리핑하였다. 90분 후 등몰량의 수산화나트륨을 넣고, 유욕 온도를 120℃로 설정하며, 120분 동안 계속하여 감압 증류시켜 펜탄디아민 유분을 수집하였다. 대조 시험에서 이산화탄소를 스트리핑하지 않고, 동일한 조건에 따라 등몰량의 수산화나트륨을 넣은 펜탄디아민 촉매액을 직접 증류시켜 펜탄디아민 유분을 수집하였다. 이산화탄소를 스트리핑한 후 강염기로 치환한 펜탄디아민 촉매액을 다시 증류시켜 62.3 g의 펜탄디아민을 얻었지만, 대조 시험에서는 11.8 g의 펜탄디아민만 얻었다.

<110> NINGXIA EPPEN BIOTECH CO., LTD <120> Method for Fermentation-Production of Pentanediamine Comprising Carbon Dioxide Stripping Technique <130> P1740033C <150> CN201610322421.5 <151> 2016-05-16 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2148 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca 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ccagtattaa atgatcctgt tccggcgggt 420 atcgcctgta ttgctatcgt ctgggtattt acctttgtaa atatgctcgg cggtacctgg 480 gtaagccgtt taaccactat tggtctggtg ctggttctta ttcctgtggt gatgactgct 540 attgttggct ggcattggtt tgatgcggca acttatgcag ctaactggaa tactgcggag 600 cggccgcaat 610 <210> 4 <211> 1080 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 cgcggatcct gcgccattct caacatcctt tagatgaaaa acaattagca gcactgaaca 60 cagaaataga taacattgtt acactaccgg aattgaataa cctgtccatt atatatcaaa 120 taaaagcggt cagtgctctg gtaaaaggta aaacagatga gtcttaccag gcgataaata 180 ctggcattga tcttgaaatg tcctggctaa attatgtatt gcttggcaag gtttatgaaa 240 tgaaggggat gaaccgggaa gcggctgatg catatctcac cgcctttaat ttacgcccag 300 gggcaaacac cctttactgg attgaaaatg gtatattcca gacttctgtt ccttatgttg 360 taccttatct cgacaaattt ctcgcttcag aataagtaac tcccgggttg atttatgctc 420 ggcaatattt gttgttgagt ttttgtatgt tactgttggt ataatatgtt gcggcataat 480 acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc gaaattagga gaagagcatg 540 agttctgcca agaagatcgg gctatttgcc tgtaccggtg ttgttgccgg taatatgatg 600 gggagcggta ttgcattatt acctgcgaac ctagcaagta tcggtggtat tgctatctgg 660 ggttggatta tctctattat tggtgcaatg tcgctggcgt atgtatatgc ccgactggca 720 acaaaaaacc cgcaacaagg tggcccaatt gcttatgccg gagaaatttc ccctgcattt 780 ggttttcaga caggtgttct ttattaccat gctaactgga ttggtaacct ggcgattggt 840 attaccgctg tatcttatct ttccaccttc ttcccagtat taaatgatcc tgttccggcg 900 ggtatcgcct gtattgctat cgtctgggta tttacctttg taaatatgct cggcggtacc 960 tgggtaagcc gtttaaccac tattggtctg gtgctggttc ttattcctgt ggtgatgact 1020 gctattgttg gctggcattg gtttgatgcg gcaacttatg cagctaactg gaatactgcg 1080 1080

Claims

(1)리신 및 인산피리독살(pyridoxal phosphate)을 기질로 하여, 리신 탈카르복실화효소를 과발현하는 세포를 배양하여 1,5-펜탄디아민을 포함하는 발효액을 획득하는 단계로, 상기 세포는 리신 탈카르복실화효소 유전자의 프로모터를 T7 프로모터로 교체하여 발현을 강화한 세포이고, 상기 세포는 대장균 BL21(DE3)이며, 상기 배양에 산성 pH 조절제를 추가하지 않고, 상기 세포 자체가 CO₂를 생성하여 1,5-펜탄디아민을 중화하는 것인, 단계;
(21)발효액 중의 액체를 분리하는 단계;
(22)단계(21)에서 획득한 액체 중의 이산화탄소를 스트리핑한 후 염기를 넣어 처리하는 단계; 및
(23)단계(22)에서 획득한 처리액으로부터 1,5-펜탄디아민을 함유하는 성분을 추출하는 단계;
를 포함하는 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제1항에 있어서,
단계(21)에서, 분리는 원심분리 또는 여과인 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제1항에 있어서,
단계(22)에서, 감압 및/또는 승온을 통해 액체 중의 이산화탄소를 분리하여 액체 중의 이산화탄소를 스트리핑하는 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제1항에 있어서,
단계(22)에서, 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨 및/또는 수산화칼슘을 포함하는 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제1항에 있어서,
단계(23)에서, 상기 추출은 증류, 증발 및/또는 건조를 포함하는 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제5항에 있어서,
단계(23)에서, 상기 증류는 상압 증류, 감압 증류 및/또는 정류인 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제5항에 있어서,
단계(23)에서, 상기 증발은 플래시 증발인 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
제5항에 있어서,
단계(23)에서, 상기 건조는 분무 건조 및/또는 감압 건조인 1,5-펜탄디아민의 발효 제조 방법.
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