CN112251475B - 一种提高l-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法 - Google Patents

一种提高l-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高L‑谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，采用谷氨酰胺生产菌经发酵获得L‑谷氨酰胺，在培养基中添加微量元素氨基酸螯合物，所述微量元素氨基酸螯合物由谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰组成，其中，谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为20‑30：5‑10：10‑15：2‑4：15‑25；所述方法提高细胞生长速率和细胞活力，提高L‑谷氨酰胺产量和糖酸转化效率的效果。

Description

一种提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法
技术领域
本发明涉及发酵法生产氨基酸的技术领域，尤其是一种提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法。
背景技术
近年来，随着对L-谷氨酰胺的深入研究，L-谷氨酰胺被广泛应用于医药，保健食品，饲料等领域。作为一种具有潜力的新药，L-谷氨酰胺在临床上主要应用于治疗胃肠溃疡，缓解运动疲劳，改善脑神经机能等方面。
近年来，随着对L-谷氨酰胺生理作用以及应用范围的深度研究，谷氨酰胺的需求量和生产量都在不断增加，且药用需求量很大，具有广阔的市场前景。谷氨酰胺的工业生产方法主要有化学合成法，酶法和发酵法，其中发酵法生产谷氨酰胺是目前使用的主要方法。因此，进一步优化L-谷氨酰胺的生产工艺具有重要意义。如何进一步提高微生物发酵法生产L-谷氨酰胺的产率和糖酸转化率成为了推动L-谷氨酰胺产业可持续发展的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，采用谷氨酰胺生产菌经发酵获得L-谷氨酰胺，在培养基中添加微量元素氨基酸螯合物，所述微量元素氨基酸螯合物由谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰组成，其中，谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为20-30：5-10：10-15：2-4：15-25。
上述微量元素氨基酸螯合物是指利用金属阳离子与氨基酸进行反应并形成配位键，其中金属阳离子与氨基酸的氨基端和羧基端形成五元环或六元环的特殊环状分子结构，使整个环状分子内趋于电中性。通过结合成为这种分子结构，氨基酸螯合物与发酵液内其他物质不易形成沉淀物或与不溶性胶体互相吸附，因此具有良好的化学稳定性。普通的无机元素，以阴阳离子存在，易解离，生成难溶性物质，不易被细胞吸收。使用微量元素氨基酸螯合物即增加了有效氨基酸的营养成分，又增强了微量元素的吸收效果。达到提高细胞生长速率和细胞活力，提高L-谷氨酰胺产量和糖酸转化效率的效果。
优选的，上述提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，具备步骤如下：
（1）菌体活化：将菌种从-80℃保存的保菌管接种到斜面培养基活化，斜面培养基为:牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，玉米浆25mL/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂粉25g/L；
（2）种子培养：将活化好的菌种接入一级种子摇瓶32℃，pH7.0，220rmp摇床培养10h；再将一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养，32℃，pH7.0，溶氧30-50%，培养至OD600 达到25，种子培养基为葡萄糖25 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓15 ml/L，K2HPO4·3H2O1 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L；
（3）发酵培养：将二级种子液放出至剩余600mL，加入2.3L发酵培养基和100mL浓度为80%的葡萄糖（作为发酵初糖，分消，115℃，灭菌15 min）。发酵培养基如下：K2HPO4·3H2O1.8 g/L，VB1 0.1 mg/L，豆浓10ml/L，玉米浆干粉4 g/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，FeSO4 10mg/L，ZnSO4 5mg/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，(NH4)2SO4 60g/L，121℃，灭菌20 min，并用NaOH调pH至4-5；发酵过程控制温度32℃，通过自动流加25%的氨水控制pH在1-4h为7.0-7.2，4h-发酵结束每2h降低0.5，直到pH达到5.5，溶氧控制在30-50%，通过流加泡敌消泡，并通过流加含有微量元素氨基酸螯合物的浓度为80%的葡萄糖溶液将残糖控制在0.3-0.5%；所述微量元素氨基酸螯合物中谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰在葡萄糖溶液中含量分别为200-300mg/L、50-100mg/L、100-150mg/L、20-40mg/L、150-250mg/L。
优选的，上述提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰在葡萄糖溶液中的最佳含量分别为250mg/L、80mg/L、130mg/L、30mg/L、200mg/L。
有益效果：
上述提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，采用微量元素氨基酸螯合物随葡萄糖流加发酵技术，流加的螯合物包括谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰。氨基酸螯合物是指利用金属阳离子与氨基酸进行反应并形成配位键，其中金属阳离子与氨基酸的氨基端和羧基端形成五元环或六元环的特殊环状分子结构。即增加了发酵培养的有效氨基酸的营养成分，又增强了微量元素的吸收效果，达到提高细胞生长速率和细胞活力，提高L-谷氨酰胺产量和糖酸转化效率的效果。
所述方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L-谷氨酰胺产量和转化率的大幅提高，适合于工业化生产。
具体实施方式
下述方法步骤充分公开具体技术方案，使本领域技术人员可以重复实施。
菌种谷氨酸棒杆菌采用谷氨酸棒杆菌GM34,购自天津科技大学代谢控制发酵实验室；
斜面培养基如下：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，玉米浆25mL/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO40.5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂粉25g/L;
种子培养基如下：葡萄糖25 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓15 ml/L，K2HPO4·3H2O1 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L；
发酵培养基如下：发酵初糖（100mL浓度为80%的葡萄糖，分消，115℃，灭菌15min），K2HPO4·3H2O 1.8 g/L，VB1 0.1 mg/L，豆浓10ml/L，玉米浆干粉4 g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4 10 mg/L，ZnSO4 5mg/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，(NH4)2SO4 60g/L。121℃，灭菌20min，并用NaOH调pH至4-5。
实施例1
一种提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，具体步骤如下：
（1）将菌种从-80℃保存的保菌管接种到斜面培养基活化，再将菌种接入一级种子摇瓶，32℃，pH7.0，220rmp摇床培养10h。
（2）将一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养，32℃，pH7.0，溶氧30-50%，培养至OD600 达到25。
（3）将二级种子液放出至剩余600mL，加入2.3L发酵培养基和100mL浓度为80%的发酵初糖（发酵初糖不含微量元素氨基酸螯合物）。发酵过程控制温度32℃；通过自动流加25%的氨水控制pH在1-4h为7.0-7.2，4h-发酵结束每2h降低0.5，直到pH达到5.5；溶氧控制在30-50%；通过流加适量泡敌消泡；通过流加浓度为80%的葡萄糖溶液（含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为250mg/L、80mg/L、130mg/L、30mg/L、200mg/L）将残糖控制在0.3-0.5%。
（4）42h发酵结束，发酵液OD600值达到77.4，L-谷氨酰胺的产量为55.3g/L，糖酸转化率为52.9%。分别比对照实验（OD600值为62.92，L-谷氨酰胺产量为45.6 g/L，糖酸转化率为49.3%）分别提高了23.2%、21.2%和7.3%。
实施例2
采用的谷氨酸棒杆菌同实施例1；各培养基同实施例1；培养方法同实施例1。发酵过程通过流加浓度为80%的葡萄糖溶液（含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为200mg/L、50mg/L、100mg/L、20mg/L、150mg/L）将残糖控制在0.3-0.5%。
42h发酵结束，发酵液OD600值达到74.6，L-谷氨酰胺的产量为52.5g/L，糖酸转化率为52.7%。分别比对照实验（OD600值为62.92，L-谷氨酰胺产量为45.6 g/L，糖酸转化率为49.3%）分别提高了18.7%、15.2%和6.8%。
实施例3
采用的谷氨酸棒杆菌同实施例1；各培养基同实施例1；培养方法同实施例1。发酵过程通过流加浓度为80%的葡萄糖溶液（含有谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰分别为300mg/L、90mg/L、150mg/L、40mg/L、250mg/L）将残糖控制在0.3-0.5%。
42h发酵结束，发酵液OD600值达到73.3，L-谷氨酰胺的产量为53.58g/L，糖酸转化率为52.5%。分别比对照实验（OD600值为62.92，L-谷氨酰胺产量为45.6 g/L，糖酸转化率为49.3%）分别提高了16.5%、17.5%和6.4%。
实施例4
采用的谷氨酸棒杆菌同实施例1；各培养基同实施例1；培养方法同实施例1。发酵过程通过流加浓度为80%的葡萄糖溶液（含有硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钙、硫酸铜、硫酸锰分别为0.71mmol/L、0.33mmol/L、0.33mmol/L、0.08mmol/L、0.57mmol/L，对应实施例1等摩尔浓度的无机盐离子）将残糖控制在0.3-0.5%。
42h发酵结束，发酵液OD600值达到65.1，L-谷氨酰胺的产量为47.2g/L，糖酸转化率为51.1%。分别比对照实验（OD600值为62.92，L-谷氨酰胺产量为45.6 g/L，糖酸转化率为49.3%）分别提高了3.4%、3.5%和3.6%。
实施例5
采用的谷氨酸棒杆菌同实施例1；各培养基同实施例1；培养方法同实施例1。发酵过程通过流加浓度为80%的葡萄糖溶液（含有谷氨酸、丙氨酸、精氨酸分别为2.72mmol/L、0.66mmol/L、0.66mmol/L，对应实施例1等摩尔浓度的氨基酸）将残糖控制在0.3-0.5%。
42h发酵结束，发酵液OD600值达到67.8，L-谷氨酰胺的产量为46.8g/L，糖酸转化率为50.3%。分别比对照实验（OD600值为62.92，L-谷氨酰胺产量为45.6 g/L，糖酸转化率为49.3%）分别提高了7.7%、2.6和2%。
实施例6
采用的谷氨酸棒杆菌同实施例1；各培养基同实施例1；培养方法同实施例1。发酵过程通过流加浓度为80%的葡萄糖溶液（含有谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钙、硫酸铜、硫酸锰分别为2.72mmol/L、0.66mmol/L、0.66mmol/L、0.71mmol/L、0.33mmol/L、0.33mmol/L、0.08mmol/L、0.57mmol/L，对应实施例1等摩尔浓度的氨基酸和无机盐离子）将残糖控制在0.3-0.5%。
42h发酵结束，发酵液OD600值达到68.6，L-谷氨酰胺的产量为48.8g/L，糖酸转化率为51.8%。分别比对照实验（OD600值为62.92，L-谷氨酰胺产量为45.6 g/L，糖酸转化率为49.3%）分别提高了9.0%、7.0%和5.1%。
对照试验
采用的谷氨酸棒杆菌同实施例1；各培养基同实施例1；培养方法同实施例1。发酵过程流加浓度为80%的葡萄糖溶液（不含无机盐离子、氨基酸和微量元素氨基酸螯合物），将残糖控制在0.3-0.5%。
42h发酵结束，发酵液OD600值达到62.92，L-谷氨酰胺的产量为45.6g/L，糖酸转化率为49.3%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，其特征在于：采用谷氨酰胺生产菌经氨基酸螯合微量元素随葡萄糖流加发酵技术获得L-谷氨酰胺，所述谷氨酰胺生产菌为谷氨酸棒杆菌GM34，在培养基中添加微量元素氨基酸螯合物，所述微量元素氨基酸螯合物由谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰组成，其中，谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜和谷氨酸螯合锰的重量比为20-30：5-10：10-15：2-4：15-25。
2.根据权利要求1所述的提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，其特征在于：具备步骤如下：
（1）菌体活化：先将菌种接种到斜面培养基活化，斜面培养基为:牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，玉米浆25mL/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂粉25g/L；
（2）种子培养：再将活化好的菌种接入一级种子培养基32℃，pH7.0，220rmp摇床培养10h；再将一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养，32℃，pH7.0，溶氧30-50%，培养至OD600 达到25，所述种子培养基为葡萄糖25g/L，玉米浆干粉15g/L，豆浓15 ml/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L；
（3）发酵培养：将二级种子液放出至剩余600mL，加入2.3L发酵培养基和100mL浓度为80%的葡萄糖，葡萄糖作为发酵初糖、分消、115℃灭菌15 min ，所述发酵培养基如下：K2HPO4·3H2O 1.8g/L，VB1 0.1mg/L，豆浓10ml/L，玉米浆干粉4g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4 10mg/L，ZnSO4 5mg/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 60g/L，121℃，灭菌20min，并用NaOH调pH至4-5；发酵过程控制温度32℃，通过自动流加25%的氨水控制pH在1-4h为7.0-7.2，4h-发酵结束每2h降低0.5，直到pH达到5.5，溶氧控制在30-50%，通过流加泡敌消泡，并通过流加含有微量元素氨基酸螯合物的浓度为80%的葡萄糖溶液将残糖控制在0.3-0.5%；所述微量元素氨基酸螯合物中谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰在葡萄糖溶液中含量分别为200-300mg/L、50-100mg/L、100-150mg/L、20-40mg/L、150-250mg/L。
3.根据权利要求2所述的提高L-谷氨酰胺发酵产率和糖酸转化率的方法，其特征在于：所述谷氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锌、精氨酸螯合钙、谷氨酸螯合铜、谷氨酸螯合锰在葡萄糖溶液中的含量分别为250mg/L、80mg/L、130mg/L、30mg/L、200mg/L。
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