CN117757862A - 一种发酵生产缬氨酸的方法与应用 - Google Patents

一种发酵生产缬氨酸的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵培养技术领域，具体公开了一种发酵生产缬氨酸的方法与应用。本发明的发酵生产缬氨酸的方法，其在发酵培养基中添加2‑氯甲苯，所述2‑氯甲苯的浓度为0.1g/L‑0.5g/L。本发明方法可以显著提升缬氨酸产量，提高发酵生产缬氨酸的效率，为发酵法生产其他氨基酸产品、核苷类产品提供借鉴。

Description

一种发酵生产缬氨酸的方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵培养技术领域，具体地说，涉及一种发酵生产缬氨酸的方法与应用。
背景技术
支链氨基酸(branch chain amino acid，BCAA)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/L，50℃的溶解度为96.2g/L，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。
L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，L-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，L-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，L-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。
目前，L-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。但目前L-缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高，导致转化率仍较低，较难满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种生物合成高效生产缬氨酸的方法。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种发酵生产缬氨酸的方法，其在发酵培养基中添加2-氯甲苯，所述2-氯甲苯的浓度为0.1g/L-0.5g/L。
优选，所述2-氯甲苯的浓度为0.2g/L。
本发明研究发现，在发酵培养基配方中添加2-氯甲苯，能显著提高缬氨酸的产量，从而提升发酵生产缬氨酸的效率。本发明所述的2-氯甲苯是一种有机化合物，又名邻氯甲苯，化学式为C7H7Cl，为无色透明液体。
本发明的方法中，所述发酵培养基包括葡萄糖、MgSO4·7H2O、酵母、(NH4)2SO4、KH2PO4、甜菜碱盐酸盐、L-丙氨酸、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3和MnSO4·H2O。
优选，所述发酵培养基包括葡萄糖20-50g/L、MgSO4·7H2O0.5-2.5g/L、酵母粉0.5-2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0-5.0g/L、KH2PO41.0-3.5g/L、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/L、L-丙氨酸0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O1.0-2.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.1-0.5mg/L、CuSO4 0.1-0.5mg/L、ZnSO4·7H2O 0.1-1.0mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1-0.5mg/L、H3BO3 0.01-0.1mg/L和MnSO4·H2O 0.1-1.0mg/L。
更优选，所述发酵培养基包括葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、酵母粉0.5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、KH2PO4 3g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、FeSO4·7H2O 1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.2mg/L、CuSO40.2mg/L、ZnSO4·7H2O 0.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO30.08mg/L和MnSO4·H2O 0.8mg/L。
本发明的方法中，发酵在有氧或厌氧下进行，优选在厌氧下进行，更优选从种子培养开始到发酵生产结束，整个发酵菌的生长和产酸过程都在厌氧下进行。
本发明的培养基在现有的有氧发酵或厌氧发酵生产缬氨酸的过程中均可应用来提升缬氨酸的产量。
厌氧发酵是指生产菌种在不通入任何气体，或通入不含有氧气的其他气体的条件下，通过无氧呼吸来实现生长和生产目的产物的过程。
优选在不通气条件下厌氧发酵生产缬氨酸。本发明中不通气条件下是指从种子培养开始到发酵生产结束，整个发酵菌的生长和产酸过程都在不通入任何气体的条件下进行。
本发明的方法中，发酵条件为：压力为0.01-0.05Mpa，转速为200-500rpm，温度为37±1℃，发酵过程控制pH 6.8-7.0，在葡萄糖用尽前补加葡萄糖，控制发酵体系中的葡萄糖浓度为0-20g/L；当发酵在有氧下进行时，维持溶氧20％-30％。
本发明的方法中，发酵菌为大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为大肠杆菌ATCC8739、大肠杆菌ATCC25922或大肠杆菌ATCC35150。
优选，发酵菌为大肠杆菌TYS8789，其保藏编号为CCTCC NO:M2022134。
大肠杆菌TYS8789(Escherichia coli TYS8789)为大肠杆菌ATCC8739来源，其构建方法参见申请号为202210248471.9(公开号CN114958888A)的中国专利申请，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期是2022年02月18日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022134。
本发明还提供一种上述方法在提升缬氨酸的发酵糖酸转化率上的应用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供的肠杆菌科细菌在添加2-氯甲苯的条件下有氧或厌氧发酵生产缬氨酸的方法，具有显著的优势，目的产物缬氨酸产酸、转化率大幅提升。本发明可以为发酵法生产其他氨基酸产品、核苷类产品提供借鉴。且本发明方法容易理解和实现，特别适合工业化生产。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
本发明中部分培养基组成如下：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。
LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂粉。
一级种子培养基：A组分：葡萄糖20-80g/L、MgSO4·7H2O0.5-2.5g/L，121℃湿热灭菌15分钟。B组分：酵母粉(安琪)5-10g/L、蛋白胨(Oxoid)5-10g/L、(NH4)2SO4 2.0-13.2g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、K2HPO4·3H2O 1.0-5.0g/L，灭菌前用5mol/L KOH调pH7.2-7.4，121℃湿热灭菌15分钟。将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为一级种子培养基。
二级种子培养基：C组分：葡萄糖20-30g/L、MgSO4·7H2O0.5-2.5g/L，121℃湿热灭菌15分钟。D组分：酵母粉(安琪)0.5-2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0-5.0g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/L、L-丙氨酸0.1-0.5g/L、VB1 0.1-1.0mg/L、FeSO4·7H2O 1.0-2.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.1-0.5mg/L、CuSO4 0.1-0.5mg/L、ZnSO4·7H2O0.1-0.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.1-0.5mg/L、H3BO3 0.01-0.1mg/L，121℃灭菌15分钟。将C组分与D组分在无菌条件下混合，即为二级种子培养基。
发酵培养基：E组分：葡萄糖20-50g/L、MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L，121℃湿热灭菌15分钟。F组分：酵母粉(安琪)0.5-2.0g/L、(NH4)2SO42.0-5.0g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/L、L-丙氨酸0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O 1.0-2.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.1-0.5mg/L、CuSO4 0.1-0.5mg/L、ZnSO4·7H2O 0.1-1.0mg/L、Na2MoO4·2H2O0.1-0.5mg/L、H3BO30.01-0.1mg/L、MnSO4·H2O 0.1-1.0mg/L，121℃灭菌15分钟。将E组分与F组分在无菌条件下混合，即为发酵培养基。
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的液相色谱法(HPLC)检测：
L-缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸利用HPLC进行测定，以乙腈/水(50:50，v/v)混合物和50mM乙酸钠作为流动相，1:1等度洗脱，流速为1mL/min，紫外检测波长为360nm，色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA柱(3.5μm，4.6×75mm)，柱温：40℃。
对比例1有氧发酵产缬氨酸
1、一级种子培养方法：在无菌条件下，从生产菌种TYS8789种子活化LB固体培养基平板上取1环菌体接种至装有60mL一级种子培养基的500mL三角瓶中，三角瓶口用8层纱布扎紧，放入往复摇床中200rpm，37℃震荡培养，OD600达到5.0下摇床。
一级种子培养基：A组分：葡萄糖20g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，121℃湿热灭菌15分钟。B组分：酵母粉(安琪)10g/L、蛋白胨(Oxoid)10g/L、(NH4)2SO4 4g/L、KH2PO4 3.0g/L、K2HPO4·3H2O 5.0g/L，灭菌前用5mol/L KOH调pH7.2，121℃湿热灭菌15分钟。将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为一级种子培养基。
2、二级种子培养方法：在无菌条件下，将60mL一级种子接入装有6L二级种子培养基的10L发酵罐中，罐压为0.01-0.05Mpa(罐压随着菌体浓度升高逐步提升，初始罐压为0.01Mpa，OD600每升高1.0罐压提高0.005Mpa，最高罐压为0.05Mpa)，转速为200-500rpm(转速随着菌体浓度升高逐步提升，初始转速为200rpm，OD600每升高1.0转速提高50rpm，最高转速为500rpm)，通入无菌空气维持溶氧20％-30％，37℃培养，OD600达到5.5下罐。
二级种子培养基：C组分：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，121℃湿热灭菌15分钟。D组分：酵母粉(安琪)1g/L、(NH4)2SO43.0g/L、KH2PO4 2g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、VB10.5mg/L、FeSO4·7H2O 1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.25mg/L、CuSO40.2mg/L、ZnSO4·7H2O 0.4mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO30.05mg/L，121℃灭菌15分钟。将C组分与D组分在无菌条件下混合，即为二级种子培养基。
3、主发酵培养方法：在无菌条件下，将5L二级种子接入装有25L发酵培养基的50L发酵罐中，罐压为0.01-0.05Mpa(罐压随着菌体浓度升高逐步提升，初始罐压为0.01Mpa，OD600每升高1.0罐压提高0.005Mpa，最高罐压为0.05Mpa)，转速为200-500rpm(转速随着菌体浓度升高逐步提升，初始转速为200rpm，OD600每升高1.0转速提高50rpm，最高转速为500rpm)，通入无菌空气维持溶氧20％-30％，37℃培养50h。发酵过程用浓度为25-28％的氨水控制pH6.8-7.0。在葡萄糖用尽前补加浓度为60％(w/w)的葡萄糖，控制葡萄糖浓度为0-20g/L，直至发酵结束。
发酵培养基：E组分：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 2g/L，121℃湿热灭菌15分钟。F组分：酵母粉(安琪)0.5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、KH2PO4 3g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、FeSO4·7H2O1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.2mg/L、CuSO4 0.2mg/L、ZnSO4·7H2O0.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO3 0.08mg/L、MnSO4·H2O0.8mg/L，121℃灭菌15分钟。将E组分与F组分在无菌条件下混合，即为发酵培养基。
4、发酵产物检测：经HPLC检测，发酵液中缬氨酸浓度达77.8g/L，糖酸转化率为43.5％，副产物异亮氨酸4.2g/L，亮氨酸0.5g/L。
实施例1添加2-氯甲苯有氧发酵产缬氨酸
培养基配方和培养方法如对比例1所述，在对比例1的基础上，在发酵培养基中添加2-氯甲苯，添加量分别为0.1g/L，0.2g/L，0.5g/L，1.0g/L，发酵结束检测产物的含量如下表1。2-氯甲苯添加量为0.2g/L时效果最好。
表1
2-氯甲苯添加量 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 缬氨酸糖酸转化率
0g/L 77.8g/L 4.2g/L 0.5g/L 43.5％
0.1g/L 78.2g/L 4.0g/L 0.6g/L 43.6％
0.2g/L 85.1g/L 3.7g/L 0.4g/L 46.8％
0.5g/L 80.5g/L 3.9g/L 0.4g/L 44.1％
1.0g/L 69.4g/L 3.5g/L 0.4g/L 38.6％
对比例2不通气厌氧发酵产缬氨酸
1、一级种子培养方法：在无菌条件下，从生产菌种TYS8789种子活化LB固体培养基平板上取1环菌体接种至装有60mL一级种子培养基的500mL三角瓶中，三角瓶口用不透气封口膜扎紧，放入往复摇床中200rpm，37℃震荡培养，OD600达到5.0下摇床。
一级种子培养基：A组分：葡萄糖20g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，121℃湿热灭菌15分钟。B组分：酵母粉(安琪)10g/L、蛋白胨(Oxoid)10g/L、(NH4)2SO4 4g/L、KH2PO4 3.0g/L、K2HPO4·3H2O 5.0g/L，灭菌前用5mol/L KOH调pH7.2，121℃湿热灭菌15分钟。将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为一级种子培养基。
2、二级种子培养方法：在无菌条件下，将60mL一级种子接入装有6L二级种子培养基的10L发酵罐中，罐压为0.01-0.05Mpa(罐压随着菌体浓度升高逐步提升，初始罐压为0.01Mpa，OD600每升高1.0罐压提高0.005Mpa，最高罐压为0.05Mpa)，转速为200-500rpm(转速随着菌体浓度升高逐步提升，初始转速为200rpm，OD600每升高1.0转速提高50rpm，最高转速为500rpm)，不通气，37℃培养，OD600达到5.5下罐。
二级种子培养基：C组分：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，121℃湿热灭菌15分钟。D组分：酵母粉(安琪)1g/L、(NH4)2SO43.0g/L、KH2PO4 2g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、VB10.5mg/L、FeSO4·7H2O 1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.25mg/L、CuSO40.2mg/L、ZnSO4·7H2O 0.4mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO30.05mg/L，121℃灭菌15分钟。将C组分与D组分在无菌条件下混合，即为二级种子培养基。
3、主发酵培养方法：在无菌条件下，将5L二级种子接入装有25L发酵培养基的50L发酵罐中，罐压为0.01-0.05Mpa(罐压随着菌体浓度升高逐步提升，初始罐压为0.01Mpa，OD600每升高1.0罐压提高0.005Mpa，最高罐压为0.05Mpa)，转速为200-500rpm(转速随着菌体浓度升高逐步提升，初始转速为200rpm，OD600每升高1.0转速提高50rpm，最高转速为500rpm)，不通气，37℃培养50h。发酵过程用浓度为25-28％的氨水控制pH 6.8-7.0。在葡萄糖用尽前补加浓度为60％(w/w)的葡萄糖，控制葡萄糖浓度为0-20g/L，直至发酵结束。
发酵培养基：E组分：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 2g/L，121℃湿热灭菌15分钟。F组分：酵母粉(安琪)0.5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、KH2PO4 3g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、FeSO4·7H2O1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.2mg/L、CuSO4 0.2mg/L、ZnSO4·7H2O0.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO3 0.08mg/L、MnSO4·H2O0.8mg/L，121℃灭菌15分钟。将E组分与F组分在无菌条件下混合，即为发酵培养基。
4、发酵产物检测：经HPLC检测，发酵液中缬氨酸浓度达95.2g/L，糖酸转化率为58.0％，副产物异亮氨酸2.6g/L，亮氨酸0.3g/L。
实施例2添加2-氯甲苯厌氧发酵产缬氨酸
培养基配方和培养方法如对比例2所述，在对比例2的基础上，在发酵培养基中添加2-氯甲苯，添加量分别为0.1g/L，0.2g/L，0.5g/L，1.0g/L，发酵结束检测产物的含量如下表2。2-氯甲苯添加量为0.2g/L时效果最好。
表2
2-氯甲苯添加量 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 缬氨酸糖酸转化率
0g/L 95.2g/L 2.6g/L 0.3g/L 58.0％
0.1g/L 95.8g/L 2.5g/L 0.3g/L 58.1％
0.2g/L 100.3g/L 2.8g/L 0.4g/L 59.7％
0.5g/L 96.5g/L 2.7g/L 0.5g/L 58.6％
1.0g/L 72.6g/L 2.0g/L 0.2g/L 47.6％
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种发酵生产缬氨酸的方法，其特征在于，在发酵培养基中添加2-氯甲苯，所述2-氯甲苯的浓度为0.1g/L-0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2-氯甲苯的浓度为0.2g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖、MgSO4·7H2O、酵母、(NH4)2SO4、KH2PO4、甜菜碱盐酸盐、L-丙氨酸、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3和MnSO4·H2O。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖20-50g/L、MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L、酵母粉0.5-2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0-5.0g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/L、L-丙氨酸0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O 1.0-2.5mg/L、CoCl2·6H2O0.1-0.5mg/L、CuSO4 0.1-0.5mg/L、ZnSO4·7H2O0.1-1.0mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1-0.5mg/L、H3BO3 0.01-0.1mg/L和MnSO4·H2O 0.1-1.0mg/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、酵母粉0.5g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO4 3g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、FeSO4·7H2O 1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.2mg/L、CuSO4 0.2mg/L、ZnSO4·7H2O0.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO3 0.08mg/L和MnSO4·H2O 0.8mg/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，发酵在有氧或厌氧下进行，优选在厌氧下进行，更优选从种子培养开始到发酵生产结束，整个发酵菌的生长和产酸过程都在厌氧下进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵条件为：压力为0.01-0.05Mpa，转速为200-500rpm，温度为37±1℃，发酵过程控制pH 6.8-7.0，在葡萄糖用尽前补加葡萄糖，控制发酵体系中的葡萄糖浓度为0-20g/L；当发酵在有氧下进行时，维持溶氧20％-30％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，发酵菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌ATCC8739、大肠杆菌ATCC25922或大肠杆菌ATCC35150。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵菌为大肠杆菌TYS8789，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022134。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在提升缬氨酸的发酵糖酸转化率上的应用。
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