DE69835929T2

DE69835929T2 - Beta-galaktosid alpha-2,6-sialyltransferase kodierendes gen

Info

Publication number: DE69835929T2
Application number: DE69835929T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Japan Tobacco Inc. Yokohama-shi YAMAMOTO; Motoko Nakashizuka; Ichiro Japan Tobacco Inc. Central Ph TERADA
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2018-03-03
Also published as: EP0915163B1; EP0915163A4; CA2252493A1; DE69835929D1; JP3140976B2; JPH10234373A; EP0915163A1; CA2252493C; WO1998038315A1; US6255094B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gen, das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase codiert.
STAND DER TECHNIK
In den letzten Jahren wurden die biologischen Aktivitäten komplexer Kohlenhydrate, wie beispielsweise von Glycoproteinen oder Glycolipiden erfolgreich aufgeklärt und die Bedeutung von Zuckerketten wurde verstanden. Sialinsäuren sind als Zucker bekannt, die oftmals am nicht reduzierenden Ende einer Zuckerkette komplexer Kohlenhydrate zu finden sind. Während die physiologischen Funktionen und die biologische Signifikanz von Zuckerketten von Bedeutung sind wird angenommen, dass Sialinsäuren eine besonders große Zahl von Funktionen aufweisen. Es ist jedoch schwierig, diese Substanzen chemisch zu synthetisieren, insbesondere Sialinsäure an Oligosaccharidketten, komplexe Kohlenhydrate etc. hinzuzufügen. Demgemäß wurde enzymatischen Verfahren, durch die diese Produkte einfach in hoher Ausbeute ohne Nebenreaktionen synthetisiert werden können, viel Aufmerksamkeit gezollt.
Die Sialyltransferasen, die gegenwärtig auf dem Markt erhältlich sind, schließen Enzyme ein, die aus der submandibularen Drüse, Leber etc. eines Tieres, wie beispielsweise einer Ratte, eines Schweins und eines Menschen, gewonnen wurden [Poulson et al., J. Biol. Chem. 252, 2356-2362 (1977), Weistein et al., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 (1982), Miyagi et al., Eur. J. Biochem. 126, 253-261 (1982)]. Jedoch können die Enzyme aus Tieren aufgrund von Schwierigkeiten nicht in großen Mengen gewonnen werden, die die Aufreinigung einschließen, was diese sehr teuer macht. Darüber hinaus ist die schlechte Stabilität dieser Enzyme ebenfalls ein Problem.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder Forschungsarbeiten nach einem Bakterium durchgeführt, das eine Sialyltransferaseaktivität aufweist, um Sialyltransferase bereitzustellen, die in großer Menge erzeugt werden kann. Sie haben als Resultat herausgefunden, dass ein Meeresbakterium, nämlich Photobacterium damsela JT0160 (hierin nachstehend als „JT0160" bezeichnet) eine solche Aktivität aufweist. Sie haben weiterhin die Sialyltransferase 0160 (hierin nachstehend als „ST0160" bezeichnet) auf einem elektrophoretisch homogenen Niveau durch JT0160 erzeugt. Sie haben weiterhin die Bindungseigenschaft dieses Enzyms analysiert und somit aufgeklärt, dass ST0160 eine β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase ist, die Sialinsäuren über eine α- 2,6-Bindung an die 6-Position von Galaktose am nicht reduzierenden Ende einer Zuckerkette überträgt [JP (Kokai) Hei 8-154673]. Es wurde somit möglich, die Sialyltransferase in großer Menge durch Kultivieren von JT0160 zu erzeugen, das zur Erzeugung von ST0160 in der Lage ist. Weil dieses Enzym vom Membran-bindenden Typ ist, ist es in diesem Verfahren notwendig, ein Tensid bzw. einen oberflächenaktiven Stoff bei der Aufreinigung des Enzyms zuzusetzen, was Probleme, wie beispielsweise eine mögliche Kontamination von Oberflächen im aufgereinigten Enzym entstehen lässt.
Andererseits haben es die Fortschritte in der Gentechnik möglich gemacht, bestimmte Proteine in großen Mengen unter Verwendung von rekombinanten Escherichia coli-Zellen zu exprimieren, die durch einen Expressionsvektor transformiert wurden, der das Gen eines Proteins von Interesse trägt. Wenn dieser Ansatz auf die Produktion von β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase angewandt wird, können die oben beschriebenen Probleme gelöst werden und es ist darüber hinaus möglich, inodifizierte oder nicht native Enzyme, wie beispielsweise lösliches Enzym zu erzeugen, dem die Sequenz fehlt, die in die Membranbindung des Protein involviert ist, oder ein Enzym mit einer modifizierten Substratspezifität etc. Darüber hinaus wird es durch Verwendung eines hocheffizienten Promotors, wie beispielsweise des T7-Promotors, möglich, ein Produktionssystem zu konstruieren, das zur Leistung einer extrem hohen Produktivität in der Lage ist, sodass ein erwünschtes Protein sich auf 50% oder mehr der löslichen Proteine beläuft, die in mikrobiellen Zellen erzeugt werden. Es bestand jedoch das Problem, dass die genomische DNA von JT0160 nicht aus der Kultur in Meeresnährlösung extrahiert werden konnte, die normalerweise als Wachstumsmedium verwendet wird. Somit wurde bisher kein Gen, das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase codiert, gewonnen. Das soll heißen, die β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase war zur Verwendung in der Gentechnik vor der vorliegenden Erfindung trotz Bestehens einer starken Nachfrage nicht verfügbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues Gen, das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase codiert, bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Expressionsvektoren zur Erzeugung des β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins bereitzustellen, das das oben erwähnte Gen enthält.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteinen bereitzustellen, durch Verwendung der oben erwähnten Expressionsvektoren.
KURZE BESCHREIBUNGEN DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Struktur von pAQI.
2 veranschaulicht die Struktur von pAQN.
3 veranschaulicht das Verfahren der Konstruktion von pAQN-EHX aus pAQN.
4 veranschaulicht das Verfahren der Konstruktion von pEBSTC aus pBSTC.
5 veranschaulicht das Verfahren der Konstruktion von pEBST aus pBSTN.
6 veranschaulicht die Struktur des Expressionsvektors pEBST.
7 (SEQ ID NO: 2) zeigt die erste Hälfte der Nukleotidsequenz des bst-Gens zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz hiervon.
8 (SEQ ID NO: 2) zeigt die letztere Hälfte der Nukleotidsequenz des bst-Gens zusammen mit der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz.
9 zeigt das Wachstum von E. coli MV 1184 Transformantenstämmen (A2, B2 und C2), die einen Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthalten.
10 zeigt die Retentionszeit der enzymatischen Reaktionsprodukte der Rohenzyme, die auf CMP-NeuAc einwirkten, das als Zuckerdonor-Substrat verwendet wurde. Die Figur zeigt, dass die Rohenzyme, gewonnen aus den 6-Transformanten in Beispiel 2 II(2) dieselbe Aktivität aufweisen wie diejenige von ST0160.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Als Ergebnis umfangreicher Studien waren die Erfinder zum ersten Mal dabei erfolgreich, genomische DNA aus JT0160 zu extrahieren, indem JT0160 nicht auf einer marinen Nährlösung (Marine Broth) 2216 (hergestellt von Difco), sondern auf Nährlösung (Nutrient Broth) (hergestellt von Oxoid) gezüchtet wurde. Sie haben weiterhin versucht das Gen, das das ST0160-Protein codiert (hierin nachstehend als „bst-Gen" bezeichnet) aus der so extrahierten DNA zu isolieren. Trotz verschiedener Schwierigkeiten einschließlich der Tatsache, dass das ST0160-Protein potentiell für üblicherweise verwendete Wirtszellen toxisch ist, wurde das bst-Gen erfolgreich isoliert. Weiterhin wurde die Nukleotidsequenz des Gens zusammen mit der abgeleite ten Aminosäuresequenz bestimmt. Das ST0160-Protein weist die Aminosäuresequenz auf, die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird.
Die Erfinder haben weiterhin Expressionsvektoren konstruiert, die das so gewonnene Gen enthalten und waren bei der Expression des rekombinanten Proteins ST0160 erfolgreich.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr ausführlicher beschrieben werden.
β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase
Der Begriff "β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase", wie hierin verwendet, bedeutet ein Protein mit einer Aktivität, um Sialinsäure aus Cytidin-monophosphat-sialinsäure auf die 6-Position eines Galaktose-Rests in der Zuckerkette eines komplexen oder freien Kohlehydrats zu übertragen oder auf die 6-Position eines Monosaccharids, das dazu in der Lage ist, komplexe Kohlenhydrate darzustellen und mit einer Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom an der 6-Position. Dieses Enzym weist einen optimalen pH-Wert innerhalb eines Bereichs von 5 bis 6 auf, wobei die optimale Temperatur 30°C und das durch Gelfiltration bestimmte Molekulargewicht 64.000 ± 5.000 ist, obwohl die vorliegende Erfindung nicht an diese Zahl gebunden ist. Beispiele für das oben erwähnte Monosaccharid, das dazu in der Lage ist komplexe Kohlenhydrate darzustellen und das eine Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom an der 6-Position aufweist, schließen Galaktosamin, Mannose und N-Acetylgalaktosamin-Mannose ein.
Die β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase, die durch das Gen der vorliegenden Erfindung codiert wird, wurde in Photobacterium damsela JT0160 entdeckt. Es wurde gezeigt, dass dasselbe Enzym ebenfalls in Photobacterium damsela ATCC33539 und Photobacterium damsela ATCC35083 enthalten ist. Es wird somit erwartet, dass dieses Enzym auch von anderen Mikroorganismen oder Organen erzeugt werden kann.
β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase
Die Nukleotidsequenz des bst-Gens, bestimmt in der vorliegenden Erfindung, ist in SEQ ID NO: 2 und in den 7 und 8 zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die hiervon codiert ist, gezeigt. Wie diese SEQ ID NO: 2 zeigt, umfasst die DNA des Gens 2028 Basenpaare insgesamt (das heißt Nukleotide Nr. 396 bis 2423). Die Sequenz von Nukleotiden Nr. 396 bis 398 entspricht dem Initiations- bzw. Startcodon, während diejenigen der Nr. 2421 bis 2423 dem Stoppcodon entspricht. Die Sequenz (*) der Nr. 2421 bis 2423 (das heißt TAA) kann durch TGA oder TAG ersetzt werden. Weiterhin enthält die DNA eine Region, die mit der Promotorsequenz hoch homolog ist. (296- und 238-Regionen) und die Ribosomenbindungsregion (SD-Sequenz) von E. coli im 5' stromaufwärts des Strukturgens gelegenen Bereichs, wie in den 7 und 8 dargestellt ist. Ebenso wurde eine Stamm- und Schlaufenstruktur, die eine typische Terminatorregion darstellt, im 3' Bereich stromabwärts dieses Strukturgens beobachtet. Es wird angenommen, dass es diese Regionen sind, die die Expression des bst-Gens regulieren.
SEQ ID NO: 1 repräsentiert die Aminosäuresequenz des ST0160-Proteins. Das ST0160-Protein ist insgesamt aus 675 Aminosäureresten zusammengesetzt, die eine Signalsequenz einschließen, die aus 15 Aminosäureresten (Nr. 1 – 15 in SEQ ID NO: 1) und einem extrazellulären Bereich (Nr. 16 – 498 in SEQ ID NO: 1) besteht. Das Protein mit der Aminosäuresequenz, die auf Basis des bst-Gens abgeleitet wurde, weist ein Molekulargewicht von 76,5 kDa auf, wohingegen das Molekulargewicht hiervon ausschließlich der Signalsequenz 74,8 kDa berechnet wird. Weil das Molekulargewicht, bestimmt durch SDS-Elektrophorese, eines im Wesentlichen reinen ST0160-Proteins ungefähr 61 kDa ist [JP (Kokai) Hei 8-154673)] wird angenommen, dass das ST0160-Protein in der aktiven Form prozessiert wird oder gegenüber einer intrazellulären Protease während der Aufreinigung verwundbar ist.
Die C-terminale Region (Nr. 497-675 in SEQ ID NO: 1) weist eine signifikant hohe Homologie von 60% oder darüber mit dem Phosphat-Transportsystem-regulierenden Protein von E. coli auf. Es sei darauf hingewiesen, dass zwei lange α-Helixstrukturen begleitet von einer kurzen Helixstruktur dazwischen an den Resten 539-594 in dieser Region angeordnet sind. Unter der Annahme, dass im Allgemeinen eine α-Helixeinheit 18 Aminosäurereste aufweist, trägt das ST0160-Protein die beiden aufeinander folgenden α-Helixeinheiten in einer solchen Weise, dass in jeder Einheit alle vier Aminosäuren, die eine Fläche bilden, hydrophob sind. Zusätzlich besteht eine Region mit in erster Linie hydrophoben Aminosäureresten in der C-terminalen Region. Keine Region, die potentiell an Membranen bindbar ist, wird nachgewiesen, außer der oben erwähnten Region und der Signalsequenzregion am N-Terminus und es wird angenommen, dass die obige Region die Membran-bindende Region von ST0160 ist. Somit ist das ST0160-Protein von Sialyltransferasen von Tierursprung bezüglich der Art und Weise der Membranbindung vollkommen verschieden, weil angenommen wird, dass die Membran-bindenden Regionen der Sialyltransferasen tierischen Ursprungs, die bis jetzt kloniert wurden, sich im N-terminalen Bereich befinden.
Wenn diese Fakten in Erwägung gezogen werden ist offensichtlich, dass das Protein eine enzymatische Aktivität sogar dann aufweist, wenn zumindest ein Teil der Membran-bindenden Region und/oder der Signalsequenzregion des ST0160-Proteins deletiert wurde. Deswegen werden Gene, die solche Proteine codieren, ebenfalls in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen. Insbesondere ist eine β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase, die aufgrund der Deletion der Membran-bindenden Region des ST0160-Proteins löslich ist, eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie hierin nachstehend ausführlicher beschrieben werden wird.
Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden wird, kann das Gen der vorliegenden Erfindung aus einer Genbibliothek gewonnen werden, die unter Verwendung der genomischen DNA von JT0160 gebildet wird, die beispielsweise in Nährlösung (Nutrient Broth) gezüchtet wird (hergestellt von Oxoid), beispielsweise durch das Plaquehybridisierungsverfahren. Alternativ kann sie einfach durch das PCR-Verfahren unter Verwendung einer Genbibliothek als Matrize hergestellt werden, die von einem Mikroorganismus stammt, basierend auf der Nukleotidsequenz der DNA, die in der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde.
Weiterhin kann das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferasegen, das so hergestellt wurde, durch die nachfolgenden Verfahren zu Mutanten modifiziert werden.
Eine einzelne Aminosäure wird von zwei oder mehreren Codons codiert. Deswegen ist irgendeine DNA, die die Aminosäuresequenz codiert, repräsentiert durch die Aminosäurereste 16 – 498 von SEQ ID NO: 1, in die vorliegende Erfindung mit eingeschlossen.
Die Nukleotidsequenzen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung schließen isolierte DNAs und RNAs ein, die mit der hierin offenbarten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferasenukleotidsequenz unter Bedingungen einer milden oder starken Stringenz hybridisierbar sind und die biologisch aktive β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase codieren. Der Ausdruck „Bedingungen einer milden Stringenz" für eine Hybridisierung bedeutet solche, die in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe., Band 1, Seiten 1101-1104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben sind. Wie es Sambrook et al. definieren, schließen die Bedingungen einer milden Stringenz eine Vorwaschlösung (5 × SSC, 0,5% SDS und 0,1 mM EDTA) (pH 8,0) und eine Hybridisierung ein, die bei 55°C, 5 × SSC über Nacht durchgeführt wird. Die Bedingungen mit einer schweren Stringenz schließen eine Hybridisierung ein, die bei einer höheren Temperatur und mit Waschung durchgeführt wird. Die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung können in geeigneter Weise abhängig von verschiedenen Faktoren ausgewählt werden, wie beispielsweise der Größe der Sonde. Es wird bevorzugt, die Hybridisierung bei einer Konzentration von 5 × SSC oder unterhalb bei einer Temperatur von 20°C oder darüber zu bewirken.
Herstellung rekombinanter β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Expressionsvektoren bereit, die das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferasegen enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins, das das Kultivieren von Wirtszellen umfasst, die den Expressionsvektor enthalten, unter Bedingungen, die zur Expression des oben erwähnten Gens geeignet sind, und unter Wiedergewinnung des so exprimierten rekombinanten Proteins.
Um das rekombinante β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, wird die β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferasegensequenz an geeignete Transkriptions- oder Translations-regulierende Nukleotidsequenzen gebunden, die aus Genen von Säugetieren, Mikroorganismen, Viren, Insekten etc. abgeleitet sind, und diese werden in einen Expressionsvektor eingefügt, ausgewählt abhängig von den zu verwendenden Wirtszellen. Die regulatorischen Sequenzen sind beispielhafterweise Transkriptionspromotoren, Operatoren oder Enhancer, mRNA-Ribosomenbindungsstellen und geeignete Sequenzen, die den Start oder die Termination der Transkription oder Translation kontrollieren.
Beispiele für Wirtszellen, die für die Expression des β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins geeignet sind, schließe prokaryontische Zellen, Hefen und höhere eurkaryontische Zellen ein. Klonierungs- und Expressionsvektoren, die in den Wirtszellen der Bakterien, Pilze, Hefen und Säugetiere in geeigneter Weise verwendet werden, sind beispielsweise in Pouwels et al., "Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)" beschrieben.
Prokaryonten schließen gramnegative und grampositive Bakterien ein, wie beispielsweise E. coli und Bacillus subtilis. Wenn ein Prokaryont, wie beispielsweise E. coli, als Wirt verwendet wird, kann das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein den N-terminalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in den prokaryontischen Zellen zu erleichtern. Nach Abschluss der Expression kann das N-terminale Met aus dem rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein deletiert werden.
Ein Expressionsvektor, der in prokaryontischen Wirtszellen verwendet werden kann, enthält im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypisch selektive Markergene, die beispielsweise dem Wirt eine Toleranz gegenüber Antibiotika oder einer Auxotrophie verleihen. Beispiele für Expressionsvektoren, die für prokaryontische Wirtszellen geeignet sind, schließen kommerziell erhältliche Plasmide ein, wie beispielsweise pBR322 (ATCC37017), und solche, die hiervon abgeleitet sind. Das Plasmid pBR322 enthält Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgene, die die Identifizierung transformierter Zellen erleichtern. Ein geeigneter Promotor und die DNA-Sequenz des β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferasegens werden in den pBR322-Vektor eingefügt. Weitere Beispiele von kommerziell erhältlichen Vektoren schließen pKK223-3 (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (hergestellt von Promega Biotec, Madison, Wisconsin) ein.
Beispiele für Promotorsequenzen, die üblicherweise in Expressionsvektoren für prokaryontische Wirtszellen verwendet werden, schließen tac-Promotor, β-Lactamase (Penicillinase) und den Lactosepromotor (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979) ein. Ein besonders nützliches prokaryontisches Wirtszellexpressionsystem ist eines mit Verwendung des Phagen-λP_L-Promotors und der hitzelabilen cI857ts Repressorsequenz. Beispiele von Plasmidvektoren mit einem Derivat eines λP_L-Promotors, erhältlich von der American Type Culture Collection, schließen das Plasmid pHUB2 ein, das in E. coli JMB9 (ATCC370929) enthalten ist, und pPLc28 ein, enthalten in E. coli RP1 (ATCC53082).
Wie hierin nachstehend beschrieben werden war es unmöglich, E. coli zu gewinnen, das ein das HindIII-Fragment (ungefähr 2,8 kbp) tragende Plasmid aufweist, das das gesamte bst-Gen enthält. Statt dessen wurde das Gen als zwei HindIII-Fragmente kloniert (ungefähr 1,6 kb und ungefähr 1,2 kb). Im Hinblick auf diese Tatsachen kann das durch das Gen erzeugte Protein für E. coli tödlich sein. Um deswegen dieses Gen zu exprimieren, ist die Verwendung eines regulierbaren Promotors bevorzugt, sodass das bst-Gen exprimiert wird, nachdem der Wirt ausreichend gezüchtet wurde. Ein typisches Beispiel für den regulierbaren Promotor ist ein tac-Promotor, obwohl die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt ist. Weiterhin haben die Erfinder herausgefunden, dass die Expression durch Anordnen eines tac-Promotors an einem Punkt, der beispielsweise mehrere Basen vom Startcodon des bst-Gens entfernt ist, geschwächt werden kann. Das Intervall zwischen dem Promotor und dem Startcodon kann in geeigneter Weise in herkömmlicher Weise variiert werden.
Ebenfalls können die rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteine in Hefewirtszellen exprimiert werden. Obwohl es besser ist, Hefen zu verwenden, die zur Art bzw. zum Genus Saccharomyces gehören (beispielsweise S. cerevisiae) können auch solche verwendet werden, die zu anderen Arten gehören, wie beispielsweise Pichia und Kluyveromyces. Hefevektoren enthalten üblicherweise eine Sequenz aus dem Replikationsursprung eines 2 μ Hefeplasmids, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, eine Polyadenylierungssequenz, Sequenzen zur Terminierung der Tanskription und selektive Markergene. Die rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteine können durch Verwendung der Leadersequenz des Hefe-α-Faktors sezerniert werden. Darüber hinaus existieren andere bekannte Leadersequenzen, die zur Förderung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind. Hefen können durch die beispielsweise in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, beschriebenen Verfahren transformiert werden.
Die rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteine können durch Verwendung von Säugetier- oder Insektenwirtszellkultursystemen exprimiert werden. Statt dessen können etablierte Zelllinien verwendet werden, die aus Säugetieren stammen.
Transkriptions- und Translations-regulatorische Sequenzen für Säugetierwirtszellexpressionsvektoren können aus Virusgenomen gewonnen werden. Üblicherweise verwendete Promotorsequenzen und Enhancersequenzen sind aus Polyomaviren, Adenovirus 2 etc. abgeleitet. Um die Strukturgensequenz in Säugetierwirtszellen zu exprimieren, können andere genetische Elemente aus SV40-Virusgenomen verwendet werden, die beispielsweise der Replikationsursprung SV40, Early- und Late-Promotoren, Enhancer-Splice-Stellen und DNA-Sequenzen aus Polyadenylierungsstellen sind. In Säugetierwirtszellen zu verwendende Expressionsvektoren können beispielsweise durch das Verfahren von Okayama & Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) konstruiert werden.
Ein Verfahren zur Herstellung des β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins der vorliegenden Erfindung umfasst das Kultivieren von Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor transformiert wurden, der die DNA-Sequenz enthält, die das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein codiert, unter solchen Bedingungen, dass die Expression dieses Proteins ermöglicht wird, und danach das Gewinnen des β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins aus dem Kulturmedium oder Zellextrakt, abhängig vom verwendeten Expressionssystem. Verfahren zur Aufreinigung eines rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins können in geeigneter Weise durch Erwägung mehrerer Faktoren ausgewählt werden, beispielsweise des Typs der verwendeten Wirtszellen, ob Protein in das Kulturmedium sezerniert wird oder nicht etc.
Lösliche β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung lösliche β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteine und Gene bereit, die dieses Protein codieren. Ein derartiges lösliches β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein enthält die gesamte extrazelluläre Domäne des natürlichen β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins oder eines Teils hiervon, jedoch fehlt ihm die Membran-bindende Region, die das Polypeptid an Zellmembranen bindet. Beispielsweise kann das oben erwähnte ST0160-Protein durch Deletieren des gesamten oder eines Teils der Aminosäurereste in der Region zwischen 499- und 675-Positionen solubilisiert werden. Unmittelbar nach der Synthese kann das lösliche β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein ein natürliches oder heterogenes Signalpeptid enthalten. In diesem Fall jedoch sollte das Signalpeptid abgetrennt werden, wenn das β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein aus Zellen sezerniert wird. Die vorliegende Erfindung schließt jegliches lösliches Protein ein, aus dem die Membran-bindende Region und/oder die Signalpeptidregion vollständig oder teilweise deletiert wurde, solange sie die β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseaktivität beibehält. Das soll heißen, das lösliche β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseprotein kann einen Teil der Membran-bindenden Region, einen Teil der cytoplasmatischen Region oder andere Sequenzen enthalten, vorausgesetzt, dass das Protein enzymatisch aktiv ist. Solche löslichen Proteine können in einfacher Weise aufgereinigt werden, wenn sie durch Wirtszellen erzeugt werden, weil sie nicht an Zellmembranen binden. Signalpeptide zum Sezernieren der Proteine können aus entweder dem Wirtsorganismus oder einem heterogenen Organismus gewonnen werden. Die Aminosäuresequenz zwischen den 1- und 15-Positionen in SEQ ID NO: 1 ist ein bevorzugtes Signalpeptid.
Trunkierte β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferasen, die ein lösliches Protein umfassen, können durch Verwendung irgendeiner der in der Technik bekannten Techniken hergestellt werden. Beispielsweise wird das klonierte volle Länge DNA-Fragment von SEQ ID NO: 2 mit einem Restriktionsenzym gespalten, sodass sich trunkierte DNA-Fragmente ergeben, die dann durch Elektrophorese auf einem Agarosegel isoliert werden. Bei diesem Prozess kann das volle Länge DNA-Fragment mit einem Restriktionsenzym entweder an einer Stelle gespalten werden, die in der Natur auftritt, oder an der Restriktionsstelle des Linkers, der im DNA-Fragment von SEQ ID NO: 2 enthalten ist. Die DNA-Sequenz, die ein trunkiertes DNA-Proteinfragment codiert, das so isoliert wurde, kann durch die wohl bekannte Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden. Alternativ kann ein Stoppcodon an einem geeigneten Ort eingebracht werden, das beispielsweise unmittelbar stromabwärts des Codons der letzten Aminosäure der extrazellulären Region angeordnet ist, mittels bekannter Mutageneseverfahren.
Ein weiteres Verfahren umfasst das Deletieren von Nukleotiden aus der terminalen Region des DNA-Fragments durch eine Behandlung mit einem Enzym (beispielsweise Ba131-Exonuklease) und ein Ersetzen von dieser durch ein Fragment, sodass ein erwünschtes Ende bereitgestellt wird. Linker, die bei diesem Ansatz von Nutzen sind, sind kommerziell erhältlich. Sie schließen solche ein, die an das stumpfe Ende gebunden werden können, das durch die Digestion mit Ba131 erzeugt wird und weisen eine Restriktionsendonukleasespaltstelle auf.
Es ist ebenfalls möglich, ein synthetisches Oligonukleotid herzustellen, das an das DNA-Fragment gebunden wird, um einen N-Terminus oder C-Terminus an einem erwünschten Punkt im rekombinanten Protein zu erzeugen. Um die Genmanipulation zu erleichtern, kann das Oligonukleotid einen Restriktionsort stromaufwärts der codierenden Sequenz enthalten oder kann ein Startcodon (ATG) am N-Terminus hiervon zur Expression des Proteins in einem spezifischen Wirt tragen.
Die löslichen Proteine können durch Kultivieren von Wirtszellen erzielt werden, die durch die gewonnenen Gene transformiert wurden und danach durch Aufreinigen des Kulturüberstandes. Um die Ausbeute zu erhöhen, wird es bevorzugt, die Zellen zu desintegrieren.
Um die speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, jedoch keinesfalls um den technischen Umfang hiervon zu beschränken, sind die nachfolgenden Beispiele angegeben.
Die in den Beispielen unten verwendeten Methoden waren wie folgt:
Aminosäuresequenzanalyse der Peptide
Aminosäuresequenzen von Peptiden wurden durch ein Proteinsequenzen Modell 476A (Perkin Elmer Co.) analysiert.
Synthese der Sonden
Bereiche, die so viele Aminosäuren mit einer kleinen Anzahl einer Codon-Degeneration umfassten wie irgend möglich wurden aus der Aminosäuresequenz eines zu sondierenden Proteins ausgewählt und die Nukleotidsequenzen, die aus diesen Aminosäuresequenzen abgeleitet waren, wurden synthetisiert. Die Synthese wurde durch Japan Bio-Service durchgeführt.
Konstruktion der JT0160-Genbibliothek
JT0160 wurde in Nährlösung (Oxoid Co.) für 16 h bei 30°C gezüchtet, und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt (8.000 Upm für 10 min bei 4°C). Genomische DNA wurde aus 3 g dieser Zellen durch das Verfahren von Saito und Miura (Herstellung von transformierender Desoxyribonukleinsäure durch Phenolbehandlung, Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963)) isoliert. 50 μg der aufgereinigten genomischen DNA wurden mit Sau3AI teilweise digeriert und die sich ergebenden Genfragmente wurden an den λDASH II/BamHI-Vektorkit (Produkt von Stratagene Co.) gebunden. Diese wurden durch Verwendung von GigapakII-Verpackungsextrakten (Stratagene Co.) verpackt, um eine Genbibliothek zu konstruieren.
Amplifikation der Genbibliothek
Escherichia coli XL-1 Blue MRA (P2) wurde als Wirtsorganismus verwendet, um die konstruierte Genbibliothek zu amplifizieren. Der Organismus wurde auf LB-Medium unter Schütteln bei 150 Upm bei 37°C gezüchtet und danach wurde die Kultur mit 10 mM Magnesiumchlorid verdünnt bis zu einer Ablesung von 0,5 bei O.D.₆₆₀. 10 μg der Genbibliothek-Zubereitung wurden zu 600 μl dieser verdünnten Bakteriensuspension zugesetzt und für 15 min unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Suspension wurde mit 10 ml von LB-Topagarose vorgewärmt auf 48°C vermischt, die auf LB-Platten überschichtet wurde, die auf 37°C vorgewärmt wurden. Die Platten wurden bei Raumtemperatur verfestigt und für 8 h bei 37°C inkubiert. Nachdem der Wirtsor ganismus auf der oberen Agarose vollständig lysiert war, wurden 5 ml SM-Puffer den Platten zugesetzt und man ließ diese für 15 min stehen. Danach wurde die Agarose mit einem Spatel zusammen mit dem SM-Puffer abgekratzt und zentrifugiert (8.000 Upm für 10 min bei 4°C), sodass sich eine Überstandslösung ergab, die als amplifizierte Genbibliothek verwendet wurde.
Fluoreszenzmarkierung einer Sonde
Die synthetisierten Sonden wurden mit Fluoreszenz unter Verwendung von 3'-Oligomarkierungskit (Produkt von Amersham) markiert.
Hybridisierung
Eine Kopie wurde auf Agarosegel zur Southern-Hybridisierung wie folgt hergestellt:
DNA wurde mit Restriktionsendonuklease(n) digeriert und die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf 0,8 % Agarosegel in TAE-Puffer aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel in einer Denaturierungslösung (0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl) für 15 min eingeweicht, um zu ermöglichen, dass die DNA-Fragmente im Gel mit Alkali denaturiert werden. Danach wurde das Gel in eine Neutralisationslösung für 5 min eingeweicht (0,5 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl), um das alkalische Mittel zu neutralisieren. Das Gel wurde auf einem Blatt HybondN+ mit derselben Größe überschichtet, das zwischen Blättern von Kim-Papierhandtüchern eingeklemmt wurde, und wurde bei Raumtemperatur angeordnet, damit die DNA auf das HybondN+ übertragen werden konnte, wodurch ein Abdruck bzw. eine Kopie auf dem Gel gebildet wurde. Die Kopie wurde mit 2 × SSC-Puffer gewaschen und auf einem Filterpapier bei Raumtemperatur angeordnet, um zu trocknen. Danach wurde die Kopie für 2 h bei 80°C gebacken.
Eine Kopie von Kolonien oder Plaques zur Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung wurde gemäß den folgenden Verfahren hergestellt:
Ein Blatt HybondN⁺ wurde auf einer Agarplatte angeordnet, die eine geeignete Zahl von Kolonien oder Plaques trug, wobei die Kolonien oder Plaques auf das Blatt übertragen wurden, um eine Kopie zu ergeben. Die Masterplatte wurde bei 4°C nach dieser Replikation aufbewahrt. Die Kopie wurde für 5 min auf Filterpapier angeordnet, das mit einer Denaturierungslösung be feuchtet wurde (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl), um dadurch die Kolonien oder Plaques in alkalischen Mitteln zu denaturieren. Die Kopie wurde auf Filterpapier neutralisiert, das mit einer Neutralisationslösung (0,5 M Tris HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl) für 3 min befeuchtet wurde, gewaschen mit 2 × SSC-Puffer und auf Filterpapier trocknen gelassen. Danach wurde die Kopie bei 80°C für 2 h gebacken.
Eine Hybridisierung wurde durch Verwendung von 3'-Oligomarkierungskit (Amersham) gemäß der beigefügten Betriebsvorschrift wie folgt durchgeführt:
Die Kopie wurde in einem Hybribag angeordnet, der 30 ml Hybridisierungslösung enthielt, gefolgt von einem Schütteln in einem Wasserbad bei 43°C für 1 h, bis das Gleichgewicht erreicht war. Als nächstes erhielt diese Lösung eines Fluoreszenz-markierte Sonde, sodass sich eine Konzentration von 10 ng/ml ergab und wurde im Wasserbad für 3 h bei 43°C geschüttelt, um ein Annealing zu bewirken. Die Verfahren, die unten beschrieben wurden, wurden in einer Ablage bzw. einem Einsatz durchgeführt.
Nach Abschluss des Annealings wurde die Kopie zweimal mit 5 × SSC gewaschen, das 0,1 Triton X-100 enthielt, für 5 min bei Raumtemperatur. Danach wurde sie zweimal mit 1 × SSC gewaschen, das 0,1 % Triton X-100 enthielt, bei 43°C für 15 min und noch einmal mit Puffer 1 (0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl) für 1 min. Die Kopie wurde in einer Blockierungslösung eingeweicht und für 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde die Kopie mit Puffer 1 für l min gewaschen. Danach wurde die Kopie in einer geeigneten Antikörperlösung eingeweicht und für 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt, um eine Bindung des Antikörpers zu bewirken. Die Kopie wurde viermal mit Puffer 2 (0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,4 M NaCl) für 5 min gewaschen. Die Kopie wurde in einer Nachweislösung für 1 min geschüttelt, bis sich eine Fluoreszenz entwickelte. Sie wurde dann zwischen Blättern von Kim-Papierhandtüchern eingeschlossen, um kurz Wasser zu entfernen und danach in einer Filmkassette angeordnet. Das Blatt eines transparenten Polymerfilms (Saran-Wickel bzw. -Wrap) und danach ein Röntgenfilm wurden darauf überschichtet und der Röntgenfilm für 15 min exponiert. Der Film wurde dann durch den Fuji Medical Film Prozessor (Fuji Film Co.) entwickelt.
Isolierung von Phagen, die das bst-Genfragment enthalten
Plaques, die die erwünschten Eigenschaften zeigen, wurden aus der Agarplatte isoliert, in SM-Puffer (50 μl) suspendiert und bei 4°C gelagert. Die mit SM-Puffer extrahierten Phagen wurden durch das in „Amplifikation der Genbibliothek" beschriebene Verfahren amplifiziert.
Aufreinigung von Phagen-DANN
Phagen-DNA wurde aus der amplifizierten Phagensuspension durch Verwendung eines λprepDNA-Aufreinigungskits (rpmega Biotec) wie folgt aufgereinigt: 40 μl Nukleasegemisch wurden zu 10 ml der amplifizierten Phagensuspension zugesetzt, gevortext und bei 37°C für 15 min stehengelassen, um die Nukleinsäure in der Lösung abzubauen. Die Phagenteilchen wurden ausgefällt, indem man sie für 30 min nach Zusatz von 4 ml einer Phagenausfällungslösung auf Eis stehen ließ. Das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10.000 Upm für 10 min bei 4°C) gesammelt, die in 500 μl eines Phagenpuffers resuspendiert wurde. Diese Phagensuspension wurde zentrifugiert (15.000 Upm für 5 min bei 4°C), um unlösliche Zellbruchstücke zu entfernen. 1 ml DNA-Aufreinigungslösung wurde diesem Überstand zugesetzt, um Phagen-DNA durch Denaturieren der proteinartigen Bestandteile des Phagen zu extrahieren und man ließ die extrahierte DNA sich an das Harz gleichzeitig adsorbieren. Die Suspension wurde auf eine Spritze übertragen, um eine DNA-Aufreinigungssäule bereitzustellen, die mit dem Harz bepackt war. Die Säule wurde mit 2 ml 80% Isopropanol gewaschen und danach zentrifugiert (12.000 Upm für 20 sec bei 4°C), um das Harz zur Trockne zu bringen. Die Phagen-DNA wurde aus dem Harz durch Zusetzen von 100 μl vorgewärmten TE-Puffer bei 80°C zur Säule eluiert und danach durch Zentrifugieren der Säule bei 12.000 Upm für 20 sec bei 4°C.
Insertion der Genfragmente in einen Vektor.
Das Plasmid pUC19 wurde mit HindIII bei 37°C für 1 h digeriert, mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) für 1 h bei 65°C behandelt und danach mit 70% Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit 10% Ethanol gewaschen, in einem Speedbag getrocknet, um Ethanol zu entfernen und in sterilem Wasser gelöst.
Die aufgereinigte Phagen-DNA (5 μg) wurde mit HindIII digeriert und auf eine Agarosegelelektrophorese aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde der Anteil des Gels, der die Ziel-Genfragmente, hybridisiert an die Sonde in einer Southern-Hybridisierung, enthielt, ausgeschnitten. Die DNA wurde aus diesem Gelstück mit Geneclean (Funakoshi Co.) ausgeschnitten und wurde mit Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit 70% Ethanol gewaschen, mit Speedbag getrocknet, um Ethanol zu entfernen, und in 10 μl sterilem Wasser gelöst.
Die DNA-Lösung aus dem Gelstück (9 μl) wurde mit dem pUC19 (1 μl) vermischt, das mit HindIII behandelt wurde und danach mit BAP. Anschließend wurde die Takara-Ligationskitlösung I (10 μl) zugesetzt und das Gemisch wurde gevortext und über Nacht bei 16°C inkubiert.
Transformation
Die Transformation von E. coli MV 1184 wurde wie folgt durchgeführt:
Plasmid-DNA (10 μl) wurde kompetenten Zellen von E. coli MV 1184 (100 μl) zugesetzt, die bei –80°C aufbewahrt wurden und wurden auf Eis getaut. Das Gemisch wurde auf Eis für 30 min angeordnet, für 1 min auf 42°C erhitzt und erneut auf Eis für 3 min angeordnet. Hierzu wurden 900 μl vorgewärmter LB-Nährlösung zugesetzt und das Schütteln wurde bei 37°C für 1 h fortgeführt. Danach wurde eine Teilmenge der bakteriellen Suspension auf einer Agarplatte verteilt, die LB, Ampicillin, IPTG und X-Gal enthielten. Die Agarplatte wurde bei 37°C für 16 h inkubiert.
Isolierung von Plasmid-DNA
Kolonien wurden aus der Agarplatte aufgenommen, ausgesät und mit LB-Ampicillinnährlösung unter Schütteln für l6 h bei 37°C inkubiert. Die vermehrten Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (15.000 Upm für 10 min bei 4°C), woraus Plasmid-DNA durch Verwendung eines QIAGEN Mini-Präparationskits aufgereinigt wurde.
DNA-Nukleotidsequenzanalyse
Nukleotidsequenzen wurden durch das ALFred Sequenziergerät für die Genfragmente analysiert, die in einem Plasmid oder in eine Phage eingefügt wurden. Die Plasmidproben für die Nukleotidsequenzanalyse wurden gemäß der Vorschrift hergestellt, die dem cy5 Autoread Sequenzierkit (Pharmacia) beigefügt waren, und eine Analyse wurde mit diesem Kit durchgeführt. Phagenproben der Nukleotidsequenzanalyse wurden gemäß der Vorschrift hergestellt, die dem Autocycle Sequenzierkit (Pharmacia) beigefügt waren und eine Analyse wurde mit diesem Autocycle Sequenzierkit durchgeführt.
Die Gelelektrophorese für eine Nukleotidsequenzanalyse wurde auf einen 0,5 mm Long Ranger Gel durchgeführt, gemäß den Bedingungen, die für diese 0,5 mm lange Rangergelelektrophorese angegeben sind.
Hinterlegung
Photobacterium damsela JT0160 wurde unter der Zugangsnummer FERM BP-4900 am 24. November 1994 im National Institute of Bioscience and Human Technology hinterlegt, Agency of Industrial Science and Technology, Japan.
Beispiel 1. Isolierung des bst-Gens
Das bst-Gen wurde aus der JT0160-Bibliothek durch Verwendung einer Sonde kloniert, die aus dem ST0160-Protein entwickelt wurde, dessen Aminosäuresequenz bestimmt wurde.
I. Isolierung des 5'-terminalen Fragments des bst-Gens
a. Trypsinverdauung eines ST0160-Proteins
Eine 5 μg Teilmenge (1 ml) einer im Wesentlichen reinen ST0160-Zubereitung wurde in ein 1,5 ml siliconisiertes Röhrchen pipettiert, dem 150 μl 100% TCA zugesetzt wurden. Das Gemisch ließ man auf Eis für 20 min stehen, um das Enzym auszufällen, und es wurde bei 15.000 Upm für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Das Präzipitat wurde zweimal mit kaltem Aceton gewaschen und danach in einem Speedbag getrocknet. Diesem getrockneten Material wurden 25 μl eines Gemisches aus 8 M Urea und 0,4 M Ammoniumbicarbonat zugesetzt, und danach wurden 2,5 μl 45 mM Dithiothreitol hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 15 min bei 50°C inkubiert, um ir gendwelche Disulfidbrücken im Peptid zu spalten. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die sich ergebenden SH-Gruppen wurden durch Zusatz von 2,5 μl 100 mM Iodacetamid modifiziert und durch Stehen lassen des Gemisches für 15 min bei Raumtemperatur. Hierzu wurden 70 μl superreinen Wassers und Calciumchlorid in einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt, gefolgt von 5 U Trypsin in 10 μl. Das Gemisch wurde zur Typsindigestion bei 37°C für 24 h inkubiert.
b. Isolierung von Peptiden
Peptide aus dem Trypsin-digerierten ST0160 wurden wie folgt fraktioniert:
SmartSystem (Pharmacia), ausgerüstet mit einer Säule μRPCC2/C18SC2.1/10 (Pharmacia), wurde zur Isolierung der Peptide verwendet. Das Trypsin-digerierte ST0160 wurde auf die Säule aufgebracht, und die Peptidfraktionen wurden mit einem Gradienten einer Lösung 1 (0,06% TFA, 2% Acetonitril) und Lösung 2 (0,052% TFA, 100% Acetonitril) unter Wechseln von 100% Lösung 1 zu 50% Lösung 2 in 180 min gesammelt.
c. Aminosäuresequenzanalyse des ST0160-Proteins
Die Aminosäuresequenzen wurden für insgesamt 10 Peptide bestimmt, das heißt 1 Peptid der N-terminalen Region ebenso wie 9 Peptide, die vermutlich aus den inneren Regionen des ST0160 Enzyms abgeleitet waren, durch Trypsindigestion. Diese Aminosäuresequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Die N-terminale Aminosäure konnte nicht bestimmt werden; vermutlich aufgrund der Tatsache, dass sie entweder in Form einer modifizierten Aminosäure oder eines Cys-Restes vorlag.
d. Synthese der Sonden
Eine Sonde (Sonde A) wurde aus der Aminosäuresequenz (d) synthetisiert (entsprechend den Aminosäureresten 258-270 in SEQ ID NO: 1), ausgewählt aus den bestimmten inneren Sequenzen. Sonde A wies die folgende Sequenz auf:
5'-GCIAAITAIITIGCIGGIACIIIICCIGAIGCICCIAA-3' (SEQ ID NO: 3)
wobei I für Inosin steht, das ein Basenpaar mit Adenin, Uracil oder Cytosin bilden und diese erkennen kann.
e. Southern-Hybridisierung genomischer DNA
Durch Verwendung der oben in Abschnitt d synthetisierten Sonde A wurde eine Southern-Hybridisierung gegen eine HindIII-digerierte genomische DNA von P. damsela JT0160 durchgeführt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 2,8 kbp wurde insofern beobachtet, als es intensiv mit der Sonde hybridisierte. Nach der Agarosegelelektrophorese der genomischen HindIII-digerierten DNA wurde ein Anteil des Gels, der die 2,8 kbp DNA enthielt, ausgeschnitten, um die DNA zu extrahieren. Die extrahierte DNA wurde am pUC19 ligiert, das mit HindIII digeriert wurde und anschließend mit BAP. E. coli MV 1184 wurde mit diesem Plasmid transformiert und einer Koloniehybridisierung unterworfen. Unerwarteterweise hybridisierte keine der Kolonien mit Sonde A.
f. Isolierung von Phagen, die mutmaßlich bst-Genfragmente enthalten
Weil keine Kolonie von Interesse durch Koloniehybridisierung im obigen Abschnitt d gefunden werden konnte, wurde die Bibliothek aus P. damsela JT0160 genomischer DNA einer Plaquehybridisierung mit der Sonde unterworfen. Danach wurden 7 Phagen-Klone gewonnen, die wahrscheinlich ein bst-Genfragment enthielten. Die Phagen-DNA wurde aus jedem der Klone isoliert, wonach sie vermehrt wurden. Die DNA wurde mit HindIII digeriert und auf eine Sou thern-Hybridisierung angewandt. Als Folge hybridisierte ein DNA-Fragment von ungefähr 1,6 kbp von allen Klonen intensiv mit Sonde A.
g. Subklonierung
Ein Klon, ausgewählt aus den 7 Phagen-Klonen, wurde durch Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von 5 μg seiner DNA, digeriert mit HindIII, analysiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel ausgeschnitten und die DNA aus dem Anteil extrahiert, der ein DNA-Fragment von ungefähr 1,6 kbp enthielt. Die extrahierte DNA wurde an pUC19 ligiert, das mit HindIII und anschließend mit BAP digeriert wurde. Das sich ergebende Plasmid wurde dazu verwendet, E. coli MV1184 zu transformieren. Eine Koloniehybridisierung ergab 3 Kolonien, die stark mit Sonde A hybridisierten. Diese 3 Kolonien wurden von der Agarplatte aufgenommen, getrennt ausgesät und in LB-Ampicillinnährmedium bei 37°C unter Schütteln für 16 h vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, aus denen Plasmid-DNA hergestellt wurde. Die Plasmid-DNA wurde mit HindIII digeriert und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Plasmide aus allen 3 Klonen das DNA-Insert eines ungefähr 1,6 kbp Fragments enthielten. Wenn das Gel nach der Elektrophorese durch Southern-Hybridisierung durch Verwendung einer Sonde A analysiert wurde, hybridisierte das 1,6 kbp DNA-Fragment stark mit der Sonde. Deswegen wurde erwogen, dass dieses Fragment in den Plasmiden ein Segment des bst-Gens enthielt.
h. Analyse der 5'-terminalen Nukleotidsequenz des bst-Gens
Das DNA-Fragment von ungefähr 1,6 kbp, das in den Plasmiden in Abschnitt g kloniert wurde, wurde bezüglich der Nukleotidsequenz durch Verwendung eines ALFred DNA-Sequenziergerätes analysiert (Nukleotidsequenz von 35 bis 1639 in SEQ ID NO: 2). Die Aminosäuresequenz, die aus der Nukleotidsequenz geschätzt wurde, zeigte ein langes offenes Leseraster (Open Reading Frame = ORF), das aus 414 Aminosäureresten bestand, ausgehend vom 396. ATG (Met-Rest) von der HindIII-Erkennungsstelle, und erstreckte sich über eine weitere Hind III-Erkennungsstelle stromabwärts. Ein Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz, die aus diesem ORF abgeleitet wurde und derjenigen, die chemisch für ST0160 in Abschnitt c bestimmt wurde, identifiziert die 8 Aminosäurereste in der N-terminalen Region.
Demgemäß wurde in Erwägung gezogen, dass das ORF den 5'-Terminus des bst-Gens umfasste. Das Plasmid wurde als pBSTN bezeichnet.
Jedoch zeigte das Molekulargewicht von 60 kDa von ST0160 die Notwendigkeit einer weiteren Klonierung in der Suche der 3'-terminalen Region des bst-Gens, die zumindest 200 Aminosäurereste auf der C-terminalen Seite des STOl60-Proteins codiert.
Die Sequenz beginnt vom Asn-Rest, der 2. Aminosäure im ST0160 N-Terminus, stimmte mit der Sequenz überein, ausgehend von der 17. Aminosäure im ORF, sodass in Erwägung gezogen wurde, dass der N-Terminus von ST0160 vom Cys-Rest startet, wie es zunächst in Abschnitt c vorgeschlagen wurde. Die Hydrophobie-Hydrophilie-Analyse des ORF zeigte, dass eine Region mit einer sehr hohen Hydrophobie in der N-terminalen Sequenz des ORF bestand. Darüber hinaus existierten 2 positiv geladene Lys-Reste knapp nach der Startaminosäure Met des ORF. Weil dies ein typisches Alignment einer Signalsequenz ist wurde in Erwägung gezogen, dass die Sequenz von 15 Aminosäuren vom Met-Rest des Aminosäurerestes bis knapp vor den 16. Cys-Rest die Signalsequenz von ST0160 ist.
II. Isolierung des 3'-terminalen Fragmentes des bst-Gens
a. Bestimmung einer 3'-stromabwärts Nukleotidsequenz des bst-Gens
2 Primer wurden für die Nukleotidsequenzbestimmung, wie unten dargestellt, synthetisiert, auf Basis der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts in pBSTN:
5'-GGGGGGGAAACGAAAGAGTATTATG-3' (SEQ ID NO: 4) (Sequenz 1482-1506 in SEQ ID NO: 2)
5'-ATTTTTCAAGGGGCATCCTGCTGG-3' (SEQ ID NO: 5) (Sequenz 1583-1606 in SEQ ID NO: 2)
Diese Primer wurden dazu verwendet, die Nukleotidsequenz der Phagen-DNA zu analysieren, die in Abschnitt I. f gewonnen wurde, die das bst-Genfragment enthalten sollte. Ungefähr 150 bp der Nukleotidsequenz in der 3'-stromabwärts gelegenen Richtung von der HindIII-Erkennungsstelle von pBSTN wurde bestimmt.
b. Klonieren eines 3'-terminalen Fragments des bst-Gens
Die Sonde B wurde auf Grundlage der bestimnmten Sequenz wie folgt synthetisiert:
5'-AAGATTTCATTTGAGGT-3' (SEQ ID NO: 6) (Sequenz 1665-1681 in SEQ ID NO: 2).
Die Phagen-DNA wurde mit HindIII digeriert, auf eine Agarosegelelektrophorese aufgebracht und danach durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Fluoreszenz-markierten Sonde B nachgewiesen. Ein Genfragment von ungefähr 1,2 kbp hybridisierte intensiv mit Sonde B.
Demgemäß wurden 5 μg der Phagen-DNA mit HindIII digeriert, durch Elektrophorese auf Agarosegel aufgetrennt und eine Region, die ein DNA-Fragment von 1,2 kbp enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde extrahiert. Die DNA wurde in pUC19 ligiert, die mit HindIII digeriert wurde und anschließend mit BAP, und das sich ergebende Plasmid wurde dazu verwendet, um E. coli MV 1184 zu transformieren. Eine Koloniehybridisierung der Transformanten mit Sonde B ergab 5 Kolonien, die eine intensive Hybridisierung zeigten.
Die Kolonien wurden aus den Agarplatten aufgenommen, in LB-Ampicillinnährlösung inokuliert und bei 37°C für 16 h unter Schütteln inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde aus Zellen jedes Klons isoliert, der durch Zentrifugation gesammelt wurde (15.000 Upm für 30 sec bei 4°C). Die DNA wurde mit HindIII digeriert und einer Elektrophorese auf Agarosegel unterworfen, was bestätigte, dass das Plasmid aus jeder der Kolonien ein DNA-Insert von ungefähr 1,2 kbp Fragmentlänge beherbergte. Alle DNA-Fragmente von ungefähr 1,2 kbp hybridisierten mit Sonde A durch Southern-Hybridisierung intensiv.
b. Analyse der C-terminalen DNA-Sequenz eines bst-Genfragments
Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments von ungefähr 1,2 kbp aus dem obigen Abschnitt wurde durch das ALFred DNA-Sequenziergerät analysiert. Die Aminosäuresequenz, die aus der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde, zeigte ein langes ORF mit 262 Aminosäuren, ausgehend von einem HindIII-Ort. Im 3'-stromabwärts dieses ORF existierte eine Stamm- und Schlaufenstruk tur (stem and loop structure), die aus einem Stamm von 10 bp und einer Schlaufe von 7 bp zusammengesetzt war.
Im Hinblick auf die obigen Erkenntnisse wurde angenommen, dass das ORF in diesem Fragment die C-terminale Sequenz des bst-Gens repräsentiert (Nukleotidsequenz 1634-2743 in SEQ ID NO: 2). Dieses Plasmid wurde als pBSTC bezeichnet.
III. DNA-Methyltransferase von JT0160
Wie in Abschnitt I. b dargestellt ist, hybridisierte ein DNA-Fragment von ungefähr 2,8 kbp intensiv mit Sonde A, wenn es durch Southern-Hybridisierung der HindIII-digerierten JT0160-genomischen DNA getestet wurde. Diese Größe gleichte der Summe der Längen der Genfragmente, eingefügt in pBSTN und pBSTC, nämlich der Länge der gesamten bst-Gennukleotidsequenz. Die Tatsache zeigte, dass die genomische DNA nicht mit HindIII gespalten wurde, obwohl das bst eine gegenüber HindIII empfindliche Stelle (AAGCTT) enthält. Diese Unempfindlichkeit gegenüber HindIII legte die Möglichkeit nahe, dass die genomische DNA von JT0160 in den Zellen modifiziert sein könnte, beispielsweise durch Methylierung. Eine Analyse der gesamten Nukleotidsequenz des bst-Gens zeigte, dass der HindIII-Ort, der im Gen enthalten ist, eine Palindromstruktur G AAGCTTC darstellt, zusammen mit den flankierenden Nukleotiden. Weil die meisten Restriktionsendonukleasestellen oder Methylierungsstellen ein Palindrom umfassen wurde angenommen, dass die obige 8-bp-Sequenz G AAGCTTC eine Erkennungsstelle für die Methyltransferase von JT0160 ist. Andererseits wiesen die verbleibenden HindIII-Orte in den Enden des bst-Gens die Sequenzen AAGCTTA und AAAGCTT auf, die keine Palindrome sind, die gegenüber einer Methylierung empfindlich sind, und konnten daher mit HindIII gespalten werden.
Gegenwärtig sind mehrere Restriktionsendonukleasen bekannt, die eine 6 bp Sequenz erkennen und diese werden üblicherweise in der Gentechnik verwendet. Jedoch macht ein kürzlicher Trend Restriktionsendonukleasen erforderlich, die eine 8 bp Sequenz erkennen, um lange genomische DNAs von Menschen zu untersuchen. Trotz dieser Bedürfnisse ist Not1 die einzige Restriktionsendonuklease eines 8 bp Erkennungstyps, die kommerziell erhältlich ist. Andererseits ist bekannt, dass viele Bakterienspezies eine Methyltransferase und eine Restriktionsendonuklease, die dieselbe Nukleotidsequenz erkennt, als Verteidigungsmechanismus besitzen. Weil JT0160 eine DNA-Methyltranferase eines 8 bp Erkennungstyps aufzuweisen schien besteht eine Möglichkeit, dass dieser Organismus ebenfalls eine Restriktionsendonuklease aufweist, die die oben erwähnte Sequenz spaltet. Die Aussicht, neue Restriktionsendonukleasen vom 8 bp Erkennungstyp zu entwickeln, ist sehr wichtig und viel versprechend.
IV. Sialylmotiv
Bis jetzt wurden mehrere Arten von Sialyltransferasen aufgereinigt oder kloniert, hauptsächlich aus Tierspezies. Sialyltransferasen tierischen Ursprungs besitzen zwei Regionen, die eine signifikant hohe Homologie in den Aminosäuresequenzen unabhängig von dem Ursprung oder der Spezies aufweisen. Diese Strukturen werden als Sialylmotive bezeichnet. Ein Motiv ist als Bindungsstelle für CMP-Sialinsäure bekannt, was der übliche Zuckerrezeptor der meisten Sialyltransferasen ist. Keine Region einer signifikanten Homologie wurde zwischen der geschätzten Aminosäuresequenz von ST0160 und derjenigen von Ratten-β-Galaktosid-α-2,3-sialyltransferase gefunden. Keine Region von ST0160 wies irgendeine signifikante Homologie mit der obigen Sialylmotivsequenz auf. Diese Tatsachen legen nahe, dass der Ursprung von ST1060 sich von demjenigen von Tiersialyltransferasen, die oben erwähnt sind, unterscheidet. Eine Analyse dieses Enzyms bezüglich der Bindungsstelle für ein Substrat, insbesondere für CMP-Sialinsäure, wird interessante Ergebnisse bereitstellen und eine derartige Analyse wird von Nutzen sein.
Beispiel 2. Expression von rekombinantem ST0160-Protein
In diesem Beispiel stellen wir den Beweis bereit, dass das lange offene Leseraster (ORF), das als separate Fragmente in pBSTN und pBSTC kloniert wurde, das bst-Gen ist, das heißt das Gen, das die Sialyltransferase (ST0160) von Photobacterium damsela JT0160 codiert. Zu diesem Zweck wurde das Gen in einen Expressionsvektor eingeführt, um die Expression des Gens in E. Coli und die Analyse der Genprodukte zu ermöglichen. Zusätzlich wurde das gewonnene ST0160-Produktionssystem dazu verwendet, die Funktion der Region in der C-terminalen Sequenz zu analysieren, die vermutlich für die Bindung an die Membranen verantwortlich ist.
I. Konstruktion eines Expressionsplasmids
Das bst-Gen wurde als für E. coli lethal angesehen wegen der Tatsache, dass es das HindIII-Fragment von 2,8 kbp in pUC18 nicht einfügen konnte, obwohl die Southern-Hybridisierung das Vorhandensein eines Fragments eines bst-Gens nahe legte, und dass das gesamte Fragment in die beiden separaten HindIII-Fragmente von 1,6 kbp und 1,2 kbp kloniert wurde. Wir machten deswegen einen Versuch, die beiden bst-Genfragmente zu verbinden, die separat kloniert wurden, unter dem künstlich kontrollierbaren tac-Promotor.
Ein Expressionsvektor, der verwendet wurde, war pAQN, eine modifizierte Form von pAQI.
1 und 2 zeigen die Struktur von jeweils pAQI und pAQN. Diese Plasmide tragen das Gen (aquI-Gen), das Aqualysin I codiert, zwischen dem EcoRI-Ort knapp nach dem tac-Promotor und die HindIII-Stelle knapp vor dem rrnBT1T2-Terminator. Das aquI-Gen ist für eine Genmanipulation von Nutzen, weil es 10 einmal vorkommende Restriktionsorte enthält, die die EcoRI- und die HindIII-Orte im Plasmid einschließen. Darüber hinaus ist das Plasmid für dieses Experiment geeignet, weil es ein lacIq enthält, das den tac-Promotor kontrolliert, sodass der tac-Promotor effizienter als im normalen System reguliert werden wird.
Das Verfahren zur Konstruktion von pAQI ist in der japanischen Patentanmeldung Nr. Hei2-92288 offenbart und das Plasmid wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Japan, unter FERM BP-2305 hinterlegt.
Die Modifikation von pAQI zu pAQN wurde durch Verwendung von Mutan-K (Takara Brewery Co.) wie folgt durchgeführt:

1. BP-2305 wurde über Nacht bei 37°C gezüchtet und pAQI wurde aus dem Organismus durch Verwendung eines QIAprep Spin Plasmidkits (QIAGEN Co.) extrahiert.
2. pAQI wurde mit XhoI und HindIII digeriert und danach ligiert (pAQIΔXH).
3. Das EcoRI-XbaI-Fragment des Aqualysin-Gens wurde aus pAQIΔXH gespalten, das dann in eine EcoRI-XbaI-Stelle von M13mp18 insertiert wurde (pMBALI).
4. Das Plasmid pMBALI wurde mittels Punktmutationen mit den nachfolgenden Primern modifiziert, um AccIII-, BamHI- und BglII-Erkennungsstellen innerhalb des EcoRI-XbaI-Segments des Aqualysin-Gens zu erzeugen und um XmaIII- und KpnI-Orte zu zerstören (pMBAL1ΔXH). Zur Einfügung einer AccIII-Stelle (Nukleotid Nr. 141) (SEQ ID NO: 21) 5'-CCTGGATGATCCGGAAGCTATCC-3' (23 mer) Zur Einfügung einer BamHI-Stelle (Nukleotid Nr. 503) (SEQ ID NO: 22) 5'-TGACACCGGGATCCGCACGA-3' (20 mer) Zur Einfügung einer BglII-Stelle (Nukleotid Nr. 966) (SEQ ID NO: 23) 5'-TAGTTGCGTAGATCTCTTCGCC-3' (22 mer) Zur Zerstörung der XmaIII-Stelle (Nukleotid Nr. 531) (SEQ ID NO: 24) 5'-AGTTCGGCGGACGGGCCCG-3' (19 mer) Zur Zerstörung der KpnI-Stelle (Nukleotid Nr. 592) (SEQ ID NO: 25) 5'-ACGGCCACGGGACCCATGTGG-3' (21 mer) Das Annealing wurde bei 65°C für 15 min und bei 37°C für 15 min durchgeführt.
5. Das EcoR XbaI-Fragment wurde aus pMBAL1ΔXH ausgeschnitten und in das Plasmid AQIΔH eingefügt, woraus das Segment EcoRI baI deletiert wurde (pAQN).

Die Konstruktion des Plasmids pEBST zum Exprimieren des bst-Gens wurde durch Einfügen der Genfragmente aus pBSTN und pBSTC in pAQN stromabwärts des tac-Promotors durchgeführt, in der Orientierung wie unten beschrieben, weil beide Fragmente HindIII-Fragmente waren. Weiterhin war der endogene Promotor des bst-Gens vollständig entfernt worden.
Kurz gesagt wurden die Restriktionsstellen von pAQN, ausgerichtet in der Reihefolge EcoRI, BglII, XbaI und HindIII knapp nach dem tac-Promotor ausgerichtet, mit EcoRI, HindIII und XbaI ausgetauscht. Als nächstes wurde die HpaI-Stelle (Nukleotidsequenz 2596-2601 in SEQ ID NO: 2) stromabwärts des ORF in pBSTC durch eine XbaI-Erkennungsstelle ausgetauscht. Das ORF, das die C-terminale Sequenz umfasste, wurde als XbaI-HindIII-Fragment in die modifizierte pAQN-Stelle eingefügt. Eine EcoRI-Stelle wurde in pBSTN stromaufwärts des Met-Codons am N-Terminus des ORF eingefügt. Das ORF, das diesen N-Terminus umfasste, wurde als ein EcoRI-HindIII-Fragment in pAQN eingefügt, das bereits das ORF trug, das die C- terminate Sequenz enthält, wodurch die Konstruktion des Expressionsplasmids pEBST abgeschlossen wurde.
Mutanten, denen die C-terminale Region fehlt, wurden in einer ähnlichen Art und Weise konstruiert.
Details sind unten angegeben:
a. Materialien

Die folgenden Materialien wurden bei der Konstruktion des Expressionsvektors verwendet:

Wirt:	E. coli MV 1184
Plasmide:	M13mp18 (Bio-Rad), M13mp19 (BioRad) pUC 18 (Takara Brewery), pUC 19 (Takara Brewery), pBSTN, pBSTC
Expressionsvektor:	pAQN
Reagenzien:	Wako Pure Chemicals Co.
Reagenzien zur Gentechnik und Kits:	bezogen von Takara Brewery außer dem ortsspezifischen Mutagenese-Kit, der von Bio-Rad bezogen wurde
Linker:	HindIII-Linker 5'-CCAAGCTTGG-3' (SEQ ID NO: 7) (Takara Brewery, 4670A) XbaI-Linker 5'-CTCTAGAG-3' (SEQ ID NO: 8) (Takara Brewery, 4693A)
Synthetische Oligonukleotide:	Primer BST01 5'-TTATGTGAATTCGCTTAATATG-3' (SEQ ID NO: 9) Primer BST02 5'-TTTTTATGTGAATGTGGAATTCATGAAGAAAATACTGA-3' (SEQ ID NO: 10)

Primer BST03 5'-CAAAACAATTACTGATTAATAGTGAATTGGCGATGTGGCAG-3' (SEQ ID NO: 11) Primer BST04 5'-TGTTCTGTTCTGGGCTTAGTGATAAGATCTCTCGATGGAAGTTGCC-3' (SEQ ID NO: 12)

b. Verfahren
Modifikation von pAQN (3)
Zunächst wurde pAQN mit HindIII und XbaI digeriert, durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment befüllt und erneut ligiert. Diese Behandlung zerstört die HindIII-Stelle, wohingegen die XbaI-Stelle wiederhergestellt wurde (pAQNΔXH in 3). Die Veränderungen der Nukleotidsequenzen während des Modifikationsprozesses sind wie folgt dargestellt:
Als nächstes wurde pAQNΔXH mit BglII digeriert und durch eine Behandlung mit dem Klenow-Fragment eingefüllt. Ein HindIII-Linker wurde zugesetzt, und das Plasmid wurde ligiert. Diese Behandlung änderte den BglII-Ort zu einem HindIII-Ort (pAQN-EHX in 3).
Modifikation von pBSTC und Insertion in pAQN-EHX (4)
Das 1,2 kbp HindIII-Fragment von pBSTC, von dem angenommen wurde, dass es eine C-terminale Sequenz von ST0160 enthielt, wurde in den HindIII-Ort in der Klonierungsregion von M13mp18 eingefügt. Eine Kolonie wurde ausgewählt, bei der der 3'-Terminus des Inserts zur EcoRI-Stelle hin orientiert war (das heißt XbaI-Stelle) in der Klonierungsregion (pMBSTC in 4).
Danach wurde pMBSTC mit HpaI gespalten, durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment befüllt, ein XbaI-Linker wurde hinzugesetzt und das Plasmid wurde ligiert, wodurch die HpaI-Stelle zu einer XbaI-Stelle verändert wurde (pMBSTC-HX in 4).
Das Plasmid pMBSTC-HX wurde mit XbaI digeriert und ohne weitere Behandlung ligiert, was eine Deletion des überschüssigen XbaI-Fragments zur Folge hatte (das eine HindIII-Stelle enthielt) (pMBSTCΔX in 4).
Das HindIII-XbaI-Fragment aus pMBSTCΔX wurde in den HindIII-XbaI-Ort von pAQN-EHX insertiert, um pEBSTC zu erzeugen.
Konstruktion von modifiziertem ST0160, dem einem Membran-bindende Region fehlt
Wir haben ebenfalls eine modifizierte Form von ST0160 konstruiert, der die potentielle Membranbindungsregion fehlt (abgekürzt als M hierin nachstehend) und die Region, die zu phoU hoch homolog ist (abgekürzt als P hierin nachstehend), um ihre Funktionen klarzustellen und die Expression zu bewirken.
Die Verfahren zu dieser Modifikation waren wie folgt: Das Plasmid pMBSTCΔX (4) wurde einer ortsspezifischen Mutagenese an den Codonen unterworfen, die die 539. Aminosäure Leucin in der ORF-Sequenz codiert (durch Verwendung von Primer BST03) und die 498. Asparaginsäure (durch Verwendung von Primer BNST04), und diese Codons wurden jeweils zu Stoppcodons umgewandelt. Die so konstruierten Plasmide waren pMBSTRCΔC137 bzw. pMBSTCΔC 178. Bei dieser Mutagenese wurden 3 unterschiedliche Stoppcodons eingefügt, um den Translationsstopp sicherzustellen und weiterhin wurde eine neue Restriktionsstelle einge fügt, um bequeme Mittel zur Bestätigung der Mutation zu haben (PshBI für pMBSTCΔC 137 bzw. BglII für pMBSTCΔC178).
Aus pMBSTCΔC137 und pMBSTCΔC178 wurde ihr HindIII-XbaI-Fragment entfernt und das jeweilige Fragment wurde in den Hind-XbaI-Ort von pAQN-EHX wie bei der Konstruktion von pMBSTCΔX beschrieben eingefügt, wodurch pEBST (pEBSTCΔC137 bzw. pEBSTCΔC178) konstruiert wurden.
Konstruktion eines Expressionsvektors durch Modifikation und Insertion von pBSTN in pEBSTC (5)
Wir schnitten das 1,6 kbp HindIII-Fragment aus, von dem in Erwägung gezogen wurde, dass es eine N-terminale Sequenz von ST0160 enthielt, aus pBSTN wie in Abschnitt I. h vom Beispiel 1 konstruiert, und fügten dieses in die HindIII-Stelle der M13mp19-Klonierungsregion ein. Ein Klon wurde ausgewählt, der das Insert in der Orientierung enthielt, dass der N-Terminus zu EcoRI in der Klonierungsregion orientiert war (pMBSTN in 5).
Als nächstes wurde ein EcoRI-Ort in pBSTN, durch ortsspezifische Mutagenese stromaufwärts des ORF-Startpunktes eingefügt. 2 rekombinante Plasmide wurden konstruiert. Eines war Plasmid pMBSTN-E0, das keine Nukleotide zwischen der EcoRI-Stelle und dem Methionincodon ATG aufwies (durch Verwendung von Primer BST02), und das andere war Plasmid pMBSTN-E7, das 7 Nukleotide zwischen diesen aufwies (durch Verwendung von Primer BST01). Wenn pMBSTN-E0 in pAQN eingefügt wurde, betrug die Distanz zwischen der SD-Sequenz und dem ATG 9 bp, wohingegen pMBSTN-E7 16 bp durch Insertion erbrachte. Es wurde erwartet, dass die Distanz von 9 Basen zwischen der SD-Sequenz und dem ATG, bereitgestellt von pMBSTN-E0, die effizienteste Expression aufgrund dieser Distanz erreichen würde. Andererseits wurde die größere Distanz zwischen der SD-Sequenz und dem ATG in pMBSTN-E7 in dem Versuch erzeugt, ein Expressionssystem zu konstruieren, bei dem die Expression im Hinblick auf die Möglichkeit, dass das bst-Gen für E. coli lethal ist, wie oben beschrieben, reduziert ist.
Die Plasmide pMBSTN-E0 und pMBSTN-E7 wurden jeweils mit EcoRI digeriert und ohne irgendeine weitere Behandlung ligiert, um das überschüssige EcoRI-Fragment zu entfernen (einschließlich einer HindIII-Stelle) (pMBSTN-E0ΔE und pMBSTN-E7ΔE in 5).
Das jeweilige EcoRI-Fragment, ausgeschnitten aus pMBSTN-E0ΔE pMBSTN-E7ΔE wurde in die EcoRI-HindIII-Stelle von pEBSTC insertiert, um Expressionsvektoren von pEBST zu erzeugen (6).
Eine ähnliche Einfügung wurde für pEBSTCΔC137 und pEBSTCΔC178 vorgenommen. Insgesamt wurden 6 ST1060 Expressionsvektoren konstruiert, wie in Tabelle 2 dargestellt ist. Tabelle 2
II. Beispiel für eine Expression
(1) Transformation und Konservierung von bakteriellen Stämmen
Jeder der 6 Expressionsvektoren (10 μl), gezeigt in Tabelle 2, wurde kompetenten Zellen von E. coli MV1184 (100 μl) zugesetzt, die auf Eis aufgetaut wurden, aus dem Ansatz, der bei –80°C aufbewahrt wurde. Das Gemisch wurde auf Eis für 30 min angeordnet, für 1 min auf 42°C erhitzt und erneut auf Eis für 3 min angeordnet. Hierzu wurden 900 μl vorgewärmte LB-Nährlösung zugesetzt, und das Gemisch wurde für 1 h bei 37°C geschüttelt. Danach wurden Teilmengen des Gemischs auf Agarplatten, die LB, Ampicillin, IPTG und X-Gal enthielten, verteilt. Die Agarplatten wurden für 16 h bei 37°C inkubiert.
(2) Kultivierung
Transformanten (6 Typen) wurden in LB-Nährlösung gezüchtet, die Ampicillin und IPTG enthielt, unter Schütteln bei 150 Upm bei 30°C und ihr Wachstum und die Sialyltransferaseaktivität wurden gemessen. Die Inokulumgröße des Mediums betrug 0,5% der Zellen, die in Abschnitt (1) zubereitet wurden und in Glycerol aufbewahrt wurden. Das Wachstumsmedium enthielt 100 mg/l Ampicillin und 0,02 mM IPTG. Das Wachstum wurde durch Sammeln einer Teilmenge in Zeitintervallen überwacht, um die Turbidität bzw. Trübheit bei 660 nm zu messen.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Transformanten von E. coli MV 1184, die die Expressionsvektoren A-, B- und C-Reihen beherbergten, nach einer langen Verzögerungszeit zu wachsen begannen. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Transformanten (A2, B2 und C2) wurden als C-Serien > B-Serien > A-Serien, wie in 9 dargestellt, verglichen.
Eine rohe Enzymzubereitung wurde durch Sammeln von Zellen unter Zentrifugation, Resuspension in 20 mM Cacodylatpuffer (pH 5,0), der 0,2% Triton X-100 enthielt, und deren Zerstörung in einem Beschaller hergestellt. Wie in Tabelle 3 gezeigt wurde, war das Niveau der Enzymproduktion ebenfalls in der Reihenfolge C > B > A.
Die Sialyltransferaseaktivität wurde bezüglich der Mengen von [4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc, transferiert auf das Akzeptorsubstrat Lactose aus dem Donorsubstrat CMP-[4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc gemessen. Das Standardreaktionsgemisch bestand aus einer Enzymprobe in 20 mM Cacodylatnatriumpuffer (pH 5,0), der 70 nmol CMP-[4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc (642 cpm/nmol), 1,25 μmol Lactose und 0,02% Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 25 μl enthielt. Die Enzymreaktion wurde für 3 min bei 30°C zweifach für alle Messungen durchgeführt. Nach dieser Periode wurde das Reaktionsgemisch durch Zusatz von 5 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) verdünnt und auf eine Dowex 1 × 8 Säule (Phosphatform, 0,5 × 2 cm) aufgebracht. Das Eluat (2 ml) wurde direkt in einem Szintillationsvial gesammelt und bezüglich der Radioaktivität gemessen. Die Radioaktivität von [4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc im Eluat wurde mit einem Szintillationszähler gemessen, um die Menge des [4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc zu berechnen, das auf das Akzeptorsubstrat übertragen wurde. Eine Einheit (U) der Enzymaktivität wurde durch 1 μmol Sialinsäure übertragen auf Lactose in 1 min unter den obigen Bedingungen definiert. Tabelle 3
(3) Charakterisierung der enzymatischen Reaktionsprodukte
Der rohe Enzymextrakt, hergestellt wie in Abschnitt 2 oben beschrieben, wurde teilweise durch Säulenchromatographie mit einer Ionenaustauschersäule (Q-Sepharose, Pharmacia) aufgereinigt und danach mit Hydroxyapatit (Kouken Co.) aufgereinigt. Die Reaktion mit dieser Enzymzubereitung wurde mit Pyridylaminolactose als Zuckerakzeptorsubstrat und CMP-NeuAc als Zuckerdonorsubstrat bei 30°C für 6 h durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das Enzym durch Erhitzen auf 100°C für 2 min inaktiviert und das Reaktionsprodukt wurde durch HPLC analysiert.
Die HPLC-Analyse wurde durch Injizieren von 10 μl Reaktionsgemisch in eine PALPAK Typ R Säule (Takara Brewery Co.), die mit einem Shimazu LC-10 HPL-System (Shimazu Co.) ausgestattet war, und mit einer Lösung aus 100 mM Essigsäuretriethylamin (pH 5,0) equilibriert war, die 0,15% n-Butanol enthielt, durchgeführt, nachdem das Enzym inaktiviert war. Zur Elution von Pyridylaminozuckerketten wurden Lösung A (100 mM Essigsäuretriethylamin, pH 5,0) und Lösung B (100 mM Essigsäuretriethylamin, pH 5,0, das 0,5% n-Butanol enthielt) als lineare Gradienten verwendet, die von 30% B bis zu 100% B (0-35 min) und danach 100% B alleine (35-50 min) begannen, mit einer Elutionsrate von 1 ml/min und bei einer Säulentemperatur von 40°C. Die Pyridylaminozuckerketten wurden durch Fluoreszenz nachgewiesen (Anregung bei 320 nm und Emission bei 400 nm) des Eluats.
Die Ergebnisse in 10 zeigen, dass die Reaktionsprodukte irgendwelche der Rohenzymzubereitungen einen Peak der Retentionszeit ergaben, der derselbe war wie derjenige des Reaktionsproduktes aus reinem ST0160-Enzym, was darauf hinweist, dass alle 6 Rohenzymzubereitungen Sialinsäure auf die Galaktosekomponente an der Position 6 übertrugen, um eine 2,6-Bindung zu bilden.
(4) Solubilisiertes Enzym
Allgemein gesagt ist jegliches Protein in der Überstandslösung aus einer Zentrifugation bei 100.000 × g für 1 h als solubilisiertes Protein definiert. Deswegen wurden die C2-Reihen-Organismen in LB-Penicillin-IPTG-Nährlösung unter Schütteln unter 150 Upm und bei 30°C gezüchtet und ein roher Enzymextrakt wurde aus den Zellen hergestellt, der durch Zentrifugation gesammelt wurde, mittels Schall-Zerstörung in 20 mM Cacodylatpuffer (pH 5,0). Die Zellsus pension, die durch Schallbehandlung zerstört wurde, wurde bei 100.000 × g für 1 h bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde bezüglich einer Sialyltransferaseaktivität gestestet. Die Enzymaktivität im Überstand betrug ungefähr 50% (120 Einheiten/l) der Gesamtenzymaktivität, die in Abschnitt (2) oben erzeugt wurde. Ein ähnliches Experiment mit Klonen A1- und A2-Reihen ergab keine wesentliche Enzymaktivität in der Überstandslösung von 100.000 × g für 1 h, bis ein Detergens in den Extraktionspuffer zugesetzt wurde. Es wurde konsequenterweise bestimmt, dass der C-terminale Anteil des Gens, das dieses Enzym codiert, der Bereich ist, der in die Bindung an Membranen involviert ist und dass es möglich ist, einen löslichen Typ von Sialyltransferase künstlich durch Deletieren dieses Anteils zu erzeugen.
(5) Sialyltransferaseaktivität im Überstandsmedium nach Wachstum einer C2-Transformante
Ein Transformantenstamm der C2-Reihen wurde in LB-Ampicillin-IPTG-Medium unter Schütteln bei 150 Upm bei 30°C gezüchtet. Wenn die Ablesung OD₆₀₀ 2,8 erreichte, wurden 970 ml Anteile des Wachstumsmediums aus der Kultur entfernt und die Sialyltransferaseaktivität wurde gemessen.
Die Sialyltransferaseaktivität wurde durch die Menge von [4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc gemessen, die auf das Akzeptorsubstrat Lactose vom Donorsubstrat CMP-[4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc übertragen wurde. Das Standardreaktionsgemisch bestand aus einer Enzymprobe in 20 mM Cacodylatnatriumpuffer (pH 5,0), der 70 nmol CMP-[4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc (642 cpm/nmol), der 1,25 μmol Lactose und 0,02% Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 25 μl enthielt. Die Enzymreaktion wurde bei 30°C für 3 min durchgeführt, zweifach für alle Messungen. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch durch Zusatz von 5 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) auf 2 ml verdünnt und auf eine Dowex 1 × 8 Säule (Phosphatform, 0,5 × 2 cm) aufgebracht. Das Eluat (2 ml) wurde direkt in einem Szintillationsvial gesammelt und bezüglich der Radioaktivität gemessen. Die Radioaktivität von [4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc im Eluat wurde durch einen Flüssigszintillationszähler gemessen, um die Menge des [4,5,6,7,8,9-¹⁴C]-NeuAc zu berechnen, das auf das Akzeptorsubstrat übernagen wurde. Eine Einheit (U) der Enzymaktivität wurde durch 1 . μmol Sialinsäure definiert, übertragen auf Lactose in 1 min unter den obigen Bedingungen.
Die Sialyltransferaseaktivität betrug wie beobachtet 12,98 U/l.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gen, das ein Protein mit der Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäurenreste 16-498 der SEQ ID NO:1 codiert.
Gen gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus folgendem (a) oder (b): (a) eine DNA umfassend die Nukleotidsequenz 46-1494 der SEQ ID NO:2, oder (b) eine DNA umfassend eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an die Nukleotidsequenz 46-1494 der SEQ ID NO:2 unter moderat stringenten Bedingungen unter Verwendung einer Vorwaschlösung (5 × SSC, 0,5% SDS und 0,1 mM EDTA) (pH 8,0) zu hybridisieren und wobei die Hybridisierung bei ungefähr 55°C, 5 × SSC über Nacht durchgeführt wird, und die ein Protein mit im Wesentlichen der gleichen β-Galaktosidase-α2,6-sialyltransferaseaktivität codiert.
Gen gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen des Weiteren eine Nukleotidsequenz umfasst, die die Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäurereste 499-X der SEQ ID NO:1, codiert, wobei X eine ganze Zahl von 500-675 einschließlich darstellt.
Expressionsvektor, der ein Gen eines der Ansprüche 1-3 umfasst.
Expressionsvektor gemäss Anspruch 4, der eine Signal-DNA-Sequenz umfasst, die von dem Wirt, der transformiert werden soll, abgeleitet ist.
Expressionsvektor gemäss Anspruch 4, der eine Signal-DNA-Sequenz umfasst, die die Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäurereste 1-15 der SEQ ID NO:1, codiert.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins, das das Züchten von Zellen eines Wirtsorganismus, die mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 4 bis 6 unter Bedingungen transformiert wurden, die den Zellen ermöglichen, dass sie β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferase exprimieren, und das Wiedergewinnen des β-Galaktosid-α2,6-sialyltransferaseproteins aus der Kultur umfasst.