ES2798373T3 - Transsialidasas de photobacterium mutadas - Google Patents
Transsialidasas de photobacterium mutadas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2798373T3 ES2798373T3 ES16806993T ES16806993T ES2798373T3 ES 2798373 T3 ES2798373 T3 ES 2798373T3 ES 16806993 T ES16806993 T ES 16806993T ES 16806993 T ES16806993 T ES 16806993T ES 2798373 T3 ES2798373 T3 ES 2798373T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cys
- amino acid
- phe
- tyr
- ser
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Una α2,6-transsialidasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1, y que comprende por lo menos uno de: - en la posición 156, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp; y/o - en la posición 161, un aminoácido seleccionado de Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly; y/o - en la posición 180, un aminoácido seleccionado de Asp, Asn, Gln; y/o - en la posición 186, un aminoácido seleccionado de Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr; y/o - en la posición 218, un aminoácido seleccionado de Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr; y/o - en la posición 222, un aminoácido seleccionado de Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His; y/o - en la posición 235, un aminoácido seleccionado de Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu; y/o - en la posición 242, un aminoácido seleccionado de Arg, His o Lys; y/o - en la posición 261, un aminoácido seleccionado de His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe; y/o - en la posición 315, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr o Cys; y/o - en la posición 342, un aminoácido seleccionado de Ser o Cys; y/o - en la posición 349, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr o Cys; y/o - en la posición 350, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe; y/o - en la posición 356, un aminoácido seleccionado de Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp; y/o - en la posición 438, un aminoácido seleccionado de Arg, His o Lys; en donde dichas posiciones se definen mediante la alineación de dicha secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1 usando un algoritmo de comparación.
Description
DESCRIPCIÓN
Transsialidasas de photobacterium mutadas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a transsialidasas de photobacterium modificadas con mutaciones particulares que tienen regioselectividad aumentada y/o termoestabilidad aumentada.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las a2,6-sialil transferasas de tipo salvaje se han aislado de bacterias marinas, como Photobacterium damselae JT0160 (US 5827714, US 6255094, Yamamoto et al. J. Biochem. 123, 94 (1998)), y posteriormente de Photobacterium sp. JT-ISH-224 (US 7993875, US 8187838, Tsukamoto et al. J. Biochem. 143, 187 (2008)) y posteriormente de P. leiognathi JT-SHIZ-145 (US 8187853, US 8372617, Yamamoto et al. Glycobiology 17, 1167 (2007)) y finalmente de P. leiognathi JT-SHIZ-119 (US 2012/184016, Mine et al. Glycobiology 20, 158 (2010)). Se ha descubierto que la a2,6-sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 y la a2,6-sialil transferasa truncada de Photobacterium damselae JT0160 también tienen actividad de sialidasa (US 2012/0184016, Mine et al. Glycobiology 20, 158 (2010), Cheng et al. Glycobiology 20, 260 (2010)). Sin embargo, estas a2,6-sialil transferasas de tipo salvaje no se han usado o no son completamente adecuadas para elaborar oligosacáridos sialilados, particularmente oligosacáridos de leche humana sialilados (HMO).
Por lo tanto, se han buscado mutantes de tales enzimas, preferiblemente que tuviesen una regioselectividad aumentada y/o una termoestabilidad aumentada, en particular para la síntesis enzimática de oligosacáridos sialilados, especialmente HMO sialilados.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una a2,6-transsialidasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1, y que comprende por lo menos uno de:
- en la posición 156, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr; y/o
- en la posición 161, un aminoácido seleccionado de Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly; y/o
- en la posición 180, un aminoácido seleccionado de Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp; y/o
- en la posición 186, un aminoácido seleccionado de Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218, un aminoácido seleccionado de Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222, un aminoácido seleccionado de Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235, un aminoácido seleccionado de Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242, un aminoácido seleccionado de Arg, His o Lys, preferiblemente His; y/o
- en la posición 261, un aminoácido seleccionado de His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 342, un aminoácido seleccionado de Ser o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 349, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys; y/o - en la posición 350, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356, un aminoácido seleccionado de Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe;
y/o
- en la posición 438, un aminoácido seleccionado de Arg, His o Lys, preferiblemente His;
en donde dichas posiciones se definen mediante la alineación de dicha secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1 usando un algoritmo de comparación.
Por consiguiente, esta invención se refiere a una a2,6-transsialidasa mutada o modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1, y tiene las siguientes mutaciones (la posición de la mutación corresponde a alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr; y/o
- en la posición 161 está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly; y/o - en la posición 180 está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp; y/o
- en la posición 186 está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His; y/o
- en la posición 261 está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 342 está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 349 está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o - en la posición 356 está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; y/o
- en la posición 438 está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His.
Las proteínas mutadas de acuerdo con la invención muestran actividad de transsialidasa y/o sialil transferasa, preferiblemente una actividad de a2,6-transsialidasa y/o a2,6-sialil transferasa.
Ventajosamente, la secuencia de aminoácidos que debe mutarse de acuerdo con esta invención para tener una actividad de a2,6-transsialidasa y/o a2,6-sialil transferasa con regioselectividad mejorada es la de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, particularmente la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15.
Más ventajosamente, la a2,6-transsialidasa mutada tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 y que es preferiblemente la de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15, que se ha mutado en lo siguiente posiciones de aminoácidos (la posición de la mutación corresponde a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
y/o
- en la posición 161 Gln o Pro está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly; y/o
- en la posición 180 Glu está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp, y/o
- en la posición 186 Ala o Gly está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 Ala o Ser está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn o Ser está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 Lys o Thr está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 Val o Leu está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His; y/o
- en la posición 261 Arg o Ile está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 Leu está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 342 Thr está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356 Tyr está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; y/o - en la posición 438 Pro está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His.
Incluso más ventajosamente, la secuencia de aminoácidos de la a2,6-transsialidasa mutada es la de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15 que está mutada en las siguientes posiciones de aminoácidos (la posición de mutación corresponde a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Cys o Tyr; y/o
- en la posición 161 Gln está sustituido por Phe o Gly; y/o
- en la posición 180 Glu está sustituido por Asp, y/o
- en la posición 186 Ala está sustituido por Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 Ala está sustituido por Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn está sustituido por Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 Lys está sustituido por Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 Val está sustituido por His; y/o
- en la posición 261 Arg está sustituido por Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 Leu está sustituido por Cys; y/o
- en la posición 342 Thr está sustituido por Cys; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 Gly está sustituido por Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356 Tyr está sustituido por Val o Phe; y/o
- en la posición 438 Pro está sustituido por His.
Aún más ventajosamente, la secuencia de aminoácidos de la a2,6-transsialidasa mutada es la de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15 que está mutada en por lo menos dos posiciones de aminoácidos (la posición de la mutación corresponde con la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1) de 156, 218, 222 y 349, particularmente por lo menos en tres posiciones de 156, 218, 222 y 349, más particularmente:
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Cys o Tyr; y/o
- en la posición 218 Ala está sustituido por Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn está sustituido por Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser o Cys.
La invención también se refiere a un proceso para sintetizar un carbohidrato sialilado, que comprende el paso de hacer reaccionar un donante de sialilo y un aceptor de carbohidratos en presencia de la a2,6-transsialidasa mutada (modificada) de la invención para transferir el residuo de sialilo del donante de sialilo al aceptor de carbohidratos.
La invención se refiere además al uso de la a2,6-transsialidasa mutada (modificada) de la invención para la preparación de un carbohidrato sialilado, preferiblemente un oligosacárido de leche humana sialilada que tiene un residuo 6-sialilo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Se pretende que las figuras siguientes ilustren adicionalmente la invención.
Figura 1: muestra las secuencias y la alineación de 3 a2,6-sialil transferasas: sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 truncada por su péptido señal (A2-15) (SEQ ID No. 1), sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 truncada por su péptido señal (A2-15) (SEQ ID No. 2) y sialil transferasa de P. damselae JT0160 truncada por su péptido señal (A2-15) (SEQ ID No. 3). Las secuencias se alinearon mediante el alineamiento múltiple de secuencias (MSA) usando CLUSTAL Omega (1.2.1) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
Figura 2: muestra las secuencias y la alineación de 2 a2,6-sialil transferasas: sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 truncada por su péptido señal (A2-15) (siendo la SEQ ID No. 1) y sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 truncada por su péptido señal (A2-15) (SEQ ID No. 2). Las secuencias se alinearon mediante alineamiento de secuencias por parejas usando EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).
Figura 3: muestra las secuencias y la alineación de 2 a2,6-sialil transferasas: sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 truncada por su péptido señal (A2-15) (siendo la SEQ ID No. 1) y sialil transferasa de P. damselae JT0160 truncada por su péptido señal (A2-15) (SEQ ID No. 3). Las secuencias se alinearon mediante alineamiento de secuencias por parejas usando EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se ha descubierto ahora que las cuatro sialil transferasas de photobacterium mencionadas anteriormente, pero truncadas por sus péptidos señal, concretamente la sialil transferasa A2-15 truncada de P. leiognathi JT-SHIZ-119, la sialil transferasa A2-15 truncada de P. leiognathi JT-SHIZ-145, y la sialil transferasa A2-17 truncada de Photobacterium sp. JT-ISH-224, muestran una actividad de transsialidasa además de su actividad de sialil transferasa, es decir, son capaces de transferir el residuo de sialilo de un oligosacárido sialilado a un aceptor por transialización. Esto se ha demostrado en una reacción en la que 6'-SL sirvió como donante de sialilo y LNnT sirvió como aceptor de sialilo para producir LNnT sialilado. Aunque la reacción es estereoselectiva, es decir solo son detectables los productos a2,6-sialilados, la regioselectividad es pobre, ya que cualquiera de los dos residuos de
galactosilo de LNnT, o ambos, están sialilados (Esquema 1). El compuesto A es LST c, un oligosacárido sialilado que se encuentra en la leche humana, mientras que los compuestos B y C no son oligosacáridos naturales de la leche humana.
Esquema 1
La sialil transferasa A2-15 truncada de P. leiognathi JT-SHIZ-145 produjo una relación de producto molar de compuesto A: compuesto B: compuesto C “ 46:53:1 con -17% de conversión total después de 4 horas. De igual manera, la sialil transferasa A2-15 truncada de P. damselae JTO160 (no parte del alcance) produjo los tres productos sialilados con una ligera preferencia por el compuesto A, y la sialil transferasa A2-17 truncada de Photobacterium sp. JT-ISH-224 y la sialil transferasa A2-15 truncada de P. leiognathi JT-SHIZ-119 también produjeron los tres productos sialilados con una preferencia más fuerte por el compuesto A en comparación con la enzima de P. damselae JT0160. En todas estas reacciones no se detectó hidrólisis significativa.
Sorprendentemente, ahora también se ha descubierto que ciertas a2,6-transsialidasas mutadas artificialmente muestran, en reacciones de transsialidación, una regioselectividad mejorada hacia la fracción de galactosilo terminal frente a una fracción de galactosilo interna del aceptor en comparación con la enzima original de tipo salvaje (no mutado) que tiene actividad de a2,6-transsialidasa y/o a2,6-sialil transferasa de la que provienen los mutantes. Específicamente, tales mutantes de a2,6-transsialidasa muestran mejor regioselectividad hacia el compuesto A y, en consecuencia, proporcionan una proporción significativamente más alta de compuesto A con respecto al compuesto B y/o el compuesto C.
Por consiguiente, un primer aspecto de la invención se refiere a una a2,6-transsialidasa mutada que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID No. 1, y que ha mutado (es decir, un aminoácido ha sido reemplazado por otro aminoácido) en una o más posiciones de aminoácidos (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1) de la siguiente manera:
- 156 que está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
- 161 que está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly;
- 180 que está sustituido por Asp, Asn, Gin, preferiblemente Asp;
- 186 que está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; - 218 que está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr;
- 222 que está sustituido por Gin, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe;
- 235 que está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val;
- 242 que está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His;
- 261 que está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; - 315 que está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys;
- 342 que está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys;
- 349 que está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys;
- 350 que está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys;
- 356 que está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; o
- 438 que está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la sialil transferasa de P. leiognathi JTSHIZ-119 truncada por su péptido señal (A2-15).
Las a2,6-transsialidasas mutadas definidas anteriormente muestran una regioselectividad mejorada en comparación con la enzima original de tipo salvaje (no mutada) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la SEQ ID No. 1 u otras enzimas correspondientes del tipo salvaje (no mutadas) que tienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID No. 1, y de la cual provienen las enzimas de tipo salvaje de los mutantes.
Además, las a2,6-transsialidasas mutadas de acuerdo con la invención muestran no solo actividad de una transsialidasa, preferiblemente de una a2,6-transsialidasa, sino también actividad de una sialil transferasa, preferiblemente de una a2,6-sialil transferasa.
De acuerdo con esta invención, los términos "identidad sustancial" y "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos significan preferiblemente que las dos o más secuencias son iguales o tienen por lo menos aproximadamente un 90% de residuos de aminoácidos en común cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o secuencias designadas de aminoácidos (es decir, las secuencias tienen por lo menos un 90 por ciento (%) de identidad). El porcentaje de identidad puede medirse usando algoritmos de comparación de secuencias BLAST 2.0 con parámetros predeterminados, o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A este respecto, la posición de una mutación en la secuencia de en la secuencia de aminoácidos de las transsialidasas modificadas (mutadas) de la invención con referencia a la SEQ ID No. 1 significa que la posición se define mediante la alineación de la secuencia de transsialidasa de prueba con la SEQ ID No. 1 usando un algoritmo de comparación de secuencias de proteínas o mediante la alineación manual y la inspección visual mencionadas anteriormente. Ejemplos de tales secuencias alineadas se muestran en las Fig. 1-3. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad, la similitud de secuencia y la alineación es el algoritmo BlAST 2.2.20+, que se describe en Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25, 3389 (1997). El BLAST 2.2.20+ se usa para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para las proteínas de la invención. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ejemplos de algoritmos de alineación de secuencias son CLUSTAL Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) o MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).
Las a2,6-sialil transferasas preferidas de tipo salvaje con una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica con la SEQ ID No. 1, que tiene por lo menos aproximadamente un 90 por ciento de identidad de secuencia (determinado por BLAST) con la SEQ ID No. 1, se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1
Preferiblemente, las a2,6-sialil transferasas con una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la SEQ ID No. 1 que van a mutarse de acuerdo con esta invención para tener una actividad de a2,6-transsialidasa y/o a2,6-sialil transferasa con regioselectividad mejorada, son la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15, más preferiblemente la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15.
En la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 es preferiblemente la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15, que tiene las siguientes mutaciones (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
y/o
- en la posición 161 Gln o Pro está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly; y/o
- en la posición 180 Glu está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp, y/o
- en la posición 186 Ala o Gly está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 Ala o Ser está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn o Ser está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 Lys o Thr está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 Val o Leu está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His; y/o
- en la posición 261 Arg o Ile está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 Leu está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 342 Thr está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356 Tyr está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; y/o - en la posición 438 Pro está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His.
En la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 es una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1, más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, o la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2 -15, particularmente la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, y tiene mutación(es) en las siguientes posiciones de aminoácidos (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
y/o
- en la posición 161 Gln está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly;
y/o
- en la posición 180 Glu está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp, y/o
- en la posición 186 Ala o Gly está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys, o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 Ala está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn o Ser está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 Lys está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 Val está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His; y/o
- en la posición 261 Arg o Ile está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 Leu está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 342 Thr está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356 Tyr está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; y/o - en la posición 438 Pro está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His
Más preferiblemente, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 es la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, y está mutada en las siguientes posiciones de aminoácidos (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
y/o
- en la posición 161 Gln está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly;
y/o
- en la posición 180 Glu está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp, y/o
- en la posición 186 Ala está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 Ala está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 Lys está sustituido por Arg, His, Ser, Thr, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 Val está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His; y/o
- en la posición 261 Arg está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 Leu está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 342 Thr está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356 Tyr está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; y/o - en la posición 438 Pro está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His.
También preferiblemente, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID No.1 tiene por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres, mutaciones en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones de aminoácidos siguientes (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- 156 que está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
- 161 que está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly;
- 180 que está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp;
- 186 que está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu; - 218 que está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr;
- 222 que está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe;
- 235 que está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val; - 242 que está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His;
- 261 que está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val; - 315 que está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys;
- 342 que está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys;
- 349 que está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys;
- 350 que está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys;
- 356 que está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp, preferiblemente Val o Phe; y
- 438 que está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His.
Estas a2,6-transsialidasas mutadas se caracterizan por una regioselectividad incluso más mejorada hacia la fracción
de galactosilo terminal frente a una fracción de galactosilo interna del aceptor en comparación con las enzimas mutadas de un punto divulgadas anteriormente en reacciones de transsialidasa y/o sialil transferasa.
De acuerdo con una realización preferida, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID No.1 tiene por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres, mutaciones en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones de aminoácidos siguientes (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- sustitución del aminoácido en la posición 156 por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
- sustitución del aminoácido en la posición 218 por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr;
- sustitución del aminoácido en la posición 222 por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y
- la sustitución del aminoácido en la posición 349 por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys.
De acuerdo con una realización más preferida, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1, es preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15, y tiene por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres, mutaciones en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las siguientes posiciones como sigue (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr; - en la posición 218, Ala o Ser se sustituye por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr;
- en la posición 222 Asn o Ser se sustituye por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y
- en la posición 349, Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys.
De acuerdo con una realización aún más preferida, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 es preferiblemente la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, o la sialil transferasa de P. leiognathi JTSHIZ-145 o su variante truncada A2-15, y tiene por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres, mutaciones en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las siguientes posiciones (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr; - en la posición 218, Ala está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente mentira, Val, Phe o Tyr;
- en la posición 222 Asn o Ser está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y
- en la posición 349, Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys.
De acuerdo con una realización incluso más preferida, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 es preferiblemente la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, pero tiene por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres, mutaciones en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las siguientes posiciones como sigue (numeración correspondiente a alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- en la posición 156, Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
- en la posición 218, Ala está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Phe o Tyr;
- en la posición 222 Asn está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y
- en la posición 349, Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys.
De acuerdo con una realización especialmente preferida, en la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención, la secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1 es la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, y contiene las siguientes mutaciones: A218Y, N222R y G349S (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos
con la SEQ ID No. 1).
También de acuerdo con el primer aspecto de esta invención, la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención tiene:
a) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1, preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15.
b) , por lo menos una mutación en una posición de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las posiciones de aminoácidos siguientes (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- posición 156 donde Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
- posición 161 donde Gln o Pro está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly, preferiblemente Phe o Gly;
- posición 180 donde Glu está sustituido por Asp, Asn, Gln, preferiblemente Asp;
- posición 186 donde Ala o Gly está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr, preferiblemente Tyr, Cys o Leu;
- posición 218 donde Ala o Ser está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr;
- posición 222 donde Asn o Ser está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe;
- posición 235 donde Lys o Thr está sustituido por Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu, preferiblemente Arg, His, Cys o Val;
- posición 242 donde Val o Leu está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His;
- posición 261 donde Arg o Ile está sustituido por His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe, preferiblemente Asp, Phe, His o Val;
- posición 315 donde Leu está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Cys;
- posición 342 donde Thr está sustituido por Ser o Cys, preferiblemente Cys;
- posición 349 donde Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys;
- posición 350 donde Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe, preferiblemente Ser, Tyr, Phe o Cys;
- posición 356 donde Tyr está sustituido por Ala, Val, Ile, Leu, Phe o T rp, preferiblemente Val o Phe; y - posición 438 donde Pro está sustituido por Arg, His o Lys, preferiblemente His;
c) y una mutación adicional en las posiciones 353, 400, 412 o 450 a 458.
Sorprendentemente, también se ha descubierto que todas las a2,6-transsialidasas mutadas (como se ha tratado anteriormente), a la vez que proporcionan una regioselectividad mejorada como se ha mencionado anteriormente, muestran una estabilidad mejorada, preferiblemente termoestabilidad mejorada, que permite que la síntesis de un producto sialilado se lleve a cabo de manera eficaz en condiciones más estrictas, particularmente temperaturas más altas, lo que lleva frecuentemente a tiempos de reacción más rápidos. Las posiciones preferidas para las mutaciones con respecto a la termoestabilidad aumentada pueden seleccionarse de las posiciones de aminoácidos 353, 400, 412, 451, 452 y 458 (la posición de la mutación corresponde a la alineada con la SEQ ID No. 1), y las mutaciones particularmente preferidas pueden seleccionarse del grupo siguiente: K353I, S400Y, S412P, D451K, D451L, D451M, T452V, D458R y/o D458F.
Por consiguiente, una a2,6-transsialidasa mutada preferida de esta invención tiene:
a) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.1, preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, o la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15, más preferiblemente de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15,
b) por lo menos dos, preferiblemente tres mutaciones, en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones de aminoácidos siguientes (numeración correspondiente a la alineación de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1):
- posición 156 donde Gly está sustituido por Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp, preferiblemente Ser, Cys o Tyr;
- posición 218 donde Ala está sustituido por Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr, preferiblemente Ile, Val, Phe o Tyr;
- posición 222 donde Asn o Ser está sustituido por Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o
His, preferiblemente Cys, Asp, Arg o Phe; y
- posición 349 donde Gly está sustituido por Ser, Thr o Cys, preferiblemente Ser o Cys;
preferiblemente las siguientes mutaciones: A218Y, N222R y G349S, y
c) una mutación adicional en la posición 353, 400, 412 o 450 a 458.
Una a2,6-transsialidasa mutante más preferida de esta invención
a) es la sialil transferasa de Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, que
b) tiene las siguientes mutaciones: A218Y, N222R y G349S, y
c) tiene por lo menos una de las siguientes mutaciones: K353I, S400Y, S412P, D451 K, D451L, D451M, T452V, D458R y D458F.
Una a2,6-transsialidasa mutada incluso más preferida de esta invención es la sialil transferasa de Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15 que ha sido mutada de la siguiente manera: A218Y, N222R, G349S, S412P y D451 K.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para elaborar una a2,6-transsialidasa mutada del primer aspecto de la invención, que comprende los pasos de:
a) proporcionar una secuencia de ADN que codifica dicha a2,6-transsialidasa mutada, luego
b) expresar dicha a2,6-transsialidasa mutada en una célula huésped transformada con la secuencia de ADN obtenida en el paso a).
El paso a) puede llevarse a cabo de manera convencional elaborando una secuencia de ADN que codifique una a2,6-transsialidasa mutada de la invención. En el paso b), la secuencia de ADN así creada se introduce a nivel génico mediante métodos biológicos moleculares habituales. La secuencia de ADN de las variantes enzimáticas puede clonarse en un vector de expresión que puede introducirse en una cepa de expresión del huésped apropiada, como E. coli, que contiene plásmidos de a Dn con la información requerida para la regulación de la expresión de la variante de la enzima. La secuencia que codifica la variante enzimática puede colocarse bajo el control de un promotor inducible. Como resultado, añadiendo un inductor, puede controlarse la expresión de la variante enzimática (generalmente, se usa isopropil-p-O-tiogalactopiranosido (IpTg )). Las células huésped así transformadas se cultivan luego en medio nutritivo convencional (por ejemplo, caldo Lennox, medio mínimo M9) e inducido con IPTG. Después de la expresión, la biomasa puede recogerse por centrifugación. La enzima mutada puede aislarse de la biomasa después de una lisis y purificación celular apropiadas. En este proceso, pueden usarse métodos convencionales de centrifugación, precipitación, ultrafiltración y/o cromatográfica.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para sintetizar un sacárido o glicoconjugado sialilado haciendo reaccionar un donante de sialilo y un aceptor de sacárido o glicoconjugado en presencia de una a2,6-transsialidasa mutada del primer aspecto de la invención, por lo que el residuo de sialilo del donante de sialilo se transfiere al aceptor de sacárido o de glucoconjugado.
El aceptor de sacárido usado en el tercer aspecto de la invención puede ser cualquier mono- u oligosacárido, o el aceptor de glicoconjugado (como glicoproteínas, glicopéptidos, peptidoglicanos, glicolípidos, lipopolisacáridos, etc.) pueden comprender cualquier mono- u oligosacárido. El aceptor de oligosacárido o el fragmento de oligosacárido del aceptor de glicoconjugado comprende preferiblemente 2-10, más preferiblemente 2-6, particularmente 2-4 unidades de monosacárido, y preferiblemente contiene una unidad de galactosa, más preferiblemente una unidad de galactosa terminal en el extremo no reductor. Incluso más preferiblemente, dicha unidad de galactosa forma un fragmento de N-acetil-lactosaminilo (Galpp1-4GlcNAcp) o de lacto-N-biosilo (Galpp1-3GlcNAcp) con una N-acetilglucosamina adyacente o un fragmento de lactosilo con una unidad de glucosa cuya glucosa está ventajosamente en el extremo reductor. En particular, el aceptor de oligosacáridos es lactosa, o comprende una fracción de N-acetillactosaminilo o lacto-N-biosilo y es de fórmula 1
en donde Ri es fucosilo o H,
R2 se selecciona de grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo, en donde el grupo N-acetil-lactosaminilo puede llevar un residuo de glicosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos de sialilo y/o fucosilo, siempre que por lo menos un residuo de galactosilo de un grupo N-acetil-lactosaminilo o uno lacto-N-biosilo no esté sustituido,
R3 es un grupo H o N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con un residuo glucosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-lactosaminilo y/o uno o más lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo, siempre que por lo menos un residuo de galactosilo de un grupo N-acetil-lactosaminilo o uno lacto-N-biosilo no esté sustituido.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula 1 son de las fórmulas 1a o 1b
en donde R1 es como se ha definido anteriormente,
R2aa es un grupo N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con otro grupo N-acetil-lactosaminilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo puede estar sustituido con uno o más residuos de sialilo y/o fucosilo, pero preferiblemente sin un residuo de sialilo y/o fucosilo,
R3a es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo que puede estar sustituido con un grupo lacto-N-biosilo si R2a es un grupo N-acetil-lactosaminilo no sustituido; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos de sialilo y/o fucosilo, pero preferiblemente sin un residuo sialilo y/o fucosilo,
R2b es un grupo lacto-N-biosilo opcionalmente sustituido con un residuo de sialilo y/o fucosilo, pero preferiblemente sin un residuo de sialilo y/o fucosilo, y
R3b es un grupo N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con un grupo N-acetil-lactosaminilo, o con dos grupos N-acetil-lactosaminilo o con un grupo N-acetil-lactosaminilo y un grupo lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos des sialilo y/o fucosilo, pero preferiblemente sin un residuo de sialilo y/o fucosilo.
Más preferiblemente, los compuestos de fórmulas 1a y 1b tienen uno o más de los siguientes enlaces y modificaciones:
- al grupo N-acetil-lactosaminilo de R2a, si está sustituido, se le une otro grupo N-acetil-lactosaminilo por un enlace interglucosídico 1-3,
- el grupo lacto-N-biosilo, si está presente en R3a, se une al grupo N-acetil-lactosaminilo mediante un enlace interglucosídico 1-3,
- al grupo N-acetil-lactosaminilo de R3b, si está sustituido,
o se le une otro grupo N-acetil-lactosaminilo mediante un enlace interglucosídico 1-3,
o o se le unen dos grupos N-acetil-lactosaminilo mediante enlace interglucosídico un 1-3 y uno 1-6, y
o se le une un grupo lacto-N-biosilo mediante un enlace interglucosídico 1-3 y se le une un grupo N-acetillactosaminilo mediante un enlace interglucosídico 1-6.
Incluso más preferiblemente, el aceptor de carbohidratos usado en el tercer aspecto de la invención se selecciona del grupo que consiste de lactosa, lacto-N-neotetraosa (LNnT), Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4[Fuca1-3]Glc, lacto-N-hexaosa (LNH, Galp1-3GlcNAcp1-3[Galp1-4GlcNAcp1-6]Galp1-4Glc), lacto-N-neohexaosa (LNnH, Galp1-4GlcNAcp1-3[Galp1-4GlcNAcp1-6]Galp1 -4Glc), Fuca1-2Galp1-3GlcNAcp1-3(Galp1-4GlcNAcp1-6)Galp1-4Glc, Galp1-3[Fuca1-4]GlcNAcp1-3[Galp1-4GlcNAcp1-6]Galp1-4Glc, Galp1-4[Fuca1-3]GlcNAcp1-6[Galp1-4GlcNAcp1-3] Galp1-4Glc, Fuca1-2Galp1-3[Fuca1-4]GlcNAcp1-3(Galp1-4GlcNAcp1-6)Galp1-4Glc, Fuca1-2Galp1-4[Fuca1-3]
GlcNAcp1-6(Galp1-4GlcNAcp1-3)Galp1 -4Glc, NeuAca2-3Gaipi-3GlcNAcpi-3[Gaipi-4GlcNAcpi-6]Gaipi-4Glc, sialil-LNnH I (SLNnH-I, Galpi-4GlcNAcpi-3[NeuAca2-6Galpi-4GlcNAcpi-6]Galpi-4Glc), sialyl-LNnH II (SLNnH-II, Galp1-4GlcNAcp1-6[NeuAca2-6Galp1-4GlcNAcp1-3]Galp1 -4Glc), NeuAca2-3Galpi-3[Fuca1-4] GlcNAcpi-3(Galpi-4GlcNAcp1-6)Galp1 -4Glc, NeuAca2-6Galpi-4[Fuca1 -3] GlcNAcpi-3(Galpi-4GlcNAcpi-6)Galpi -4Glc, Galpi-4[Fuca1-3] GlcNAcp1-3(NeuAca2-6Galp1-4GlcNAcp1-6)Galp1-4Glc, y disialil-LNH II (DSLNH-II, Galpi-4GlcNAcpi-6[NeuAca2-3Galp1-3[NeuAca2-6]GlcNAcp1-3]Galp1-4Glc), ventajosamente lactosa, LNnT, Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4[Fuca1-3]Glc, LNH y LNnH.
Una a2,6-transsialidasa mutada del primer aspecto de la invención demuestra una fuerte selectividad para a2,6 y una fuerte regioselectividad cuando se lleva a cabo el método del tercer aspecto de la invención. No puede observarse ningún producto a2,3-sialilado. Como resultado, el producto de la reacción es un sacárido o glicoconjugado de a2,6-sialilo, preferiblemente un oligosacárido o un glicoconjugado de a2,6-sialilo que comprende un fragmento de oligosacárido de 2,6-sialilo, cuyo oligosacárido comprende preferiblemente 2-10, más preferiblemente 2-6, particularmente 2-4 unidades de monosacárido, y preferiblemente contiene una unidad de galactosa, más preferiblemente una unidad de galactosa terminal en el extremo no reductor. Preferiblemente, la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención lleva el residuo sialilo de un donante apropiado a la posición 6 de la galactosa terminal en el aceptor, más preferiblemente a la posición 6 de galactosa en lactosa, o, si el aceptor es de fórmula 1 anterior, específicamente a la posición 6 de la galactosa no sustituida terminal en un grupo N-acetillactosaminilo o uno lacto-N-biosilo. Por consiguiente, una a2,6-transsialidasa mutada de esta invención se usa preferiblemente para sintetizar HMO sialilados en los que el residuo de sialilo está unido a una galactosa con un enlace a2,6, preferiblemente los HMO sialilados enumerados en la Tabla 2 a continuación (para las abreviaturas ver Urashima et al. Milk Oligosaccharides, Nova Science Publishers, NY, 2011, Tabla 4 en pág. 14-25).
Tabla 2
El donante de sialilo usado en el tercer aspecto de la invención puede ser cualquier compuesto de sialilo del cual la a2,6-transsialidasa mutada de esta invención pueda transferir el residuo de sialilo a un aceptor de carbohidratos como se ha descrito anteriormente. Por consiguiente, en una reacción de transsialidasa, el donante de sialilo puede ser un sacárido de sialilo a2-6, preferiblemente de 3 o 4 unidades de monosacárido que incluyen el residuo de sialilo, más preferiblemente 6'-SL, o un compuesto de fórmula 2
en donde X se selecciona del grupo que consiste de azida, flúor, fenoxi opcionalmente sustituido, piridiniloxi opcionalmente sustituido, grupo A, grupo B, grupo C y grupo D
en donde Ra es independientemente H o alquilo, o dos grupos Ra adyacentes representan un grupo a=C(Rb)2 , en donde Rb es independientemente H o alquilo, Rc se selecciona independientemente del grupo que consiste de alcoxi, amino, alquilamino y dialquilamino, Rd se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo y -C(=O)Re , en donde Re es OH, alcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, hidrazino, alquilhidrazino, dialquilhidrazino o trialquilhidrazino, preferiblemente X en la fórmula 2 se selecciona del grupo que consiste de grupo fenoxi, p-nitrofenoxi, 2,4-dinitrofenoxi, 2-cloro-4-nitrofenoxi, 4,6-dimetoxi-1, 3,5-triazin-2-iloxi, 4,6-dietoxi-1, 3,5- triazin-2-iloxi, 2-etil-5-metil-3-oxo-(2H)-furan-4-iloxi, 5-etil-2-metil-3-oxo-(2H)-furan-4-iloxi y 2,5-dimetil-3-oxo-(2H)-furan-4-iloxi. Ventajosamente, el donante de sialilo es 6'-SL. Alternativamente, los sialoglicoconjugados naturales como la fetuina, el glicomacropéptido de caseína (cGMP) o el ácido polisálico, también son donantes de ácido siálico adecuados en las reacciones de transsialidasa. En las reacciones de sialil transferasa, el donante de sialilo es un derivado nucleotídico del ácido siálico, preferiblemente ácido CMP-siálico.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona el uso de una a2,6-transsialidasa mutada del primer aspecto de la invención para sintetizar un carbohidrato sialilado, preferiblemente un mono u oligosacárido a2-6-sialílico, más preferiblemente un HMO sialilado que tiene un residuo a2-6-sialilo, incluso más preferiblemente aquellos en los que el residuo de sialilo está unido a una fracción Gal, aún más preferiblemente aquellos en los que el residuo de sialilo está unido a una fracción Gal terminal, especialmente los HMO sialilados enumerados en el Tabla 2 anterior, particularmente 6'-SL, LST c, FLST c, SLNH, SLNnH-I, SLNnH-II o DSLNnH.
EJEMPLOS
En los ejemplos siguientes, se probaron mutantes de PP. leiognathi JT-SHIZ-119 sialil transferasa truncada por su péptido señal (A2-15), la(s) posición(es) de la mutación es/son de acuerdo con la SEQ ID No. 1.
Ejemplo 1 - mutantes de un solo punto
La determinación de la actividad se realizó en tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH = 6,0) a 30° C en una escala de 100-200 pl usando 50 mM de LNnT y 50 mM de 6'-SL con 1/10 volúmenes de extracto enzimático bruto. Se tomaron muestras (20 pl) en los puntos temporales proporcionaos a continuación. Las reacciones se detuvieron añadiendo 20 pl de una mezcla de acetonitrilo-formiato de amonio (10 mM, pH = 4.0) 4:1.
Posteriormente se añadieron 160 pl de agua destilada, las muestras se mezclaron de nuevo, se centrifugaron y se analizaron con HPLC (inyección de 5 pl). Se usó una columna Kinetix 2.6p HILIC 100A (150x4.6 mm) a una temperatura de horno de columna de 401 C con un caudal de 2,5 ml/min usando 81% de acetonitrilo y 19% de tampón de formiato de amonio (10 mM, pH = 4.0) como fase móvil. Los sustratos y productos eluidos se detectaron a 200 nm.
Para todos los cálculos, las áreas de pico de LNnT y los productos sialilados individuales (compuestos A, B y C, ver Esquema 1) se normalizaron de acuerdo con sus respectivos números de residuos de N-acetilo como sigue:
área de pico normalizada de LNnT = área de pico de LNnT
área de pico normalizada del compuesto A = 1Xárea de pico del compuesto A
área de pico normalizada del compuesto B = 1Xárea de pico del compuesto B
área de pico normalizada del compuesto C = ^á rea de pico del compuesto C
La selectividad se indica mediante el cálculo del porcentaje de producto de los compuestos A, B y C y se calcula como
producto [área de pico normalizada]
producto [%] = 100 • ^productos [área de pico normalizadaj+LNnT [área de pico normalizada]
Las concentraciones de productos individuales [mM] se calcularon como (suponiendo que la suma de la concentración de LNnT y de todos los productos es 50 mM):
producto [área de pico normalizada]
producto [%] = 50 ^productos [área de pico normalizada]+LNnT [área de pico normalizada]
La conversión total de LNnT a productos se calculó como:
conversión [%] = ^ • ^productos [mM],
La siguiente tabla muestra los porcentajes de productos generados por enzimas de tipo salvaje y mutantes dados después de 24 horas. Las conversiones fueron del 46-67%.
Todos los imitantes produjeron una cantidad reducida de subproductos (compuestos B y C).
Ejemplo 2 - mutantes multipunto
La determinación de la actividad se realizó como se describe en el Ejemplo 1, y las muestras se tomaron típicamente después de 1, 2, 4 y 24 horas. La selectividad se demuestra por la pureza del producto del compuesto A (calculado como
100
compuesto A [mM]
compuesto A [mM]+ compuesto B [mM]+ compuesto C [mM] ■)
en función de la conversión en la tabla siguiente.
Ejemplo 3 - mejora de la termoestabilidad de mutantes multipunto
La termoestabilización de mutantes multipunto se verificó mediante la determinación de la temperatura de fusión (Tm) de curvas de inactivación. La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que permanece el 50% de la actividad inicial de los restos enzimáticos después de 15 min de incubación a temperaturas elevadas.
La determinación de la actividad residual se realizó como se describe en el Ejemplo 1. La concentración de mutantes y de tipo salvaje se normalizó por lo tanto al mismo nivel. Las temperaturas de fusión de los mutantes se enumeran en la tabla siguiente.
Ejemplo 4 - Demostración de la actividad sialil transferasa y transsialidasa de un mutante de acuerdo con la invención
El mutante A218Y-N222R-G349S-S412P-D451K de sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 truncada por su péptido señal (A2-15) (las posiciones de las mutaciones son de acuerdo con la SEQ ID No. 1) se probó en reacciones de sialil transferasa y transsialidasa.
La determinación de la actividad se realizó en tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH = 6,0; condición A) o en medio tipo E. coli in vivo (KCI = 125 mM, K3PO4 = 25 mM, glutamato monosódico = 10 mM, CaCh = 1 pM, MgSO4 = 5 mM,
Claims (15)
1. Una a2,6-transsialidasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1, y que comprende por lo menos uno de:
- en la posición 156, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln o Trp; y/o
- en la posición 161, un aminoácido seleccionado de Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp o Gly; y/o
- en la posición 180, un aminoácido seleccionado de Asp, Asn, Gln; y/o
- en la posición 186, un aminoácido seleccionado de Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Cys o Thr; y/o - en la posición 218, un aminoácido seleccionado de Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Cys, Gly o Thr; y/o - en la posición 222, un aminoácido seleccionado de Gln, Asp, Glu, Cys, Thr, Phe, Tyr, Trp, Arg, Lys o His;
y/o
- en la posición 235, un aminoácido seleccionado de Arg, His, Ser, Cys, Ala, Val, Ile o Leu; y/o
- en la posición 242, un aminoácido seleccionado de Arg, His o Lys; y/o
- en la posición 261, un aminoácido seleccionado de His, Lys, Asp, Glu, Ala, Val, Leu o Phe; y/o
- en la posición 315, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr o Cys; y/o
- en la posición 342, un aminoácido seleccionado de Ser o Cys; y/o
- en la posición 349, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr o Cys; y/o
- en la posición 350, un aminoácido seleccionado de Ser, Thr, Cys, Tyr, Trp o Phe; y/o
- en la posición 356, un aminoácido seleccionado de Ala, Val, Ile, Leu, Phe o Trp; y/o
- en la posición 438, un aminoácido seleccionado de Arg, His o Lys;
en donde dichas posiciones se definen mediante la alineación de dicha secuencia de aminoácidos con la SEQ ID No. 1 usando un algoritmo de comparación.
2. La a2,6-transsialidasa de la reivindicación 1 que tiene una regioselectividad mejorada en una reacción de transsialidación en comparación con una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID No. 1.
3. La a2,6-transsialidasa de la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1 es la de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, o la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-145 o su variante truncada A2-15.
4. La a2,6-transsialidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1 es la de la sialil transferasa de P. leiognathi JT-SHIZ-119 o su variante truncada A2-15, y mutada en las posiciones de aminoácidos siguientes:
- en la posición 156 Gly está sustituido por Ser, Cys o Tyr; y/o
- en la posición 161 Gln está sustituido por Phe o Gly; y/o
- en la posición 180 Glu está sustituido por Asp, y/o
- en la posición 186 Ala está sustituido por Tyr, Cys o Leu; y/o
- en la posición 218 Ala está sustituido por Ile, Val, Phe o Tyr; y/o
- en la posición 222 Asn está sustituido por Cys, Asp, Arg o Phe; y/o
- en la posición 235 Lys está sustituido por Arg, His, Cys o Val; y/o
- en la posición 242 Val está sustituido por His; y/o
- en la posición 261 Arg está sustituido por Asp, Phe, His o Val; y/o
- en la posición 315 Leu está sustituido por Cys; y/o
- en la posición 342 Thr está sustituido por Cys; y/o
- en la posición 349 Gly está sustituido por Ser o Cys; y/o
- en la posición 350 Gly está sustituido por Ser, Tyr, Phe o Cys; y/o
- en la posición 356 Tyr está sustituido por Val o Phe; y/o
- en la posición 438 Pro está sustituido por His.
5. La a2,6-transsialidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una mutación en por lo menos dos de las posiciones de aminoácidos siguientes: 156, 218, 222 y 349.
6. La a2,6-transsialidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que tiene las siguientes mutaciones: A218Y, N222R y G349S.
7. La a2,6-transsialidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene además una mutación en las posiciones de aminoácidos 353, 400, o 450-458.
8. La a2,6-transsialidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que tiene las siguientes mutaciones A218Y, N222R, G349S, S412P y D451K.
9. Un proceso para elaborar una a2,6-transsialidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende los pasos de:
a) proporcionar una secuencia de ADN que codifica dicha a2,6-transsialidasa, luego
b) expresar dicha a2,6-transsialidasa en una célula huésped transformada con la secuencia de ADN obtenida en el paso a).
10. Un método para sintetizar un sacárido o glicoconjugado sialilado que comprende el paso de hacer reaccionar un donante de sialilo y un sacárido o glicoconjugado como aceptor en presencia de una a2,6-transsialidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para transferir el residuo de donante de sialilo al aceptor de sacárido o gliconjugado.
11. El método de la reivindicación 10, en donde el aceptor es un oligosacárido o glicoconjugado que comprende un oligosacárido, dicho oligosacárido tiene un residuo de galactosilo terminal en el extremo no reducto, y el residuo de sialilo es transferido por la a2,6-transsialidasa para unirlo en la posición 6 de dicho residuo de galactosilo.
12. El método de cualquiera de la reivindicaciones 10 a 11 que resulta en la formación de un oligosacárido de leche humana sialilado que tiene un residuo de galactosilo al que se une el residuo de sialilo con un enlace a2-6.
13. El método de la reivindicación 12, en donde dicho residuo de galactosilo en dicho oligosacárido de leche humana es una parte de un residuo de N-acetil-lactosaminilo.
14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el oligosacárido de leche humana es 6'-SL, LST c, FLST c, SLNH, SLNnHI, SLNnH-II, FSLNH, FSLNH-III, FSLNnH-I, FSLNnH-II, DFSLNH-I, DFSLNnH, DSLNH-I o DSLNnH.
15. El uso de una a2,6-transsialidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un sacárido o glicoconjugado sialilado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15171175 | 2015-06-09 | ||
| PCT/IB2016/053410 WO2016199069A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-06-09 | Mutated sialidases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2798373T3 true ES2798373T3 (es) | 2020-12-11 |
Family
ID=53365908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16806993T Active ES2798373T3 (es) | 2015-06-09 | 2016-06-09 | Transsialidasas de photobacterium mutadas |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10428318B2 (es) |
| EP (1) | EP3307882B1 (es) |
| DK (1) | DK3307882T3 (es) |
| ES (1) | ES2798373T3 (es) |
| WO (1) | WO2016199069A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11142541B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-10-12 | Glycom A/S | Purification of oligosaccharides |
| AU2018305183A1 (en) * | 2017-07-26 | 2020-02-13 | Chr. Hansen HMO GmbH | Sialyltransferases and their use in producing sialylated oligosaccharides |
| CA3087529A1 (en) | 2018-01-03 | 2019-07-11 | Palleon Pharmaceuticals Inc. | Recombinant human sialidases, sialidase fusion proteins, and methods of using the same |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5827714A (en) | 1994-12-07 | 1998-10-27 | Japan Tobacco Inc. | β-galactoside-α-2, 6-sialyltransferase, and a process for producing from Photobacterium |
| JP3140976B2 (ja) | 1997-02-28 | 2001-03-05 | 日本たばこ産業株式会社 | β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子 |
| WO2007105305A1 (ja) | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Japan Tobacco Inc. | 新規なβ－ガラクトシド－α２，６－シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子およびその製造方法 |
| CA2679703A1 (en) | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Japan Tobacco, Inc. | A novel .beta.-galactoside-.alpha.2,6-sialyltransferase, a gene encoding thereof, and a method for enhancing enzyme activity |
| US20120184016A1 (en) | 2009-06-12 | 2012-07-19 | Toshiki Mine | Novel protein and gene that codes therefor |
| JP2013531049A (ja) * | 2010-07-16 | 2013-08-01 | グリコム アー／エス | オリゴ糖の誘導体化 |
| CA2835989A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Glycom A/S | Diversification of human milk oligosaccharides (hmos) or precursors thereof |
| KR101574952B1 (ko) * | 2013-04-11 | 2015-12-07 | 서울대학교 산학협력단 | α-2,3 및 α-2,6 시알산 전이효소의 변이체 탐색 방법 및 시알릴올리고당 생산에의 응용 |
| BR112015025951A2 (pt) | 2013-04-12 | 2017-10-17 | Univ Danmarks Tekniske | sialidase mutante com atividade trans-sialidase, para uso em produção de glicanos sialilados |
| KR101755430B1 (ko) * | 2014-09-25 | 2017-07-27 | 한국생명공학연구원 | 개선된 효율을 갖는 시알산전달효소를 이용한 당단백질의 당사슬에 시알산을 부가하는 방법 |
-
2016
- 2016-06-09 US US15/579,843 patent/US10428318B2/en active Active
- 2016-06-09 WO PCT/IB2016/053410 patent/WO2016199069A1/en active Application Filing
- 2016-06-09 ES ES16806993T patent/ES2798373T3/es active Active
- 2016-06-09 EP EP16806993.8A patent/EP3307882B1/en active Active
- 2016-06-09 DK DK16806993.8T patent/DK3307882T3/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK3307882T3 (da) | 2020-05-18 |
| WO2016199069A1 (en) | 2016-12-15 |
| US10428318B2 (en) | 2019-10-01 |
| EP3307882A4 (en) | 2019-01-09 |
| EP3307882B1 (en) | 2020-04-15 |
| US20180163185A1 (en) | 2018-06-14 |
| EP3307882A1 (en) | 2018-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4397955B2 (ja) | ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物の生合成のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒグリコシルトランスフェラーゼ | |
| US20220243237A1 (en) | Sialyltransferases and uses thereof | |
| US9688954B2 (en) | Metabolically engineered microorganisms | |
| CA2441570C (en) | Campylobacter glycosyltransferases for biosynthesis of gangliosides and ganglioside mimics | |
| US10415021B2 (en) | Mutated fucosidase | |
| JP2008259515A6 (ja) | ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物の生合成のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒグリコシルトランスフェラーゼ | |
| JPWO2017010559A1 (ja) | 新規ＥｎｄｏＳ変異酵素 | |
| JP2008259516A6 (ja) | ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物の生合成のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒグリコシルトランスフェラーゼ | |
| JP2005533525A (ja) | 細菌グリコシルトランスフェラーゼを用いたオリゴ糖、糖脂質、及び糖タンパク質の合成 | |
| US20070202578A1 (en) | Production of globosides oligosaccharides using metabolically engineered microorganisms | |
| ES2798373T3 (es) | Transsialidasas de photobacterium mutadas | |
| Mizanur et al. | Bacterial CMP-sialic acid synthetases: production, properties, and applications | |
| Talafová et al. | A semi-multifunctional sialyltransferase from Bibersteinia trehalosi and its comparison to the Pasteurella multocida ST1 mutants | |
| Gurung et al. | Characterization of the sialic acid synthase from Aliivibrio salmonicida suggests a novel pathway for bacterial synthesis of 7-O-acetylated sialic acids | |
| Ming et al. | Effect of acceptor chain length and hydrophobicity on polymerization kinetics of the Neisseria meningitidis group C polysialyltransferase | |
| Schoenhofen et al. | Biosynthesis of legionaminic acid and its incorporation into glycoconjugates | |
| WO2020040257A1 (ja) | 改変ホスホリラーゼを利用したラクト－Ｎ－ビオースＩまたはガラクト－Ｎ－ビオースのβグリコシドの酵素合成法 | |
| US20140349339A1 (en) | PmST3 ENZYME FOR CHEMOENZYMATIC SYNTHESIS OF ALPHA-2-3-SIALOSIDES | |
| US11891598B2 (en) | Means and methods for producing phosphate containing capsular polysaccharides | |
| Schwardt et al. | Minireview: bacterial sialyltransferases for carbohydrate synthesis | |
| WO2016136984A1 (ja) | エンドｍ変異体、及びｎ結合型糖鎖含有化合物又はｎ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法 | |
| Banana-Dube | Investigation of a polyprenyl/dolichyl phosphate mannose synthase involved in bacterial protein mannosylation | |
| Chen et al. | Asp141 and the hydrogen-bond chain Asp141–Asn109–Asp33 are respectively essential for GT80 sialyltransferase activity and structural stability | |
| Zhang | Functional Studies of Fucosyltransferases and Enzymes Involved in N. meningitidis Capsular Polysaccharide (CPS) Synthesis | |
| Nadat | Characterization of sialate-O-acetylesterases in the gut commensal bacterium Bacteroides thetaiotamicron |