KR20140021974A - 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물 - Google Patents

사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 D-사이코스 3-에피머화 효소는 과당의 3번째 탄소 위치를 에피머화하여 사이코스를 생산하는 탁월한 활성을 보유한 효소로써, 이 효소의 산업적으로 유용한 넓은 범위의 pH, 높은 온도에서의 안정성을 특징으로 산업화에 적용한다면 경제성이 높은 사이코스의 대량생산이 가능하며, 기능성 당산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품소재, 의약용, 화장품용 소재 등 유용하게 사용될 수 있다.

Description

사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물 {COMPOSITION FOR CONVERTING FRUCTOSE INTO PSICOSE, AND METHOD FOR PRODUCING PSICOSE USING THE SAME}
본 발명은 트리포네마 프리미티아(Treponema primitia) 유래의 사이코스 3- 에피머화 효소, 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물 및 사이코스 생산방법에 관한 것이다.
D-사이코스(D-psicose)는 과당(fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)로써 설탕과 비교했을 때 70% 감미도를 갖지만(Oshima 2006) 에너지는 0.3% 밖에 없으므로 다이어트 식품의 저칼로리 감미료로 적용 가능한 기능성 단당류이다(Matsuo et al. 2002). 또한 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식품, 수신용 음식품 등에 응용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부지방 축적 억제를 할 수 있으므로 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다(Matsuo et al. 2001; Iida et al. 2008; Hayashi et al. 2010; Hossain et al. 2011).
위와 같은 특징으로 사이코스는 설탕을 대체 할 수 있는 좋은 소스이나 사이코스는 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에 식품산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 생산하는 방법이 필요하다. 기존의 사이코스 생산 방법으로는 주로 화학적 과정을 거쳐 생산되었다. 빌릭(Bilik)등은 몰리브산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당에서 사이코스로 전환하는 방법을 제안하였다. 맥도날드(McDonald)는 1,2:4,5-디-δ-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노스(1,2:4,5-di-δ-isopropylidene-beta-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 사이코스를 생산하였다. 또한 도너 (Doner)는 에탄올과 트리메틸아민과 함께 과당을 가열하여 사이코스를 생산하였다. 그러나 이들 화학적 생산방법에는 비용이 많이 소모되는 반면 그 효율은 낮고 또한 부산물들이 많이 발생한다는 단점이 있다.
생물학적 사이코스 생산방법으로는 미생물의 세포반응을 이용하여 갈락티톨 (galactitol), D-타가토스 또는 D-탈리톨 등으로부터 사이코스를 생산하는 방법이 제안되었다(Ken Izumori). 그러나 이 방법은 기질이 희소당에 속하기 때문에 산업적 생산에 응용하기 힘들다. 산업화에 가장 효율적인 방법은 D-케토오스 3-에피머화효소 군 중 과당에서 사이코스로 전환하는 효소를 찾는 방법이다. 기존에 발표된 내용은 크로스트리디움 셀루로리티쿰 H(10)(Mu et al. 2011), 아그로박테리움 투메패시언스(Kim et al. 2006), 슈도모나스 치코리(Itoh at al. 1994), 리조비움 스페로이데스 (Zhang et al. 2009) 유래의 D-타가토스 3-에피머화 효소를 대장균에 삽입하여 형질전환 시킨 후 형질전환 된 대장균에서 발현된 D-타가토스 3-에피머화 효소를 사용하여 과당에서 사이코스를 생산하였다.
그러나 기존의 기능이 밝혀진 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 방법은 중온 및 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타낸다. 알칼리 조건하에서의 반응은 비특이적 반응과 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않다. 또한 기존의 효소들은 높은 온도에서 안정성이 떨어지거나 느린 반응속도적 측면으로 인해 산업화에 적용되는 사이코스 생산의 제조원가를 상승하는 요인을 가지고 있는 문제가 있었다. 그러므로 사이코스의 생산 수율, 온도, pH 및 반응 속도 모두가 산업화에 적합한 신규한 D-사이코스 3-에피머화 효소 개발이 요구된다.
이에 본 발명은 기존에 기능이 밝혀지지 않은 단백질로서, 산업적으로 반응이 용이한 온도 (약 50~60 ℃)에서 반응 속도가 빠르고, 안정성이 뛰어난 특성을 가짐으로써 사이코스 산업적 생산분야에 적용하기에 적합한 D-사이코스 3-에피머화 효소 활성을 갖는 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 및 이를 이용하여 사이코스를 생산하는 새로운 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 현재까지 그 기능이 밝혀지지 않은 폴리뉴클레오사이드 중 아그로박테리움 투메패시엔스 또는 로도박터 스페로이데스와 촉매활성 잔기는 일치 하지만 전체 아미노산 서열은 40~60% 정도의 상동성이 있는, 비 병원성인 루미노코코스 속, 크로스트리디움 속, 트레포네마 속, 파라코코스 속, 시트레이셀라 속, 시노리조비움 속에 포함되는 미생물에서 케토오스 3-에피머화 효소의 활성을 스크리닝 한 결과, 그 중 트레포네마 프리미티아 ZAS-1가 가지고 있는 유전자 중에서 과당을 사이코스로 전환할 수 있는 효소를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 최초로 밝힐 수 있었으며, 이에 따라 안전한 단백질 과발현을 위하여 최적화한 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하고 이를 일정한 벡터에 삽입하고 발현시켜 고효율로 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 갖는 효소를 확보하였다.
또한, 본 발명자는 상기 효소의 특정 위치에 존재하는 전하가 없는 아미노산을 전하를 띠는 산성 아미노산 및/또는 염기성 아미노산으로 치환한 경우에, 상기 효소의 활성을 그대로 유지하면서 높은 발현율을 갖는, 특히 수용성 단백질로 발현하는 효율을 향상된 단백질 변이체를 제조할 수 있었다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 제공한다.
상기 효소 단백질은 바람직하게는 트리포네마 프리미티아(Treponema primitia)로부터 유래된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 트리포네마 프리미티아(Treponema primitia) ZAS-1로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 효소는 생화학적 기능은 알려져 있지 않지만 염기서열의 특성만으로 자일로스 이성화효소로 명명되어 있었으나, 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 갖는 효소를 스크리닝 하면서 상기 효소가 과당의 3번째 탄소 위치에서 에피머화 반응을 일으켜 사이코스로 전환할 수 있는 기능을 가짐을 발견하게 되었다.
따라서 바람직하게는 상기 효소 단백질은 과당의 3번 탄소 위치를 에피머화함으로써 과당을 사이코스로 전환하는 것일 수 있다.
상기 효소 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 과당을 사이코스로 전환시켜줄 수 있는 활성이 유지되는 한, 이에 한정되지 않고 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 또는 소실된 경우 등을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 32 내지 34 킬로달톤(kDa)일 수 있고, 최적 온도는 50 내지 65 ℃이며, 이는 바람직하게는 pH 7에서 1mM Co2 + 이온의 존재 하에 5분간 반응 진행시 측정한 것이나 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 효소단백질의 최적 pH는 최적 pH가 6.0 내지 9.0일 수 있으며, 이는 60 ℃에서 1mM Co2 + 이온의 존재 하에 5분간 반응 진행시 측정된 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 서열번호 1 내지 4중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 다음의 특성중 하나 이상을 보유한 것일 수 있다:
(a) 단량체의 분자량이 32 내지 34 kDa,
(b) 최적온도가 50 내지 65 ℃, 및
(c) 최적 pH가 6.0 내지 9.0.
또한 상기 효소 단백질은 금속이온에 의해 활성화가 조절되는 특성을 가지며, 바람직하게는 망간 및 코발트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속의 이온, 보다 바람직하게는 Mn2 + 및/또는 Co2 + 이온에 의해 활성이 증가되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 상기 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질의 일예로서 효소 단백질의 특정위치에서 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유발하여 제조된 효소 단백질이 변이체를 제공한다. 이러한 효소 변이체는, 최적 온도는 바람직하게는 pH 7에서 1mM Co2 + 이온의 존재 하에 5분간 반응 진행시 50 내지 65 ℃ 일 수 있다. 또한 60 ℃에서 1mM Co2 + 이온의 존재 하에 5분간 반응 진행시 최적 pH가 6.0 내지 9.0 특성을 만족할 뿐만 아니라, 또한 수용성 단백질로 발현율이 향상된 특성을 가진다.
상기 효소 변이체의 바람직한 예는, 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 229번째 아미노산 및 264번째 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 치환된 것인 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 229번째 아미노산 및 264번째 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 구체적인 효소 변이체의 예는, 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 229번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 단백질 (A229E 단독 변이체), 264번째 아미노산이 아스파르트산으로 치환된 단백질(N264D 단독 변이), 또는 아미노산 서열의 229번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고 264번째 아미노산이 아스파르트산으로 치환된 효소 단백질(A229E/ N264D 이중 변이체)이다. A229E 단독 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며, N264D 단독 변이는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며, A229E/ N264D 이중 변이체는 서열번호 4을 가진다.
본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4중어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 과당의 사이코스로의 전환용 조성물을 제공한다.
상기 유전자는 바람직하게는, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것일 수 있으나, 상기한 염기서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 상기 변이 효소 단백질을 암호화하는 유전자로서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 가지며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 가지며, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 98%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
상기 유전자는 그 자체로, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 목적한 유전자 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 상기 유전자 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 적정 핵산 서열은 전사 및 번역 종결인자(terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론 및 T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.
상기 벡터 시스템은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421).
상기 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 상기 효소 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.
보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하고 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된, 사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에서 ?滑珦恍?은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 말한다.
상기 벡터를 안정적이며 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 형질전환 대상 미생물로는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이용할 수 있으며, 예컨대 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등의 다양한 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사 속 균, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균(E. coli) (기탁번호 KCCM 11295P)일 수 있다.
상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 효소 단백질은 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 효소 단백질이다. 따라서, 상기 효소 단백질 또는 이를 발현하는 재조합 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 예는, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4중에서 선택된 의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 제조용 조성물을 제공한다. 상기 사이코스 제조용 조성물은 과당을 기질로 하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것으로, 상기 재조합 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 재조합 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명의 다른 일 구현예는 다른 예는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4중에 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물 (이하, '효소 단백질 등')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담 체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.
상기 재조합 미생물의 배양은 사용되는 미생물의 특성에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양조건하에서 이루어질 수 있다. 배양 방법은 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양 방법 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양에 사용되는 배지는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등이 될 수 있다.
상기 배양물은 일반적으로 대장균을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 35? 내지 37?에서 상기 재조합 미생물을 150 내지 250rpm에서 진탕배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한 바람직하게는 이때 온도를 14 ℃ 내지 30 ℃로 하여 단백질 과발현을 유도 할 수 있다.
상기 균체는 상기 미생물의 배양물에 대해 원심분리, 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균체를 균질화시키고 원심분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 분리 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다.
예컨대, 회수된 균체를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 니켈-NTA 컬럼(Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 200mM 이미다졸의 농도로 목적 단백질을 회수할 수 있다.
상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물(기질 및 단백질 모두을 포함) 기준으로 0.005 unit/ml 내지 10 unit/ml, 0.05unit/ml내지 10 unit/ml, 0.1 unit/ml 내지 10 unit/ml, 0.1 unit/ml 내지 5 unit/ml, 0.5 unit/ml내지 5.0 unit/ml, 또는 0.5 unit/ml 내지 2.0 unit/ml일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.
또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 0.1 내지 100mg(dcw)/ml, 0.1 내지 50mg(dcw)/ml, 0.1 내지 10mg(dcw)/ml, 1 내지 100mg(dcw)/ml, 1 내지 50mg(dcw)/ml, 1 내지 10mg(dcw)/ml, 2 내지 100 mg(dcw)/ml, 2 내지 50mg(dcw)/ml, 2 내지 10 mg(dcw)/ml, 3 내지 100mg(dcw)/ml 3 내지 50mg(dcw)/ml, 또는 내지 3 내지 10mg(dcw)/ml 일 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은, 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 반응 단계 이전에 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 준비 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은 서열번호 1 내지 서열번호 4중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 발현하는 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 반응 단계 이전에 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양 및 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 과당과 반응시키는 단계는 바람직하게는 상기 효소 단백질의 최적 활성화 조건하에 이루어질 수 있다. 즉, 바람직하게는 pH 6.0 내지 9.0에서 이루어질 수 있으며, 또한 바람직하게는 50 ℃ 내지 65 ℃의 온도 조건하에 이루어지는 것일 수 있다. 또한 상기 효소 단백질을 포함하는 균체를 사용할 경우 바람직하게는 과당과 반응시키기 전에 상기 회수된 균체를 예컨대, 0.85%(w/v) NaCl 등을 사용하여 2회 이상 세척하여 사용할 수 있다.
또한, 효소 농도에 따라서 달라지지만, 대체적으로 반응시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 효소의 열안정성(예컨대, 50 ?에서의 열안정성)을 고려하여, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 8 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 8시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 8시간, 1 내지 6시간, 1 내지 4시간, 1 내지 2시간, 2 내지 8시간, 또는 2 내지 6시간으로 할 수 있다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.
상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 5~60%(w/v), 보다 바람직하게는 10~40%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다. 상기 범위로 과당을 사용함으로써 보다 경제적이며 효율적으로 사이코스를 생산할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 과당과 반응시키는 단계는 망간 및 코발트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속의 이온을 더욱 첨가하여 이루어질 수 있다. 상기 금속 이온은 바람직하게는 0.1 내지 2mM, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5mM로 첨가할 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우 활성 증가 효과를 충분히 얻을 수 없으며, 상기 범위를 초과할 경우 사용되는 양에 비해 얻게 되는 활성 증대 효과가 미미하여 바람직하지 않다. 상기 금속 이온은 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온이 배양물에 첨가되거나 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수 있다.
상기 사이코스 생산방법은 이후 생산된(과당으로부터 전환된) 사이코스를 회수하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 사이코스를 회수하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
한편, 상기 과당은 바람직하게는 경제적 측면으로 고려하여 전화효소에 의해 분해된 설탕에서 얻어지거나 또는 액상과당에 의하여 획득한 것일 수 있다.
이 경우, 상기 사이코스 생산은 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 사이코스 3-에피머화 효소를 설탕 전화효소와 함께 사용하여 이루어짐으로써 경제성을 보다 높일 수 있다.
본 발명에 따른 트레포네마 프리미티아 ZAS-1 유래의 D-사이코스 3-에피머화 효소는 과당의 3번째 탄소 위치를 에피머화하여 사이코스를 생산하는 탁월한 활성을 보유한 효소로써, 이 효소의 높은 온도에서의 빠른 사이코스 전환속도와 안정성을 특징으로 산업화에 적용한다면 경제성이 높은 사이코스의 대량생산이 가능할 것이다. 그러므로 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소와 사이코스 생산방법은 기능성 당 산업뿐 만 아니라 이를 이용한 건강식품소재, 의약용, 화장품용 소재 등 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 재조합 사이코스 3-에피머화 효소 발현용 재조합 DNA를 포함하는 발현벡터 pET-TDPE를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소의 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소의 금속이온의 효과를 분석한 도면이다.
도 4는 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소의 최적 온도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소의 최적 pH를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 고농도 과당에서 생물전환에 의한 사이코스를 생산 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 사이코스 3-에피머화 효소를 함유하고 있는 재조합 균주를 이용하여 고농도 과당에서 생물전환에 의한 사이코스 생산 결과를 나타내는 도면이다.
(A) 5.4 mg-균체건조중량/ml 반응부피의 대장균과 400 g/L 과당과의 반응
(B) 2.7 mg-균체건조중량/ml 반응부피의 대장균과 100 g/L 과당과의 반응
도 8은 전화효소를 사용하여 설탕을 분해한 결과를 나타낸 그림이다. 이때 설탕은 과당과 포도당으로 분해된다.(■40% (w/v) 설탕, ◆50% (w/v) 설탕, ▲60% (w/v) 설탕, ● 70% (w/v) 설탕)
도 9는 본 발명에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 3차원 구조를 나타내는 도면으로서, A 229와 N 264의 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 10은 실시예 4에서 제조된 변이형 사이코스 3-에피머화 효소 발현용 재조합 DNA를 포함하는 발현벡터 pET21a-mutantTDPE를 나타내는 도면이다.
도 11는 실시예 5에서 정제된 변이체 사이코스 3-에피머화 효소의 kinetics를 보여주는 도면이다.
도 12는 실시예 5에서 정제된 변이체 사이코스 3-에피머화 효소의 금속이온의 효과를 분석한 도면으로서, 효소농도가 2 unit/ml에서 수행한 결과이다.
도 13는 실시예 5에서 정제된 변이체 사이코스 3-에피머화 효소의 최적 온도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14은 실시예 5에서 정제된 변이체 사이코스 3-에피머화 효소의 최적 pH를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15은 실시예 4에서 제조된 A229E 단독 변이효소, N264D 단독 변이 효소, 및 A229E/ N264D 이중 변이 사이코스 3-에피머화 효소와, 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소 (야생형)의 활성을 각각 나타낸다.
도 16은 실시예 4에 따라 제조된 A229E 단독 변이효소, N264D 단독 변이 효소, 및 A229E/ N264D 이중 변이 사이코스 3-에피머화 효소와, 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소 (야생형)의 발현여부를 나타내는 배양액 상등액의 SDS-PAGE 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 17는 실시예 4에 따라 제조된 A229E 단독 변이효소, N264D 단독 변이 효소, 및 A229E/ N264D 이중 변이 사이코스 3-에피머화 효소와, 실시예 1에서 수득한 상등액의 사이코스 3-에피머화 효소 (야생형)의 활성을 나타내는 그래프로서, 수용성 발현율을 의미한다.
도 18은 실시예 5에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 고농도 과당에서 생물전환에 의한 사이코스를 생산 결과를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.
실시예 1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주 제조
발현균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 트레포네마 프리미티아 ZAS-1로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였다.
합성된 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현 벡터인 pET21a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a/사이코스 3-에피머화 효소(pET-TDPE)를 제조하였다(도 1 참조). 이후 제조된 재조합 벡터로 heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 형질전환 하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 균주를 제조하였다. 제조된 재조합 균주는 E. coli pETTDPE SYC320로 명명하고 한국미생물보존센터(KCCM)에 2012년 8월 1일자로 기탁번호 KCCM 11295P로 기탁하였다.
형질전환된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕배양 한 후, 이 배양액을 500ml LB-ampicilline 배지에 접종, 37 ℃, 200rpm에서 진탕배양 하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 이때 과발현 유도시점부터 배양조건은 16 ℃, 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.
이후 원심분리기 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 균체를 이용한 사이코스 생산 및 효소정제에 사용하였다. 또한, 회수한 상등액은 효소 활성 특정을 위해 사용하였다.
실시예 2. D- 사이코스 3- 에피머화 효소 정제 및 특성 확인
D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 사이코스를 생산하기 위해서는 먼저 정제된 효소를 사용하여 효소의 특성을 정확히 결정해야 한다.
(1) D-사이코스 3-에피머화 효소의 정제
상기 실시예 1에서 회수된 균체를 lysis buffer(50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 10 mM imidazol)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4 ℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 파쇄액을 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow. Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0에 20 mM imidazol과 200 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 마지막 과정인 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 200 mM imidazol을 흘려줌으로써 목적 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50mM PIPES pH7.0)으로 전환하여 다음 실험에 사용하였다.
이 방법으로 부분 정제된 D-사이코스 3-에피머화 효소를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 33.2 킬로달톤(KD)인 것을 확인하였다. (도2 참조)
(2) D-사이코스 3-에피머화 효소의 금속이온 요구성 분석
상기 실시예 2에서 얻어진 D-사이코스 3-에피머화 효소에 대해서도 역시 금속이온이 영향을 미치는지 알아보았다.
상기 정제된 효소에 CuCl2, MnCl2, CaCl2, ZnSO4, MgSO4, NiSO4, CoCl2를 각각 1 mM씩 처리하고, 아무것도 처리하지 않은 효소(대조군: Non)와 활성을 비교하여 도 3에 나타냈다. 이때 반응은 50 mM 과당, 효소 0.5 unit/ml이 50mM PIPES 완충용액 (pH7.0)에서 60℃, 5분간 반응한 것을 측정한 것이다. 100℃에서 5분간 가열하여 효소활성을 중지시켰다. 효소 활성은 기질인 50mM 과당과 1mM Co2 + 을 함유한 50mM PIPES 완충용액 pH7.0, 60 ℃에서 효소를 반응시켜 분당 1 μmol의 사이코스를 생산하는 양을 1unit으로 정의하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 효소는 망간이온과 코발트이온 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 기존의 효소와 마찬가지로 금속 이온 요구성이 있음을 알 수 있었다.
(3) D-사이코스 3-에피머화 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성 분석
실시예 2의 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성을 살펴보기 위하여, 먼저 pH 7에서 30-80 ℃까지 측정해본 결과 도 4에 나타난 바와 같이 상기 효소는 50 내지 65℃ 범위에서 높은 활성을 나타냈으며, 특히 60 ℃에서 최대 활성을 보임을 알 수 있었다.
또한 pH 변화에 따른 활성을 알아보기 위해, 60 ℃에서 50mM sodium acetate pH4-6, 50 mM sodium citrate pH5-7, 50mM PIPES pH7, 50 mM Tris-HCl pH7-9, 50 mM glycine NaOH pH9-10의 완충용액을 각각 사용하여, 최대 활성을 나타내는 pH을 살펴본 결과 도 5에 나타난 바와 같이, pH6.0-9.0 범위에서 80% 이상의 높은 활성을 보였으며, 그 중 pH7.0에서 활성이 특히 높게 나타났다. 또한 pH7.0에 해당되는 완충용액 중에서도 PIPES 완충용액에서 활성이 최대로 나타나 해당 완충용액에서 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다.
이 때 활성측정은 50 mM 과당, 1 mM CoCl2, 효소 0.5 unit/ml으로 각각의 pH와 온도 범위에서 이루어졌으며, 100 ℃에서 5분간 가열하여 효소활성을 중지시켰다.
(4) D-사이코스 3-에피머화 효소의 기질 특이성 분석
50 mM의 과당, 사이코스, 포도당, 자일로스, 타가토스를 각각 기질로 하여 10 mM 기질, 1 mM CoCl2, 효소 0.5 unit/ml으로 50 mM PIPES 완충용액 pH7.0, 60℃에서 5분간 반응하여 각각의 기질에 대한 활성 정도를 측정하였다. 100 ℃에서 5분간 가열하여 효소활성을 중지시켰다.
그 결과 하기 표 1에서와 같이 상기 기질 중 사이코스와 과당에서만 높은 활성을 보였으며, 특히 사이코스의 기질특이성이 과당과 비교했을 때 약 38% 높은 것으로 나타났다. 기존에 알려진 케토오스 3-에피머화 효소는 타가토스와 솔보스 그리고 사이코스와 과당에 반응성이 있는 것에 비하여 본 발명의 효소는 사이코스와 과당에만 특이적이게 반응하는 특징이 있어 기존에 알려진 효소와 기질 특이성이 상이함을 확인할 수 있었다.
Fructose Psicose Tagatose Mannose Glucose Xylose
Relative activity (%) 100 138 - - - -
(5) D-사이코스 3-에피머화 효소의 반응속도(Kinetic parameter) 분석
실시예 2의 트레포네마 프리미티아 ZAS-1 유래의 D-사이코스 3-에피머화 효소와 기존에 발표된 타가토스 3-에피머화 효소의 과당에 대한 기질 친화도와 효소 반응속도를 비교하여 본 발명의 효소 특성을 살펴보기 위해 kinetic parameter 분석을 실시하였다 (Zhu Y. et . al.(2012), Kim HJ. et . al.(2006), Mu W. et . al .(2011))
과당을 기질로 5-300 mM 사이의 기질 농도에서 활성을 측정하였고 효소는 0.5 unit/ml의 정제된 단백질을 사용하여 1 mM의 CoCl2 첨가조건에서 60?, 50 mM PIPES 완충용액 pH7.0에서 효소 활성을 측정하였고, 100 ℃에서 5분간 가열하여 효소활성을 중지시켰다.
이 결과 효소 반응속도를 단량체로 계산 했을 경우 과당의 Km 값은 56 mM이고 kcat은 7246.2 min-1이었으며, 사이코스의 Km은 13.7 mM이고 kcat은 5700 min-1이었다. 즉 과당에 대한 본 발명의 사이코스 3-에피머화 효소의 과당에 대한 촉매효율(catalytic efficiency)은 129로써, 기존에 발표된 사이코스 3-에피머화 효소 중 촉매효율이 가장 높은 것으로 보고된 아그로박테리움 투메패시언스 유래의 사이코스 3-에피머화 효소의 촉매효율인 85보다도 약 1.5배 이상 높은 것으로 측정되어 실시예 2의 효소는 과당에서 사이코스로의 전환 활성이 가장 높은 효소임을 알 수 있다.
그러므로 본 발명의 효소는 산업적으로 반응이 용이한 온도 (약 50~60 ℃)에서 반응 속도가 빨라 사이코스 생산 속도 측면에서 가장 우월한 잇점을 가지고 있어 사이코스 산업화에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.
실시예 3. D-사이코스 3-에피머화 효소에 의한 사이코스 생산
(1) 고농도 과당에서 생물전환에 의한 사이코스 생산
실시예 2에서 얻어진 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 고농도의 사이코스를 생산하기 위하여 상기에서 구해진 최적화 조건 60 ℃, 50 mM PIPES pH 7하에 400 g/L의 과당과 5~50 unit/ml의 효소를 반응시켰다. 그 결과 효소 50 Unit/ml에서 최종 128 g/L의 사이코스를 생산하여 고농도의 과당에서도 사이코스 전환율 30.2%를 획득 할 수 있었다. (도 6 참조)
(2) 효소가 포함된 균체 반응에 의한 사이코스 생산
상기 실시예 1에서 회수된 균체를 이용하여 사이코스를 생산하기 위해 상기 (1)과 동일하게 효소의 최적 조건 60?, 50 mM PIPES pH 7하에서 반응을 실시하였다. 5.4 또는 2.7 mg-균체건조중량/ml 반응부피의 대장균과 400 또는 100 g/L 과당을 각각 반응시킨 결과, 400 g/L의 과당에서는 5.4 mg-균체건조중량/ml 반응부피의 조건에서 약 3시간 이후 반응이 거의 완료되었으며 116 g/L의 사이코스를 생산하여, 전환율은 약 29%를 보였다(도 7의 A 참조). 100 g/L의 과당에서는 2.7 mg-균체건조중량/ml 반응부피의 조건에서 약 2시간 이후 반응이 거의 완료되었으며 29 g/L의 사이코스를 생산하여, 전환율은 약 29%를 보였다. (도 7의 B 참조)
(3) 전환효소를 이용한 설탕의 분해
상기 실시예 2의 효소의 기질로 사용되는 과당은 전화효소에 의해 분해된 설탕에서 얻어지거나 또는 액상과당에 의하여 획득하는 것이 산업화의 경제적 측면을 고려해 보았을 때 우월 할 것이다.
40~70%(w/v)의 설탕을 65 ℃에서 30mg/L 전화 효소(Novozyme), pH4.5에서 약12 시간 동안 반응시켜, 각각의 설탕 함량을 초기에 100%인 것으로 환산하였을 때, 설탕이 전화효소에 의해 과당과 포도당으로 분해되는 것을 도 8에 나타냈다. 이 때 과당과 포도당은 1:1로 분해되며 다른 생성물은 생성되지 않는다.
도 8에 나타난 바와 같이, 설탕은 거의 대부분이 과당과 포도당으로 전환되었으며, 특히 최고 농도인 700g/L(70%(w/v))의 설탕을 반응시켰을 때, 전환당 중 과당 함유량은 35% 정도이므로, 산업화 측면을 고려해 보았을 때 전화당과 사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 설탕에서부터 사이코스를 생산하려고 할 때 과당의 농도는 400 g/L 이하가 적당하다고 판단되며, 이 농도에서 효소반응과 상기 효소가 포함된 균체 반응에 의해 29-32%의 전환율이 확인한 바 상기 효소에 의한 사이코스 생산이 산업적 적용에 적당하다고 판단된다.
실시예 4. 변이형 D-사이코스 3-에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주 제조
(1) 돌연변이 유발 설계에 대한 서열 분석
서열번호 1의 아미노산 서열을 ESyPred3D Web Server 1.0에 입력하고, PDB template는 2HK1(Protein DataBank)을 입력하여 서열번호 1 아미노산 서열에 해당하는 단백질의 3차원 구조를 예측하였다. 다른 사이코스 3-에피머화효소와 마찬가지로 β-sheet이 중심에 위치하고 그것을 α-helix 구조가 감싸고 있는 전형적인 TIM-Barrel 구조의 단백질이었다. 단백질이 수용성의 성질을 지니기 위해서는 용매(물)와 접촉하는 바깥 부분의 아미노산이 전하를 띠고 있어야 한다는 가정 하에 전하를 띠고 있지 않은 아미노산을 선별하였고, 효소의 사이코스 전환능에 영향을 줄 수 있는 단백질의 3차원 구조를 해치지 않으면서 수용성 발현율에 영향을 미칠 것으로 예상되는 잔기를 선별하였고, 그 중 A 229와 N 264의 아미노산 잔기가 도 9에 나타낸 바와 같다. 부위-지향성 돌연변이 잔기 선별의 기준은 1) 구조상으로 TIM-Barrel 구조의 바깥쪽에 위치하여야 하며, 2) 비수용성(hydrophobic)한 잔기여야 하는 것이었다. 비수용성 잔기를 전하를 띠는 산성 또는 염기성의 잔기로 치환하기로 하였고, A229E, N264D의 돌연변이체 제작 모델을 완성하였다.
(2) PCR에 의한 돌연변이 작제 및 cloning
사이코스 3-에피머화효소 돌연변이체는 종래의 연구로부터 적용된 quikchange(Stratagene) 부위-지향성 돌연변이 유발법을 사용하여 제작되었다. stratagene사의 quikchange 부위-지향성 돌연변이 유발법은 insert만을 PCR을 통해 증폭하고 플라스미드 DNA로 subcloning하는 방식이 아닌, plasmid DNA 전체를 PCR을 통해 증폭하고, template DNA는 DpnI 효소로 분해하는 방식을 사용한다. Quikchange 부위-지향성 돌연변이 유발법은 보다 빠르게 돌연변이를 유발할 수 있다는 장점이 있다. 복제를 하는 주형으로 사용된 DNA는 야생형 사이코스 3-에피머화 효소를 암호화 하는 DNA pET21a의 벡터 DNA에 클로닝 되어 있는 플라스미드 DNA다. 하기 제조된 변이형 사이코스 3-에피머화 효소 발현용 재조합 DNA를 포함하는 발현벡터 pET21a-mutant TDPE를 도 10에 나타냈다.
A229E 돌연변이체를 제작하기 위하여 주형 DNA 250ng, A229E forward 프라이머 125ng, A229E reverse 프라이머 125ng, pfu ultra high fidelity DNA polymerase 2.5ul, 10X 반응 버퍼 5ul, 10mM dNTP 1ul를 포함하는 최종 부피 50ul에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응은 GeneAmp PCR system 9700 에서 95 ℃(1분)에서 1회의 사이클, [95 ℃(50초), 60 ℃(50초), 68 ℃(6분)]의 18회의 사이클, 68 ℃(7분)에서 1회의 사이클을 포함한다. 돌연변이가 유발되지 않은 주형 DNA를 인식하여 분해하는 DpnI 효소를 PCR이 끝난 50ul 부피의 반응액에 500U(10U/ul) 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 처리한다.
N264D 돌연변이체를 제작하기 위하여 주형 DNA 250ng, N264D forward 프라이머 125ng, N264D reverse 프라이머 125ng, pfu ultra high fidelity DNA polymerase 2.5ul, 10X 반응 버퍼 5ul, 10mM dNTP 1ul를 포함하는 최종 부피 50ul에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응은 GeneAmp PCR system 9700 에서 95℃(1분)에서 1회의 사이클, [95 ℃(50초), 60 ℃(50초), 68 ℃(6분)]의 18회의 사이클, 68 ℃(7분)에서 1회의 사이클을 포함한다. 돌연변이가 유발되지 않은 주형 DNA를 인식하여 분해하는 DpnI 효소를 PCR이 끝난 50ul 부피의 반응액에 500U(10U/ul) 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 처리하였다.
A229E/N264D double 돌연변이체를 제작하기 위하여 주형 DNA는 N264D 돌연변이체를 사용하였다. A229E/N264D double 돌연변이체를 제작하기 위하여, N264D 돌연변이체 DNA 250ng, A229E forward 프라이머 125ng, A229E 역방향 프라이머 125ng, pfu ultra high fidelity DNA polymerase 2.5ul, 10X 반응 버퍼 5ul, 10mM dNTP 1ul를 포함하는 최종 부피 50ul에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응은 GeneAmp PCR system 9700 에서 95 ℃(1분)에서 1회의 사이클, [95 ℃(50초), 60 ℃(50초), 68 ℃(6분)]의 18회의 사이클, 68 ℃(7분)에서 1회의 사이클을 포함한다(표 3). 돌연변이가 유발되지 않은 주형 DNA를 인식하여 분해하는 DpnI 효소를 PCR이 끝난 50ul 부피의 반응액에 500U(10U/ul) 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 처리하였다.
변형된 프라이머를 위한 프라이머의 위치와 서열
명칭 서열 (5' --> 3') Tm(℃) 포함효소
A229E (서열번호9) CGTGGAACGAGATCGGTCACGCGCT 76 A229E
A229E (서열번호10) AGCGCGTGACCGATCTCGTTCCACG 76 A229E
N264D (서열번호11) AAGTTTGGCGTGACCTGCTGCCGGAAA 76 N264D
N264D (서열번호12) TTTCCGGCAGCAGGTCACGCCAAACTT 76 N264D
segment step cycles temperature(℃) time
1 Initialization 1 95 1 min
2 Denaturation 18 95 50 sec
2 Annealing 118 60 50 sec
2 Elongation 18 68 6 min (1min/kb of plasmid length)
3 Final Enlongation 1 68
(3) 형질 전환 및 발현
E. coli DH10B를 최초 숙주로서 사용하였다. 실시예 2 에서 기술한 PCR 반응액에 DpnI이 첨가 된 혼합액을 바로 DH10B에 형질 전환한다. PCR 반응액과 DpnI의 혼합 용액을 5ul 피펫팅 하여 초저온 냉동고에 보관되어있던 CaCl2법으로 제작된 competent cell인 DH10B 50ul에 heat shock 방법으로 형질 전환한다. LB-ampicillin 고체 배지에 도말하고 37 ℃에서 배양한다. 고체 배지 상에 생성된 콜로니 중에서 3개를 선별하여 3ml LB-ampicillin 액체 배지에서 배양한 후 miniprep kit(quiagen) 을 이용하여 plasmid DNA를 추출한다. 시퀀싱은 외부기관(제노텍, 한국)에서 실시하였으며, 그 결과 사이코스 3-에피머화 효소를 암호화 하는 DNA의 A229E, N264D, A229EN264D 부위에 돌연변이가 유발되었음을 확인하였다. 돌연변이 유발이 확인된 plasmid DNA는 냉동고에 보관되어있던 CaCl2법으로 제작된 competent cell인 E. coli BL21 solu (DE3) 50ul에 heat shock 방법으로 형질전환하였다. LB-ampicillin 고체 배지에 도말하고 37 ℃에서 배양하였다.
형질전환으로 획득한 사이코스 3-에피머화 효소 돌연변이를 암호화 하는 plasmid DNA를 포함하고 있는 E. coli BL21 solu (DE3)의 콜로니를 피킹하여 3ml LB-ampicillin 액체 배지에 접종하고 37 ℃에서 12시간 배양한다. 뿌옇게 자란 3ml 배양볼륨의 미생물을 1ml 피펫팅 하여 250ml 삼각 플라스크에 담긴 50ml의 LB-ampicillin 액체 배지에 접종하여 37 ℃에서 배양한다. 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때 IPTG가 0.1mM 되도록 induction을 한 후 16?에서 배양한다. 모든 배양은 200 rpm 교반 인큐베이터에서 이루어진다. 16?에서 배양한 지 12시간 후에 3500gX의 6? 에서 30분 동안 원심분리 하여 미생물을 회수하였다.
실시예 5. 변이 D-사이코스 3-에피머화 효소 정제 및 특성 확인
(1) 변이 효소의 정제
실시예 4에서 회수한 세포를 10ml 50mM Sodium phosphate 10mM imidazole pH8.0 용액에 100ul PMSF 를 넣고 고르게 현탁하여 sonicator로 (Sonifer II cell disrupture, NIRO-SOAVI), duty cycle 20, output control 2로 맞추어 놓고 15분간 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 8000 X g로 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 제거하고 상등액은 0.2 um 여과지로 여과하여 정제하는 것이 바람직한데, 이때 모든 정제 과정은 저온 챔버에서 진행한다. Bio-RAD poly-prep chromatography column에 Ni-NTA 레진을 1ml 충진한다. 레진 충진 부피의 10배인 10ml lysis 완충용액 (50mM Sodium Phosphate, 10mM imidazole pH8.0)을 컬럼에 적용하여 레진을 완충용액으로 평형상태를 만든다. 0.2um 여과지로 여과한 상등액을 컬럼에 적용한다. 50mM Sodium Phosphate, 10mM imidazole pH8.0 (washing I, lysis 와 완충용액 조성 동일) 10ml을 적용한다. 50mM sodium phosphate 20mM Imidazole pH8.0 (Washing II) 10ml을 적용한다. 충진 레진 부피의 3배 (3ml) 50mM Sodium Phosphate 200mM imidazole pH8.0으로 용출(elution)한다. Amicon Centricon에 단백질 용출액을 넣고 3000 X g에서 20분간 원심분리하여 단백질을 농축한다. 농축액에 25mM PIPES pH 7.0을 채우고 3000 X g에서 원심분리 하는 것을 5회 반복하여 완충용액을 25mM PIPES pH 7.0으로 교환한다.
(2) 변이 효소의 반응속도(Kinetic parameter) 분석
실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로, 과당의 농도를 5~500mM로 하여, 각각의 사이코스 생산량을 기반으로 기질 농도에 따른 초기 속도 (V0)값을 측정 하였다. 표 4는 각 과당 농도에 따른 초기 속도의 결과 값을 보여주며, 도11은 Saturation Kinetics에 대한 결과를 나타낸 그래프이다. 결과적으로 야생형 사이코스 3-에피머화효소와 돌연변이체의 초기 속도에 비하여 A229EN264D의 초기 속도는 증가, A229E, N264D의 초기 속도는 감소하는 양상을 보이지만, 양상을 보았을 때, 큰 차이는 없는 것으로 보인다.
[S](mM) Vo(μM/min)
야생형 A229E N264D A229E/N264D
5 113 105 87 109
7.5 141 141 141 139
10 171 156 167 170
25 316 281 276 385
50 488 405 449 613
100 673 556 579 853
250 766 669 639 717
500 915 879 868 938
초기 속도 값에 역수를 취한 값으로 Vmax 값과 Km 값을 구한 결과는 표5와 같다. 야생형 사이코스 3-에피머화 효소에 비해, A229E 돌연변이체의 Km값은 감소하였으나, N264D, A229EN264D의 돌연변이체의 Km 값은 증가하였으나. 야생형 사이코스 3-에피머화 효소의 고유한 특성을 유지하고 있다고 할 수 있다.
야생형 A229E N264D A229E/N264D
Vmax (uM/min) 789 610 791 973
Km(mM) 32 25 37 40
(3) 변이 효소의 금속 이온 요구성 분석
금속 이온 요구성 실험은 야생형과 변이 사이코스 3-에피머화 효소에 대해 효소 농도 2 unit /ml에서 실행하였으며, 구체적으로 MnCl2, ZnSO4, MgSO4, 및 CoCl2를 각각 1 mM씩 처리하고, 아무것도 처리하지 않은 효소(대조군: Non)와 활성을 비교하여 나타냈다. 이때 반응은 50 mM 과당, 효소 2 unit/ml이 50mM PIPES 완충용액 (pH7.0)에서 60 ℃, 5분간 반응한 것을 측정한 것이다. 100?에서 5분간 가열하여 효소활성을 중지시켰다. 효소 활성은 기질인 50 mM 과당과 1mM Co2 + 을 함유한 50mM PIPES 완충용액 pH7.0, 60 ℃에서 효소를 반응시켜 분당 1 μmol의 사이코스를 생산하는 양을 1 unit으로 정의하였다.
상기 실험결과 사이코스 생산량에 대한 결과는 도 12의 그래프로 보여주고 있다. 사이코스 3-에피머화 효소 (2 unit/ml) 첨가 실험에서는, 금속 이온을 넣지 않은 것에 비하여 활성은 모두 증가 하는 특징을 보이는 것을 알 수 있었는데, 실험 결과 Treponema primitia ZAS-1 유래의 사이코스 3-에피머화 효소와 다르게 그 돌연변이체 3종은 Co, Mn, Mg, Zn 이렇게 4종의 금속 이온에 활성을 보이는 특성을 지닌다.
(4) 변이 효소의 온도 및 pH변화에 따른 활성 분석
실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로, 변이 효소의 온도 및 pH 변화에 따른 활성분석을 수행하였다. 상기 사이코스 3-에피머화 효소의 야생형과 돌연변이체는 pH 6~9에서 활성을 나타내는데, 다른 사이코스 3-에피머화 효소와가 약알칼리에서 최적 활성을 보이는 것과는 달리, 중성 pH인 pH7과 비교적 산성인 pH에서도 우수한 활성을 보이는 것이 특징이다. (도 13)
상기 사이코스 3-에피머화 효소의 야생형과 돌연변이체는 65℃에서 최적 온도를 나타내는 특징을 지닌다. (도 14) 이는 공정온도가 60℃ 전후임을 감안할 때, 경제적으로 기존 사이코스 3-에피머화 효소에 비해 우수성을 지닌다고 할 수 있다.
(5) 변이 효소 활성과 부위-지향성 돌연변이 효과
50mM 과당, 1mM CoCl2, 25mM PIPES pH7.0 용액에 정제한 단백질의 최종 농도가 0.009mg/ml이 되도록 넣고 50 ℃의 항온 수조에서 반응하여 효소 활성을 측정 하였다. 측정결과를 하기 표 6 및 도 15에 나타냈다. 도 15는 실시예 4에서 제조된 A229E 단독 변이효소, N264D 단독 변이 효소, 및 A229E/ N264D 이중 변이 사이코스 3-에피머화 효소와, 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소 (야생형)의 활성을 각각 나타낸다.
야생형 사이코스 3-에피머화 효소는 46.4 unit/mg, A229E 돌연변이 사이코스 3-에피머화 효소는 50.5 unit/mg, N264D 돌연변이 사이코스 3-에피머화 효소는 48.6 unit/mg, A229E/N264D 사이코스 3-에피머화 효소는 53.7 unit/mg 의 활성을 보였다. 야생형 대비 돌연변이체 A229E는 1.09배, N264D는 1.04배, A229E/N264D는 1.15배 사이코스 전환 활성이 증가했다. 단, A229E 돌연변이, N264D 돌연변이 사이코스 3-에피머화 효소는 모두 야생형 사이코스 3-에피머화 효소와 비교할 때 그 활성이 오차범위 안에 있었으며, 야생형과 A229E/N264D 돌연변이 사이코스 3-에피머화 효소의 활성은 차이는 불과 0.8 unit/mg 이었다. 결국 A229E, N264D, A229E, N264D의 부위 지향성 돌연변이는 사이코스 3-에피머화 효소의 활성에 영향을 미치지 않는다고 할 수 있다.
　 야생형 A229E N264D A229E/N264D
정제 효소 활성(unit/mg) 46.4 ±5.5 50.5±4.0 48.6±5.0 53.7±1.1
(6) 수용성 발현율에 대한 부위-지향성 돌연변이 유발 효과
야생형과 A229E, N264D, A229E/N264D 돌연변이체의 발현양 증가 여부를 알아보기 위하여 상등액을 SDS-PAGE를 통하여 확인해 보았고, 그 결과는 도 16에 나타냈다. 도 16은 실시예 4에서 제조된 A229E 단독 변이효소, N264D 단독 변이 효소, 및 A229E/ N264D 이중 변이 사이코스 3-에피머화 효소와, 실시예 2에서 정제된 사이코스 3-에피머화 효소 (야생형)의 발현여부를 나타내는 배양액 상등액의 SDS-PAGE 분석결과를 나타내는 사진이다.
단량체 분자량은 33.2kDa 이며, 해당하는 돌연변이체의 밴드가 두꺼워졌음을 알 수 있다. 이는 돌연변이체의 수용성 발현율이 증대되었음을 의미한다. 발현율의 증가를 정량적으로 측정하기 위하여 상등액의 활성을 측정을 실시하였다. 50mM 과당, 1mM CoCl2, 25mM PIPES pH7.0 용액에 세포 상등액의 최종 농도가 0.09mg/ml이 되도록 넣고 50℃의 항온 수조에서 반응 하여 효소 활성을 측정하였다. 돌연변이체 A229E, N264D, A229E/N264D의 정제 효소의 활성이 야생형과 대비하여 오차 범위 내의 차이만을 보이는 반면, 세포를 파쇄하고 원심분리 한 상등액의 활성은 2배 이상의 차이를 보였다. 야생형은 1.5 unit/mg, 돌연변이체 A229E는 5.0 unit/mg, 돌연변이체 N264D는 3.2 unit/mg, 돌연변이체 A229E/N264D는 5.3 unit/mg 이었다.
종류 야생형 A229E N264D A229E /N264D
상등액 효소 활성(unit/mg) 1.5±0.14 5.0±0.77 3.2±0.16 5.3±0.45
상등액의 활성을 정제 단백질 활성 증가 비율로 나누어 수용성 발현율에 대한 부위-지향성 돌연변이의 유발효과를 측정하였다. 그 결과를 도 17의 그래프로 나타냈다. 도 17은 실시예 4에서 제조된 A229E 단독 변이효소, N264D 단독 변이 효소, 및 A229E/ N264D 이중 변이 사이코스 3-에피머화 효소와, 실시예 1에서 수득한 상등액의 사이코스 3-에피머화 효소 (야생형)의 활성을 나타내는 그래프로서 수용성 발현율을 의미한다.
야생형에 대비하여 A229E 돌연변이체의 수용성 발현율은 3.05배, N264D 돌연변이체의 수용성 발현율은 2.04배, A229E/N264D 돌연변이체의 수용성 발현율은 3.04배 증가 하였다(표 8). A229E 단독 돌연변이체의 수용성 발현율 증가가 N264D 단독 돌연변이체의 수용성 발현율 증가보다 1.5배 높았으며, A229E/N264D 이중 돌연변이체의 발현율은 A229E 단독 돌연변이체의 수용성 발현율에 준하는 수준으로 N264D가 추가적으로 주는 효과는 없었다.
　 A229E N264D A229E/N264D
야생형 대비 증가 X 3.05 X 2.04 X 3.04
결론적으로, 단백질이 용매(물)와 접하는 부분에 위치한 전하를 나타내지 않는 아미노산 잔기를 전하를 띄는 아미노산 잔기로 치환하면 수용성 발현율이 증대될 수 있음이 증명되었다. 단, 효소의 활성을 잃지 않고 수용성 발현율을 증대시키는 것이 효소 개량의 목표인데, 이러한 관점에서 A229E와 N264D, 이렇게 두 개의 자리는 효소의 활성을 유지하면서 수용성 발현율까지 증대시킬 수 있는 역할을 하는 유효한 잔기로 결론을 내릴 수 있다.
실시예 6. 변이 D- 사이코스 3- 에피머화 효소에 의한 사이코스 생산
변이 효소에 의한 고농도 과당에서 생물전환에 의한 사이코스 생산을 확인하고자, 실시예 3과 같이 변이 효소의 과당에서 사이코스 생산능 분석을 분석하였다.
상기 사이코스 3-에피머화 효소의 야생형과 돌연변이체의 고농도 과당에서 사이코스 생산능을 알아보기 위하여, E. coli BL21 (DE3) solu 1mg/ml, 과당 40% 수용액에서 전환능을 측정하였다. 구체적으로, 실시예 5에서 얻어진 변이형 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 고농도의 사이코스를 생산하기 위하여 60 ℃, 50 mM PIPES 완충용액 (pH 7)조건하에서 400 g/L의 과당과 5~50 unit/ml의 효소를 반응시켰다.
도 18은 고농도 과당에서의 사이코스 에피머화 효소와 야생형 돌연변이의 활성을 보여주고 있다. 발현율 증대가 가장 두드러진 A229EN264D의 돌연변이체에서 전환이 가장 빠르게 일어나며, A229E, N264D 역시 야생형보다 빠른 사이코스로의 전환을 보이며 전환율은 30%이다.
한국미생물보존센터 KCCM11295P 20120801
<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> COMPOSITION FOR CONVERTING FRUCTOSE INTO PSICOSE, AND METHOD FOR PRODUCING PSICOSE USING THE SAME <130> DPP20132799KR <150> KR 10-2012-0087883 <151> 2012-08-10 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of psicose 3-epimerase from Treponema primitia ZAS-1 <400> 1 Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Val Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Tyr Val Ser Asp Ser 35 40 45 Gln Leu Phe Asp Leu Arg Asp Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ser Ser Asp 65 70 75 80 Asn Arg Val Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Val Leu Gly 85 90 95 Lys Leu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Leu Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Leu Pro Ile Asp Lys Ala Gly Asp Trp 115 120 125 Lys Arg Ser Val Glu Asn Ile Arg Glu Ile Ala Ala Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Arg Asn Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Asn Thr Cys Glu Glu Gly Ile Lys Phe Val Asp Glu Val Asn 165 170 175 His Pro Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Met Ala Glu Ala Ile Arg Met Ala Gly Asp Lys Leu Gly 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gln Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Cys 210 215 220 Ile Pro Trp Asn Ala Ile Gly His Ala Leu Arg Asp Ile Arg Tyr Asn 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Lys Val Trp Arg Asn Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Thr 260 265 270 Ile Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Gly Ser Thr Ser Val Leu 290 295 <210> 2 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of modified psicose 3-epimerase(A229E) <400> 2 Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Val Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Tyr Val Ser Asp Ser 35 40 45 Gln Leu Phe Asp Leu Arg Asp Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ser Ser Asp 65 70 75 80 Asn Arg Val Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Val Leu Gly 85 90 95 Lys Leu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Leu Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Leu Pro Ile Asp Lys Ala Gly Asp Trp 115 120 125 Lys Arg Ser Val Glu Asn Ile Arg Glu Ile Ala Ala Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Arg Asn Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Asn Thr Cys Glu Glu Gly Ile Lys Phe Val Asp Glu Val Asn 165 170 175 His Pro Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Met Ala Glu Ala Ile Arg Met Ala Gly Asp Lys Leu Gly 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gln Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Cys 210 215 220 Ile Pro Trp Asn Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Asp Ile Arg Tyr Asn 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Thr 260 265 270 Ile Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Gly Ser Thr Ser Val Leu 290 295 <210> 3 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of modified psicose 3-epimerase(N264D) <400> 3 Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Val Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Tyr Val Ser Asp Ser 35 40 45 Gln Leu Phe Asp Leu Arg Asp Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ser Ser Asp 65 70 75 80 Asn Arg Val Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Val Leu Gly 85 90 95 Lys Leu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Leu Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Leu Pro Ile Asp Lys Ala Gly Asp Trp 115 120 125 Lys Arg Ser Val Glu Asn Ile Arg Glu Ile Ala Ala Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Arg Asn Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Asn Thr Cys Glu Glu Gly Ile Lys Phe Val Asp Glu Val Asn 165 170 175 His Pro Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Met Ala Glu Ala Ile Arg Met Ala Gly Asp Lys Leu Gly 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gln Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Cys 210 215 220 Ile Pro Trp Asn Ala Ile Gly His Ala Leu Arg Asp Ile Arg Tyr Asn 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Thr 260 265 270 Ile Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Gly Ser Thr Ser Val Leu 290 295 <210> 4 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of modified psicose 3-epimerase(A229E & N264D) <400> 4 Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Val Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Tyr Val Ser Asp Ser 35 40 45 Gln Leu Phe Asp Leu Arg Asp Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ser Ser Asp 65 70 75 80 Asn Arg Val Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Val Leu Gly 85 90 95 Lys Leu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Leu Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Leu Pro Ile Asp Lys Ala Gly Asp Trp 115 120 125 Lys Arg Ser Val Glu Asn Ile Arg Glu Ile Ala Ala Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Arg Asn Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Asn Thr Cys Glu Glu Gly Ile Lys Phe Val Asp Glu Val Asn 165 170 175 His Pro Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Met Ala Glu Ala Ile Arg Met Ala Gly Asp Lys Leu Gly 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gln Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Cys 210 215 220 Ile Pro Trp Asn Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Asp Ile Arg Tyr Asn 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Thr 260 265 270 Ile Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Gly Ser Thr Ser Val Leu 290 295 <210> 5 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psicose 3-epimerase from Treponema primitia ZAS-1 <400> 5 atgcagtacg gtatctactt cgcgtactgg accaaagaat ggcaggcgga ctacaaaaaa 60 tacatcgaca aagtttctaa actgggtttc gacatcctgg aaatctcttg cgcggcgctg 120 aaagaccagt acgtttctga ctctcagctg ttcgacctgc gtgactacgc gaaagaaaaa 180 ggtgttaccc tgaccgcggg ttacggtccg gcgaaaggtg aaaacctgtc ttcttctgac 240 aaccgtgttg ttaaaaacgc gaaagcgttc tacaaagacg ttctgggtaa actgaacaaa 300 ctggacatcc gtctgctggg tggtggtctg tactcttact ggccggttga ctactctctg 360 ccgatcgaca aagcgggtga ctggaaacgt tctgttgaaa acatccgtga aatcgcggcg 420 atcgcggcgg accgtaacgt tgttctgggt atggaagttc tgaaccgttt cgaaggttac 480 ctgctgaaca cctgcgaaga aggtatcaaa ttcgttgacg aagttaacca cccgaacgtt 540 aaagttatgc tggacacctt ccacatgaac atcgaagaag acaacatggc ggaagcgatc 600 cgtatggcgg gtgacaaact gggtcacttc cacatcggtg aacagaaccg taaagttccg 660 ggtaaaggtt gcatcccgtg gaacgcgatc ggtcacgcgc tgcgtgacat ccgttacaac 720 ggtaccgttg ttatggaacc gttcgttatg ccgggtggta ccatcggtca ggacatcaaa 780 gtttggcgta acctgctgcc ggaaacctct gaaaccatcc tggaccgtga cgcgaaaggt 840 gcgctggaat tcgttaaaca cgttttcggt tctacctctg ttctgctcga g 891 <210> 6 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified psicose 3-epimerase(A229E) <400> 6 atgcagtacg gtatctactt cgcgtactgg accaaagaat ggcaggcgga ctacaaaaaa 60 tacatcgaca aagtttctaa actgggtttc gacatcctgg aaatctcttg cgcggcgctg 120 aaagaccagt acgtttctga ctctcagctg ttcgacctgc gtgactacgc gaaagaaaaa 180 ggtgttaccc tgaccgcggg ttacggtccg gcgaaaggtg aaaacctgtc ttcttctgac 240 aaccgtgttg ttaaaaacgc gaaagcgttc tacaaagacg ttctgggtaa 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gtgactacgc gaaagaaaaa 180 ggtgttaccc tgaccgcggg ttacggtccg gcgaaaggtg aaaacctgtc ttcttctgac 240 aaccgtgttg ttaaaaacgc gaaagcgttc tacaaagacg ttctgggtaa actgaacaaa 300 ctggacatcc gtctgctggg tggtggtctg tactcttact ggccggttga ctactctctg 360 ccgatcgaca aagcgggtga ctggaaacgt tctgttgaaa acatccgtga aatcgcggcg 420 atcgcggcgg accgtaacgt tgttctgggt atggaagttc tgaaccgttt cgaaggttac 480 ctgctgaaca cctgcgaaga aggtatcaaa ttcgttgacg aagttaacca cccgaacgtt 540 aaagttatgc tggacacctt ccacatgaac atcgaagaag acaacatggc ggaagcgatc 600 cgtatggcgg gtgacaaact gggtcacttc cacatcggtg aacagaaccg taaagttccg 660 ggtaaaggtt gcatcccgtg gaacgagatc ggtcacgcgc tgcgtgacat ccgttacaac 720 ggtaccgttg ttatggaacc gttcgttatg ccgggtggta ccatcggtca ggacatcaaa 780 gtttggcgtg acctgctgcc ggaaacctct gaaaccatcc tggaccgtga cgcgaaaggt 840 gcgctggaat tcgttaaaca cgttttcggt tctacctctg ttctgctcga g 891 <210> 8 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified psicose 3-epimerase(A229E & N264D) <400> 8 atgcagtacg gtatctactt cgcgtactgg accaaagaat ggcaggcgga ctacaaaaaa 60 tacatcgaca aagtttctaa actgggtttc gacatcctgg aaatctcttg cgcggcgctg 120 aaagaccagt acgtttctga ctctcagctg ttcgacctgc gtgactacgc gaaagaaaaa 180 ggtgttaccc tgaccgcggg ttacggtccg gcgaaaggtg aaaacctgtc ttcttctgac 240 aaccgtgttg ttaaaaacgc gaaagcgttc tacaaagacg ttctgggtaa actgaacaaa 300 ctggacatcc gtctgctggg tggtggtctg tactcttact ggccggttga ctactctctg 360 ccgatcgaca aagcgggtga ctggaaacgt tctgttgaaa acatccgtga aatcgcggcg 420 atcgcggcgg accgtaacgt tgttctgggt atggaagttc tgaaccgttt cgaaggttac 480 ctgctgaaca cctgcgaaga aggtatcaaa ttcgttgacg aagttaacca cccgaacgtt 540 aaagttatgc tggacacctt ccacatgaac atcgaagaag acaacatggc ggaagcgatc 600 cgtatggcgg gtgacaaact gggtcacttc cacatcggtg aacagaaccg taaagttccg 660 ggtaaaggtt gcatcccgtg gaacgagatc ggtcacgcgc tgcgtgacat ccgttacaac 720 ggtaccgttg ttatggaacc gttcgttatg ccgggtggta ccatcggtca ggacatcaaa 780 gtttggcgtg acctgctgcc ggaaacctct gaaaccatcc tggaccgtga cgcgaaaggt 840 gcgctggaat tcgttaaaca cgttttcggt tctacctctg ttctgctcga g 891 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying modified psicose 3-epimerase(A229E) <400> 9 cgtggaacga gatcggtcac gcgct 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying modified psicose 3-epimerase(A229E) <400> 10 agcgcgtgac cgatctcgtt ccacg 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying modified psicose 3-epimerase(N264D) <400> 11 aagtttggcg tgacctgctg ccggaaa 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying modified psicose 3-epimerase(N264D) <400> 12 tttccggcag caggtcacgc caaactt 27

Claims (22)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 과당의 3번 탄소 위치를 에피머화하여 사이코스로 전환하는 것인 효소 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 하기 특성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 특성을 갖는 효소 단백질:
    (a) 단량체의 분자량이 32 내지 34 kDa,
    (b) 최적온도가 50 내지 65℃, 및
    (c) 최적 pH가 6.0 내지 9.0.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은, 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 229번째 아미노산 및 264번째 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 치환된 것인, 효소 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 229번째 아미노산 및 264번째 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 치환된 것인, 효소 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 229번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 단백질, 264번째 아미노산이 아스파르트산으로 치환된 단백질, 또는 아미노산 서열의 229번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고 264번째 아미노산이 아스파르트산으로 치환된 단백질인 효소 단백질.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 트리포네마 프리미티아(Treponema primitia)로부터 유래된 것인 효소 단백질.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 효소 단백질은 망간, 코발트, 아연 및 마그네슘으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속의 이온에 의해 활성이 증가되는 것인 효소 단백질.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 효소 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가지며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 가지며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 가지며, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 가지는 것인, 효소 단백질.
  11. 서열번호 1 내지 서열번호 4중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하고 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터.
  12. 서열번호 1 내지 서열번호 4중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된, 사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것인 재조합 미생물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 바실러스 속 균, 코리네 박테리아속 균, 또는 살모넬라 속 균인 재조합 미생물,
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli) (기탁번호 KCCM 11295P)인 재조합 미생물.
  16. 제1항 내지 10항중 어느 한항에 따른 효소 단백질, 제12항 내지 제15항중 어느 한항에 따른 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물, 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물을 포함하는, 사이코스 생산용 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 망간, 코발트, 아연 및 마그네슘으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속의 이온을 추가로 포함하는, 사이코스 생산용 조성물.
  18. 제 16항에 따른 사이코스 생산용 조성무을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 과당은 5~60%(w/v)의 농도인, 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 과당과 반응시키는 단계는 pH 6.0 내지 9.0의 조건하에 이루어지는 것인, 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 과당과 반응시키는 단계는 50℃ 내지 65℃의 온도 조건하에 이루어지는 것인, 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 사이코스는 상기 과당과 반응시키는 단계를 통해 과당의 3번 탄소 위치가 에피머화되어 과당이 사이코스로 전환됨으로써 얻어지는 것인, 방법.
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