JPWO2020105709A1 - 新規ケトース３−エピメラーゼ - Google Patents

Abstract

課題：食品産業で用いることができる安全性が高く、かつ高活性で耐熱性のケトース３−エピメラーゼ、これを生産する微生物、およびケトースの製造方法の提供。解決手段：アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることができ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定した分子質量が約３６ｋＤａであり、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ。（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。

Description

本発明は、新規なケトース３−エピメラーゼとその製造方法、これを生産する微生物、該酵素をコードするＤＮＡとこれを含む組換えベクターと形質転換宿主細胞、ケトース３−エピメラーゼ変異体、およびケトース３−エピメラーゼまたは変異体によるケトースの製造方法に関する。

希少糖は、自然界には存在しないか、あるいはごく微量にしか存在しない単糖類の総称であり、ヘキソースのうちアルドースとしては、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロースが、ケトースとしては、アルロース（プシコース）、ソルボース、タガトースが希少糖に含まれる。また、Ｌ体であれば、Ｌ−フラクトース、Ｌグルコースも希少糖に含まれる。
希少糖の生産技術の研究、生理作用、化学的性質に関する研究が進行中であり、現在までに特異的な生理作用が次々と解明されているが、それらの医薬、農薬、機能性食品等としての実用化に際しては、その大量生産を可能にする希少糖に特異的に反応する酵素の開発が必須である。

Ｄ−アルロースはＤ−プシコースともいい、Ｄ−フラクトースのエピマーであり、砂糖の７０％程度の甘味度があり、甘味の質においてＤ−フラクトースに類似している。しかし、Ｄ−アルロースはＤ−フラクトースと異なり、体内吸収時にほとんど代謝されずカロリーはほぼゼロに近く、脂質合成酵素の活性を抑制することで腹部脂肪を減少させる機能が明らかにされている。今までにＤ−アルロースは、低カロリー甘味料として（特許文献１）、体重減少に有効な甘味料として（非特許文献１および２）使用できることが報告され、特許文献２には、Ｄ−アルロースの血糖上昇抑制作用に着目し、健康食品、糖尿病患者用飲食品、痩身用飲食品などに使用することが記載されている。

また、Ｄ−タガトースは、砂糖の９０％程度の甘味度でエネルギーが２ｋｃａｌ／ｇであり、低カロリー甘味料として用いられている。また、ＨＤＬコレステロールの上昇効果や体脂肪蓄積抑制効果（特許文献３）を有し、Ｄ−アルロースと同様に食後血糖上昇抑制作用を有することもわかっている。

これら希少糖の製造には、現在イソメラーゼによる方法が使用されており、これは有用な酵素反応が見出された結果である。そのイソメラーゼの一種であるケトース３−エピメラーゼは、複数のケトースを基質とすることができ、基質となるケトースのうち最も３位のエピ化活性が高いケトースを名称に入れて、たとえばＤ−タガトースに対して３位のエピ化活性が最も高い酵素をＤ−タガトース３−エピメラーゼと呼ぶことがある。このＤ−タガトース３−エピメラーゼ（ＤＴＥ）を利用することにより、Ｄ−フラクトースから希少糖であるＤ−アルロースを製造する技術が確立されている。

たとえば、非特許文献３には、シュードモナス チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｉｃｈｏｒｉｉ）ＳＴ−２４株由来のＤ−ケトース３−エピメラーゼが開示されており、この酵素を利用することによりＤ−フラクトースからＤ−アルロースが製造できることが記載されている。しかしながら、この酵素は別名Ｄ−タガトース３−エピメラーゼとも呼ばれるように、Ｄ−タガトースの３位のエピ化活性が最も高く、Ｄ−フラクトースへの作用は比較的弱い。

また、特許文献４にはアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼを用いるＤ−プシコース（Ｄ−アルロース）の生成方法が、特許文献５には、アルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のケトース３−エピメラーゼを用いるＤ−アルロースの製造方法が報告されているが、これらのケトース３−エピメラーゼは、Ｄ−アルロースやＤ−タガトースを工業的規模で大量生産できる程、活性の高いものではない。

特許第４４７３９８０号公報 特許第５４２１５１２号公報 特許第５７４９８８０号公報 特許第４６４８９７５号公報 特許第５９９７６９３号公報

Asia Pac.J.Clin.Nutr.(2001)Vol.10,p.233-237 Asia Pac.J.Clin.Nutr.(2004)Vol.13,S127 Biosci.Biotech.Biochem.(1993)Vol.57,p.1037-1039

本発明は、食品を製造する際に使用が認められ毒性がないとされる微生物由来であり、かつ活性が高く耐熱性を有し、高活性でＤ−フラクトースからＤ−アルロースへの異性化を触媒できる新規なケトース３−エピメラーゼの提供、該酵素の製造方法の提供、該酵素を生産する微生物の提供、該酵素をコードするＤＮＡとこれを含む組換えベクターと形質転換宿主細胞の提供、該酵素の固定化酵素、耐熱性の向上したケトース３−エピメラーゼ変異体タンパク質の提供、該変異体タンパク質の固定化タンパク質の提供、および、該酵素、固定化酵素、該変異体タンパク質、固定化タンパク質を用いるケトースの製造方法を提供することをその課題とする。

本発明者等は、日本だけでなくヨーロッパおよびアメリカにおいて食品として使用が認められている、リストに載っている毒性がほとんどないとされる菌種に着目して、各地の土壌を採取し、そこから微生物を分離し、ケトース３−エピメラーゼ活性を有する微生物の探索を続けた。
その結果、数多く単離した菌株の中に新規なケトース３−エピメラーゼを産生するアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を見出した。このアルスロバクター属微生物であるアルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ） Ｙ５８６−１株は、活性が高く、かつ高耐熱性の新規なケトース３−エピメラーゼを産生する。

この微生物由来の新規なケトース３−エピメラーゼは、ＤまたはＬ−ケトースの３位に作用し、対応するＤ−またはＬ−ケトースへのエピマー化を触媒する活性を有している。Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高く、Ｄ−フラクトースからのＤ−アルロースの製造に適している。

すなわち、本発明は、下記（１）ないし（５）に記載のケトース３−エピメラーゼに関する。
（１）アルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物由来のケトース３−エピメラーゼであって、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定した分子質量が３６ｋＤａであり、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
（２）下記（Ｃ）および（Ｄ）の理化学的性質を有する、上記（１）に記載のケトース３−エピメラーゼ。
（Ｃ）反応至適ｐＨは６〜８である。
（Ｄ）反応至適温度は６０℃である。
上記の反応至適温度は精製酵素の６０℃である。実施例には精製酵素と粗酵素の２種類の実験が存在し、粗酵素の反応至適温度は７０℃を示した（図１参照）。粗酵素では７０℃で、精製した酵素は６０℃を示しているが、粗酵素状態の方が、周りのタンパク質等の影響で耐熱性が上がる例は良くある現象である。組換え変異体については、例えば段落００４７に耐熱性が野生型ケトース３−エピメラーゼよりも高い変異体が数多く得られる点でも優れていると記載のように、粗酵素ということで理解できる。
（３）基質特異性が、Ｄ−アルロース、Ｄ−タガトース、Ｌ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−アルロースの順である、上記（１）または（２）に記載のケトース３−エピメラーゼ。
（４）アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター ヒスチジノロボランス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
（５）アルスロバクター属に属する微生物が特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Ｙ５８６−１株である、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。

また、本発明は、下記（６）ないし（８）に記載のタンパク質、下記（９）ないし（１３）に記載のＤＮＡ、組換えベクター、または形質転換宿主細胞、若しくは下記（１４）に記載された微生物に関する。
（６）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、下記（Ａ）および（Ｂ）のケトース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が１．５５以上であるタンパク質。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
（７）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、下記（Ａ）および（Ｂ）のケトース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ６０℃で１時間保温後の残存活性が３１％以上であるタンパク質。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体からなるタンパク質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＨ５６、Ｔ５９、Ａ６０、Ｐ７７、Ｌ９４、Ｌ９７、Ｄ１０１、Ａ１０９、Ａ１２８、Ｖ１２９、Ｖ１３２、Ｓ１４４、Ｓ１６７、Ｐ１７２、Ｅ１９９、Ａ２００、Ｋ２０２、Ｓ２１８から選ばれる少なくとも１つの部位のアミノ酸置換を有し、下記（Ａ）および（Ｂ）のケトース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が高いか、または６０℃で１時間保温後の残存活性が高い変異体からなるタンパク質。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
（９）上記（６）ないし（８）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１０）配列番号２で表される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
（１１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであることを特徴とする上記（９）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列若しくはその相補的配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有するＤＮＡ。
（１２）上記（９）ないし（１１）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１３）（１２）に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換宿主細胞。
（１４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを生産する、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Ｙ５８６−１株。

また、本発明は、下記（１５）ないし（１７）に記載された固定化酵素、下記（１８）及び（１９）に記載された固定化タンパク質に関する。
（１５）上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼが担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
（１６）上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物の、菌体破砕物中に存在するケトース３−エピメラーゼ粗酵素が担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
（１７）前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および／または無機担体である、上記（１５）または（１６）に記載の固定化酵素
（１８）上記（６）ないし（８）のいずれかに記載のタンパク質が、担体に固定化されていることを特徴とする固定化タンパク質。
（１９）前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および／または無機担体である、上記（１８）に記載の固定化タンパク質。

また、本発明は、下記（１９）および（２０）記載されたケトース３−エピメラーゼの製造方法、下記（２１）記載されたケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、下記（２２）に記載されたケトースの製造方法に関する。
（１９）上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物を培地中で培養し、微生物菌体中に当該ケトース３−エピメラーゼを蓄積させ、これを採取するケトース３−エピメラーゼの製造方法。
（２０）前記培地がＤ−アルロースを添加した無機塩培地である、上記（１９）に記載のケトース３−エピメラーゼの製造方法。
（２１）上記（１３）に記載の形質転換宿主細胞を培地で培養し、培養物からケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を採取するケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
（２２）Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ、上記（６）ないし（８）のいずれかに記載のタンパク質、上記（１５）ないし（１７）のいずれかに記載の固定化酵素、または、上記（１８）または（１９）に記載の固定化タンパク質を作用させて、該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。

本発明のケトース３−エピメラーゼは、微生物由来の従来のケトース３−エピメラーゼと比べて、特に高活性であることが特徴である。たとえば、特許文献５に記載されたアルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のケトース３−エピメラーゼに比べて、培養液あたりで生産される酵素が約２倍高い活性を有するので、本発明により得られた酵素を用いることで効率よくＤ−アルロースの大量生産が可能になる。
また、酵素の至適温度が７０℃と高く、しかも８０℃においても、至適温度での７０℃での活性を１００とした相対活性が５９．４と約６０％あり、高耐熱性である。しかも、６０℃で１時間保温処理した後の残存活性も４９．４％という熱耐性を有することから、至適温度の７０℃での反応において、より多量の生産物を得ることができる。この酵素のもつ優れた耐熱性は、酵素のアミノ酸置換変異体の作成により、さらに高めることができるという特性がある。
アルスロバクター属の微生物由来の本酵素を食品産業で用いる利点として、菌の安全性が挙げられる。

本粗酵素の至適温度を示す図である。 酵素生産量への培地の影響を示す図である。 本酵素の分子質量を確認するためのＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。図中、左の数字の単位はｋＤａ。 本精製酵素と対照酵素の至適ｐＨを示す図である。 本精製酵素の至適温度を示す図である。 本精製酵素と対照酵素の１０分保温における温度安定性を示す図である。 本精製酵素の基質特異性を示す図である。 ＨＰＡ２５Ｌ、ＷＡ３０、ＩＲＡ９０４ＣＬ、ＦＲＡ５４、ＦＲＡ９５、ＸＡＤ７ＨＰを担体として用いた本酵素の固定化酵素の相対活性を示す。 Ｍｇ^２＋の存在下または非存在下における、３０℃〜８０℃での各固定化酵素の担体ごとの相対活性を示す。 図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ ３６ｋＤａのバンドを、還元処理、アルキル化処理の後、トリプシン消化した断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析の結果を示す。すなわち、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析にて得られたトリプシン消化した３６ｋＤａタンパク質のペプチドピークである。 大腸菌で発現させた組換酵素のＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。図では組換え酵素とＹ５８６−１株精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを対比させて示した。組換え酵素はＣ末端にＲＳＨＨＨＨＨＨの付加配列があり、Ｙ５８６−１株精製酵素より約１ｋＤａ大きい。図中、左の数字の単位はｋＤａ。 Ｘ線結晶構造解析による本酵素（組換え体の精製酵素）の立体構造を示す図面である。

本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から単離することができるケトース３−エピメラーゼに関するものであり、培養液あたりの酵素生産量が高く、熱安定性において特徴的な性質を有する。
アルスロバクター属の微生物は、α-アミラーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、グルカナーゼ、α-グルコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼなどの酵素起源微生物として、また、トレハロースやビタミンＫ（メナキノン）生産菌として、日本の食品添加物リストに収載されている安全な微生物である。

ケトース（ｋｅｔоｓｅ）は糖質をその構造により分類する際に用いられる化学の用語で、鎖状構造の内部にケト基（ケトン性カルボニル基）を1つ含む単糖類の総称であり、分子式はC_ｎＨ_２ｎＯ_ｎ（ｎ≧３）である。代表的なケトースとしてフラクトース（果糖）があるが、ペントースなども含む用語である。
本発明でケトースとはペントースなども含む広義でのケトースを意味し、ケトヘキソースと記載する場合は、ケトース構造を有する六炭糖のケトヘキソースを意味する。具体的には、フラクトース、アルロース、タガトースおよびソルボースであり、Ｄ−またはＬ−ケトースとは、これらのＤ−体およびＬ−体を意味する。
したがって、本発明のケトース３−エピメラーゼは、Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有し、具体的には、Ｄ−またはＬ−フラクトースとＤ−またはＬ−アルロース間の相互変換、および、Ｄ−またはＬ−タガトースとＤ−またはＬ−ソルボース間の相互変換を触媒することができる。さらに、他の全てのケトースにも作用することができる。

本発明のケトース３−エピメラーゼは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、ケトース３−エピメラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生育した菌体中からケトース３−エピメラーゼを単離することにより調製することができる。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては、例えば、アルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｙ５８６−１株およびこれらの変異株などが有利に利用できる。この出願をするに際し、Ｙ５８６−１株は、２０１８年１１月７日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３として寄託された。
Ｙ５８６−１株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った結果、塩基配列に対して相同性９８％以上であった菌株名から、当初、アルスロバクター プロトフォルミエ（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）と同定された。その後、日本食品分析センターの同定では、アルスロバクター ヒスチジノロボランス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）と判定されたため、Ｙ５８６−１株の全ゲノムの配列検索を行った結果、アルスロバクター ヒスチジノロボランスであると確定した。
そのため、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３の菌株の名称変更を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに届け出て、２０１９年１０月４日に承認された。

本発明のケトース３−エピメラーゼの粗酵素液は、アルスロバクター属のケトース３−エピメラーゼ生産菌をＤ−アルロースを添加した無機塩培地で通気培養した後、遠心分離により菌体を培養液から回収し、回収した菌体を１０ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)を用いて洗浄した後、１０ｍｌの１０ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)中に懸濁させ、溶菌酵素であるリゾチームを添加して酵素処理により細胞を破砕するか、または、菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザーで細胞破砕し、それら破砕物を遠心分離し、その遠心上清として調製される。

この精製前の粗酵素液のケトース３−エピメラーゼの活性は、Ｄ−フラクトースを基質とし、Ｄ−アルロ−スの生成量を測定することにより確認することができる。
逆反応であるＤ−アルロースからＤ−フラクトースへエピ化する酵素活性についても同様の条件で測定する。ケトースの変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１〜６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、約５〜５０％（ｗ／ｖ）、反応温度は１０〜７０℃、望ましくは、約３０〜６０℃、反応ｐＨは５〜１０、望ましくは、約７〜１０、反応時間は適宜選択できるが、バッチ反応の場合には、通常５〜５０時間の範囲が選ばれる。

粗酵素液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の濃度を変えることにより分画し、ＰＥＧとケトース３−エピメラーゼが存在する上清を、イオン交換樹脂クロマトグラフィーにより目的の酵素を吸着させてＰＥＧを洗い流し、その後吸着した酵素を溶出させる。さらに、酵素溶出液をイオン交換クロマトグラフィーと疎水クロマトグラフィーにより順次に精製して、精製酵素を単離することができる。
酵素が精製されたことを確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１２．５％）にかけて、単一なバンドが得られることと分子質量を確認する。

上記のようにして精製された本発明のケトース３−エピメラーゼは，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３６ｋＤａの分子質量を示し、その活性化が金属イオンによって調節される金属酵素である。基質との反応は、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルト、およびアルミニウムからなる群より選択された金属イオンの濃度０．５〜５ｍＭでの存在下で行われうる。

本発明のケトース３−エピメラーゼは、所定のアミノ酸配列を有している。しかしながら、本酵素の遺伝子は、ＰＣＲ増幅の手法や既存のタンパク質データベースを用いてクローニングすることが出来なかったため、Ｙ５８６−１株の全ゲノム配列を決定し、そのゲノム配列中の全ＯＲＦのコードするタンパク質群のデータベースの構築を行った。精製した酵素をトリプシン処理して得られた断片をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで解析し、得られた断片アミノ酸と一致することから、最終的に本発明のケトース３−エピメラーゼのアミノ酸配列を決定することができた。
その例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれと相同なアミノ酸配列を有し、同等なケトース３−エピメラーゼ活性を維持するタンパク質が挙げられる。
相同なアミノ酸配列とは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは７６、７７、７８、７９または８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３または９４％以上、より一層好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％以上のアミノ酸配列の同一性を有することを指す。

二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列（塩基配列）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる。この際、例えば、第一の配列にギャップを導入して、第二の配列とのアライメントを最適化してもよい。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（即ち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数及びサイズも考慮に入れる。

また、二つの配列の比較及び同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４―６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３―７７において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えばＮＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２としてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行えばよい。

本発明のＤＮＡは、本発明のケトース３−エピメラーゼをコードする遺伝子であり、所定の塩基配列を有する。その例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、配列番号２で表される塩基配列、または配列番号２で表される塩基配列と相同な塩基配列を有し、かつ、配列番号１のタンパク質と同等なケトース３−エピメラーゼ活性を維持するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。配列番号２で表される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡは新規な化合物である。
本発明にかかるＤＮＡは、公知の技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術などを組み合わせて単離することができる。
また、本発明にかかるＤＮＡには、配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ、当該ＤＮＡおよび当該ＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡならびに当該ＤＮＡおよび当該ＤＮＡの相補鎖と７０％以上の配列同一性を有するＤＮＡも含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な実験条件である。通常、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度は高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。核酸同士のハイブリッドの形成は、相補鎖がその融点よりやや低い環境において再アニールする能力に依存する。より具体的に述べると、ストリンジェントな条件としては、上記ＤＮＡを単離することができる条件として、当業者によって選択される条件であれば特に限定はされず、例えば、洗浄段階において、４２℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜６５℃の温度条件の下、２５ｍＭ〜４５０ｍＭ、好ましくは２５ｍＭ〜５００ｍＭのナトリウム濃度の条件が好ましい。このような条件としては、例えば、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄する条件などが挙げられる。さらに、温度を上げる等、より高いストリンジェントな条件にすることにより、相同性の高いＤＮＡを得ることができる。ストリンジェントな条件（緊縮条件）は、最終的に５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液を用いて、４５℃（非常に低い緊縮）、５０℃（低い緊縮）、５５℃（中位の高い緊縮）、６０℃（中くらいに高い緊縮）、６５℃（高い緊縮）及び７０℃（非常に高い緊縮）で、それぞれ１５分間、３度の洗浄を意味する。
また、相同な塩基配列とは、「７０％以上の配列同一性を有するＤＮＡ」であり、配列番号２の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有するＤＮＡであれば、何％であってもよく、例えば、と７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは７６、７７、７８、７９または８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３または９４％以上、より一層好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％以上の塩基配列の同一性を有することを指す。

本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えベクターとすることもできる。組換えベクターは、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。クローニングやタンパク質の発現という使用目的に応じて、また宿主細胞に応じて、適切なベクターが選択される。このようなベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。

このようにして得られる組換えベクターを、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主細胞に導入することができる。導入方法は、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法を用いる。形質転換された宿主細胞を取得するために、コロニーハイブリダイゼーション法等を適用する。

本発明のケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、本発明のケトース３−エピメラーゼは、本発明のケトース３−エピメラーゼ生産能を有する微生物、または本発明のケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質若しくは後述する当該タンパク質のアミノ酸置換変異体をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を、栄養培地で培養して得られる培養物から、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することで製造することができる。培養方法には公知の手法を用いることができ、例えば液体培養及び固体培養の何れも用いることができる。

このようにして、菌体を培養した後、本発明のタンパク質を精製・回収する。タンパク質の精製・回収方法は、公知の方法を自由に選択して行うことができ、例えば、培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することにより、不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことができる。また、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を溶解酵素処理、超音波処理などによって破砕した後、同様に分離、精製を行う。

また、本発明のケトース３−エピメラーゼは、他のエピメラーゼやイソメラーゼと同様に、酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能となり、公知の固定化手段、例えば、担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素とすることができ、また、担体は任意の担体であってよい。担体結合法では、酵素を担体（例えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など）に、物理的吸着、イオン結合及び共有結合等を用いて結合させることができる。架橋法では、２個又はそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、酵素同士を互いに架橋することによって固定化することができる。架橋試薬としては、Ｓｃｈｉｆｆ塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、Ｎ，Ｎ’−エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するＮ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド等を用いることができる。ゲル包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によって酵素を皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂等の合成高分子物質や、デンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナン等の天然高分子物質といった高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる。担体には、上記５種の酵素のそれぞれを固定してもよいし、あるいはこれらより選択される２，３，４、又は５種の酵素の組み合わせにて固定してもよい。

本発明のケトース３−エピメラーゼを固定化する方法の一態様は、粗酵素液を用いる固定化である。菌体懸濁液を超音波処理することで得られたケトース３−エピメラーゼを含む粗酵素液をイオン交換樹脂等に添加し、低温下で結合させることにより、ケトース３−エピメラーゼを固定化することができる。

菌体内からケトース３−エピメラーゼを取り出すためには、菌体細胞壁を破砕する必要があり、超音波処理あるいはリゾチームなどの酵素処理による破砕方法があるのは、上述のとおりである。超音波処理により得られる粗酵素液中に活性を有するケトース３−エピメラーゼが多く含まれることがわかった。

上記のようにして得られた粗酵素液から酵素を固定化する担体としても、固定化担体として公知の任意のものを用いることができる。各種イオン交換樹脂、合成吸着剤等が便利でよく用いられる。また、アルギン酸ナトリウムによる包括法も用いることができる。
すなわち、ケトース３−エピメラーゼの固定化に使用される固定化用担体については、当該酵素の固定化が可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、イオン交換樹脂、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリル、キトサン、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子担体；セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、セラミックス等の無機担体が挙げられる。また、微生物を固定化酵素として使用する場合は、４級化ピリジン化合物（例えば電気化学工業株式会社製の商品名ＤＡＣ）やアルギン酸塩を固定化用担体として使用することができる。これらの固定化用担体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの固定化用担体の中でも、固定化によるケトース３−エピメラーゼの活性維持、安価で圧損失が少なく取り扱いが容易等の観点から、好ましくはイオン交換樹脂、例えば塩基性陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂あるいは弱塩基性陰交換樹脂のいずれでも用いることができ、たとえば、強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＨＰＡ２５Ｌ（三菱ケミカル社製）、ＩＲＡ９０４ＣＬ（オルガノ社製）等が挙げられ、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはＷＡ３０（三菱ケミカル社製）、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５（オルガノ社製）等が挙げられる。合成吸着剤としてはＸＡＤ７ＨＰ（オルガノ社製）等が挙げられる。

弱塩基性陰イオン交換樹脂を担体に用いて固定化酵素を製造した場合、固定化したケトース３−エピメラーゼは、その異性化能が消失したあとに容易に溶離させることができることから、固定化担体の再生を非常に簡便に行うことができ、生産コストを下げることができる。
以上、ケトース３−エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物の、菌体破砕物中に存在するケトース３−エピメラーゼ粗酵素が担体に固定化されている、固定化酵素についての説明と同様に、本発明においては、固定化ケトース３−エピメラーゼとして、精製品又は粗精製品のケトース３−エピメラーゼを固定化したものを使用してもよく、またケトース３−エピメラーゼを産生する微生物を固定化したものを使用してもよい。さらにまた、粗酵素、精製酵素と同様に大腸菌発現酵素を固定化した固定化タンパク質を使用してもよいことはいうまでもない。

本発明のケトース３−エピメラーゼを用いて、基質となり得るケトースの３位をエピマー化することにより、対応するケトースに変換し、対応するケトースを製造することができる。本発明のケトース３−エピメラーゼは、Ｄ−アルロースまたはＤ−フラクトースに対する３位のエピ化活性が高いので、基質となり得るＤ−フラクトースから、生産物の希少糖であるＤ−アルロースを効率よく大量に製造することを可能とする。

また、本発明のケトース３−エピメラーゼの遺伝子に突然変異を導入して、対応するアミノ酸残基を部位特異的変異操作により他のアミノ酸残基に置換して、様々なアミノ酸置換を有する変異体を調製することにより、アミノ酸置換していない野生型酵素より耐熱性の高い酵素を得ることができる。反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）、あるいは、６０℃で１時間保温後の残存活性、という２つの指標で耐熱性を評価する。

立体構造解析により、本酵素は図１２に示されるようにホモ四量体であることが示され、本酵素の活性部位残基は、６位、６３位、１１０位、１５２位、１７９位、１８２位、２０５位、２１１位、２４０位のアミノ酸であり、金属イオン結合推定部位残基は、１４６位、１７７位、２０５位、２４０位のアミノ酸と予想されるため、これらのアミノ酸付近のアミノ酸置換は行わないで、他の部位のアミノ酸置換により変異体を作製する。
図１２は、Ｘ線結晶構造解析による本酵素（組換え体の精製酵素）の立体構造を示す図面である。組換え体の精製酵素を用いて結晶化を行い、Ｘ線結晶解析によりＹ５８６−1株由来のケトース３エピメラーゼの構造を決定した。本酵素は４つのサブユニットが会合したホモ四量体（ＭｏｌＡ、ＭｏｌＡ、ＭｏｌＡ、ＭｏｌＡ）を形成している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された分子質量約３６ｋ Ｄａをもつ各サブユニット構造はβ/αバレル構造を示し、中心部の活性部位には金属イオンが結合している。
本発明のケトース３−エピメラーゼは驚くべきことに、アミノ酸配列の同一性が７０％台の変異体であっても、酵素活性を保持しつつ、かつ、配列番号１の野生型酵素に比べ、反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）がより高く、かつ、６０℃で１時間保温後の残存活性がより高いものが得られる。

また、配列番号１で表されるケトース３−エピメラーゼのアミノ酸配列と、以前に報告したアルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のケトース３−エピメラーゼ（特許文献５）のアミノ酸配列を比較して、アミノ酸残基が異なる部位はケトース３−エピメラーゼ活性への関与が小さいと予想し、配列番号１のその相違する部位にあるアミノ酸等を、部位特異的変異導入による塩基置換により変化させて各種のケトース３−エピメラーゼ変異体を作成し、その中から、野生型より耐熱性の高いアミノ酸置換変異体を選択する。

部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、p.82-88）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてStratagene社のQuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kitや、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、遺伝子内の改変対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその改変対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて改変後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含むように設計すればよい。

アミノ酸置換変異体とは、元の配列のアミノ酸に対して異なるアミノ酸に置換されている変異体を意味し、置換については、保存的置換もあれば非保存的置換もあり、特にこだわることもないが、発明の好ましい態様において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、塩基性を塩基性に、酸性を酸性に、極性を極性のように、同じ性質（塩基性、酸性、または中性）、極性（親水性または疎水性）を有するアミノ酸同士や、芳香族アミノ酸同士または脂肪族アミノ酸同士の置換などが該当する。
保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、中性非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）等のグループ内により行われる。

一方、非保存的置換とは、上記グループ外のメンバーのアミノ酸と交換することであり、例えば、３次構造でタンパク質中に折り畳まれることを防ぐためにＣｙｓを欠失させるか、他のアミノ酸に置換する。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）Ｖｏｌ．１５７，ｐ．１０５−１３２）を考慮して、アミノ酸を置換する。
また、元のアミノ酸よりも立体障害の少ないアミノ酸への置換、電荷を持つアミノ酸から電荷を持たないアミノ酸へ置換することもある。

置換については、保存的置換もあれば非保存的置換もあり、例えば、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＡｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、および、ＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸残基の置換については置換可能な残基の分類は例示であり、置換可能なアミノ酸残基はこの分類に限定されるものではない。

本酵素において１か所のアミノ酸を置換した変異体から１１か所のアミノ酸を置換した多重変異体を作製して、耐熱性試験を行うと、反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）については、３７種中３０種の変異体が、特許文献５に記載されたアルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０由来の対照酵素のもの（１．５４）より高く、また、６０℃で１時間保温後の残存活性については、３７種中３７種の変異体がグロビフォルミス由来のもの（３０．８％）より高いだけでなく、配列番号１の本発明の野生型酵素のものよりも３７種中３６種が高いという結果が得られた。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、耐熱性が野生型ケトース３−エピメラーゼよりも高い変異体が数多く得られる点でも優れている。

以下、実験により本発明を詳細に説明する。
なお、以下の実験においてはＤ−アルロースをＤ−フラクトースに変換するＤ−アルロース３−エピメラーゼ活性を測定し、ケトース３−エピメラーゼ活性と表記する場合と、Ｄ−フラクトースをＤ−アルロースに変換するＤ−フラクトース３−エピメラーゼ活性を測定し、ケトース３−エピメラーゼ活性と表記した場合がある。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

＜実験１：菌株の由来および同定＞
本発明者等はスクリーニングにより単離した数多くの菌を、Ｄ−アルロースを添加した液体培地に植菌して振とう培養を行い、Ｄ−フラクトースを基質としＤ−アルロースの生成量を測定することにより、ケトース３−エピメラーゼの活性を測定した。
このようにして、最も活性の高い菌株として微生物Ｙ５８６−１株を見出し、Ｙ５８６−１株は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、アルスロバクター プロトフォルミエに属することが判明した。

菌株の同定
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を解析し、塩基数１，４６９ｂｐを特定した。
（２）相同性検索
この菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数１，４６９ｂｐの塩基配列に対し、相同性９８％以上であった菌株名と相同性（％）の値から、Ｙ５８６−１株の微生物は、アルスロバクター プロトフォルミエ（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）であることを同定し、このＹ５８６−１株は、２０１８年１１月７日で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３として寄託された。その後、アルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）と判定されたため、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３の菌株の名称変更を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに届け出て、２０１９年１０月４日に承認された。

＜実験２：アルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｙ５８６−１株（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３）の培養＞
Ｄ−アルロース１．０％を炭素源とし硫安を窒素源とする無機塩培地に、アルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｙ５８６−１株（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３）の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら３０℃で２４時間培養した。得られた培養液中のケトース３−エピメラーゼ活性は約２．６９４単位／１００ｍＬ培養液であった。以下、この菌株を省略して、単に「Ｙ５８６−１株」という。

Ｄ−アルロース１．０％を含む無機塩液体培地、酵母エキス液体培地、肉エキス液体培地、ＴＳＢ液体培地のそれぞれに、Ｙ５８６−１株の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら３０℃で２４時間培養した。２４時間培養後の生育（ＯＤ_{６００ｎｍ}）とケトース３−エピメラーゼ活性を測定した。
結果を図２に示す。検討した培地の中で最も生育の低い無機塩培地での酵素の生産量が高いことがわかった。

＜実験３：粗酵素の調製＞
遠心分離により培養液から菌体を回収した。回収した菌体は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)を用いて、洗浄した。次いで、菌体を１０ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(日本エマソン株式会社)で細胞破砕した。破砕物を１２０００ｒｐｍで２０分遠心し、その遠心上清を粗酵素とした。

＜実験４：粗酵素の活性測定＞
精製前の酵素のケトース３−エピメラーゼの活性は、Ｄ−アルロースを基質とし、Ｄ−フラクトースの生成量を測定することにより測定した。具体的には、酵素反応液組成は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)、０．１Ｍ Ｄ−アルロース、酵素液、２ｍＭ塩化マグネシウムを用い、７０℃１０分間反応し、２分間ボイルすることで反応を止めＨＰＬＣによって、反応後の液組成を測定する。酵素活性１単位は、上記条件下において、Ｄ−アルロースをエピマー化し１分間に１μｍｏｌのＤ−フラクトースを生成する酵素量と定義する。逆反応であるＤ−フラクトースからＤ−アルロースへエピ化する酵素単位についても、同様の条件で測定し同様に定義する。

＜実験５：酵素の精製＞
１．イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーによる精製
粗酵素液をイオンクロマトグラフィーによって精製した。用いたカラムは緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ ＨＰであり、ＤＵＯ ＦＬＯＷシステムを用い流速５ｍｌ／ｍｉｎで１Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で０％から１００％を５ｍｌずつのフラクションに分けて分画した。酵素活性が検出されたフラクションを回収してイオン交換クロマト分離による精製酵素を得た。

２．イオン交換クロマト分離により精製した酵素をさらに疎水クロマトグラフィーにより精製した。用いたカラムはＨｉＴｒａｐ ＰＨＥＮＹＬであり、酵素液に２Ｍとなるように硫安を加えて溶解し、流速５ｍｌ／ｍｉｎで２Ｍの硫安１００％から０％まで濃度を下げて溶出し５ｍＬずつ分画した。酵素活性が検出された画分を集め、透析し硫安を除去して、疎水クロマト分離精製酵素を得た。

３．ポリアクリルアミドゲル電気泳動
常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１２．５％）を行い、精製酵素の純度を確認した。図３では、左が標準分子質量の蛋白質であり、中央のレーンが疎水クロマトグラフィーを用いて精製した後の酵素である。この結果は約３６ｋＤａに単一なバンドが認められ、これにより酵素は純粋に精製されたことが確認され、精製した本酵素のサブユニットの分子質量は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分子質量が約３６ｋＤａであることが判明した。

＜実験６：粗酵素、精製酵素の理化学的性質の測定＞
比較対照の酵素として、特許文献５に記載されたアルスロバクター グロビフォルミス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０由来のケトース３−エピメラーゼを用いた。以下、「対照酵素」といい、「ＡｇＤＡＥ」と表記することがある。
粗酵素および精製酵素であるケトース３−エピメラーゼ活性の測定については、実験４と同様の実験を行って酵素反応を行った。１０分の酵素反応を各条件下で行い、Ｄ−アルロースから１分間に１μｍｏｌのＤ−フラクトースを生成する酵素量を１単位とした。反応後、反応液を３分間沸騰液中にいれることで反応を停止し、脱イオン処理後、ＨＰＬＣ分析により生成したＤ−フラクトースを測定した。

１．反応至適温度（野生株の粗酵素）
５０−８０℃の様々な温度での反応を行い。至適温度を求めた反応条件は表１に示す。６０℃から８０℃の温度範囲が粗酵素の好適な温度であり、反応温度と相対活性を測定した結果を示す図１から、本酵素の粗酵素の至適温度はＭｇ^２＋イオン添加時で７０℃であることが明らかとなった。

対照酵素の粗酵素も至適温度は７０℃であるが、本酵素の粗酵素は、図１に示すように、特に最も高い活性を示した７０℃を１００とした相対活性（％）が、８０℃で７７．６％、６０℃で８０．３％であるのに対して、対照酵素の粗酵素では、８０℃で５８．７％、６０℃で９６．８％であり、本酵素は特に至適温度より高い温度での活性が維持されるという特徴を有する。

同様の反応条件により、本精製酵素（野生株の精製酵素）の反応至適温度を求めたところ、図５に示すとおり、６０℃であった。また、図６は、本精製酵素と対照酵素を１０分間保温した後の残存活性を示す。１０分保温した後の温度安定性において、本酵素の６０℃での相対活性の減少は、対照酵素よりも少なく、さらに７０℃では、その相対活性の減少の差が広がったことから、本酵素は対照酵素に比べて、高温でより安定な酵素であることがわかった。

２．ケトース３−エピメラーゼ活性
実験３で製造した粗酵素液、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)、０．１Ｍ Ｄ−アルロース、２ｍＭ塩化マグネシウムを用い、７０℃１０分間反応し、２分間ボイルすることで反応を止めＨＰＬＣによって、反応後の液組成を測定する。酵素活性１単位（Ｕ）は、上記条件下において、Ｄ−アルロースをエピマー化し１分間に１μｍｏｌのＤ−フラクトースを生成する酵素量である。反応条件を表２に示す。

その結果は、培養液１００ｍＬから得られた粗酵素の総活性は、２．６９４Ｕであり、一方、培養液１００ｍＬから得られた対照酵素の粗酵素の総活性は０．８４７Ｕであり、本酵素の活性は対照酵素に比べて約３倍高いということが判明した。

３．反応至適ｐＨ（野生株の精製酵素）
測定にあたり、反応の至適ｐＨについてＤ−アルロースを基質として用い、各種緩衝液ｐＨ４〜１１を用いて７０℃で１０分反応し、生成したＤ−フラクトースを、ＨＰＬＣを用いて測定することで求めた。
反応条件を表３に示す。使用した緩衝液を表４に示す。

結果を図４に示す。本酵素の精製酵素の反応至適ｐＨは、６〜８であるのに対して、対照酵素の反応至適ｐＨは、７．５〜９とアルカリ側にあり、本酵素の反応至適ｐＨは、より広範囲であり、かつ、より酸性下で高い活性を示す。

４．熱安定性（野生株の粗酵素）
表２に示した上記２．で至適温度を求めた反応条件（１０分）による６０℃での活性を１００とした場合、６０℃で１時間の保温処理した後の活性を測定することにより、その相対活性をもとめて酵素の熱安定性について検討した。熱処理条件としては、粗酵素液、緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２ の全量２００μlとし、これを６０℃で１時間保持した後氷水中で１０分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
表７に示すように、６０℃で１時間の保温処理した後の残存活性は、本粗酵素では４９．４％であるのに対して、対照酵素では、３０．８％であり、本酵素は高い熱安定性を有することが判明した。

５．ケトース３−エピメラーゼの基質特異性（野生株の精製酵素）
８種類のケトヘキソ―スを用いて精製後の本酵素の基質特異性について検討した。酵素反応組成は、下記表５に示したように各基質終濃度０．１Ｍ、終濃度５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ８．０で、７０℃１０分反応しＨＰＬＣによる分析によりそれぞれの糖からエピ化され生産されたケトースを測定した。
Ｄ−アルロースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を、相対活性として示している。
Ｄ−フラクトース(Ｄ-fructose)、Ｄ−アルロース(Ｄ-allulose)、Ｄ−ソルボース(Ｄ-sorbose)、Ｄ−タガトース(Ｄ-tagatose)、Ｌ−フラクトース(Ｌ-fructose)、Ｌ−アルロース(Ｌ-allulose)、Ｌ−ソルボース(Ｌ-sorbose)、Ｌ−タガトース(Ｌ-tagatose)を基質として活性を相対活性として、表６と図７に示す。

本酵素（野生株の精製酵素）は、ケトヘキソースのうちではＤ−アルロースに対する活性が最も強く、次いでＤ−タガトース(Ｄ-tagatose)であった。これらの基質特異性は他のケトース３エピメラーゼと比較すると、Ｄ−アルロース３−エピメラーゼ（ＤＡＥ）と言えるものであり、シュードモナス チコリのＤ−タガトース３−エピメラーゼ（ＤＴＥ）とは明らかに異なる特異性を示した。

６．耐熱性（熱安定性）試験（組換え体の粗酵素）
（１）反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）
本酵素（組み換え体粗酵素）と対照酵素の粗酵素について、表２に示した上記２．で至適温度を求めた反応条件（１０分）による７０℃での活性と５０℃における活性を測定してその比（Ｔ７０／Ｔ５０）を求めて耐熱性を検討した。
結果を表７に示す。Ｔ７０／Ｔ５０が、本酵素（組み換え体粗酵素）では１．７８であり、対照酵素では１．５４であることから、本酵素（組み換え体粗酵素）は高温で活性が相対的に高いことが示された。
（２）６０℃で１時間保温後の残存活性
本酵素（組み換え体粗酵素）と対照酵素の粗酵素について、表２に示した上記２．で至適温度を求めた反応条件（１０分）による６０℃での活性を１００とした場合、６０℃で１時間の保温処理した後の活性を測定することにより、その相対活性をもとめて酵素の耐熱性の指標とした。熱処理条件としては、粗酵素液、緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２ の全量２００μlとし、これを６０℃で１時間保持した後氷水中で１０分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
結果を表７に示す。６０℃１時間保温後、本酵素（組み換え体粗酵素酵素）は４９．４であり、対照酵素は３０．８であることから、本酵素（組み換え体粗酵素酵）の６０℃における熱安定性が高いことが示された。

＜実験７：固定化酵素の調製＞
以下１ないし５は、野生株の粗酵素を用いた固定化に関する固定化の実験であり、実験２と同様に培養して回収したＹ５８６−１株の菌体を使用した。
１.菌体の超音波処理による粗酵素の取得
菌体１０ｇ（湿重量）を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌに懸濁し、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザーで細胞破砕した。破砕物を１２０００ｒｐｍで３０分遠心し、その遠心上清を粗酵素液とした。

２.粗酵素の固定化
純水でよく洗浄して膨潤させた後に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したイオン交換樹脂または合成吸着剤に上記で得た粗酵素液を添加し、４℃で２４時間かけて粗酵素タンパク質を結合させた。次いで、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、固定化酵素を得た。
予備実験として、強塩基性陰イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製のＳＡ１０Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＮＳＡ１００、ＳＡ２０Ａ、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＨＰＡ２５Ｌ、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８およびオルガノ社製のＩＲＡ９０４ＣＬ）、弱塩基性陰イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製のＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０およびオルガノ社製のＦＰＡ５４、ＦＰＡ６０ＣＬ、ＦＰＡ９５）、または合成吸着剤（オルガノ社製のＸＡＤ７ＨＰ、ＸＡＤ１１８ＯＮ）を用いた固定化試験を行い、イオン交換樹脂または合成吸着剤と粗酵素液の吸着による固定化酵素の活性発現率は３０％以上であった、強塩基性陰イオン交換樹脂ＨＰＡ２５Ｌ、ＩＲＡ９０４ＣＬ、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＷＡ３０、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５、合成吸着剤ＸＡＤ７ＨＰを以降の試験に用いた。

３．固定化酵素の酵素活性の測定方法
固定化酵素の酵素活性の測定は、Ｄ−アルロースを基質として酵素反応させたときのＤ−フラクトースの生成量を測定することにより行った。
まず、１００ｍｇの固定化酵素樹脂、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）（終濃度５０ｍＭ）、及びＤ−アルロース（終濃度１００ｍＭ）の溶液（４００μｌ）を反応液組成とし、３０℃恒温水槽で１０〜３０分間反応させた後、１００℃で２分間ボイルすることで直ちに反応を停止させた。この反応後の溶液を室温まで冷却してからイオン交換樹脂（２００ＣＴ及びＩＲＡ６７の混合樹脂（いずれもオルガノ社製））で脱塩し、さらにフィルター処理をして分析サンプルとした。分析は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＧＬ−Ｃ６１１（Ｈｉｔａｃｈｉ）、温度：６０℃、溶離液：０．１ｍＭ ＮａＯＨ、流速：１．０ｍｌ／分、検出器：ＲＩＤ−２０Ａ（島津））を用いて、生成したＤ−フラクトースのピーク面積を測定することにより行った。

４．酵素固定化に用いる担体による酵素活性の比較
酵素固定化に用いる担体による影響を確認するため、ＨＰＡ２５Ｌ、ＷＡ３０、ＩＲＡ９０４ＣＬ、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５、ＸＡＤ７ＨＰの各担体に固定化した本酵素の酵素活性を比較した。なお、相対活性は、比較サンプルのうちピーク面積の最も大きいサンプルを１００として算出することにより求めた。
図８、各種固定化酵素の相対活性を示す。合成吸着剤ＸＡＤ７ＨＰを用いて作製した固定化酵素の活性が、最も高いものであった。固定化される粗酵素量が多くなると、どの樹脂での相対活性も高くなった。

５．温度による固定化酵素の酵素活性の比較
３０−８０℃の様々な温度での反応を行い、各種固定化酵素の担体ごとの相対活性を測定した結果を図９に示す。
Ｍｇ^２＋イオンを添加しなくても、添加しても、合成吸着剤であるＸＡＤ７ＨＰによる固定化酵素は常温で、陰イオン交換樹脂であるＨＰＡ２５Ｌ、ＩＲＡ９０４ＣＬ、ＷＡ３０による固定化酵素は高温での相対活性が高く、反応温度により固定化担体を選択すべきであることがわかった。

＜実験８：酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えベクターと形質転換宿主細胞の調製＞
ケトース３−エピメラーゼ酵素をコードするＤＮＡをアルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｙ５８６−１株からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換微生物の調製を行った。

＜実験８−１：染色体ＤＮＡの全塩基配列の決定＞
本菌のケトース３−エピメラーゼ酵素は既存の類似酵素と異なり、ＰＣＲ増幅の手法や既存のタンパク質データベースを用いて単離することが出来なかった。そこで、Ｙ５８６−１株の全ゲノム配列を決定し、そのゲノム配列中の全ＯＲＦのコードするタンパク質群のデータベースの構築を行った。Ｙ５８６−１株培養菌体を供試菌体として株式会社マクロジェン・ジャパンに依頼し、ＰａｃＢｉｏ−ＲＳＩＩ／Ｓｅｑｕｅｌを用いた次世代シーケンス解析を行った。
その結果、塩基数４，９４８，４４２ｂｐと１８８，６７７ｂｐの２つのコンティグが得られた。この２つのコンティグで約５．１Ｍｂであることから、アルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｙ５８６−１株の全ゲノム配列をカバーできていると考えられる。

＜実験８−２：タンパク質データベースの構築＞
得られた約５．１ＭｂのＤＮＡ配列を基に、Ｐｒｏｋｋａプログラムを用いて４，７３４個のＯＲＦを推定し、それぞれのＯＲＦについてアミノ酸配列を推定した。この４，７３４個のアミノ酸配列をＹ５８６−１株のタンパク質データベースとした。

＜実験８−３：ケトース３−エピメラーゼ活性タンパク質の同定＞
上記のタンパク質データベースを用いて、タンパク質同定システムであるＭＡＳＣＯＴ ｓｅｒｖｅｒ（マトリックスサイエンス社）に登録し、ケトース３−エピメラーゼ活性が見られたタンパク質の同定を行った。供試サンプルには、段落［００４９］のＳＤＳ−ＰＡＧＥの３６ｋＤａのバンドを用い、還元処理、アルキル化処理の後、トリプシン消化した断片をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析に供した（図１０）。
その結果、下記の２８９アミノ酸からなる配列１（配列表の配列番号１）のアミノ酸配列中で下線を引いて示すアミノ酸配列と８７％の相似性が見られたことから、配列番号１のアミノ酸からなる本タンパク質がＹ５８６−１株のケトース３−エピメラーゼであることが強く示唆された。

［配列１］（配列番号１）
MKIGCHGLVWTGR FDAEGIRYSVQK TKEAGFDLIEFPLMDPFSFDVATAKSALAEHGLTASASLGLSEATDVSSEDPAIVKAGEELLNRALDVLAELGATDFCGVIYSAMKKYMEPATEQGLSNSK AAVGRVVDR AAGLGINVSLEVVNRYETNVLNTGRQALSYLSDVKRPNLGVHLDTYHMNIEESDMFSPVLDTAEALKYVHIGESHRGYLGTGSVDFDNFFKALGRIGYDGPVVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDK LTAIKTIELH
（配列１ Ｙ５８６−１株のタンパク質データベースを用いて同定したアミノ酸配列下線部で示すアミノ酸配列がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで得られたピークと一致した配列。）

＜実験８−３：ケトース３−エピメラーゼ酵素遺伝子の単離＞
アミノ酸配列より同定した遺伝子のＤＮＡ配列（配列表の配列番号２）を合成し、ｐＱＥ６０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）に組み込み、発現用大腸菌を形質転換した。構築した大腸菌発現系を用いて誘導酵素の確認を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は図１１に示すように、Ｃ末端にＲＳＨＨＨＨＨＨが付加された誘導タンパク質が可溶性画分に確認された。組換酵素はＣ末端にＲＳＨＨＨＨＨＨの付加アミノ酸配列があるため、Ｙ５８６−１株精製酵素より約１ｋＤａ大きい。また、このバンドのケトース３−エピメラーゼ活性も確認された。

［配列２］（配列番号２）
ATGAAAATTGGCTGCCACGGCCTGGTATGGACCGGCCGTTTCGACGCTGAAGGCATCCGCTACTCCGTCCAGAAGACCAAGGAAGCCGGGTTTGATCTGATCGAATTCCCGCTCATGGATCCCTTCTCCTTCGATGTGGCCACGGCAAAGTCGGCACTCGCAGAGCATGGTTTGACCGCCTCCGCATCATTGGGACTTTCCGAAGCTACGGATGTCAGCAGTGAAGATCCGGCCATTGTGAAAGCGGGGGAGGAGTTGCTCAACCGTGCCCTTGATGTTCTTGCGGAGCTGGGTGCCACCGACTTCTGCGGCGTGATCTACAGTGCGATGAAGAAGTACATGGAGCCGGCCACCGAGCAAGGCTTGAGCAACAGCAAGGCCGCTGTCGGGAGGGTGGTCGACAGGGCTGCTGGCCTGGGCATCAACGTCTCGCTTGAGGTCGTGAACCGGTATGAAACCAACGTGCTGAACACCGGGCGGCAGGCTCTGTCCTACCTCTCTGATGTCAAGCGGCCGAATCTAGGCGTTCATTTGGATACTTACCACATGAACATCGAGGAATCGGACATGTTCTCTCCGGTGCTGGACACCGCCGAGGCTCTTAAGTACGTGCACATTGGCGAGAGCCACCGAGGTTACCTCGGCACCGGGAGCGTCGATTTCGACAACTTCTTCAAGGCTCTTGGCCGCATCGGCTACGACGGACCGGTCGTCTTCGAATCATTCTCCTCCGCGGTCGTGGCCCCGGATCTGAGCCGCATGCTTGGCATCTGGCGCAACCTGTGGGCGGACAACGAAGAACTCGGCGCCCACGCCAACGCCTTCATACGCGACAAACTCACGGCCATCAAGACCATCGAACTGCACTAA
（配列２ Ｙ５８６−１株のタンパク質データベースを用いて同定したＤＮＡ配列 下線部で示す終止コドンに当たる塩基はクローニングの際には除去した。）

＜実験９：本酵素とアミノ酸配列の同一性が７０％以上の変異体とその酵素活性＞
配列１のアミノ酸配列と７８．５％のアミノ酸配列同一性を有する、下記配列３（配列表の配列番号３）の変異体と、７６．８％のアミノ酸配列同一性を有する、下記配列４（配列表の配列番号４）の変異体とを作成し、上記実験６の２．と６．と同じ方法で、その粗酵素の酵素活性、耐熱性を測定した。

［配列３］（配列番号３）（下線部は、配列番号１と相違するアミノ酸）
MNIGCHGLVWTGTFDADGIRLAVEKTKQAGFDLIEFPLMDPFSFDVAAAQAALAEHGLAVSASLGLSDETDITSSDPAVVAAGEALLLRAVDVLAELGGTHFCGVIYSAMKKYMDPVTPEGLASSRRTIARVADHAAERGVSVSLEVVNRYETNVLNTARQALAYLGEVDRPNLGIHLDTYHMNIEESDMFAPVLDAAPALRYVHIGESHRGYLGTGTVDFDTFFKALGRIGYDGPIVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWTDNDELGAHANAYIRDKLVAVDSIRLH
［配列４］（配列番号４）（下線部は、配列番号１と相違するアミノ酸）
MNIGCHGLVWTGNFDAEGIRLAVHKTREAGFDLIEFPLMDPFTFDVSVAKDALEEYDIAVSASLGLSEETDVTSADPAVAAAGEALLIKAVDVLADLGGEHFCGVIYSAMKKYMEPVTPEGLASSKAAIARVADHAAARGVSVSLEVVNRYETNVLNTARQALAYIAEVDRPNLGIHIDTYHMNIEESDMFTPVLDAAPALRYVHIGESHRGYLGTGTVDFDTFFKALGRIGYNGPIVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWNDNDELGAHANAYIRDKLVAVDSIRLH

本酵素の活性部位残基は、６位、６３位、１１０位、１５２位、１７９位、１８２位、２０５位、２１１位、２４０位のアミノ酸であり、金属イオン結合推定部位残基は、１４６位、１７７位、２０５位、２４０位のアミノ酸と予想されるため、これらのアミノ酸付近のアミノ酸置換は行わなかった。

組換え体の粗酵素の結果を以下の表８示す。

表８中、Ｙ５８６ＤＡＥ１とは、Ｙ５８６−１株由来のケトース３−エピメラーゼに属するＤ−アルロース３−エピメラーゼを指す。以下同様である。

表８に示すように、約７８％、７７％のアミノ酸同一性を有する変異体酵素であっても、活性部位・金属イオン結合推定部位付近を除くアミノ酸置換であれば、酵素活性を維持しつつ、有用な特性である耐熱性の指標とする、Ｔ７０／Ｔ５０はむしろ高くなり、その酵素としての特性に変化はないことが確認された。

＜実験１０：本酵素のアミノ酸置換変異体の作成とその酵素活性＞
本発明の配列番号１で表されるケトース３−エピメラーゼのアミノ酸配列と、対照酵素（アルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のケトース３−エピメラーゼ）（特許文献５）のアミノ酸配列を比較して、アミノ酸残基が異なる部位はケトース３−エピメラーゼ活性への関与が小さいと予想し、配列番号１のその相違する部位のアミノ酸等を、部位特異的変異操作による塩基置換により変化させて各種のケトース３−エピメラーゼ変異体を作成し、その中から、野生型より耐熱性の高いアミノ酸置換変異体が得られる部位のものを選択した。

部位特異的変異導入により、まず１アミノ酸置換変異体を作成した。目的の変異導入部位にアミノ酸置換が起こるような１ないし２塩基対に塩基置換を加えた塩基配列を持つ両ＤＮＡ鎖のＰＣＲプライマーを作製し、変異導入元のプラスミドＤＮＡとこれらの両プライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ断片を宿主大腸菌に形質転換し、得られたクローンからプラスミドＤＮＡを抽出して目的変異が導入されたことを、シークエンス解析によって確認した。多重置換変異体については、上記の方法を繰り返すことにより作製した。
組換えによって得られた各１アミノ酸置換変異体の粗酵素のＴ７０／Ｔ５０と６０℃で１時間保温後の残存活性を測定した。そのうち、Ｔ７０／Ｔ５０または６０℃で１時間保温後の残存活性のいずれかが、対照酵素より高い変異体を選択したところ、表９の１８の部位のアミノ酸置換体であった。

次に、上記１８の部位のアミノ酸置換を２〜１１個同時に置換した任意の２〜１１重の変異体を作成して、各組換え変異体の粗酵素のＴ７０／Ｔ５０と６０℃で１時間保温後の残存活性を測定した。結果を表１０と表１１に示す。
Ｔ７０／Ｔ５０が対照酵素のＡｇＤＡＥ（１．５４）を上回る部位特異的変異酵素が３７種中３０種、そのうち親株野生型組換え酵素Ｙ５８６−１株 ＤＡＥ（１．７８）を上回る変異酵素は３７種中２０種得られた（表１０）。
また、６０℃１時間保温後の残存活性が対照酵素のＡｇＤＡＥ（３０．８％）を上回る部位特異的変異酵素が３７種中３７種、そのうち親株野生型組換え酵素Ｙ５８６−１株 ＤＡＥ（４９．４％）を上回る変異酵素は３７種中３６種得られた（表１１）
以上の結果から、本発明のケトース３−エピメラーゼは、部位特異的変異を行うことにより、さらに熱安定性が高まる変異体が多数得られるという優れた有用な酵素であることがわかった。

本発明のケトース３−エピメラーゼは、遊離のＤ−又はＬ−ケトース、Ｄ−又はＬ−ケトペントースに作用させて、これらケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−又はＬ−ケトース、Ｄ−又はＬ−ケトースを容易に生成する。この反応は、各種ケトース、とりわけＤ−フラクトースを原料としたＤ−アルロースの大量生産の道を拓くものである。
特に、従来のケトース３−エピメラーゼに比べて、培養液から得られる総活性が対照酵素の約３倍高いので、本発明の酵素によりＤ−アルロースの大量生産が可能になる。
また、酵素の至適温度が７０℃と高く、高耐熱性酵素であることから、至適温度の６０〜７０℃付近での反応において、より高いＤ-アルロースの生産収率がもたらされる。
また、本発明のケトース３−エピメラーゼは、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができ、固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするケトースの大量生産ができる。
さらに、本発明のケトース３−エピメラーゼのアミノ酸置換変異体には、変異前の本酵素より熱安定性が高いものが多数含まれる。
したがって、本発明のケトース３−エピメラーゼとその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。

Claims (23)

1. アルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物由来のケトース３−エピメラーゼであって、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定した分子質量が３６ｋＤａであり、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ。
   （Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
   （Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
2. 下記（Ｃ）および（Ｄ）の理化学的性質を有する、請求項１に記載のケトース３−エピメラーゼ。
   （Ｃ）反応至適ｐＨは６〜８である。
   （Ｄ）反応至適温度は６０℃である。
3. 基質特異性が、Ｄ−アルロース、Ｄ−タガトース、Ｌ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−アルロースの順である、請求項１または２に記載のケトース３−エピメラーゼ。
4. アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）である、請求項１ないし３のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
5. アルスロバクター属に属する微生物が特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Ｙ５８６−１株である、請求項１ないし４のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
6. 以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
   （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、下記（Ａ）および（Ｂ）のケトース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が１．５５以上であるタンパク質。
   （Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
   （Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
7. 以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
   （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、下記（Ａ）および（Ｂ）のケトース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ６０℃で１時間保温後の残存活性が３１％以上であるタンパク質。
   （Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
   （Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
8. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体からなるタンパク質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＨ５６、Ｔ５９、Ａ６０、Ｐ７７、Ｌ９４、Ｌ９７、Ｄ１０１、Ａ１０９、Ａ１２８、Ｖ１２９、Ｖ１３２、Ｓ１４４、Ｓ１６７、Ｐ１７２、Ｅ１９９、Ａ２００、Ｋ２０２、Ｓ２１８から選ばれる少なくとも１つの部位のアミノ酸置換を有し、下記（Ａ）および（Ｂ）のケトース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３−エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が高いか、または６０℃で１時間保温後の残存活性が高い変異体からなるタンパク質。
   （Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有する。
   （Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの中ではＤ−アルロースに対する３位のエピ化活性が最も高い。
9. 請求項６ないし８のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
10. 配列番号２で表される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
11. 下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列若しくはその相補的配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ、
    （ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および
    （ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有するＤＮＡ
12. 請求項９ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
13. 請求項１２に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換宿主細胞。
14. 請求項１ないし３のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを生産する、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２８１３として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Ｙ５８６−１株。
15. 請求項１ないし５のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼが担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
16. 請求項１ないし５のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物の、菌体破砕物中に存在するケトース３−エピメラーゼ粗酵素が担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
17. 前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および／または無機担体である、請求項１５または１６に記載の固定化酵素
18. 請求項６ないし８のいずれかに記載のタンパク質が、担体に固定化されていることを特徴とする固定化タンパク質。
19. 前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および／または無機担体である、請求項１８に記載の固定化タンパク質。
20. 請求項１ないし５のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物を培地中で培養し、微生物菌体中に当該ケトース３−エピメラーゼを蓄積させ、これを採取するケトース３−エピメラーゼの製造方法。
21. 前記培地がＤ−アルロースを添加した無機塩培地である、請求項２０に記載のケトース３−エピメラーゼの製造方法。
22. 請求項１３に記載の形質転換宿主細胞を培地で培養し、培養物からケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を採取する、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
23. Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、請求項１ないし５のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ、請求項６ないし８のいずれかに記載のタンパク質、請求項１５ないし１７のいずれかに記載の固定化酵素、または、請求項１８または１９に記載の固定化タンパク質を作用させて、該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。

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