CN103946379B

CN103946379B - 球形节杆菌生产的酶

Info

Publication number: CN103946379B
Application number: CN201280033597.9A
Authority: CN
Inventors: 何森健; P·K·古洛帕利; 新谷知也; 吉川谅
Original assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Rare Sugar Production Technical Research Laboratories LLC
Current assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Rare Sugar Production Technical Research Laboratories LLC
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: EP2730652B1; EP2730652A4; US20140186925A1; WO2013005800A1; JP5997693B2; KR101944027B1; KR20140045423A; JPWO2013005800A1; US9057062B2; CN103946379A; EP2730652A1

Abstract

本发明提供能够用于食品产业中的安全性高的差向异构酶和酮糖的制造方法。本发明的酮糖3-差向异构酶，其能够从属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物得到，并且具有下述的底物特异性：（1）将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或者L-酮糖。（2）在D-或者L-酮糖中，相对于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。

Description

球形节杆菌生产的酶

技术领域

本发明涉及属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物生产的酶（酮糖3-差向异构酶）、以及使用该酶的酮糖的制造方法，详细而言，涉及酮糖3-差向异构酶，进一步涉及使用该酶的酮糖的制造方法，其中，所述酮糖3-差向异构酶能够从属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物，优选为球形节杆菌（Arthrobacterglobiformis）M30（保藏编号NITEBP-1111）得到，并且具有下述（A）和（B）的底物特异性：

（A）将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或者L-酮糖。

（B）在D-或者L-酮糖中，相对于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，在甜味的强度和种类上与D-果糖极其类似。但是D-阿洛酮糖与D-果糖不同，其在体内吸收时基本不代谢，热量贡献低。在专利文献1中，记载了D-阿洛酮糖作为低卡路里甜味剂，能够有利地利用于低卡路里饮食品的制造中。即，D-阿洛酮糖可以作为减肥食品的有效成分使用。作为非砂糖甜味剂而广泛利用的糖醇类如果超过规定量摄取，则会引起腹泻等的副作用，但是D-阿洛酮糖这样的副作用很少。进一步，D-阿洛酮糖在人体内基本不代谢，因此热量值大致接近零，通过抑制脂质合成酶的活性而具有减少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖也可以作为对体重减少有益的甜味剂使用（例如，参照非专利文献1和2）。另外，在专利文献2中，记载了由于D-阿洛酮糖具有血糖上升抑制作用，因此能够有利地利用于健康食品、糖尿病患者用饮食品、瘦身用饮食品等中。从这样的观点出发，D-阿洛酮糖集中了作为健康食品、减肥甜味剂的多个关注点，因此，在食品产业中，对于高效且安全的生成D-阿洛酮糖的方法的开发的必要性提高。

另一方面，在非专利文献3中，公开了来自菊苣假单胞菌（Pseudomonascichorii）ST-24的D-酮糖3-差向异构酶，记载了通过利用该酶可以从D-果糖来制造D-阿洛酮糖。但是，正如该酶的别名被称为D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose3-epimerase）那样，已知其对D-塔格糖的特异性最高，对D-果糖的作用比较弱。另外，菊苣假单胞菌是植物病原性微生物，D-酮糖3-差向异构酶产生能力非常低，因此，还不能说其适合工业的利用。因此寻求与属于假单胞菌属的微生物不同的，酮糖3-差向异构酶产生能力高的，在食品生产方面、安全性方面没有问题的微生物，以及对D-果糖的特异性高，且适合制造D-阿洛酮糖的新型酮糖3-差向异构酶。

在此，在专利文献3中，以提供新型的酮糖3-差向异构酶及其制造方法、编码该酶的DNA、含有该DNA的重组DNA和转化体、以及使用该酶的酮糖的制造方法为课题，通过提供从属于根瘤菌属的微生物能够得到的酮糖3-差向异构酶及其制造方法、编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体、以及使用该酶将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化来制造对应的D-或者L-酮糖的方法，从而解决上述课题。另外，在专利文献4中，开发了使用来自农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的D-阿洛酮糖差向异构酶（以下称为阿洛酮糖3-差向异构酶）的D-阿洛酮糖的生成方法。

如以上所述，为了处理上述问题，对于使用D-果糖作为底物，用酶生成D-阿洛酮糖的方法进行了研究。但是迄今开发的方法在用于作为食品的D-阿洛酮糖的生产中时，在安全性方面还存在很多问题点。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2001-011090号公报

专利文献2：日本专利特开2005-213227号公报

专利文献3：WO2007/058086号公报

专利文献4：日本专利特表2008-541753号公报

非专利文献

非专利文献1：Matsuo,T.,Y.Baba,M.Hashiguchi,K.Takeshita,K.IzumoriandH.Suzuki,AsiaPac.J.Clin.Nutr.,10:233-237(2001)

非专利文献2：Matsuo,T.andK.Izumori,AsiaPac.J.Clin.Nutr.,13:S127(2004)

非专利文献3：KenIzumorietal.,Biosci.Biotech.Biochem.,57,1037-1039(1993)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供从作为在制造食品时使用被认可的、在现有添加物名册收录清单中收录的菌种中基本没有毒性的菌种中，获得以高收率催化从D-果糖向D-阿洛酮糖的异构化的新型酮糖3-差向异构酶，以及使用该酶的酮糖的制造方法。

本发明者等在每次有机会的时候就采集各地的土壤，从其中分离微生物，持续探索具有酮糖3-差向异构酶产生能力的属于假单胞菌属微生物以外的微生物。除了上述日本的现有添加物名册收录清单以外，还着眼于在欧洲和美国作为食品使用被认可的清单中记载的菌种中基本没有毒性的菌种，持续专门探索。

其结果，在大量分离的菌株中发现了新型的产生酮糖3-差向异构酶的属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物。另外，来自该微生物的新型的酮糖3-差向异构酶具有作用于D或者L-酮糖的3位，催化向对应的D-或者L-酮糖进行差向异构化的广泛的底物特异性，并意外地发现其在D-或者L-酮糖中，相对于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高，适合于从D-果糖到D-阿洛酮糖的制造。从而确立能够通过属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物得到的新型酮糖3-差向异构酶及其制造方法，并确立利用该酶的酮糖的转化方法以及酮糖的制造方法，由此完成本发明。

即，本发明的目的在于，提供能够从属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物得到的酮糖3-差向异构酶，以及利用该酶将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化，制造对应的D-或者L-酮糖的方法。

属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物的新型酮糖3-差向异构酶产生能力比较高，并且和菊苣假单胞菌不同，不具有植物病原性。另外，能够从该微生物中得到的本发明的酮糖3-差向异构酶尤其能够很好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖之间的相互转化，因此在从D-果糖到D-阿洛酮糖的制造中有用。

解决课题的手段

本发明将下述（1）～（6）中记载的酮糖3-差向异构酶作为要点。

（1）一种酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶能够从属于节杆菌属的微生物得到，并且具有下述（A）、（B）的底物特异性：

（A）将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或者L-酮糖，

（2）如上述（1）所述的酮糖3-差向异构酶，其中，所述属于节杆菌属的微生物为球形节杆菌。

（3）如上述（1）所述的酮糖3-差向异构酶，其中，所述属于节杆菌属的微生物为球形节杆菌M30（保藏编号NITEBP-1111）。

（4）如上述（1）～（3）中任一项所述的酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶是通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量为120kDa、亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体（homotetramer）结构。

（5）如上述（1）～（4）中任一项所述的酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶具有下述物理化学性质（a）～（e）：

（a）最适pH

在30℃下反应30分钟，在20mM的镁（Mg²⁺）存在的条件下，pH为6～11；

（b）最适温度

在pH7.5下反应30分钟，在20mM的镁（Mg²⁺）存在的条件下温度为60～80℃；

（c）pH稳定性

在4℃下保持24小时的条件下，至少在pH5～11的范围内稳定；

（d）热稳定性

在pH7.5下保持1小时，在4mM的镁离子（Mg²⁺）存在的条件下，在约50℃以下稳定；在镁离子（Mg²⁺）不存在的条件下，在约40℃以下稳定；

（e）通过金属离子活化

通过二价锰离子（Mn²⁺）、二价钴离子（Co²⁺）、钙（Ca²⁺）和镁离子（Mg²⁺）活化。

（6）如上述（1）～（5）中任一项所述的酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶具有下述底物特异性1.～8.：

1.将D-果糖作为底物时相对活性为43.8%，

2.将D-阿洛酮糖作为底物时的活性为100%，

3.将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1.13%，

4.将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18.3%，

5.将L-果糖作为底物时的相对活性为0.97%，

6.将L-阿洛酮糖作为底物时的相对活性为21.2%，

7.将L-山梨糖作为底物时的相对活性为16.6%，

8.将L-塔格糖作为底物时的相对活性为44.0%，

其中，将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100，将相对于各个酮糖的活性作为相对活性来表示。

另外，本发明将下述（7）中记载的酮糖的转化方法、以及下述（8）中记载的酮糖的制造方法作为要点。

（7）一种酮糖的转化方法，其特征在于，在含有选自D-或者L-酮糖中的1种以上的酮糖的溶液中，使上述（1）～（6）中任一项记载的酮糖3-差向异构酶作用，从而将该酮糖的3位进行差向异构化。

（8）一种酮糖的制造方法，其特征在于，在含有选自D-或者L-酮糖中的1种以上的酮糖的溶液中，使上述（1）～（6）中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用，从而将该酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的酮糖并收集该酮糖。

发明效果

本发明可以得到以下的效果。

1.作为将来自球形节杆菌的本酶用于食品产业中的最大优势在于菌的安全性。

2.D-阿洛酮糖生产菌的最适pH为，假单胞菌属（Pseudomonas）为7～9，根瘤菌属（Rhizobium）为9～9.5，土壤杆菌属（Agrobacterium）为7～8。另一方面，由本菌株生产的酶的最适pH在6～8之间，在着色少的7以下的pH下也可以生产D-阿洛酮糖。

3.由测定了30分钟的酶活性的结果，报告了根瘤菌属（Rhizobium）通过Mn²⁺、Mg²⁺会增加活性，土壤杆菌属（Agrobacterium）通过Co²⁺、Mn²⁺会增加活性。在本酶的情况下，确认了通过Mn²⁺和Co²⁺会增加活性。另外，通过Mg²⁺、Ca²⁺也可以增加活性。

4.与以前的酶相比，可以进行在宽范围温度区域内的反应。

5.从L-塔格糖向L-山梨糖的反应活性大。

6.可以得到即便在培养基中添加的D-阿洛酮糖少至0.15%也具有活性的菌体。

7.即便在水中也具有酶活性，进行从果糖向阿洛酮糖的反应。

8.比菊苣假单胞菌繁殖速度大。

通过本发明，能够从作为在制造食品时使用被认可的、在现有添加物名册收录清单中收录的菌种中基本没有毒性的菌种中，获得以高收率催化从D-果糖向D-阿洛酮糖的异构化的新型酮糖3-差向异构酶。进而，提供使用该酶的酮糖的制造方法。

即，本发明能够提供能够从属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物得到的酮糖3-差向异构酶，以及能够提供利用该酶，从而将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或者L-酮糖的方法。能够从该微生物得到的本发明的酮糖3-差向异构酶，尤其可以良好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖之间的相互转化，因此在从D-果糖制造D-阿洛酮糖中有用。

附图说明

图1是表示使用了无机盐培养基的各种碳源对酶生产量的影响的图。

图2是表示在各种培养基中对酶生产量的影响的图。

图3是表示金属离子对D-PE活性的影响的图。

图4是表示最适温度的图。

图5是表示热稳定性的图。

图6是表示最适pH的图。

图7是表示pH稳定性的图。

图8是表示通过离子交换色谱进行的分离洗提的图。

图9是表示用疏水作用色谱进行的分离洗提的图。

图10是用于确认纯度的SDS-PAGE的照片。

图11是表示最适pH的范围的图。

图12是表示最适温度的范围的图。

图13是表示稳定的pH范围的图。

图14是表示稳定的温度范围的图。

图15是表示泳动距离（migrationdistance）和分子量的关系的图。

图16是表示标准蛋白质的移动距离的关系图和分子量的关系的图。

具体实施方式

本发明涉及能够从属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物得到的，具有下述底物特异性的酮糖3-差向异构酶，在食品工业中使用的菌的安全性、低的最适pH、热稳定性以及金属要求性方面有特点。

[安全性]

作为将本酶、球形节杆菌用于食品产业中的最大优势在于菌的安全性。该菌种首先在美国由FDA在EAFUS（EverythingAddedtoFoodintheUnitedStates）：AFoodAdditiveDatabase中作为“来自固定化球形节杆菌的葡萄糖异构酶（Glucoseisomerasefromimmobilizedarthrobacterglobiformis）”而被收录。该使用方法将菌体直接固定化，并且证明菌体本身的安全性非常高。

另外，在欧洲由EFFCA（TheEuropeanfood&feedculturesassociation）和IFD（InternationalFederationfortheRoofingTrade）的《InventoryofMicroorganismswithadocumentedhistoryofuseinfood》中记载了作为“柑橘发酵以除去柠檬苦素并降低苦味（Citrusfermentationtoremovelimoninandreducebitterness）”被使用的要点。这显示与酵母等同样，将该菌种用于发酵中，并显示安全性极高。在日本，节杆菌属是作为“α-淀粉酶、异麦芽糖葡聚糖酶（isomaltodextranase）、蔗糖酶（Invertase）、尿素酶、葡聚糖酶、α-葡萄糖基转移酶、果糖基转移酶”等的酶基原微生物，另外，作为海藻糖或者维生素K（甲萘醌）生产菌而被收录于食品添加物清单中。

虽然这样在日美欧有很长的使用实际成绩，但是惊讶的是没有发现由该菌种产生的差向异构酶。

另一方面，作为至今已知的D-阿洛酮糖的生产酶，有通过假单胞菌属（Pseudomonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）等产生的生产酶。它们也有上述美欧的清单中没有收录的作为机会致病菌或者植物细胞感染等的报告。

另外，在通过作为糖质酶的代表性酶的葡萄糖异构酶进行的从葡萄糖来生产果糖中，报告有多种菌株（60种以上），但是实用化的菌株不过是在链霉菌属（Streptomyces）、芽胞杆菌属（Bacillus）、游动放线菌属（Actinoplanes）、节杆菌属等少数的属中的应用。因此，节杆菌属是具有使用实际成绩的安全性高的菌种。

[最适pH和金属要求性]

进一步，本发明的优势在于以下的事项。

D-阿洛酮糖的最适pH为，假单胞菌属为7～9，根瘤菌属为9～9.5，土壤杆菌属为7～8。另一方面，由本菌株生产的酶的最适pH在6～8之间，在着色少的7以下的pH下也可以生产D-阿洛酮糖。

另外，由测定了30分钟的酶活性的结果，报告了根瘤菌属通过Mn²⁺、Mg²⁺会增加活性，土壤杆菌属通过Co²⁺、Mn²⁺会增加活性。在本酶的情况下，确认了通过Mn²⁺和Co²⁺会增加活性。另外，由于通过Mg²⁺、Ca²⁺也可以增加活性，因此使用了Mg²⁺等的本菌株可以生产D-阿洛酮糖。

[菌株的来源以及鉴定]

本发明者等在大量分离的菌株中发现产生新型的酮糖3-差向异构酶的微生物M30株，并且通过基于16SrRNA基因碱基序列同源性进行系统分析，判定M30株属于球形节杆菌。

菌株的鉴定

（1）16SrRNA基因碱基序列同源性

分析16SrRNA基因区域，并确定碱基数为734。

（2）同源性检索

针对该菌株的16SrRNA基因的碱基序列，通过BLAST检索（日本DNA数据库）进行与已知菌种的同源性检索。由相对于上述特定的碱基数734的碱基序列，同源性为97%以上的菌株名和同源性（%）的值来确定M30株的微生物为球形节杆菌（Arthrobacterglobiformis）。

作为本发明的具有酮糖3-差向异构酶活性的菌株，球形节杆菌（Arthrobacterglobiformis）M30是在2011年6月22日保藏在位于千叶县木更津市上总镰足2-5-8的独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，首先以受理编号NITEAP-1111受理，并以保藏编号NITEP-1111保藏。

在本发明中所谓的酮糖是指具有酮糖结构的六碳糖，具体而言，是指果糖、阿洛酮糖、塔格糖、和山梨糖，D-或者L-酮糖是指它们的D-体和L-体。

本发明的酮糖3-差向异构酶具有将D-或者L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或者L-酮糖的活性，并且催化D-或者L-果糖与D-或者L-阿洛酮糖之间的相互转化、以及D-或者L-塔格糖与D-或者L-山梨糖之间的相互转化。本发明的酮糖3-差向异构酶是在D-或者L-酮糖中相对于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高的酶。本发明的酶可以由属于后述的节杆菌（Arthrobacter）属的微生物得到。

本发明的酮糖3-差向异构酶可以通过培养属于节杆菌（Arthrobacter）属且具有酮糖3-差向异构酶产生能力的微生物，从在培养液中繁殖的菌体中采集酮糖3-差向异构酶来调制。作为属于节杆菌（Arthrobacter）属的微生物，可以优选利用球形节杆菌（Arthrobacter globiformis）M30（保藏编号NITEBP-1111）株及其变异株等。M30株的酮糖3-差向异构酶的产生能力比较高，因此在得到本发明的酶方面优选。M30株在此次进行国际申请时，于2012年5月2号请求从2011年6月22日原保藏在日本国独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心（日本国千叶县木更津市东上总镰足2-5-8）的NITEP-1111移管至基于布达佩斯条约的保藏，并以保藏编号为NITEBP-1111进行国际保藏。

[精制前的本酶的物理化学性质]

精制前的酶的酮糖3-差向异构酶的活性可以通过将D-果糖作为底物，测定D-阿洛酮糖的生成量来测定。具体而言，酶反应液组成是使用50mMTris-HCl缓冲液（pH7.0）200ml、0.2MD-果糖375μl、酶液100μl、10mM氯化锰75μl，在55℃下反应30分钟，煮沸2分钟以停止反应，通过HPLC测定反应后的溶液组成。1单位酶活性定义为在上述条件下，将D-果糖进行差向异构化在1分钟内生成1μmol的D-阿洛酮糖的酶的量。对于作为逆反应的从D-阿洛酮糖向D-果糖的差向异构化的酶单位，也在同样条件下测定并同样定义。

本发明的酮糖3-差向异构酶有具有下述的物理化学性质的情况。

（a）最适pH

在55℃下反应30分钟，在1mM的二价钴离子（Co²⁺）存在的条件下，pH为6.0～10。

（b）最适温度

在pH7.0下反应30分钟，在1mM的二价钴离子（Co²⁺）存在的条件下，温度约为50℃～约70℃。

（c）pH稳定性

在4℃下保持24分钟，至少在pH5.5～11的范围内稳定。

（d）热稳定性

在pH7.0下保持10分钟，在1mM的二价钴离子（Co²⁺）存在的条件下，在约70℃以下稳定，在1mM的二价钴离子（Co²⁺）不存在的条件下，在约60℃以下稳定。

（e）通过金属离子活化

通过二价锰离子（Mn²⁺）或者二价钴离子（Co²⁺）活化。

酮糖的转化反应通常按照以下的条件进行。底物浓度为1～60%（w/v），优选为约5～50%（w/v）；反应温度为10～70℃，优选为约30～60℃；反应pH为5～10，优选为7～10；酶活性为每1g底物为1单位以上，优选为选自50～5,000单位的范围。反应时间可以适当选择，由于与经济性的关系，在分批反应的情况下，通常在5～50小时的范围内选择。

由此转化得到的反应溶液含有原料的酮糖和新生成的酮糖，也可以有利地实施将其直接用作甜味剂、保湿剂、结晶析出防止剂、酱油糖汁赋予剂。通常反应溶液可以按照常用方法使用活性碳来脱色，使用H型和OH型离子交换树脂来脱盐、浓缩得到糖浆状制品。

如果需要可以将该浓缩液例如通过使用碱金属型或者碱土类金属型强酸性阳离子交换树脂的柱色谱，分离精制新生成的酮糖和原料酮糖，将高浓度含有新生成的酮糖的成分浓缩，得到糖浆状制品，进一步在能够结晶化酮糖的情况下，也可以有利地实施使其结晶析出，从而得到结晶制品。另外，也可以有利地实施将该分离了的原料酮糖再次用于转化反应的原料中。

这样得到的酮糖优选作为甜味剂，并能够有利地利用于饮食物、饲料、饵料、牙膏、口香片、舌下片、内服药等经口摄取物的甜味赋予、嗜好性提高等中。另外，也能够有利地作为发酵用碳源、试药、化学品·医药品的原料、中间体等利用。

以下，通过实验详细说明本发明。另外，在以下的实验中，按照上述的活性测定法测定将D-阿洛酮糖转化为D-果糖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，标记为酮糖3-差向异构酶活性。

<实验1：球形节杆菌M30（保藏编号NITEBP-1111）株的培养>

在将0.2%的D-阿洛酮糖作为碳源、将硫酸铵作为氮源的无机盐培养基中，无菌添加球形节杆菌（Arthrobacterglobiformis）M30（受保藏编号NITEBP-1111）株的种营养液1%（v/v），一边通气搅拌一边在30℃下培养16小时。得到的培养液中的酮糖3-差向异构酶活性约为14单位/100ml培养液。

<实验2：球形节杆菌M30（保藏编号NITEBP-1111）株的培养和粗酶的提取>

通过离心分离从培养液中回收菌体。回收了的菌体使用1mMTris-HCl缓冲液（pH7.0）清洗。接下来，将菌体悬浊于10ml的1mMTris-HCl缓冲液（pH7.0）之后，一边将该菌体悬浊液在冰水中冷却一边用超声波均质机（株式会社SONICS&MATERIALS）破碎细胞。将破碎物在12000rpm下离心20分钟，将该离心上清液作为粗酶。

<实验3：粗酶的透析>

向纤维素酯透析膜（CelluloseEsterDialysisMembrane）（SPECTRUMLaboratory公司）中加入粗酶，将膜整体浸渍于含有20mMEDTA的10mMTris-HCl缓冲液中12小时以透析。将膜用10mMTris-HCl缓冲液（pH7.0）清洗2次之后，从膜中提取粗酶液。

<实验4：酶活性的检测>

按照下述的反应条件，分别使之反应之后，通过煮沸停止反应。用离子交换树脂将反应溶液进行脱盐，用过滤器处理调制HPLC样品。将样品在HPLC系统（TOSOHCORPORATION）中用CK08EC（三菱化学）进行色谱分析。从色谱图的峰面积值算出生成的各种糖。

<试验结果>

<实验5：酮糖3-差向异构酶的性质>

1.碳源及其浓度对活性的影响

在含有0.05-1%的D-阿洛酮糖（D-p）、1%的D-果糖（D-f）、1%的D-塔格糖（D-t）、0.1%的果糖（D-f）和0.1%的D-阿洛酮糖（D-p）、1%的D-阿洛酮糖（D-p）和0.1%的D-塔格糖（D-t）的MSM培养基中培养球形节杆菌M30（保藏编号NITEBP-1111）株，并按照与上述同样的操作调节所得到的粗酶的各活性。

其结果（图1）可知，由于本菌的酶是在D-阿洛酮糖存在时被生产的，因此是由D-阿洛酮糖得到的诱导酶，D-阿洛酮糖浓度为0.2%时显示最高活性。

2.培养基对酶活性的影响

用3种不同的培养基（最少无机盐（MSM）培养基、TSB培养基、以及酶提取物（YE）培养基）在30℃下培养16小时，按照与上述同样的方法得到粗酶。

其结果（图2）可知，酶在通过向最便宜的最少无机盐的培养基中添加D-阿洛酮糖，酶活性最高。

3.金属离子对D-PE活性的影响

对在实验3中所示的含有EDTA的缓冲液，使用透析过的酶液，在以下的表1所示的反应条件下测定酶活性。得到的结果示于图3中。

通过对EDTA进行透析活性会消失表示本酶要求金属离子。测定金属离子对酶活性的影响，结果通过添加MnCl₂、CoCl₂，酶活性增大。由此确认本酶需要Mn²⁺或者Co²⁺。

[表1]

4.温度对D-PE活性的影响（最适温度）

进行10-80℃的各种温度下的反应。求得了最适温度的反应条件示于表2中。测定结果示于图4中。在从50℃到70℃的温度范围内存在最适温度。

[表2]

5.温度对D-PE活性的影响（热稳定性）

对于热稳定性，对钴离子存在的情况和不存在的情况进行了研究。在1mM的钴离子存在下，在pH7.0、10-80℃下进行了10分钟热处理，测定了残留活性。其结果示于图5中。由此可知在钴离子存在的情况下，直至70℃是稳定的，在钴离子不存在的情况下，直至60℃是稳定的。

6.pH对D-PE活性的影响（最适pH）

进行各种pH下的酶反应，求得最适反应pH。在各pH下使用过的缓冲液如下所示。使用了pH3-6的50mM柠檬酸缓冲液；pH6.0-8.0的50mM磷酸缓冲液；pH7.0-9.0的Tris-HCl缓冲液；以及pH9.0-11.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。反应条件示于表3中。得到的结果示于图6中。可知最适pH在6-10的范围内。

[表3]

7.pH对D-PE活性的影响（pH稳定性）

将酶在各pH下在4℃下保持24小时，通过在55℃下反应30分钟求得残留的酶活性。其结果示于图7中。本酶显示从约pH6到pH11的宽范围的pH稳定性。

8.D-PE的底物特异性

使用8种六单糖（酮糖）对精制前的本酶的底物特异性进行了研究。酶反应组成为，用表4所示各底物0.2M350μl、酶液350μl（Tris缓冲液pH7.0），在55℃下反应30分钟，通过HPLC分析来测定从各糖被差向异构化所产生的酮糖。其结果如下。将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100，将相对于各酮糖的活性作为相对活性来表示。

将D-果糖（D-fructose）、D-阿洛酮糖（D-psicose）、D-山梨糖（D-sorbose）、D-塔格糖（D-tagatose）、L-果糖（L-fructose）、L-阿洛酮糖（L-psicose）、L-山梨糖（L-sorbose）、L-塔格糖（L-tagatose）作为底物，将活性作为相对活性示于表5中。相对于D-阿洛酮糖的活性最强，接下来为D-果糖。它们的底物特异性如果与其它的游离的酮糖3-差向异构酶相比较，可以称为D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE），显示与菊苣假单胞菌的D-塔格糖3-差向异构酶（DTE）明显不同的特异性。

[表4]

[表5]

[酶的精制和物理化学性质的测定]

接下来，将本发明的酶进一步精制为纯净的状态，测定物理化学性质。

[酶的精制时和精制酶的活性测定以及蛋白质的测定]

对于酶活性的测定，使用表6所记载的酶反应液组成进行了酶反应。在30℃下进行30分钟酶反应，将该条件下在1分钟内生成1μmol的D-果糖的酶量作为1单位。反应之后，将反应液加入到3分钟沸腾溶液中停止反应，脱离子处理之后，通过HPLC分析来测定生成了的D-果糖。另外，对于蛋白质的测定，通过Bradford法，对250μl的Bradford液加入5μl的酶液，均匀搅拌之后进行测定。

[表6]

判定精制过的本酶为通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量为120kDa的同源四聚体（homotetramer）结构的差向异构酶。

[菌体的培养]

[菌的前培养]

将本菌接种于表7所示的培养基中，进行前培养。向500ml三角烧瓶中加入培养基100ml，在30℃、200rpm下振动12小时进行培养。

[表7]

[主培养]

将前培养的生长培养基100mL接种于表8所示主培养10L中，在30℃下以通气量2ml/min、300rpm进行24小时通气搅拌培养。

[表8]

[酶的提取]

从主培养10L中得到活菌体230g。将其悬浊于1L的缓冲液（10mMTris-HClpH7.5+1mMMgCl₂）中，使用高压均质机破碎菌体，提取酶。破碎条件在20000psi下进行。通过离心分离（10000rpm，20min，4℃）除去不溶物的得到粗酶液1150ml。酶的精制中使用了该粗酶液的130ml。

[酶的精制]

[通过PEG（聚乙二醇）的分离]

向粗酶液130ml中添加26gPEG6000（浓度20%），在低温下搅拌溶解。通过离心分离（10000rpm，20min，4℃）将生成的沉淀和上清液进行分离。将沉淀溶解于30mL的缓冲液中。测定活性的结果为沉淀中不存在活性。接下来，向上清液中同样添加PEG26g（最终浓度为40%），分离生成的沉淀和上清液，测定活性。其结果在沉淀中确认没有活性。在上清液中确认有活性。

[PEG除去的方法]

在PEG浓度为40%时酶也不会沉淀，而存在于上清液中。为了将上清液的酶向接下来的精制过程推进，需要除去PEG。利用PEG不吸附于离子交换树脂的性质，从而除去PEG。具体而言，通过使酶吸附于离子交换树脂并冲洗PEG，之后将吸附了的酶利用高浓度的NaCl从树脂中溶出，由此除去PEG。

PEG除去的具体方法如下所示。

向用缓冲液（10mMTris-HClpH7.5+10mMMgCl₂）平衡化过的Q-SepharoseFastFlow58ml中加入含有40%PEG的酶液，慢慢搅拌10分钟使酶吸附。将该树脂填充于柱（容积约50ml）中，用缓冲液（1MNaCl+10mMTris-HClpH7.5+10mMMgCl₂）150ml洗提。每次分离10ml并回收具有活性的部分。对该缓冲液（10mMTris-HClpH7.5+10mMMgCl₂）将其进行一夜透析除去NaCl，得到PEG分离酶液。

[通过离子交换色谱进行的精制]

将PEG分离酶液通过离子色谱分离法进行精制。使用的柱为Q-SepharoseHighPerformance，使用AKTA系统，在流速为1.5ml/min下以1MNaCl的浓度梯度从35%到60%每次分别分离5ml的成分。在图8所示箭头的成分中酶活性被洗提。通过将其回收并进行离子交换色谱分离得到精制酶。图8中显示离子交换色谱分离洗提图。由于蛋白质洗提的图8的中央部用箭头表示的部分存在酶活性，因此回收了该部分。

将通过离子交换色谱分离而精制的酶用疏水色谱分离法进行进一步精制。使用的柱为RESOURCEPHE6ml。添加硫酸铵溶解，使得在酶液中成为2M。以流速为3ml/min将2M的硫酸铵从100%到0%降低浓度洗提并每次分离5ml。图9的箭头的大峰处酶活性被洗提。将该成分透析除去硫酸铵得到疏水色谱分离精制酶。蛋白质的洗提的第二个大峰处存在活性。图9的箭头表示回收了的成分。

[精制表]

对于酶的精制过程，一并将粗酶、PEG分离酶、离子交换色谱分离精制酶、疏水色谱精制酶的各个蛋白质量、酶活性等作为精制表示于表9中。通过该精制得到了收率为12%、精制倍率为31.5倍的精制酶。

[表9]

[精制酶的纯度]

按照常法使用SDSPAGE（凝胶浓度15%）确认了精制酶的纯度。在图10中，左边为标准的蛋白质，后面的2道为使用疏水色谱精制之后的酶。其结果是在29～45kDa之间确认了单一的带。由此确认酶被纯净地精制。

[精制酶的性质]

对精制过的酶的性质进行研究。

[反应最适pH]

如图11所示，在pH6～11内显示活性，活性最高的pH为7.5。

测定时，对于反应的最适pH，使用D-阿洛酮糖作为底物，使用pH4～11的各种缓冲液在30℃下反应30分钟，通过用HPLC测定来求得生成的D-果糖。反应液组成示于表10中，使用的缓冲剂示于表11中。

[表10]

[表11]

[反应最适温度]

从显示测定了反应温度和总体活性的结果的图12可知，本酶的最适温度在添加Mg²⁺离子时为70℃。在Mg²⁺离子不存在下最适温度为60℃，在Mg²⁺离子存在下最适温度显著变高，在60℃～80℃下显示高的活性。在图12中，以在Mg²⁺离子存在下表现最高活性的70℃作为100时的相对活性来表示。反应条件如表12所示，将精制酶在pH7.5下在各个温度下反应30分钟，测定生成的D-果糖的量。对添加Mg²⁺离子的情况和不添加Mg²⁺离子的情况（代替MgCl₂而添加水）进行了研究。反应在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃下进行30分钟。

[表12]

[pH稳定性]

研究了精制酶的pH稳定性的结果如图13所示可知至pH5～11是稳定的。

测定条件是在各pH下保持4℃24小时，在pH7.5下使该酶反应。残留活性的测定在pH7.5、30℃下进行30分钟。使用的缓冲液使用与在最适pH下使用过的相同的缓冲液。

在图13中，将pH6的柠檬酸缓冲液的情况下的残留活性作为100，将各pH下的残留活性作为相对活性来表示。

[热稳定性]

对于精制酶的热稳定性，在Mg²⁺离子的存在下或者不存在下进行研究。在Mg²⁺离子存在的情况下和不存在的情况下，热稳定性大大变化，Mg²⁺离子会增大酶的热稳定性。在Mg²⁺离子存在下，在50℃在1小时内稳定。另一方面，在Mg²⁺离子不存在的情况下，整体在约10℃下为低的热稳定性。另外，最适反应温度为70℃，从该结果显示本酶通过在底物的存在下稳定性增大，即，认为显示ES复合体的稳定性高。在图14中以不进行热处理的酶的活性作为100的相对活性来表示。

作为热处理条件，将精制酶液40μl、缓冲液（10mMTris-HClpH7.5）160μl、4mMMgCl₂（不添加Mg²⁺离子的情况下为水）100μl的总量作为300μl，将其在各个温度下保持1小时后在冰水中冷却10分钟之后，按照常用方法测定残留的酶活性。

[金属离子的影响]

对酶的金属离子要求性进行研究。在含有1mMEDTA的10mMTris-HClpH7.5中将精制酶进行2小时透析。之后，在不含有EDTA的10mMTris-HCl缓冲液pH7.5中进行一昼夜的透析，得到EDTA处理酶。使用该酶，在含有各种金属离子1mM的条件下以D-阿洛酮糖作为底物测定对其活性的影响。将该结果，以无添加的酶活性作为100，以相对活性表示各金属离子添加时的活性，示于表13中。

确认了在Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺的各离子的存在下，活性为1.3倍以上，在Mg²⁺离子存在下为最高活性。由该结果可知，本酶可以用Mg²⁺离子活化。如果考虑Mg²⁺离子在热稳定性中的大的影响，可知在本酶反应中Mg²⁺离子是重要的。

[表13]

金属离子	相对活性（%）
		Co²⁺	130
Mn²⁺	137
		Mg²⁺	150
Ca²⁺	110
		Ni²⁺	87
Fe²⁺	32
		Zn²⁺	0
Cu²⁺	0
		K⁺	117
Na⁺	120
		无	100

[底物特异性]

对于本酶对全部己酮糖的反应性进行了研究。反应液组成示于表14中。其结果将D-阿洛酮糖作为100的相对活性整理于表中。本酶对全部己酮糖都显示活性，对D-阿洛酮糖显示最高的活性，明确为D-阿洛酮糖3-差向异构酶。对于底物特异性一并示于表15中。D-山梨糖、L-果糖是在70℃下反应120分钟求得初速度，除此之外，其它都是在70℃下反应20分钟求得初速度。

[表14]

[表15]

[Km和Vmax]

测定了本酶的D-阿洛酮糖和D-果糖的Km和Vmax。测定是在30℃下在Mg²⁺离子存在下的酶活性测定的条件下进行的。其结果，关于D-阿洛酮糖，V_max=168U/mg，K_m=30.1mM，关于D-果糖，V_max=68.5U/mg，K_m=31.5mM。

[酶的分子量]

[亚单位的分子量]

用SDS-PAGE（凝胶浓度15%）测定了精制酶的移动距离和分子量标记的移动距离。其结果可知，本酶的亚单位的分子量为约32kDa。

图15中显示泳动距离和分子量的关系。图15显示标记蛋白质的泳动距离cm和分子量kDa之间的关系。从精制酶的移动距离为约4.1cm可以推定本酶的亚单位为约32kDa。另外，泳动图示于图10中。

[酶的分子量]

使用凝胶过滤色谱测定本酶的分子量。即，求标准蛋白质和移动距离的关系图16，从本酶的移动距离来计算。其结果可知，酶的分子量为约120kDa。

在分子量的测定中，凝胶过滤色谱的柱使用了Superdex200pg16/600。使用过的电泳缓冲液（runningbuffer）组成为10mMTris-HClpH7.5，NaCl200mM，MgCl₂1mM。

使用标准蛋白质（标记）使用了以下的5种。

由于将本酶洗脱在72.5ml中，因此从移动距离和分子量的关系计算可知本酶的分子量为约120kDa。通过SDS-PAGE得到的亚单位的分子量为约32kDa，使用凝胶过滤法得到本酶的分子量为约120kDa。由此可以认为本酶为亚单位的分子量是32kDa的同源四聚体结构。

[与其它DPE、DTE的比较]

将至今报告的D-塔格糖3-差向异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的性质一并示于表16中。将本菌株所生产的酶与来自其它微生物的己酮糖3-差向异构酶相比较，最大的特征在于最适温度高。

[表16]

本发明的酮糖3-差向异构酶与其它的差向异构酶或者异构酶同样是不需要辅酶的异构化反应。因此，可以用于将酶固定化，通过各种固定化方法可以得到活性高的固定化酶。通过使用固定化酶，可以连续地进行大量差向异构化反应。通过能够工业地固定化，可以大量生产作为目标的酮糖。

实施例1

将本微生物在以D-阿洛酮糖作为碳源的最少无机盐培养基中繁殖，使用从繁殖菌体中得到的酶，对D-阿洛酮糖和D-果糖的平衡比进行了研究。反应液组成使用50mMTris-HCl缓冲液200μl、0.2MD-阿洛酮糖或者D-果糖、酶液100μl、10mMCoCl₂75μl。在反应温度为50℃下反应24小时。反应结束后使用HPLC测定反应液中的D-果糖和D-阿洛酮糖的量。

其结果，在以D-阿洛酮糖作为底物的情况下、以D-果糖作为底物的情况下都达到了相同的平衡比。

平衡比D-阿洛酮糖:D-果糖=27:73

其结果显示如果使用D-果糖反应，其27%可以向D-阿洛酮糖转化，是明确显示可以从D-果糖来生产D-阿洛酮糖的结果。

实施例2

使用精制的酶，对D-阿洛酮糖和D-果糖之间的差向异构化的平衡进行了研究。其结果是，在平衡状态下的D-阿洛酮糖:D-果糖在40℃下为25:75，在70℃下为30:70。

产业上的利用可能性

将本发明的酮糖3-差向异构酶作用于游离的D-或者L-酮糖、D-或者L-戊酮糖，将这些酮糖的3位进行差向异构化，容易生成对应的D-或者L-酮糖、D-或者L-酮糖。该反应为以各种酮糖，尤其是以D-果糖为原料大量生产D-阿洛酮糖开辟了道路。进一步，本发明的酮糖3-差向异构酶可以通过各种固定化方法得到活性高的固定化酶，通过使用固定化酶，可以连续地进行大量的差向异构化反应。通过能够工业地固定化，可以大量生产作为目标的酮糖。

因此，本发明的酮糖3-差向异构酶及其制造方法的确立，不仅在制糖产业上，在与其相关联的食品、化妆品、医药品产业上工业意义极大。

作为将生产本酶的球形节杆菌使用在食品产业上的最大特征在于菌的安全性。该菌种在美国由FDA收录于EAFUS中，证明菌体本身安全性非常高。作为至今已知的D-阿洛酮糖的生产酶，有来自假单胞菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属等的酶，这些不仅没有收录于欧美的清单中，而且还有作为机会致病菌或者植物细胞感染等的报告，是需要在确认安全性上花很多劳力的微生物。在本发明中可以使用菌体本身的安全性非常高的菌是很大的技术进步。

Claims

1.一种酮糖3-差向异构酶，其中，

所述酮糖3-差向异构酶从保藏编号为NITEBP-1111的球形节杆菌M30得到，并且具有下述(A)、(B)的底物特异性：

(A)将D-或L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或者L-酮糖，

(B)在D-或者L-酮糖中，所述酮糖3-差向异构酶对于D-阿洛酮糖的底物特异性最高；

所述酮糖3-差向异构酶是通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量为120kDa、亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体结构。

2.如权利要求1所述的酮糖3-差向异构酶，其中，

所述酮糖3-差向异构酶具有下述物理化学性质(a)～(e)：

(a)最适pH

在30℃反应30分钟、20mM的Mg²⁺存在的条件下，pH为6～11；

(b)最适温度

在pH7.5反应30分钟、20mM的Mg²⁺存在的条件下，温度为60～80℃；

(c)pH稳定性

在4℃保持24小时的条件下，在pH5～11的范围内稳定；

(d)热稳定性

在pH7.5保持1小时、4mM的Mg²⁺存在的条件下，在50℃以下稳定；在Mg²⁺不存在的条件下，在40℃以下稳定；

(e)通过金属离子活化

通过Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺以及Mg²⁺活化。

3.如权利要求1所述的酮糖3-差向异构酶，其中，

所述酮糖3-差向异构酶具有下述的底物特异性(1)～(8)：

(1)将D-果糖作为底物时的相对活性为43.8％，

(2)将D-阿洛酮糖作为底物时的活性为100％，

(3)将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1.13％，

(4)将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18.3％，

(5)将L-果糖作为底物时的相对活性为0.97％，

(6)将L-阿洛酮糖作为底物时的相对活性为21.2％，

(7)将L-山梨糖作为底物时的相对活性为16.6％，

(8)将L-塔格糖作为底物时的相对活性为44.0％，

其中，将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100，将各个酮糖的活性以相对于D-阿洛酮糖的相对活性来表示。

4.一种酮糖的转化方法，其特征在于，

在含有选自D-或者L-酮糖中的1种以上的溶液中，使权利要求1所述的酮糖3-差向异构酶作用，从而将该酮糖的3位进行差向异构化。

5.一种酮糖的制造方法，其特征在于，

在含有选自D-或者L-酮糖中的1种以上的溶液中，使权利要求1所述的酮糖3-差向异构酶作用，从而将该酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的酮糖并收集该酮糖。